Tài liệu Luận văn thạc sĩ bước đầu nghiên cứu chế phẩm sinh học dưới dạng synbiotic để bổ sung vào thức ăn nuôi tôm thẻ chân trắng (penaeus vannamei)

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Bước đầu nghiên cứu chế phẩm sinh học dưới dạng synbiotic để bổ sung vào thức ăn nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)” là công trình nghiên cứu của tôi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS. Hoàng Phương Hà và TS. Lê Thị Nhi Công. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên cứu nào. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hoàn chịu trách nhiệm. Hà Nội, ngày ……tháng ……năm 2021 Học viên Nguyễn Tiến Đạt ii LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp tại Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, các thầy cô đang công tác tại Khoa Công nghệ sinh học - Học Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã luôn hỗ trợ tôi và khuyến khích liên tục trong suốt những năm học tập và qua quá trình nghiên cứu và viết luận văn này. Thành tựu này sẽ không thể có được nếu không có họ. Tôi xin cảm ơn TS Hoàng Phương Hà – Phó trưởng phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là giảng viên hướng dẫn trực tiếp của tôi. Cảm ơn vì cánh cửa đến với phòng Sinh học môi trường luôn rộng mở mỗi khi tôi gặp phải rắc rối hoặc có câu hỏi về vấn đề nghiên cứu của mình. Tiến sĩ Hà luôn tận tâm, và luôn cho phép tôi tự do bày tỏ quan điểm đồng thời đưa ra những nhận xét, góp ý, dẫn dắt tôi đi đúng hướng trong suốt thời gian nghiên cứu, thực hiện đề tài luận văn thạc sĩ. Tôi cũng xin cảm ơn TS Lê Thị Nhi Công - Trưởng phòng Sinh học Môi trường - Viện Công Nghệ Sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt đã truyền đạt cho tôi những kiến thức về chuyên ngành trong suốt thời gian học tập để tôi có được nền tảng kiến thức hỗ trợ cho tôi trong quá trình làm luận văn thạc sĩ. Tôi xin cám ơn các chị em phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường- Viện Công nghệ Sinh học, đặc biệt là Ths. Nguyễn Thị Minh đã chia sẻ kinh nghiệm, giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm tại Phòng. Cuối cùng, tôi cũng muốn bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đên thầy Đỗ Mạnh Hào – Trạm trưởng trạm nghiên cứu biển Đồ Sơn – Viện tài nguyên môi trường biển – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đồng thời là trưởng phòng của tôi tại nơi công tác, với kinh nghiệm nghiên cứu, hướng dẫn cụ thể vào tạo điều kiện cho tôi được theo học Thạc sĩ tại Học Viện Khoa học và Công Nghệ Việt Nam. Xin chân thành cảm ơn! iii MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG...................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ................................................................ vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................. viii MỞ ĐẦU......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 4 PROBIOTIC ............................................................................................. 4 1.1.1 Định nghĩa về probiotic ...................................................................... 4 1.1.2 Một số nhóm vi sinh vật probiotic ..................................................... 4 1.1.3 Các đặc tính tiêu biểu của vi sinh vật probiotic ................................. 6 1.1.4 Nghiên cứu và ứng dụng của chế phẩm probiotic trong NTTS tại Việt Nam ......................................................................................................... 8 PREBIOTIC............................................................................................ 10 1.2.1 Khái niệm về prebiotic ..................................................................... 10 1.2.2 Ứng dụng của prebiotic trong NTTS ............................................... 11 1.2.3 Khô đậu nành.................................................................................... 13 SYNBIOTIC ........................................................................................... 14 1.3.1 Khái niệm synbiotic ......................................................................... 14 1.3.2 Lên men xốp tạo tạo synbiotic từ probiotic và prebiotic ................. 14 1.3.3 Ứng dụng các sản phẩm synbiotic trên thế giới và Việt Nam ......... 15 VÀI NÉT VỀ NGHỀ NUÔI TÔM NƯỚC LỢ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM ...................................................................................................... 17 1.4.1 Trên thế giới ..................................................................................... 17 1.4.2 Tại Việt Nam .................................................................................... 18 1.4.3 Tình hình dịch bệnh trong NTTS tại Việt Nam ............................... 19 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………… ................................................................................................ 