Luận văn thạc sĩ khoa học
MỞ ĐẦU
Nhân ngày Sức khỏe Thế giới 7/4/2011, tổ chức Y tế Thế giới WHO đã đưa ra
chủ đề “Chống kháng kháng sinh: không hành động hôm nay, không còn thuốc chữa
mai sau” nhằm thức tỉnh cộng đồng về vấn đề vi sinh vật kháng thuốc đang đe dọa toàn
cầu. Chống kháng kháng sinh không phải là vấn đề mới, nhưng đã trở nên cấp bách,
đòi hỏi nỗ lực tổng hợp giúp nhân loại tránh nguy cơ quay trở lại thời kỳ chưa có
kháng sinh.
Cho đến nay, các giải pháp đưa ra nhằm hạn chế tình trạng kháng kháng sinh
chưa phát huy tác dụng như mong đợi. Trong khi hướng phát triển các loại kháng sinh
mới đang trong tình trạng bế tắc, các nhà khoa học đã tìm ra một nguồn kháng sinh tự
nhiên đầy tiềm năng, đó là các peptide kháng khuẩn (antimicrobial peptides, AMPs).
Trong số các peptide này, cecropin chủ yếu được tách chiết từ côn trùng, có phổ kháng
khuẩn rộng và có nhiều tiềm năng ứng dụng nên thu hút được rất nhiều sự quan tâm
của các nhà khoa học.
Để sản xuất AMPs nói chung và cecropin nói riêng, có ba con đường tiếp cận
chính là (1) tách chiết từ tự nhiên (2) tổng hợp trực tiếp từ các axit amin theo con
đường hóa học và (3) biểu hiện protein tái tổ hợp. Tuy nhiên, với yêu cầu thu được
lượng lớn cecropin tinh khiết, hai phương pháp đầu đều có giá thành cao và khó áp
dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm ở các nước đang phát triển như Việt Nam. Vì
vậy, với mong muốn giảm chi phí và chủ động trong việc sản xuất cecropin được phân
lập từ côn trùng ở Việt Nam cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi tiến hành đề tài
“Tách dòng và biểu hiện cecropin trong các hệ vector khác nhau”. Đây là một
hướng nghiên cứu còn khá mới ở Việt Nam nhưng hứa hẹn nhiều triển vọng. Đề tài
được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y và Phòng Genomic, Trường Đại học Khoa
học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Ngô Thị Hà
1
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về tình hình kháng kháng sinh
1.1.1. Thực trạng kháng kháng sinh
Kháng kháng sinh là hiện tượng vi sinh vật (virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng)
có khả năng vô hiệu hóa tác dụng của thuốc kháng sinh mà trước đó chúng vẫn mẫn
cảm [63, 79]. Khi các loại thuốc mất tác dụng điều trị, vi sinh vật gây bệnh vẫn tồn tại
và phát triển khiến bệnh lây lan nhanh ra cộng đồng thành dịch bệnh rất khó kiểm soát.
Đặc biệt các nước nghèo và các nước đang phát triển phải đối mặt với hậu quả vô cùng
nghiêm trọng do gánh nặng điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và những chi phí bắt buộc
cho việc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới đắt tiền. Thực trạng
kháng kháng sinh đã, đang và sẽ là vấn đề mang tính toàn cầu, thách thức toàn nhân
loại. Điều này đã được Tổng giám đốc WHO Margaret Chan nhận định nhân ngày Sức
khỏe Thế giới 7/4/2011: “Một trong những mối quan ngại hàng đầu trong việc chăm
sóc sức khỏe y tế hiện nay chính là tình trạng bệnh kháng thuốc kháng sinh. Đây chính
là nguy cơ hàng đầu gây thách thức trong công tác chăm sóc y tế và kiểm soát các bệnh
truyền nhiễm, đồng thời làm tăng chi phí chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng”.
