Tài liệu Luận văn nghiên cứu thành phần hoá học trong cặn chiết n hexane và butanol từ loài ngọc cẩu (balanophora laxiflora hemsl.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRẦN THẾ TÙNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CẶN CHIẾT N-HEXANE VÀ BUTANOL TỪ LOÀI NGỌC CẨU (BALANOPHORA LAXIFLORA HEMSL.) LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỌC HỮU CƠ HÀ NỘI - NĂM 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI TRẦN THẾ TÙNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CẶN CHIẾT N-HEXANE VÀ BUTANOL TỪ LOÀI NGỌC CẨU (BALANOPHORA LAXIFLORA HEMSL.) LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Hóa học Hữu cơ Mã số: 60.44.01.14 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Hữu Điển HÀ NỘI - NĂM 2017 Luận văn Trần Thế Tùng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học này là kết quả nghiên cứu của cá nhân tôi. Các số liệu và tài liệu được trích dẫn trong công trình này là trung thực. Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã được công bố trước đó. Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình. Hà Nội, ngày 1 tháng 6 năm 2017 HỌC VIÊN Trần Thế Tùng Luận văn Trần Thế Tùng LỜI CẢM ƠN Luận văn này được hoàn thành tại Bộ môn Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội. Với sự kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới PGS.TS. Phạm Hữu Điển. Thầy đã giao đề tài, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, chu đáo và luôn quan tâm, động viên, tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu để tôi hoàn thành Luận văn này. Luận văn này được tài trợ một phần kinh phí từ đề tài NCKH cấp Bộ (mã số B2016-SPH-18) do PGS.TS. Đặng Ngọc Quang làm Chủ nhiệm đề tài. Tôi cũng xin gửi đến thầy lời cảm ơn trân trọng. Ngoài ra, tôi xin cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Hóa Hữu cơ cũng như các thầy cô trong khoa Hóa học đã giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu. Đồng thời xin cảm ơn lớp Cao học Hóa Hữu cơ K25, các anh chị học viên, nghiên cứu sinh, các bạn sinh viên đã và đang học tập, nghiên cứu tại Bộ môn cùng gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Luận văn Trần Thế Tùng MỤC LỤC MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 Chương I: TỔNG QUAN ............................................................................... 3 1.1. Giới thiệu chung .................................................................................... 3 1.1.1. Giới thiệu chi Balanophora ............................................................. 3 1.1.1.1. Phân loại khoa học ..................................................................... 3 1.1.1.2. Các loài thuộc chi Balanophora................................................. 3 1.1.1.3. Đặc điểm thực vật ....................................................................... 9 1.1.2. Giới thiệu loài Balanophora laxiflora Hemsl............................... 10 1.1.2.1. Tên gọi ...................................................................................... 10 1.1.2.2. Mô tả cây .................................................................................. 10 1.1.2.3. Phân bố ..................................................................................... 11 1.1.2.4. Công dụng................................................................................. 11 1.2. Các nghiên cứu về chi Balanophora .................................................. 12 1.2.1. Balanophora abbreviata ................................................................ 12 1.2.2. Balanophora fungosa .................................................................... 14 1.2.3. Balanophora harlandii .................................................................. 17 1.2.4. Balanophora indica ....................................................................... 20 1.2.5. Balanophora involucrata ............................................................... 21 1.2.6. Balanophora japonica ................................................................... 26 1.2.7. Balanophora latisepala .................................................................. 31 1.2.8. Balanophora papuana ................................................................... 32 1.2.9. Balanophora polyandra ................................................................. 32 1.2.10. Balanophora tobiracola ............................................................... 35 1.3. Các nghiên cứu về loài Balanophora laxiflora Hemsl. ..................... 37 1.3.1. Thành phần hóa học...................................................................... 37 Trần Thế Tùng Luận văn 1.3.2. Hoạt tính sinh học ......................................................................... 41 Chương II: THỰC NGHIỆM ...................................................................... 44 2.1. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu ........................... 44 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................... 44 2.1.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................... 44 2.1.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................. 