22 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ, MÁY MÓC ......................... 22 2.1.1 Vật liệu ............................................................................................. 22 2.1.2 Các thiết bị máy móc ........................................................................ 22 iv 2.1.3 Môi trường........................................................................................ 23 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, KỸ THUẬT SỬ DỤNG................. 23 2.2.1 Phương pháp hóa sinh học ............................................................... 24 2.2.2 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái và định danh vi khuẩn .. 27 2.2.3 Phương pháp xác định mật độ tế bào vi khuẩn ................................ 30 2.2.4 Đánh giá khả năng sử dụng prebiotic trong khô đậu nành của probiotic ........................................................................................................ 30 2.2.5 Phương pháp xác định các điều kiện thích hợp để lên men xốp tạo chế phẩm synbiotic ....................................................................................... 31 2.2.6 Khảo sát nhiệt độ và thời gian sấy chế phẩm ................................... 31 2.2.7 Phương pháp xác định hàm lượng chất ức chế trypsin .................... 32 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 34 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG PROBIOTIC NGHIÊN CỨU........................................................................... 34 3.1.1 Khả năng sinh enzyme tiêu hóa của probiotic ................................. 34 3.1.2 Khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus....................................... 37 3.1.3 Đánh giá khả năng tạo màng sinh học của các chủng probiotic ...... 38 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI TẾ BÀO VI KHUẨN PROBIOTIC VÀ VỊ TRÍ PHÂN LOẠI CỦA CHỦNG .................................................................... 40 3.2.1 Hình thái khuẩn lạc và tế bào ........................................................... 40 3.2.2 Phân loại các chủng vi khuẩn probiotic ........................................... 41 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SỬ DỤNG KHÔ ĐẬU NÀNH CỦA PROBIOTIC ..................................................................................................... 43 TỐI ƯU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN XỐP . 45 3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men ............................... 46 3.4.2 Ảnh hưởng của độ ẩm đến quá trình lên men .................................. 47 3.4.3 Ảnh hưởng của độ dày cơ chất đến quá trình lên men ..................... 49 KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN SẤY CHẾ PHẨM ............. 51 3.5.1 Ảnh hưởng đến mật độ tế bào vi khuẩn trong chế phẩm ................. 51 3.5.2 Ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme tiêu hóa chế phẩm .............. 53 v 3.5.3 Ảnh hưởng đến khả năng kháng lại vi khuẩn gây bệnh của chế phẩm…. ......................................................................................................... 55 KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CHẤT ỨC CHẾ TRYPSIN TRƯỚC VÀ SAU LÊN MEN ............................................................................................... 56 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 60 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Diện tích và sản lượng tôm nuôi nước lợ 2010-2015 ......................... 19 Bảng 1.2. Tổng hợp tình hình dịch bệnh trên tôm nuôi từ năm 2013-2016 ....... 20 Bảng 2.1. Bảng các thiết bị, máy móc tại phòng thí nghiệm .............................. 22 Bảng 2.2. Thành phần hóa chất sử dụng để xác định đơn vị chất ức chế trypsin trong khô đậu nành .............................................................................................. 32 Bảng 3.1. Hoạt tính sinh enzyme α-amylase của các chủng nghiên cứu ............ 35 Bảng 3.2. Hoạt tính sinh enzyme cellulase của các chủng nghiên cứu .............. 36 Bảng 3.3. Hoạt tính sinh enzyme protease của các chủng nghiên cứu ............... 37 Bảng 3.4. Đường kính vòng kháng khuẩn của 6 chủng (mm) ............................ 37 Bảng 3.5.Đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc của 4 chủng probiotic tuyển chọn ..................................................................................................................... 40 Bảng 3.6. Hình thái tế bào của các chủng probiotic tuyển chọn......................... 40 Bảng 3.7. Mật độ vi khuẩn probiotic trong chế phẩm trước và sau lên men (CFU/g) ............................................................................................................... 44 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến mật độ tế bào vi khuẩn và khả năng sinh enzyme tiêu hóa của chế phẩm sau lên men ....................................... 