Năm 1928 được coi là mốc quan trọng đầu tiên đánh dấu cho công cuộc tìm
kiếm thuốc kháng sinh khi Alexander Fleming (1881-1955) phát hiện ra penicillin [72,
75]. Tuy nhiên, hơn 60 năm sau khi phát hiện và gần 50 năm sau khi penicillin được
đưa vào sản xuất ở quy mô công nghiệp, trên thế giới đã xuất hiện hơn 95% chủng
Staphylococcus aureus kháng lại penicillin và 60% kháng lại dạng dẫn xuất của nó là
methicillin [7]. Ngày nay, vi khuẩn không chỉ kháng lại penicillin mà còn kháng nhiều
loại kháng sinh khác và trở thành mối đe dọa thực sự đối với sức khoẻ nhân loại. Theo
thống kê năm 2006 của WHO, 5 vi khuẩn có tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất hiện nay
là Klebsiella (15.1%), E. coli (13.3%), P. aeruginosa (13.3%), Acinetobacter spp
Ngô Thị Hà
2
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
(9.9%) và S. aureus (9.3%). Nhóm thuốc cephalosporin thế hệ thứ tư có tỷ lệ kháng cao
đặc biệt từ 66-83%, tiếp theo là nhóm kháng sinh aminosid và fluoroquinolon có tỷ lệ
kháng xấp xỉ trên 60%. Báo cáo của WHO cho biết, số quốc gia có bệnh lao kháng
thuốc tăng từ 58 trong năm 2010 lên 69 trong năm 2011. Mỗi năm, thế giới có khoảng
440,000 ca mới nhiễm lao đa kháng thuốc, ít nhất 150,000 ca tử vong vì loại vi khuẩn
này [79]. Tính riêng ở các nước thuộc liên minh châu Âu EU thì cứ mỗi năm có
khoảng 25,000 người chết vì các loài vi khuẩn đa kháng thuốc [80]. Các kháng sinh thế
hệ mới đắt tiền, thậm chí cả một số kháng sinh thuộc nhóm “lựa chọn cuối cùng” cũng
đang mất dần hiệu lực [1]. Bằng chứng mới đây nhất là sự lây lan của chủng vi khuẩn
kháng carbapenem (NDM-1) ở một số nước châu Âu và châu Á. Loại “siêu vi khuẩn
kháng thuốc” này tiết ra enzyme NDM-1 có thể kháng lại hầu hết mọi loại thuốc kháng
sinh, kể cả nhóm kháng sinh mạnh nhất là carbapenem [7, 79]. Các nhà khoa học lo
ngại “siêu vi khuẩn” có thể lan ra khắp thế giới, đồng thời khẳng định trong tương lai
gần chưa có loại thuốc nào có khả năng tiêu diệt được. Kháng kháng sinh không chỉ
ảnh hưởng tới lĩnh vực y tế mà nó còn tác động sâu sắc đến nền kinh tế. Theo ước tính
của WHO, ở Mỹ mỗi năm chi phí y tế cho thuốc điều trị nhiễm khuẩn xấp xỉ 20 tỉ $;
còn với khối EU là 1.5 tỉ € [80]. Vì vậy, kháng kháng sinh giờ đã trở thành vấn đề
mang tính toàn cầu.
Hiện nay, tình hình kháng kháng sinh ở Việt Nam cũng diễn biến hết sức phức
tạp. Theo báo cáo của Bộ Y tế trong năm 2008 thì nhiễm khuẩn chiếm tỷ lệ tử vong cao
thứ hai (16.7%) chỉ sau bệnh về tim mạch (18.4%). Báo cáo kết quả nghiên cứu ở 19
bệnh viện ở Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh và Hải Phòng trong hai năm (2009-2010)
về tình trạng kháng kháng sinh cho thấy, có 4 chủng vi khuẩn kháng kháng sinh thường
gặp là Acinetobacter spp, Pseudomonas spp, E. coli và Klebsiella. Hầu hết các kháng
sinh thông thường như: penicillin, tetracycline, streptomycine, … đã bị kháng. Theo
báo cáo “Phân tích thực trạng: sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh ở Việt Nam”
Ngô Thị Hà
3
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
do nhóm nghiên cứu Quốc gia của Việt Nam thuộc tổ chức hiệp hội kháng kháng sinh
toàn cầu (GARP, Global Antibiotic Resistance Partnership) vào tháng 10 năm 2010 thì
tình trạng kháng kháng sinh ở nước ta đáng báo động [1]. Bằng chứng là tỷ lê ê chủng
Streptococcus pneumoniae, một trong những nguyên nhân chính gây nhiễm khuẩn hô
hấp, kháng penicillin là 71.4%, kháng erythromycin là 92.1%. Đây là tỉ lệ kháng cao
nhất trong số 11 nước trong mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á
(ANSORP) năm 2000-2001. Năm 2009 tỷ lê ê các chủng vi khuẩn Gram âm kháng với
ceftazidime là 42%, kháng với gentamicin là 63% và kháng với axit nalidixic là 74% ở
cả bệnh viện và trong cộng đồng. Xu hướng gia tăng của tình trạng kháng kháng sinh
cũng thể hiện rõ rệt. Những năm 1990, tại thành phố Hồ Chí Minh, chỉ có 8% các
chủng pneumococcus kháng với penicillin. Đến năm 1999-2000, tỉ lệ này đã tăng lên
56% [1]. Chính vì tình trạng kháng kháng sinh ngày càng có xu hướng tăng lên như
vậy mà Việt Nam đã bị WHO xếp vào nhóm nước có tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất
thế giới (WHO, 2008). Thực trạng phức tạp này không chỉ đặt ra cho ngành y tế Việt
Nam nhiều thách thức mà còn đòi hỏi cả xã hội phải cùng nhau hành động để có thể
làm giảm bớt tình trạng kháng kháng sinh.