45 2.2. Hóa chất - Dụng cụ - Thiết bị............................................................. 45 2.2.1. Hóa chất ......................................................................................... 45 2.2.2. Dụng cụ .......................................................................................... 45 2.2.3. Thiết bị ............................................................................................ 46 2.3. Thực nghiệm ........................................................................................ 46 2.3.1. Thu hái và xử lý mẫu ..................................................................... 46 2.3.1.1. Thu hái ...................................................................................... 46 2.3.1.2. Xử lí mẫu................................................................................... 46 2.3.2. Ngâm chiết và tạo cặn chiết .......................................................... 47 2.3.3. Phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-hexane .............................. 48 2.3.3.1. Thực hiện sắc kí cột thô cặn chiết n-hexane............................. 48 2.3.3.2. Thực hiện sắc kí cột tinh phân đoạn H8 ................................... 49 2.3.4. Phân lập các hợp chất từ cặn chiết butanol ................................. 50 2.3.4.1. Thực hiện sắc kí thô cặn chiết butanol ..................................... 50 2.3.4.2. Thực hiện sắc kí cột tinh phân đoạn B3 ................................... 52 2.3.4.3. Thực hiện sắc kí cột tinh phân đoạn B4 ................................... 52 2.3.5. Xác định cấu trúc phân tử của các hợp chất................................ 53 2.3.6. Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất ........................ 53 2.3.6.1. Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định................... 53 2.3.6.2. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB ...... 55 Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 57 Trần Thế Tùng Luận văn 3.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ cặn chiết n-hexane.... 57 3.1.1. Hợp chất NC2................................................................................. 57 3.1.2. Hợp chất NC8.1.............................................................................. 62 3.1.3. Hợp chất NC8.3.............................................................................. 66 3.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ cặn chiết butanol ...... 69 3.2.1. Hợp chất B1 ................................................................................... 69 3.2.2. Hợp chất B2 ................................................................................... 73 3.2.3. Hợp chất B3 ................................................................................... 75 3.2.4. Hợp chất B4 ................................................................................... 78 3.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất đã phân lập ............................ 80 KẾT LUẬN .................................................................................................... 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 83 PHỤ LỤC Luận văn Trần Thế Tùng DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Loài Ngọc cẩu (Balanophora laxiflora Hemsl.) ............................ 11 Hình 2.1. Mẫu Ngọc cẩu thu hái tại Lào Cai, 8/2015 .................................... 44 Hình 2.2. Sơ đồ ngâm chiết và tạo cặn chiết từ cao tổng loài Ngọc cẩu........ 47 Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-hexane loài Ngọc cẩu 50 Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết butanol loài Ngọc cẩu ... 51 Hình 3.1. Một phần phổ 1H NMR của hợp chất NC2 .................................... 58 Hình 3.2. Một phần phổ 13C NMR của hợp chất NC2 ................................... 59 Hình 3.3. Phổ giãn 1H NMR của hợp chất NC8.1.......................................... 62 Hình 3.4. Một phần phổ 13C NMR của hợp chất NC8.1 ................................ 63 Hình 3.5. Một số tương tác H↔C trên phổ HMBC của hợp chất NC8.1 ...... 66 Hình 3.6. Phổ giãn 1H NMR của hợp chất NC8.3.......................................... 67 Hình 3.7. Một phần phổ 13C NMR của hợp chất NC8.3 ................................ 68 Hình 3.8. Một phần phổ 1H NMR của hợp chất B1 ....................................... 69 Hình 3.9. Một phần phổ 13C NMR của hợp chất B1 ...................................... 70 Hình 3.10. Một số tương tác H↔C trên phổ HMBC của hợp chất B1 .......... 72 Hình 3.11. Một phần phổ 1H NMR của hợp chất B2 ..................................... 73 Hình 3.12. Phổ 13C NMR của hợp chất B2 .................................................... 74 Hình 3.13. Một phần phổ 1H NMR của hợp chất B3 ..................................... 76 Hình 3.14. Cấu trúc phân tử (1) và các tương tác H↔C trên phổ HMBC (2) của hợp chất B3 .......................................................................... 77 Hình 3.15. Phổ 13C NMR của hợp chất B4 .................................................... 78 Hình 3.16. Cấu trúc phân tử (1) và các tương tác H↔C trên phổ HMBC (2) của hợp chất B4 .......................................................................... 