46 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng kháng khuẩn của chế phẩm sau lên men ................................................................................................ 47 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của độ ẩm lên men đến khả năng sinh enzyme tiêu hóa của chế phẩm sau lên men ................................................................................... 47 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của độ ẩm lên men đến khả năng kháng khuẩn của chế phẩm sau lên men ................................................................................................ 48 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của độ dày cơ chất khi lên men đến mật độ tế bào vi khuẩn của chế phẩm tạo thành ............................................................................ 49 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của độ dày cơ chất khi lên men đến khả năng sinh enzyme tiêu hóa của chế phẩm tạo thành ............................................................ 50 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của độ dày cơ chất khi lên men đến khả năng kháng khuẩn của chế phẩm tạo thành ............................................................................ 50 Bảng 3.15. Thời gian sấy cần thiết để thu được chế phẩm có độ ẩm theo yêu cầu ............................................................................................................................. 51 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của độ ẩm lên men đến khả năng sinh enzyme tiêu hóa của chế phẩm sau lên men ................................................................................... 54 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm sau sấy của chế phẩm đến mật độ tế bào vi khuẩn .................................................................................................... 55 vii a. DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt phương pháp nghiên cứu chính .................................... 24 Hình 3.1. Hoạt tính sinh enzyme α-amylase của các chủng nghiên cứu ............ 34 Hình 3.2. Hoạt tính sinh enzyme cellulose của các chủng nghiên cứu.............. 35 Hình 3.3. Hoạt tính sinh enzyme protease của các chủng nghiên cứu................ 36 Hình 3.4. Khả năng tạo màng của các chủng probiotic sau 24, 48 và 72h ......... 39 Hình 3.5. Ảnh tạo màng sinh học các chủng probiotic sau 24, 48 và 72h .......... 39 Hình 3.6. Hình ảnh nhuộm Gram của các chủng probiotic sau 24 giờ nuôi ....... 41 Hình 3.7. Sản phẩm của điện di .......................................................................... 42 Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại của các chủng probiotic nghiên cứu ........... 43 Hình 3.9. Mật độ vi khuẩn probiotic trước (trái) và sau (phải) lên men trong công thức phối trộn 1-6. ...................................................................................... 45 Hình 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến mật độ tế bào vi khuẩn trong chế phẩm. A: nhiệt độ sấy 40⁰C, B: Nhiệt độ sấy 50⁰C, C: Nhiệt độ sấy 60⁰C, D: Nhiệt độ sấy 70⁰C. .............................................................................................. 53 Hình 3.11. Đơn vị chất ức chế trypsin trong chế phẩm sau lên men .................. 57 viii b. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Ý nghĩa CT Công thức ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long NTTS Nuôi trồng thủy sản TT Thứ tự VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật SHPT Sinh học phân tử 1 c. MỞ ĐẦU Tại Việt Nam, ngành Thủy sản đã và đang góp phần quan trọng vào sự tăng trưởng của nền kinh tế. Hoạt động nuôi trồng thủy sản liên tục có những bước phát triển mạnh, sản lượng tăng trung bình đạt 12,77% qua các năm. Năm 2019, tổng sản lượng khai thác và nuôi trồng đạt khoảng 8,15 triệu tấn và kim ngạch xuất khẩu ước đạt 8,6 tỷ USD. Theo định hướng phát triển đến năm 2030, tổng sản lượng thủy sản đạt khoảng 9,0 triệu tấn, trong đó sản lượng nuôi trồng thủy sản chiếm đến khoảng 70% và sản lượng khai thác chiếm khoảng 30% [1]. Tuy nhiên, hiện nay nghề nuôi tôm của chúng ta đang đương đầu với nhiều loại bệnh khác nhau: bệnh phát sáng, bệnh đầu vàng, bệnh còi tôm (EMS), hay bệnh hoại tử gan tụy… nguyên nhân phần lớn là do vi khuẩn gây bệnh thuộc chi Vibrio gây ra. Chính vì vậy, thuốc kháng sinh thường được sử dụng rộng rãi để ngừa bệnh cho vật nuôi trong nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, có đến 80% kháng sinh sử dụng được bài tiết qua nước tiểu hoặc phân của vật nuôi mà không bị phân hủy hoàn toàn. Theo số liệu báo cáo, việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản là một trong những nguyên nhân cho việc tồn dư kháng sinh trong môi trường. Các nghiên cứu từ Bangladesh, Ấn Độ, Indonesia và Thái Lan đã báo cáo dư lượng kháng sinh trong các sản phẩm thủy sản và nước nuôi trồng thủy sản. Trong đó, Chloramphenicol