1.1.2. Nguyên nhân và giải pháp cho tình trạng kháng kháng sinh
Để hiểu rõ căn nguyên của tình trạng kháng kháng sinh, báo cáo của WHO
trong ngày sức khỏe thế giới 7/4/2011 đã tổng kết 6 nguyên nhân chính dẫn đến tình
trạng kháng kháng sinh cao như sau [79]:
Thứ nhất, kháng thuốc là một hiện tượng tiến hóa tự nhiên. Khi vi sinh vật tiếp
xúc với các chất có khả năng tiêu diệt chúng, những vi sinh vật “may mắn” sống sót sẽ
tự tạo ra những cơ chế tự vệ tránh được tác dụng của các chất này. Từ đó các thế hệ vi
sinh vật kháng thuốc được hình thành. Không những thế, gen kháng thuốc có thể được
Ngô Thị Hà
4
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
truyền ngang từ cá thể này sang cá thể khác nên vi sinh vật kháng thuốc ngày càng
nhiều. Nguyên nhân này là quy luật tự nhiên nên khó có giải pháp ngăn chặn.
Tuy nhiên, 4 nguyên nhân tiếp theo lại xuất phát chủ yếu từ phía con người. Đó
chính là: sử dụng thuốc không hợp lý; chất lượng thuốc kém; công tác phòng ngừa,
kiểm soát bệnh lây truyền yếu và thiếu hệ thống giám sát. Chính những nguyên nhân
này thúc đẩy nguyên nhân đầu tiên diễn ra nhanh hơn và góp phần không nhỏ dẫn đến
tình trạng kháng kháng sinh hiện nay. Vì vậy, muốn tình trạng kháng kháng sinh giảm
xuống thì chính chúng ta phải có những hành động tích cực ngay ngày hôm nay.
Nguyên nhân cuối cùng dẫn tới tình trạng kháng kháng sinh ngày càng trầm
trọng chính là các công cụ mới chống lại sự kháng thuốc ngày càng cạn kiệt. Các loại
thuốc kháng sinh đang mất dần tác dụng. Trong khi đó, sự phát triển các loại kháng
sinh thế hệ mới ngày càng thu hẹp.
Hình 1. Lịch sử phát hiện
thuốc kháng sinh.
Nhìn vào Hình 1
chúng ta thấy hàng loạt các thuốc kháng sinh được tìm ra chủ yếu trong khoảng từ năm
1940 đến năm 1970. Có thể nói đây là thời đại hoàng kim của thuốc kháng sinh. Tuy
nhiên, từ những năm 1980 trở lại đây số lượng thuốc kháng sinh mới rất hiếm. Điều
này đặt ra mối lo ngại có phải nguồn kháng sinh đã cạn kiệt? Thêm vào đó nếu tình
trạng kháng kháng sinh ngày càng gia tăng như hiện nay thì liệu rằng những thế hệ
tương lai sẽ còn được hưởng những lợi ích mà kháng sinh mang lại? Đây chính là mối
băn khoăn chính được đưa ra trong Ngày sức khỏe thế giới năm nay.
Một trong những giải pháp nhằm đáp ứng nguồn kháng sinh mới là khai thác
các peptide kháng khuẩn AMPs (antimicrobial peptides) [7, 79]. Hàng loạt nghiên cứu
Ngô Thị Hà
5
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
đã chỉ ra rằng cơ thể của các sinh vật đều mang trong mình một hệ thống các peptide
có khả năng kháng khuẩn [22, 30]. Chúng có đầy đủ tiềm năng để trở thành nguồn
nguyên liệu quý giá mà con người có thể khai thác trong “thời đại kháng kháng sinh”
hiện nay [28, 49].
1.2. Peptide kháng khuẩn (AMPs)
1.2.1. Giới thiệu chung về AMPs
Tất cả các cơ thể đa bào đều tiến hóa qua hàng triệu năm trong môi trường có
nhiều loại vi sinh vật. Mặc dù thường xuyên tiếp xúc với các mầm bệnh qua những con
đường khác nhau nhưng nhiều loài sinh vật vẫn không có sự bảo vệ của kháng thể hoặc
các tế bào miễn dịch [30, 57]. Lý do mà chúng có thể tồn tại được là nhờ hệ miễn dịch
bẩm sinh tạo ra bởi hàng loạt AMPs tham gia đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu [20,
28]. Một thực tế quan trọng là các mầm bệnh vi sinh vật dường như không hình thành
tính kháng với các peptide này. Đây cũng chính là một trong những lý do để các nhà
nghiên cứu và các hãng dược phẩm tin tưởng rằng AMPs sẽ trở thành liệu pháp chữa
bệnh mới thay thế cho các loại thuốc kháng sinh dễ bị vi sinh vật gây bệnh kháng lại
[22, 45, 70].
1.2.1.1. Hoạt tính sinh học của AMPs
AMPs có hoạt tính kháng lại vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, vi rút, nấm, kí sinh
trùng [20, 28, 37, 48]. Tùy thuộc vào loại AMPs mà có hoạt tính kháng mạnh hay yếu,
phổ tác dụng rộng hay hẹp. Ngoài ra, một số loại AMPs còn có hoạt tính kháng viêm,
diệt tế bào ung thư và đảm nhiệm các chức năng nhất định trong hệ thống miễn dịch
bẩm sinh cũng như hệ thống miễn dịch tiếp thu [28, 30].
Ngô Thị Hà
6
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
1.2.1.2. Sự đa dạng của AMPs
AMPs được tìm thấy trong nhiều mô và cơ quan khác nhau ở tất cả các giới, các
ngành sinh vật, từ prokaryote cho đến con người [28, 60]. Tuy nhiên, hiện nay các nhà
nghiên cứu chủ yếu tập trung phân tích AMPs có nguồn gốc từ sinh vật nhân chuẩn.
Đến nay đã có khoảng 800 loại AMPs khác nhau được tìm thấy ở các sinh vật nhân
chuẩn [37]. Dựa vào mức độ tương đồng về độ tích điện, trình tự, chức năng và cấu
trúc không gian, AMPs được chia thành các nhóm như sau [4, 9]:
Nhóm peptide là phân đoạn của các protein lớn hơn: Các peptide này
được tạo ra do protein lớn hơn bị phân cắt bởi enzyme. Trong số các peptide thuộc
nhóm này, peptide được quan tâm nhiều nhất là lactoferricin được tạo ra khi lactoferrin
(một protein có hoạt tính kháng khuẩn, được tiết chủ yếu ở các mô nhầy) bị phân cắt
bởi enzyme pepsin. Các nghiên cứu cho thấy lactoferricin là peptide có hoạt tính kháng
khuẩn phổ rộng [62].
Nhóm peptide tích điện âm: Lần đầu tiên vào năm 1992, các nhà khoa
học đã phân lập được 3 peptide kích thước nhỏ (721.6 đến 823.8 Da) tích điện âm từ
cừu có hoạt tính kháng lại Mannheimia haemolytica, Escherichia coli và Klebsiella
pneumoniae [8]. Đến nay các nhà nghiên cứu đã tìm ra được rất nhiều loại peptide
kháng khuẩn tích điện âm từ lưỡng cư (maximin H5), từ người (dermcidin) [9].
Nhóm peptide tích điện dương: Đây là nhóm peptide đầu tiên được
nghiên cứu và cũng là nhóm lớn nhất, có mặt ở cả động vật lẫn thực vật trong đó phần
lớn được phân lập từ các loài côn trùng [5]. Một số loại peptide kháng khuẩn tích điện
dương điển hình như cecropin, andropin, moricin, ceratotoxin, melittin từ côn trùng
hay magainin, dermaseptin, brevinin-1, esculentins, buforin II từ lưỡng cư [9].
1.2.1.3. Tiềm năng ứng dụng của AMPs
Ngô Thị Hà
7
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
Cho đến nay, bên cạnh việc phát triển để thay thế dần các loại kháng sinh đã bị
kháng, AMPs còn hứa hẹn trở thành liệu pháp chữa trị ung thư mới đầy hiệu quả [42,
58, 64]. Hơn nữa, các gen mã cho AMPs là một nguồn gen quan trọng để tạo nên các
sinh vật chuyển gen có khả năng kháng lại mầm bệnh. Thực tế cho thấy hàng loạt các
loại thực vật và động vật chuyển gen mã cho AMPs đã được tạo ra [27, 47]. Riêng
trong lĩnh vực phát triển thuốc kháng sinh thế hệ mới từ AMPs đã thu được những kết
quả khả quan. Rất nhiều loại AMPs đã được các hãng dược phẩm đưa vào sản xuất, thử
nghiệm và một số loại đã được thương mại hóa (Bảng 1) [22].
Bảng 1. Các loại AMPs và tương tự AMPs được sản xuất thương mại [22].
Tên hãng
sản xuất
AM-Pharma
(Phần Lan)
Ngô Thị Hà
Tên thuốc
hLF-1-11 (petide nhỏ có
nguồn gốc từ lactoferrin
người)
Giai đoạn
phát triển
Phase II
8
Sử dụng trong y học
Các nhiễm trùng liên
quan đến cấy ghép tủy
xương cùng loài
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
Ceragenix
(Denver)
CSA-13 (steroid tích điện
dương bắt chước các
peptide thuộc hệ thống
bảo vệ cơ thể)
Tiền thử nghiệm
lâm sàng
Chống nhiễm khuẩn
Helix
Biomedix
(USA)
HB-50 (peptide tổng hợp
tự nhiên bắt chước
cecropin)
HB-107 (đoạn dài 19 axit
amin của cecropin B)
Tiền thử nghiệm
lâm sàng
Chống nhiễm khuẩn
Tiền thử nghiệm
lâm sàng
Chữa lành vết thương
Inimex
(Canada)
IMX942 (peptide dài 5
axit amin)
Trong quá trình
tối ưu hóa
Điều chỉnh hệ miễn dịch;
điều trị sốt và giảm bạch
cầu trung tính ở bệnh
nhân hoá trị liệu
Lytix
Biopharma
(Na Uy)
Chưa công bố
Phát minh
Chống nhiễm khuẩn và
ung thư
Novacta
Biosystems
Ltd.