được ghi nhận ở cá từ Bangladesh (~ 5ng/L), tôm từ Ấn Độ (~ 32ng/L) và Indonesia (~ 45ng/L), v.v. [2]. Do đó, việc lạm dụng kháng sinh có thể dẫn đến sự xuất hiện của vi khuẩn kháng kháng sinh (ARB) và gen kháng kháng sinh (ARGs) trong môi trường nuôi trồng thủy sản [3]. Trên thế giới, thực phẩm bổ sung dưới dạng synbiotic là một dòng sản phẩm đã và đang được trọng tâm nghiên cứu trên đối tượng động vật thủy sản. Tại Việt Nam, cho đến nay các nghiên cứu về thực phẩm hỗ trợ chuyển hóa thức ăn đối với động vật thủy sản chủ yếu ở dạng probiotic, ở dạng prebiotic riêng lẻ đã xuất hiện trong báo cáo tại Việt Nam. Nhưng chưa có nhiều báo cáo cho thấy sự phối hợp giữa các prebiotic với nhau hoặc sản phẩm 2 trong 1 của prebiotic và probiotic thành synbiotic trên tôm, cá nuôi. Đề tài nghiên cứu tạo sản phẩm synbiotic với sự kết hợp trực tiếp của probiotic và prebiotic trong khô đậu nành thông qua quá trình lên men, dùng để bổ sung vào thức ăn nuôi tôm, từ đó cân bằng hệ vi sinh đường ruột, kích thích 2 để làm tăng cường hệ miễn dịch, tăng cường sự chuyển hóa thức ăn từ đó làm tăng sản lượng tôm. Những chủng vi sinh vật có lợi sử dụng trong đề tài có khả năng sinh các enzyme tiêu hóa như amylase, cellulase, protease, khả năng kháng lại Vibrio parahaemolyticus và còn là những chủng tạo màng sinh học (biofilm) rất tốt. Đây là cơ sở để các chủng probiotic này có khả năng bám dính trên các giá thể tốt và cũng có thể tồn tại lâu dài trên thành ruột của tôm hay động vật chủ khác. Prebiotic-chất sơ thực phẩm, được chúng tôi lựa chọn là khô đậu nành, một loại phụ phẩm nông nghiệp chứa nhiều dinh dưỡng sau khi sản xuất dầu. Các Oligosaccharride - là thành phần có mặt trong chất sơ thực phẩm và một số chất ức chế dinh dưỡng như ức chế tripsine (trypsine inhibitor) chứa trong khô dầu đậu nành sẽ được chuyển hóa thành các axit béo mạch ngắn và loại được chất ức chế dinh dưỡng này nhờ trong quá trình lên men bởi các chủng probiotic. Hiện nay việc sử dụng probiotic trong NTTS thường theo hai hướng: phối trộn vào thức ăn cho tôm, cá ăn hoặc bổ sung trực tiếp vào môi trường nước ao nuôi. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy hiệu quả của probiotic trong xử lý môi trường ao nuôi. Tuy nhiên, các nghiên cứu tập trung vào sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng cải thiện sức khỏe tôm thông qua kích thích quá trình trao đổi chất, tăng cường hệ thống miễn dịch của tôm, cá và ứng dụng chất bổ trợ prebiotic hay còn gọi là chất xơ hòa tan để kích thích sự phát triển nhóm lợi khuẩn này còn chưa nhiều. Đây là vấn đề cực kỳ quan trọng trong điều kiện thâm canh và siêu thâm canh hóa hiện nay ở nước ta. Trước yêu cầu của thực tiễn, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Bước đầu nghiên cứu chế phẩm sinh học dưới dạng synbiotic để bổ sung vào thức ăn nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)”. Mục đích nghiên cứu: Tạo được chế phẩm sinh học dưới dạng synbiotic bổ sung vào thức ăn nuôi tôm thẻ chân trắng, giúp nâng cao tăng trưởng và tăng cường miễn dịch cho tôm. Nội dung nghiên cứu : - Nội dung 1. Sàng lọc các vi sinh vật probiotic 3 + Chọn các chủng vi sinh vật sinh các enzyme cellulose, protease, amylase; có khả năng tạo màng sinh học, kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên tôm. + Phân loại của vi khuẩn probiotic tuyển chọn bằng kit sinh hóa và phương pháp sinh học phân tử sử dụng gen 16S rRNA. - Nội dung 2. Xác định được khả năng sử dụng khô đậu nành (như prebiotic) cho sinh trưởng của các chủng probiotic lựa chọn - Nội dung 3. Tối ưu hóa một số điều kiện cho quá trình lên men xốp tạo chế phẩn dưới dạng synbiotic Những đóng góp của luận văn:  Khô đậu nành không chỉ đóng vai trò là nguồn dinh dưỡng mà còn là một cơ chất prebiotic hỗ trợ sinh trưởng của probiotic trong chế phẩm synbiotic nghiên cứu. Khả năng loại được chất ức chế trypsin trong khô đậu nành sau quá trình lên men xốp của probiotic đã được kiểm chứng trong nội dung đề tài.  Chế phẩm synbiotics nghiên cứu dung để bổ sung vào thức ăn nuôi tôm là một đề tài hoàn toàn mới. Kết quả của đề tài là cơ sở để phát triển chế phẩm sinh học synbiotic ứng dụng trong NTTS tại Việt Nam. 4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU PROBIOTIC Định nghĩa về probiotic Lịch sử nghiên cứu về probiotic có từ thời cổ đại. Tuy nhiên, các bằng chứng khoa học đầu tiên về probiotic được ghi nhận bởi Metchnikoff từ đầu thế kỷ 20. Thức ăn được lên men mang lại hiệu quả đáng kể trong điều trị và dự phòng tiêu chảy cấp cho trẻ em các nước trên thế giới mặc dù chưa có được các hiểu biết về một loại lợi khuẩn cụ thể nào. Các lợi khuẩn mang lại các cải thiện về điều trị và phòng bệnh ngày nay được gọi tên là các probiotic. Có rất nhiều định nghĩa về probiotic tuy nhiên định nghĩa hay được sử dụng nhất trong các nghiên cứu lâm sàng về probiotic hiện nay là của Tổ chức thực phẩm và nông nghiệp và Tổ chức Y tế thế giới (FAO/WHO năm 2002). Theo định nghĩa này, Probiotic là "vi sinh vật sống khi đưa một lượng cần thiết đầy đủ vào cơ thể đem lại hiệu quả có lợi cho cơ thể”. Ban đầu probiotic được lựa chọn với tiêu chí là tạo một môi trường tốt cho sự lên men thực phẩm, nhưng ngày nay với những hiểu biết của khoa học hiện tại, tiêu chí lựa chọn probiotic có nhiều thay đổi. Một số nhóm vi sinh vật probiotic Vi khuẩn lactic: Chi Lactobacillus Các vi khuẩn thuộc Chi Lactobacillus là các vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, tế bào hình que (rod) hoặc que ngắn (cocco-bacili). Về phân loại, Chi Lactobacillus thuộc Ngành Firmicutes, Lớp Bacili, Bộ Lactobacillales, Họ Lactobacillaceae. Họ vi khuẩn này cũng bao gồm các chi có quan hệ gần gũi với Paralactobacillus và Pediococcus. Chúng là những vi sinh vật hiếu khí và cần môi trường giàu dinh dưỡng để sinh trưởng. Trong quá trình lên men, nhóm vi khuẩn này chuyển đổi một số loại đường thành acid lactic. Tính năng đặc trưng của nhóm chế phẩm sinh học này là sinh các chất kháng khuẩn và sự hình thành màng sinh học để bảo vệ màng nhầy ruột. Sản xuất các chất ức chế như acid béo mạch ngắn làm giảm pH. Loại trừ các vi sinh vật gây bệnh hoặc ngăn chặn chúng dính vào màng nhầy ruột. Chịu ảnh hưởng của các điều kiện lý hóa trong ruột như pH và thế oxy hóa khử, qua đó hạn chế điều kiện tăng trưởng của vi sinh vật có hại. Ảnh hưởng trên sự chuyển hóa của các acid mật và do đó thúc 5 đẩy sự hấp thụ chất béo, tác dụng trên biểu mô ruột, cải thiện khả năng hấp thụ [4]. Do vậy, thực phẩm chứa Lactobacillus có thể hỗ trợ trong ngành y dược, cụ thể nó có thể hỗ trợ trong điều trị di ngoài cấp [5]. Vi khuẩn Gram dương sinh bào tử: Chi Bacillus Chi Bacillus được phân vào ít nhất 8 nhóm loài trong cây phát sinh loài của Ngành Firmicutes. Thành viên của chi Bacillus đều là các vi khuẩn dị dưỡng, có tế bào hình que, hiếu khí, sản sinh acid lactic và các sản phẩm trao đổi chất khác (CO2, diacetyl, bacteriocin). Đặc điểm nổi bật nhất của chúng là khả năng sinh nội bào tử (endospore), và đây cũng là một đặc điểm quan trọng của một chủng Probiotic. Các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus được tìm thấy phổ biến trong đất. Các enzyme mà vi khuẩn nhóm này sinh ra có khả năng chống lại các yếu tố bất lợi bên ngoài. Rengpipat và cộng sự (2000) chỉ ra rằng việc sử dụng các sản phẩm chứa vi khuẩn Bacillus sp. sẽ kích hoạt hệ miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể ở tôm sú (Penaeus monodo). Trong điều kiện môi trường thích hợp, vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus sẽ phát triển nhanh với số lượng rất lớn, đồng thời cạnh tranh với các vi sinh vật khác và động vật nguyên sinh về nguồn thức ăn nên phần nào ngăn cản được sự phát triển của Vibrio và các vi sinh vật có hại, từ đó giảm được các tác nhân gây bệnh. Bacillus subtilis có khả năng sinh nhiều enzyme nhưng quan trọng nhất là sinh enzyme amylase và protease là hai loại enzyme tiêu hóa. Vi khuẩn này thường tồn tại trong sản phẩm dưới dạng bào tử, nhờ vậy khi uống vào dạ dày nó không bị acid cũng như các men tiêu hóa ở dịch vị phá hủy. Trong môi trường ruột bào tử “nảy mầm” và phát triển thành thể sinh dưỡng giúp cân bằng hệ vi sinh có ích trong đường ruột, cải thiện hệ tiêu hóa nhất là sau khi sử dụng chất kháng sinh kéo dài [7]. Nấm men: Chi Saccharomyces Nấm men là các vi sinh vật đơn bào có nhân điển hình. Chi Saccharomyces được xếp trong Lĩnh giới Eukaryota, Giới Nấm (fungi), Ngành Ascomycota, Phân ngành Saccharomycotina, Lớp Saccharomycetes, Bộ Saccharomycetales, Họ Saccharomycetaceae. Tế bào của nấm men S. cerevisiae sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi đa phương và được chuyển trực tiếp đến túi bào tử, có chứa bào tử túi. Ngoài ra, một đặc tính của Chi Saccharomyces là khả năng lên men mạnh mẽ các loại đường. Đây cũng là đặc tính mong muốn của 6 các chủng nấm men S.cerevisiae được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, từ nướng bánh mỳ đến sản xuất đồ uống có cồn dựa trên nhiều loại thực vật thô. Ngoài ra, nhóm này có thể sinh trưởng tốt ở pH 4,5~5,5, nên nó chịu được tác dụng của môi trường acid trong ruột, chúng có khả năng phát triển tốt trong điều kiện môi trường chứa rỉ đường, amonisulfat, DAP, MgSO4, acid H2SO4 [8]. Các đặc tính tiêu biểu của vi sinh vật probiotic Khả năng sinh các enzyme tiêu hóa Các nghiên cứu cho thấy, probiotic có tác dụng tốt lên quá trình tiêu hóa của động vật bởi chúng sinh tổng hợp các enzyme ngoại bào như: protease, lipase, amylase, cũng như cung cấp các nhân tố phát triển như vitamin, acid béo và amino acid [9]. - Enzyme α – amylase: dưới tác dụng của α – amylase, tinh bột và các sản phẩm chứa tinh bột sẽ bị thủy phân thành đường glucose. α – amylase phân giải tinh bột nhanh hơn 2 – 2,5 lần so với sự phân giải bình thường của đường ruột. Nguồn đường này dễ hấp thu giúp tăng cường năng lượng cho vật nuôi. - Enzyme protease: enzyme protease là nhóm enzyme xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid giúp cho sinh vật dễ hấp thu hơn và tổng hợp cấu trúc cơ thịt của vật nuôi. Protease là enzyme quan trọng, cần thiết cho các vi sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng, từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể vi khuẩn. Vì vậy, khi bổ sung probiotic vào thức ăn của động vật, các chất dinh dưỡng được hấp thụ hiệu quả hơn, ví dụ như khi bổ sung vào thức ăn probiotic chứa vi khuẩn Bacillus cereus rất hiệu quả với cá vền, cá hồi cầu vồng với các chủng vi khuẩn B. licheniformis, B. subtilic và Fennneropenaeus indisud. Việc sử dụng các chủng Bacillus sp. khác nhau giúp tăng hiệu quả phân hủy chất khô, protein thô và phospho đều tăng khi bổ sung 50g probiotic/kg thức ăn [10]. Khả năng bám dính Trong sinh thái học, nguyên lý loại trừ cạnh tranh (competitive exclusion), hay còn gọi là định luật Gause, cho rằng hai loài cạnh tranh nhau vì cùng một nguồn sống thì không thể cùng tồn tại nếu các yếu tố sinh thái là không đổi. Đối với vi sinh vật probiotic trong hệ vi sinh vật đường ruột, nguyên lý này được thể hiện rõ nhất ở khả năng cạnh tranh vị trí bám dính hoặc chất 7 dinh dưỡng và khả năng loại trừ các vi sinh vật gây bệnh. Quá trình bám dính vào thành ruột giúp vi sinh vật không bị rửa trôi ra khỏi thành ruột bởi tác động của nhu động ruột, nhờ đó chúng có khả năng tồn tại và phát triển trong đường ruột, cuối cùng mới có thể gây ra những tác động đối với cơ thể vật chủ. Khả năng bám dính của mỗi loài vi sinh vật là nhờ khả năng tạo màng sinh học (biofilm), biofilm được hình thành bởi các polysaccharide (có bản chất là protein) nằm trên màng tế bào, trong đó có các thành phần: protein thành tế bào, polysaccharide, acid lipoteichoic đóng vai trò quyết định. Khả năng bám dính của các chủng probiotic phụ thuộc vào nhiều yếu tố như bản thân vi khuẩn probiotic, pH của đường ruột, các enzyme tiêu hóa của đường ruột, sự có mặt của muối mật…[11]. Ngoài ra độ tuổi và trạng thái sinh lý của vật chủ cũng ảnh hưởng rất lớn đến khả năng bám dính của vi khuẩn probiotic. Những cơ thể vật chủ non và thể trạng khỏe mạnh thì khả năng bám dính của vi khuẩn probiotic cũng tốt hơn. Người ta đã chứng minh khả năng bám dính và phát triển trên bề mặt ruột của Lactobacillus rhamnosus GG và Lactobacillus plantarum 299V để ngăn cản sự phát triển và lây lan của vi khuẩn E. coli O157:H7 gây bệnh tiêu chảy ở người và động vật nuôi. Hơn nữa, probiotic còn có khả năng cạnh tranh chất dinh dưỡng, chẳng hạn như sự hấp thụ các monosaccarit của vi sinh vật probiotic và làm giảm sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy Clostridium difficile trên vật nuôi bởi vì sự phát triển của loài này phụ thuộc vào các monosaccarit. Ngoài ra, probiotic còn có khả năng kết hợp với vi khuẩn gây bệnh theo kiểu đồng keo tụ, chúng kết dính với nhau tạo thành chùm và từ đó có khả năng loại bỏ các vi khuẩn gây bệnh nếu nồng độ các vi khuẩn probiotic đủ lớn. Khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh Ngày nay, cơ chế sản xuất các chất kháng vi sinh vật của vi khuẩn probiotic đã được làm sáng tỏ. Rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng probiotic có khả năng sản sinh hàng loạt các chất ức chế như acid hữu cơ, H2O2, CO2, bacteriocin, các hợp chất kháng khuẩn phân tử lượng thấp, và một số hợp chất khác. Các chất này được tiết ra bên trong ruột và bên ngoài môi trường nuôi sẽ có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh khác [12]. 8 Acid hữu cơ được tạo nên bởi hầu hết các vi khuẩn probiotic thông qua quá trình lên men hexose. Các acid hữu cơ là acid yếu, ít phân ly nên dễ dàng thấm qua màng tế bào của vi khuẩn, gây bệnh qua lớp phospholipid, dẫn đến làm thay đổi pH của nguyên sinh chất và gradient H+ làm ức chế vi khuẩn, sau đó tiêu diệt vi khuẩn. Các acid hữu cơ được biết có khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn gây bệnh S. aureus, E. ecoli, Salmonella… Thành phần của các chế phẩm sinh học bao gồm các nhóm lợi khuẩn như Bacillus, Lactobacillus khi được đưa vào chế độ ăn cho thấy có khả năng tăng cường miễn dịch của cơ thể [13,14,15]. CO2 là sản phẩm chính của quá trình lên men lactic dị hình. CO2 có thể tạo ra trong môi trường yếm khí, nhờ đó có khả năng gây ức chế với các vi khuẩn hiếu khí. Khả năng ức chế vi khuẩn thông qua CO2 chính là nhờ vào khả năng ức chế các enzyme decacboxyldase và khả năng tích lũy CO2 trong lớp phospholipid và làm rối loạn tính thấm của màng tế bào. CO2 có khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn đặc biệt là vi khuẩn Gram âm. Bacteriocin là những hợp chất kháng khuẩn có bản chất là các protein, chúng có khả năng tiêu diệt hoặc ức chế sinh trưởng đối nhiều loại vi khuẩn. Chúng thuộc vào nhóm protein đồng thể, có phổ tác dụng, cơ chế, khối lượng phân tử, nguồn gốc di truyền và tính chất sinh hóa khác nhau. Ngoài ra còn có các hợp chất kháng khuẩn phân tử lượng thấp như Reuterin được tạo