(Anh)
Mersaxitin (bacteriocin)
Tiền thử nghiệm
lâm sàng
Kháng vi khuẩn Gram
dương
Novozymes
A/S
(Đan Mạch)
Plectasin
(defensin của nấm)
Tiền thử nghiệm
lâm sàng
Kháng các loại vi khuẩn
Gram dương, đặc biệt
trong trường hợp nhiễm
phế cầu khuẩn và khuẩn
liên cầu
Pacgen
(Canada)
PAC113 (dựa trên đoạn
hoạt động của histatin 5protein được tìm thấy
trong nước bọt của người)
Được phê chuẩn
là loại thuốc mới
nghiên cứu
Thuốc uống điều trị
chứng sưng tấy do nấm
lan trong âm đạo, ruột,
miệng hoặc da
1.2.2. Peptide kháng khuẩn tích điện dương (CAMPs) và cecropin
1.2.2.1. Giới thiệu chung về CAMPs
Ngô Thị Hà
9
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
CAMPs được định nghĩa là các peptide có từ 12-50 axit amin với điện tích +2
đến +9 do có đuôi lysine hoặc arginine và có tới 50% là các axit amin kỵ nước [11, 38].
Trong số 3 nhóm peptide kháng khuẩn đã trình bày ở trên thì đây là nhóm được quan
tâm rất nhiều do các đặc điểm: (1) có mặt ở hầu hết các loài sinh vật; (2) có phổ kháng
khuẩn rộng; (3) vi sinh vật khó hình thành tính kháng và (4) có mức độ đa dạng cao
giữa các sinh vật. Đặc điểm này giúp CAMPs có tiềm năng phát triển thành các loại
thuốc khác nhau [14, 28, 63]. Đến nay, đã có khoảng hơn 600 CAMPs được phát hiện
từ vi sinh vật cho đến con người [38]. Từ những năm 1990, các hãng dược phẩm lớn
trên thế giới như Magainin Pharmaceuticals (Plymouth Meeting, PA), XOMA (Santa
Monica, CA), Demegen (Durham, NC), IntraBiotics Pharmaceuticals (Mountain View,
CA), … đã nhận thấy nhóm CAMPs mang nhiều triển vọng và tập trung phát triển để
sản xuất thành thuốc thương mại (Bảng 2) [7].
Bảng 2. Một số sản phẩm từ CAMPs được các công ty sản xuất phát triển phục vụ
điều trị bệnh [7].
Công ty sản xuất
Sản phẩm
Giai đoạn
phát triển
Magainin Pharmaceuticals
(Plymouth Meeting, PA)
Pexiganan, 1 loại CAMPs có nguồn gốc Hoàn thành
từ da ếch
phase III
Micrologix Biotech
(Vancouver, BC, Canada)
Đoạn 12 axit amin 1 loại CAMPs của
loài động vật có vú có khả năng chống
nhiễm khuẩn máu
Phase II
XOMA Corporation
(Santa Monica, CA)
CAMPs BPI dùng để kháng Neisseria
meningitidis
Phase III
Dựa vào đặc điểm về cấu trúc cuộn gấp, CAMPs có thể được phân thành 4 lớp:
lớp peptide dạng phiến gấp nếp được làm bền bởi 2 đến 4 cầu disulfit (ví dụ như ,
-defensin, plectasin, protegrins); lớp peptide dạng xoắn (ví dụ như LL-37, cecropin,
magainin); lớp peptide có cấu trúc giàu glycine, proline, tryptophan, arginine và hoặc
Ngô Thị Hà
10
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
histidine (ví dụ như indolicidin); lớp peptide dạng loop với 1 cầu disulfide (ví dụ như
bactenecin) [22].
1.2.2.2. Peptide kháng khuẩn cecropin
Cecropin là peptide kháng khuẩn đầu tiên được phân lập và nghiên cứu một
cách đầy đủ nhất [31, 45]. Cecropin được phân lập lần đầu tiên (năm 1981) từ loài
bướm đêm Hyalophora cecropia sau khi bị nhiễm với vi khuẩn [55]. Kể từ đó, người ta
nhận thấy cecropin hay các peptide tương tự cecropin cũng tồn tại ở các loài côn trùng
khác, chủ yếu thuộc Bộ Cánh phấn và Bộ Hai cánh [14, 55]. Hàng loạt các loại
cecropin đã được phân lập từ nhiều loài côn trùng ở các vùng địa lý khác nhau và được
nghiên cứu chi tiết để có những hiểu biết đầy đủ trước khi đưa vào ứng dụng thực tế.
1.2.2.2.1. Các đặc trưng về cấu trúc của cecropin
Kết quả so sánh trình tự axit amin cho thấy cecropin của các loài thuộc Bộ Hai
cánh có độ tương đồng hơn 70%. Đặc biệt cecropin IA (sarcotoxin IA) của loài nhặng
xanh Sarcophaga peregrina có độ tương đồng đến 100% với cecropin A của loài ruồi
giấm Drosophila melanogaster. Trong khi đó, cecropin của các loài thuộc Bộ Cánh
phấn lại có trình tự ít tương đồng với nhau hơn [13]. Trình tự axit amin của một số
cecropin được trình bày trong Bảng 3.