thành từ một số chủng Lactobacillus là một chất kháng khuẩn mạnh trong đường ruột người và động vật [14]. Nghiên cứu và ứng dụng của chế phẩm probiotic trong NTTS tại Việt Nam Hiện nay, ở nước ta, các nghiên cứu về probiotic đã chú trọng nhiều hơn đến vai trò của chúng khi bổ sung vào nguồn thức ăn cho động vật thủy sản. Nghiên cứu của Trần Thị Ngọc Phương và Đặng Thị Hoàng Oanh (2016) về phân lập một số dòng vi khuẩn Lactobacillus (L. reuteri và L. fermentum) trong ruột cá tra để đánh giá tiềm năng phát triển các sản phẩm probiotic [16]. Nghiên cứu cho thấy 42 chủng đối kháng với E. ictaluri. Đặc biệt, một nghiên cứu gần đây đã cho thấy một số dòng vi khuẩn Lactobacillus được phân lập trong môi trường ao nuôi tôm có khả năng kháng khuẩn cao. Khi sử dụng thức ăn có bổ sung các dòng vi khuẩn này, tỉ lệ sống của tôm bị nhiễm vi khuẩn Vibrio 9 parahaemolyticus đã được cải thiện [17]. Theo Ngan và Ngoc (2015), trong quá trình nuôi tôm thẻ chân trắng L. vannamei, các probiotic Bacillus sp. (B2) và Bacillus amiloliquefaciens (B41) có vai trò quan trọng trong việc cải thiện chất lượng nước, giảm mật độ số vi khuẩn Vibrio trong nước từ đó góp phần làm tăng năng suất tôm nuôi. Ngoài ra, Bacillus subtillis B37 cũng được chứng minh có tác dụng tốt trong việc cải thiện chất lượng nước, giảm mật độ số Vibrio spp. trong môi trường ao nuôi. Ở ĐBSCL, người nuôi tôm cá thâm canh và bán thâm canh đã sử dụng probiotic để cải thiện đường ruột của tôm cũng như cải thiện môi trường nước từ nhiều thập kỉ qua. Những dòng vi khuẩn được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản được biết đến như là các dòng thuộc Bacillus spp., Lactobacillus spp., Thiobacillus spp., Pseudomonas stutzeri, Streptomyces spp…Nhìn chung việc sử dụng chế phẩm sinh học probiotic trong nuôi trồng thủy sản hiện nay theo hai hướng, bao gồm phối trộn vào thức ăn cho tôm, cá ăn hoặc là xử lý trực tiếp vào môi trường nước ao nuôi. Do đó, nghiên cứu phát triển những dòng vi khuẩn có lợi cũng như những chất bổ trợ (prebiotic) kích thích đặc biệt sự phát triển và định cư trong ruột của tôm là cực kỳ quan trọng trong điều kiện thâm canh và siêu thâm canh hóa hiện nay [18]. Tóm lại, tác dụng có lợi của việc sử dụng chế phẩm probiotic trong NTTS gồm:  Cải thiện hệ tiêu hóa tăng cường sức khỏe và ngăn chặn mầm bệnh Probiotic được dùng thay cho kháng sinh là một biện pháp khả thi bởi tăng cường hệ miễn dịch, ức chế sinh trưởng của vi sinh vật gây bệnh và có thể kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Các sản phẩm probiotic chứa các vi sinh vật còn có khả năng tiết ra các cơ chất hóa học có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh có trong ruột vật chủ do sản sinh ra kháng sinh bacteriocins, siderophores, các enzyme (lysozyme, protease) và hydrogen peroxide, cũng như làm thay đổi pH đường ruột do sinh ra các acid hữu cơ [19]. Chức năng của probiotic trong việc thúc đẩy quá trình tăng tưởng và sử dụng thức ăn cho động vật thủy sản liên quan đến khả năng tiêu hóa thức ăn. Hầu hết các probiotic cư trú ở vật chủ và ảnh hưởng đến quá trình tiêu hóa của vật chủ bằng việc tăng số lượng sinh khối và sản xuất ra các enzyme chuyển hóa thức ăn, cải thiện sự cân bằng vi khuẩn đường ruột và kết quả là quá trình tiêu hóa và hấp thu thức ăn được cải thiện [20]. 10  Cải thiện chất lượng nước Probiotic giúp phân hủy các chất hữu cơ trong nước (chất hữu cơ là một trong những nguyên nhân làm ô nhiễm môi trường nước), hấp thu xác tảo chết và làm giảm sự gia tăng của lớp bùn đáy, giảm các độc tố và mùi hôi trong môi trường nước, ổn định pH và màu của nước giúp tôm cá phát triển tốt. Từ đó, hạn chế số lần thay nước, giảm chi phí nuôi trồng. Các chủng probiotic thuộc chi Bacillus sẽ chuyển hóa các chất hữu cơ thành CO2 hiệu quả hơn vi khuẩn Gram âm [20]. Các chủng Nitrosomonas sp, Nitrobacter sp có khả năng làm giảm hoặc loại bỏ các hợp chất nitơ vô cơ độc hại như amoni, nitrite trong ao nuôi tôm [17]; ngoài ra một số chủng vi khuẩn quang hợp tía cũng làm giảm ô nhiễm hữu cơ và H2S dưới đáy các đầm ao nuôi tôm. PREBIOTIC Khái niệm về prebiotic Prebiotic hay còn gọi là chất sơ thực phẩm. Chúng không được cơ thể hấp thụ nhưng nó là nguồn cơ chất cho hệ vi khuẩn có lợi ở đại trực tràng. Đối với hệ thống tiêu hóa, các nghiên cứu đã chứng minh các chất prebiotic có khả năng ức chế sự xâm chiếm của các tác nhân gây bệnh khác, chống lại các bệnh ác tính và mãn tính của đường ruột, chống ung thư ruột, tăng cường sự hấp thu canxi và chất khoáng, loại bỏ các chất có chứa nito, tăng cường các đáp ứng miễn dịch. Chất xơ thực phẩm có nhiều trong trái cây, ngũ cốc, các loại rau, củ, quả, đậu, cám gạo, và chúng được chia thành hai loại là chất xơ không hòa tan và chất xơ hòa tan… - Chất xơ không hòa tan (insoluble fiber): Bao gồm cellulose, hemicellulose và lignin. Chúng là thành phần chính cấu tạo nên thành tế bào thực vật. - Chất xơ hòa tan (soluble fiber): Bao gồm pectin, oligosaccharide, các chất keo, agar và chất nhầy. Nguồn cung cấp chất xơ hòa tan tốt nhất là các loại trái cây, các loại rau xanh, vỏ quả họ cam, chanh, bã táo và quả dâu tây, cám kiều mạch, đại mạch, cám gạo, vỏ hạt, các loại đậu sấy khô và các sản phẩm từ đậu nành v.v. Chất xơ hòa tan khi đi qua ruột sẽ tạo ra thể đông làm chậm quá trình hấp thu một số chất dinh dưỡng vào máu và cũng làm tăng độ xốp, mềm của bã thải tiêu hóa. [21, 22, 23]. 11 - Chất xơ hòa tan oligosaccharide (OS) là carbohydrate, được cấu tạo từ 2 10 phân tử đường đơn. Các oligosaccharide chỉ chứa liên kết α- 1,4 glucoside được gọi là maltooligosaccharide. Khi chứa cả liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside chúng được gọi là oligosaccharide phân nhánh hay isomaltooligosaccharide. Các oligosaccharide thực phẩm được sản xuất hoặc bằng con đường thủy phân axit hoặc enzyme các polysaccharide thực vật. Trong NTTS, một số OS thường được dung để bổ sung vào thức ăn như fructooligosaccharide (FOS), glucooligossacharide (GOS), Manaoligosaccharide (MOS), transgalactooligosaccharide (TOS), Isomalto Oligosacarit (IMO), xylooligosacarit (XOS), Soyabean Oligosaccharides [22], [23]. Chúng có một số tinh chất sinh học đặc trưng là: + Không bị phân hủy bởi các enzyme trong dạ dày và ruột non; + Được sử dụng bởi nhóm vi khuẩn probiotic; + Làm thay đổi độ nhớt và điểm đông đặc của thực phẩm; + Có khả năng ổn định hệ vi khuẩn đường ruột; + Ức chế hoạt động của các vi khuẩn gây bệnh đường ruột do sinh ra các axit béo mạch ngắn như axit butyric; + Làm tăng khả năng hấp thu khoáng của cơ thể; + Đóng vai trò như chất giữ ẩm và kiểm soát hàm ẩm; + Có tính chất tương tự như chất xơ thực phẩm. Do vậy prebiotic để bổ sung vào chế độ ăn uống thông qua quá trình lên men có chọn lọc bởi các probiotic có lợi như Bifidobacteria, Lactobacillus, Bacteriodes… để tạo ra các hợp chất chuỗi ngắn như propionate, lactose và một số lipid để tăng sự hấp thu glucose và các nguyên tố vi lượng [24]. Ứng dụng của prebiotic trong NTTS Trong một nghiên cứu gần đây hơn cho hệ vi sinh vật đường ruột của con người, đã cập nhật cho prebiotic, đó là nghiên cứu của Gibson vào năm 2004. cho rằng một prebiotic có đầy đủ 3 tính chất: không bị thủy phân cũng như không hấp thu ở phần trên của đường tiêu hóa, là một chất nền chọn lọc hạn chế một hoặc một số về vi khuẩn có lợi cùng sống cho đại tràng, được kích thích để phát triển và được kích hoạt trao đổi chất [25][26]. Các prebiotic tiêu biểu bao gồm: Inulin, TOS, lactulose, isomaltooligosaccharides, lactosucrose, 12 xylooligosaccharides, oligosaccharides đậu tương và GOS. Theo tiêu chí của họ chỉ có ba trong số các polisacarit có thể được phân loại như prebiotic là inulin, TOS và lactulose [26]. Prebiotic thương mại, GroBiotic-A ® (bao gồm hỗn hợp của men bia, các thành phần sữa và quá trình lên men khô sản phẩm), đã được chứng minh là tăng cường sức đề kháng của cá Bass sọc lai, cá hồi vân và cá hồi vàng với nhiều loại vi khuẩn gây bệnh [27]. Chế độ ăn uống bổ sung GroBiotic ® -A cũng cải thiện tỷ lệ sống của tôm thẻ chân trắng Thái Bình Dương Litopenaeus vannamei được nuôi trong nước có độ mặn thấp (2ppt). Ngoài ra, thử nghiệm trên môi trường nước ngọt cũng cho thấy sự cải thiện tương tựtrong sự sống sót của tôm được cho ăn GroBiotic ® -A, mặc dù cơ chế để nâng cao tỷ lệ sống theo điều kiện độ mặn thấp chưa được xác định. Một cuộc điều tra khác gần đây với Litopenaeus vannamei cũng cho thấy rằng FOS trong chế độ ăn uống tăng cường sự hô hấp của tế bào máu, là một trong những biện pháp miễn dịch không đặc hiệc. Gần đây nhất, vào năm 2020 một nghiên cứu đã được thực hiện để đánh giá năng suất tăng trưởng của tôm (Penaeus monodon ) bằng cách áp dụng bổ sung vào môi trường nuôi prebiotic và probiotic. Thí nghiệm được thực hiện trong 95 ngày ở các trang trại nuôi tôm khác nhau ở ven biển quận Bagerhat, Bangladesh. Nghiệm thức T1 là Probiotic, T2 là prebiotic, T3 là kết hợp probiotic và prebiotic được thiết kế để tiến hành thử nghiệm. Kích thước của các ao thí nghiệm là 5 mẫu Anh và mật độ thả 4 con /m2 trong mỗi nghiệm thức. Thức ăn cho tôm của CP NASA (32% protein) là cho ba lần trong một ngày trong suốt thời gian nghiên cứu. Sau 95 ngày nuôi cấy, tối đa tăng cân được quan sát thấy ở T3 (33,78 ± 0,18 g) trong khi mức tăng cân tối thiểu là quan sát được ở nhóm đối chứng (25,69 ± 0,10 g). Tỷ lệ sống sót cao nhất ở T3 (89,01%) tiếp theo là T2 (75,51%) và T1 (53,44%) và tỷ lệ thấp nhất được quan sát thấy ở nhóm chứng (50,88%). Tổng sản lượng cao hơn ở T3 (833,78 kg/ha ) so với T2 (553,40 kg/ha ), T1 (447,84 kg/ ha ) và nhóm ĐC (310,57 kg/ha ). Giá trị pH được tìm thấy tối đa ở T3 (7,71 ± 0,08) và tối thiểu ở T1 (7,41 ± 0,10). Ngoài ra, giá trị TAN tối đa được tìm thấy là 2,22 ± 0,19 mg/L tại bể đối chứng và đạt giá trị tối thiểu ở T3 (0,32 ± 0,06 mg/L). Do đó, có thể kết luận rằng kết hợp sử dụng men vi sinh và prebiotic có thể là phương tiện đáng tin cậy