Bảng 3. Trình tự axit amin của một số cecropin [13].
Loài
Ngô Thị Hà
Trình tự axit amin
11
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
Drosophila melanogaster
Cecropin A
GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR
Sarcophaga peregrina
Sarcotoxin IA
GWLKKIGKKIERVGQHTRDATIQGLGIAQQAANVAATAR
Aedes aegypti
Cecropin A
GGLKKLGKKLEGAGKRVFNAAEKALPVVAGAKALRK
Aedes albopictus
Cecropin A1
GGLKKLGKKLEGVGKRVFKASEKALPVAVGIKALGK
Hyalophora cecropia
Cecropin A
KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK
Bombyx mori
Cecropin D
GNFFKDLEKMGQRVRDAVISAAPAVDTLAKAKALGQ
Các phân tích cho thấy cecropin ngay sau khi tổng hợp thường có từ 62-64 axit
amin. Trong đó, 20-26 axit amin ở đầu tận cùng amino không xuất hiện trong phân tử
cecropin trưởng thành. Chúng có thể đóng vai trò như trình tự peptide dẫn. Phân tử
cecropin trưởng thành thường gồm khoảng 29-42 axit amin, không chứa cystein [5]. Cấu
trúc bậc hai điển hình của cecropin là xoắn α-helix (Hình 2). Đặc biệt, hầu hết các phân tử
cecropin đều mang tính lưỡng cực cho phép cecropin tương tác dễ dàng với màng tế bào
[28]. Phân tích cấu trúc của cecropin A bằng phương pháp khối phổ cộng hưởng từ cho
thấy peptide này có một đầu N-terminal dài, dạng xoắn lưỡng cực (từ vị trí 5 đến 21)
và một đuôi ngắn hơn nhưng kị nước ở đầu xoắn C-terminal (từ vị trí 24 đến 37); hai
vùng này nối với nhau thông qua khớp nối Gly-Pro [23]. Hình ảnh về cấu trúc không
gian của cecropin A được minh họa trên Hình 2.
Ngô Thị Hà
12
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
Khớp nối Gly-Pro
Hình 2. Cấu trúc cecropin A của Hyalophora cecropia phân tích bằng khối phổ cộng
hưởng từ [23].
1.2.2.2.2. Đặc điểm nổi bật của cecropin
Là một peptide kháng khuẩn tích điện dương điển hình, cecropin mang nhiều
đặc điểm nổi bật hứa hẹn nhiều tiềm năng ứng dụng.
Cecropin có phổ hoạt tính kháng khuẩn rộng: Nhìn chung các nhà nghiên
cứu đều thống nhất rằng cecropin có phổ hoạt tính rộng bao gồm vi khuẩn Gram âm, vi
khuẩn Gram dương, nấm, một số virus và kí sinh trùng [14, 26, 32, 36, 60, 61, 66].
Trong khi đó, một số loại AMPs khác có phổ hoạt tính hẹp ví dụ như attacin và
diptericin chỉ có hoạt tính kháng lại vi khuẩn Gram âm hay drosomycin chỉ có hoạt tính
kháng lại nấm [57]. Đây là đặc điểm mà bất cứ nhà nghiên cứu hoặc các hãng dược
phẩm nào cũng mong muốn thu được từ sản phẩm của mình. Nhìn chung, hoạt tính
Ngô Thị Hà
13
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
kháng khuẩn của cecropin đối với vi khuẩn Gram âm thường hiệu quả hơn so với vi
khuẩn Gram dương [13].
Cấu trúc phù hợp với hoạt tính kháng khuẩn: Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng
những đặc điểm như thành phần axit amin, cấu trúc không gian, độ tích điện và tính
lưỡng cực của cecropin có đặc điểm hoàn hảo cho hoạt tính kháng khuẩn. Cụ thể là:
Cecropin có cấu trúc lưỡng cực, dạng xoắn α-helix mà những peptide có cấu
trúc dạng này thường có hoạt tính mạnh hơn các peptide có cấu trúc bậc 2 không rõ
ràng khác. Mặt khác, cấu trúc dạng xoắn α-helix giúp peptide bền, ít bị các tác động
làm ảnh hưởng đến hoạt tính [35]. Thực nghiệm cho thấy nhờ cấu trúc này mà cecropin
vẫn giữ được hoạt tính sau khi ủ ở 1000C tới 10 phút hoặc lâu hơn nữa [41]. Không
những thế, do có cấu trúc lưỡng cực nên cecropin có khả năng tan trong nước hoặc
trong lớp màng lipit kép rất tốt. Nhờ vậy, cecropin có thể dễ dàng tương tác với các
thành phần ưa nước và kị nước của vi sinh vật hơn [35].
Cecropin là peptide tích điện dương nên thường có hoạt tính kháng khuẩn cao
hơn hẳn so với các peptide trung hòa khác [9, 39]. Hơn nữa, trong khi các peptide tích
điện âm cần cofactor kẽm để hoạt động thì các peptide tích điện dương như cecropin
không cần đến. Đặc biệt, cecropin còn đảm nhiệm nhiều chức năng khác của hệ miễn
dịch bẩm sinh [4, 10]. Do tích điện dương nên cecropin có khả năng cô lập cấu tử
Lipopolysacharite (LPS) của vi khuẩn Gram âm. Chính những cấu tử này hoạt động
như nội độc tố gây ra hiện tượng nhiễm trùng. Ngoài ra nhờ tích điện dương, cecropin
còn có tính hóa ứng động cao giúp thu hút và tập trung các tế bào trình diện kháng
nguyên, nhờ đó làm thúc đẩy các phản ứng của hệ miễn dịch tiếp thu [19, 30, 70]. Như
vậy, ngoài hoạt tính kháng khuẩn, cecropin còn đóng vai trò quan trọng trong hệ thống
miễn dịch bẩm sinh và hệ thống miễn dịch tiếp thu.
Ngô Thị Hà
14
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
Đích tác động của cecropin làm vi sinh vật khó hình thành tính kháng:
Khác với các thuốc kháng sinh truyền thống, các AMPs nói chung và cecropin nói
riêng có đích tác động chủ yếu là cấu trúc màng tế bào vi sinh vật. Chúng sẽ tuơng tác,
phá vỡ cấu trúc màng, qua đó làm dung giải tế bào [12]. Với những đặc điểm về thành
phần axit amin, tính lưỡng cực, độ tích điện và kích thước, cecropin có thể tương tác
với màng tế bào của vi sinh vật theo bốn mô hình như mô tả ở Hình 3 [28].
Hình 3. Một số mô hình tương tác của cecropin với màng tế bào vi sinh vật. Trong
hình, lớp kép lipit của màng tế bào: màu vàng; peptide cecropin: hình trụ; vùng ưa
nước của cecropin: màu đỏ; vùng kị nước: màu xanh; A: mô hình “tập hợp”; B: mô
hình “lỗ hình xuyến”; C: mô hình “thùng thủng lỗ”; D: mô hình “tấm thảm” [28].
Trong mô hình “tập hợp” (A), các phân tử cecropin tạo thành cầu qua màng như
một tập hợp giống phức mixen của các peptide và lipit. Đối với mô hình “lỗ hình
xuyến” (B), cecropin dạng xoắn chèn vào màng, lớp đơn lipit bị uốn cong liên tục làm
Ngô Thị Hà
15
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
cho vùng trung tâm chứa nước bị đầy bởi các peptide chèn vào và các đầu lipit. Trong
mô hình “thùng thủng lỗ” (C), cecropin xoắn hình thành một bó trong màng với lỗ
hổng ở giữa giống như một cái thùng. Với mô hình “tấm thảm” (D), cecropin tập hợp ở
bề mặt lớp kép và có xu hướng song song với bề mặt màng. Do tích điện dương nên
cecropin hấp dẫn các nhóm phospholipit tích điện âm ở nhiều vị trí rồi bao lấy màng tế
bào theo kiểu trải thảm.
Trong nhiều thập kỷ, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu hoạt tính phá vỡ
thành và màng tế bào vi khuẩn của cecropin A. Năm 2003, nghiên cứu của Hong và cs.
thuộc trường đại học Y Pennsylvania chỉ ra rằng, ở liều lượng thấp cecropin A không
đủ để giết tế bào vi khuẩn thông qua cơ chế tác động màng, nhưng đủ để tác động đến
phiên mã của các gen. Trong số 26 gen chịu tác động có 11 gen mã cho các protein
mang chức năng quan trọng của vi khuẩn [24]. Vi khuẩn không có khả năng thay đổi
bộ máy di truyền của chúng; điều này giải thích tại sao vi khuẩn rất khó hình thành tính
kháng lại với cecropin A. Không những thế, nghiên cứu của Wachinger và cs. đã chỉ ra
rằng một số loại cecropin tác động tới chu kì nhiễm bệnh của virus HIV bằng cách ức
chế biểu hiện gen HIV-1, qua đó làm ảnh hưởng tới quá trình nhân lên của virus HIV
[61]. Vì vậy, đến nay các nhà khoa học đã khẳng định rằng màng tế bào không phải là
đích tác động duy nhất để cecropin giết vi sinh vật. Cecropin có thể tác động tới vi sinh
vật bằng cách thay đổi hình dạng vách ngăn màng tế bào chất, ức chế tổng hợp thành tế
bào, ức chế tổng hợp axit nucleic, ức chế tổng hợp protein và ức chế hoạt động enzyme
như minh họa ở Hình 4 [28].
Ngô Thị Hà
16
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
Hình 4. Các đích tác động khác của cecropin ngoài màng tế bào [28].
Không gây hại đến tế bào thực vật, động vật và con người: Với nhiều tiềm
năng phát triển thành một liệu pháp chữa trị lí tưởng thì một câu hỏi quan trọng được
đặt ra là liệu cecropin có gây độc đối với tế bào nhân chuẩn không và cách thức mà
chúng chọn lọc đích tác động như thế nào?
Kết quả các nghiên cứu kiểm tra tính an toàn của cecropin đã đưa ra câu trả lời
đầy khả quan là phần lớn các cecropin không gây độc đối với tế bào nhân chuẩn [43,
70]. Ví dụ như năm 1996, Moore và cs. đã kiểm tra khả năng làm tan hồng cầu người
của cecropin B có nguồn gốc từ bướm đêm Hyalophora cecropia (một trong số các loại
cecropin có hoạt tính mạnh nhất). Kết quả thu được cho thấy ở nồng độ cecropin B rất
cao là 500 M (cao hơn hàng triệu lần so với nồng độ diệt các vi sinh vật khác) vẫn
không quan sát thấy hiện tượng hồng cầu người bị tan [43]. Ngoài ra, cecropin không
Ngô Thị Hà
17
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
gây ảnh hưởng đến hình thái, tốc độ tăng sinh và đặc tính biệt hóa của các dòng tế bào
nuôi cấy [42, 58, 64]. Một trong những giả thuyết giải thích cơ chế chọn lọc đích tác
động của AMPs nói chung và của cecropin nói riêng là dựa vào sự khác biệt về cấu
trúc màng tế bào [21]. Không giống như màng tế bào nhân sơ, màng tế bào nhân chuẩn
có thành phần cholesterol giúp cho các phân tử phospholipit kép co đặc hơn, do đó
màng tế bào trở nên bền vững khiến cecropin rất khó tạo ra lỗ hổng trên bề mặt màng.
Ngoài ra, chính sự phân bố một cách bất đối xứng các phân tử phospholipit tích điện
âm và trung hòa tại hai lớp màng đơn cũng là nguyên nhân giúp màng tế bào nhân
chuẩn không nhạy cảm với cecropin.
Khả năng giết tế bào ung thư một cách chọn lọc: Hoạt tính kháng ung thư của
cecropin đã được quan tâm rất sớm với những nghiên cứu của Moore và cs. (1994).
Trong điều kiện in vivo, cecropin B giúp kéo dài thời gian sống sót của những con
chuột bị ung thư cổ trướng ác tính. Trong thử nghiệm in vitro, cecropin B có hoạt tính
làm tan bào đối với các dòng tế bào ung thư vú và ung thư buồng trứng ở người [42].
Tiếp đó, năm 2008 nghiên cứu của Suttmann và cs. cho thấy cecropin B có khả năng ức
chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư bàng quang, phá hủy cấu trúc màng tế bào và
gây chết đối với các tế bào ung thư (Hình 5) [58].
Ngô Thị Hà
18
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
Hình 5. Hoạt tính của cecropin B lên tế bào ung thư bàng quang. A: tế bào ung thư
bàng quang 486P không bị xử lý với cecropin B; B: tế bào ung thư bàng quang 486P bị
xử lý với cecropin B ở nồng độ 65 µM [58].
Kết quả nghiên cứu mới nhất được công bố năm 2010 của Xiaobao và cs. cho
thấy cecropin của Musca domestica có khả năng ức chế sự phát triển của dòng tế bào
gan ung thư biểu mô BEL-7402. Đặc biệt, cecropin không làm ảnh hưởng tới sự phát
Ngô Thị Hà
19
K18 Sinh học
Luận văn thạc sĩ khoa học
triển của các tế bào gan lành xung quanh [64]. Kết quả ở Hình 6 cho thấy khi xử lý tế
bào ung thư với cecropin ở nồng độ càng cao (từ 25 µM đến 100 µM) thì số lượng tế
bào ung thư bị tiêu diệt càng nhiều.
Hình 6. Hình thái học của các tế bào BEL-7402 khi xử lý với cecropin ở các nồng độ
khác nhau được phân tích bằng kính hiển vi điện tử (A) và bằng phương pháp TUNEL
(B) [64].
Cecropin có khả năng giết các tế bào ung thư một cách chọn lọc do màng tế bào
ung thư có hàm lượng phosphatidylserin cao hơn so với tế bào bình thường.
Phosphatidylserin tích điện âm nên có ái lực cao với cecropin tích điện dương [26, 30].
Đồng thời, tế bào ung thư có độ nhớt cao giúp cho các phân tử cecropin dễ dàng tấn
công vào bên trong tế bào. Các vi nhung mao trên bề mặt của các tế bào ung thư có số
lượng lớn, đa dạng về kích cỡ và hình dạng, giữ vai trò quan trọng giúp cecropin chọn
lọc đích tác động [58].
1.2.2.2.3. Tiềm năng ứng dụng và tình hình nghiên cứu cecropin
Ngô Thị Hà
20
K18 Sinh học
- Xem thêm -
.DOC 
86 
52 
50 