79 Luận văn Trần Thế Tùng DANH MỤC BẢNG SỐ LIỆU Bảng 3.1. Các dữ liệu phổ 1H NMR, 13C NMR, DEPT của hợp chất NC2 so sánh với β-amyrin palmitate (balanophorin A) ............................ 60 Bảng 3.2. So sánh các giá trị phổ 1H NMR và 13C NMR của hợp chất NC8.1 với của 3β-acetylmonogynol A..................................................... 64 Bảng 3.3. Các giá trị phổ 1H NMR và 13C NMR của hợp chất NC8.3........... 68 Bảng 3.4. So sánh các giá trị phổ 1H NMR và 13C NMR của hợp chất B1 với quercetin 3-O--glucopyranoside (isoquercitrin) ......................... 71 Bảng 3.5. So sánh các giá trị phổ 1H NMR và 13C NMR của hợp chất B2 với methyl p-coumarate ...................................................................... 75 Bảng 3.6. So sánh các giá trị phổ 1H NMR và 13C NMR của hợp chất B3 với methyl caffeate .............................................................................. 77 Bảng 3.7. So sánh các giá trị phổ 1H NMR và 13C NMR của hợp chất B4 với methyl gallate ................................................................................ 79 Bảng 3.8. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất NC2, NC8.1 và B1 ......................................................... 80 Bảng 3.9. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB của các hợp chất NC2, NC8.1 và B1 ............................................ 80 Luận văn Trần Thế Tùng DANH MỤC VIẾT TẮT Kí hiệu CC DEPT Diễn giải - Ghi chú Phương pháp Column Chromatography sắc kí cột Distortionless Enhancement by Phổ xác định số H Polarization Transfer liên kết với C DMSO dimethyl sulfoxide DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl H:E n-hexan:ethyl acetate HHDP hexahydroxydiphenoyl Heteronuclear Multiple Phổ tương tác Bond Correlation gián tiếp H↔C Heteronuclear Single Phổ tương tác Quantum Coherence trực tiếp H↔C IR Infrared Radiation Phổ hồng ngoại MS Mass Spectrometry Phổ khối lượng NMR Nuclear Magnetic Resonance HMBC HSQC TH-DBF-DC TLC Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1’,1”-(3’,3”,4”,4”-tetrahydroxydibenzofurandicarboxyl) Thin Layer Chromatography Phương pháp sắc kí lớp mỏng Luận văn Trần Thế Tùng MỞ ĐẦU Trong thời đại phát triển của kinh tế, các chính phủ đã đầu tư phát triển nhiều ngành khoa học kĩ thuật và đặc biệt là các ngành công nghiệp. Điều này khiến cho điều kiện sống của con người được cải thiện đáng kể. Tuy nhiên, những sự thay đổi này cũng mang lại không ít những tiêu cực, khiến cho ô nhiễm môi trường trở thành vấn nạn nghiêm trọng. Hệ lụy là phát sinh ngày càng nhiều căn bệnh nguy hiểm, có khả năng lây nhiễm cao, thậm chí bùng phát thành đại dịch trên toàn thế giới. Chính vì thế, các nhà khoa học không ngừng nghiên cứu nhằm tìm ra các loại thuốc, dược phẩm mới nhằm ngăn chặn và đối phó với những bệnh dịch đã, đang và sẽ xuất hiện. Trong đó, hướng nghiên cứu các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên đã được phát triển từ nhiều năm nay. Việt Nam là một nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm nên hệ động thực vật phát triển rất phong phú và đa dạng. Trong đó, nguồn tài nguyên thực vật được sử dụng làm dược liệu chiếm một lượng đáng kể. Việc nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học, dược học của các cây thuốc dân gian giúp nâng cao hiệu quả sử dụng và khả năng khai thác chúng. Hiện nay, cây thuốc Ngọc cẩu với nhiều tác dụng đáng quý đang đang nhận được sự chú ý rất lớn. Ngọc cẩu có tên khoa học là Balanophora laxiflora Hemsl., là một loài thuộc chi Balanophora. Loài này thường mọc và sống ký sinh trên rễ những cây gốc lớn trong rừng sâu ẩm thấp, rừng rậm nhiệt đới và cận nhiệt đới ở Việt Nam, Lào, Đài Loan, Trung Quốc và các nước châu Á khác. [1,5,7,12] Trong y học cổ truyền, người ta sử dụng Ngọc cẩu làm thuốc bổ máu, kích thích ăn ngon miệng, chữa đau bụng, nhức mỏi tay chân, hồi phục sức khỏe cho người già, người mới ốm dậy và phụ nữ sau khi sinh [7]. Gần đây tại Việt 1 Luận văn Trần Thế Tùng Nam cũng như một số nước trên thế giới như Malaysia, Trung Quốc, Ngọc cẩu còn được sử dụng làm thuốc trị chứng xuất tinh sớm, liệt dương, hoạt tinh, di tinh, sinh lý yếu [15]. Do đó, nhiều công trình khoa học trong và ngoài nước đã quan tâm nghiên cứu về loài Ngọc cẩu. Một trong số đó là đề tài nghiên cứu của ThS. Nguyễn Thị Phương Thanh được hoàn thiện năm 2016. Đề tài đã nghiên cứu thành phần hóa học trong cặn chiết ethyl acetate từ Ngọc cẩu (Balanophora laxiflora Hemsl.). Nhằm hoàn thiện và phát huy thành quả này, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học trong cặn chiết n-hexane và butanol từ loài Ngọc cẩu (Balanophora laxiflora Hemsl.)”. Ngoài ra, đề tài Luận văn thạc sĩ này là một phần của Đề tài Khoa học Công nghệ cấp Bộ: “Phân lập thành phần hóa học và thử hoạt chất sinh học của loài Ngọc cẩu nhằm ứng dụng làm thực phẩm chức năng”, mã số B2016SPH-18. 2 Luận văn Trần Thế Tùng Chương I: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu chung 1.1.1. Giới thiệu chi Balanophora 1.1.1.1. Phân loại khoa học Theo tài liệu [12], ta có vị trí phân loại chi Balanophora như sau Giới: Plantae (Thực vật) Ngành: Angiospermae (Hạt kín) hay Magnoliophyta (Mộc lan) Lớp: Dicotyledones (Hai lá mầm) hay Magnoliopsida (Mộc lan) Bộ: Santalales (Đàn hương) Họ: Balanophoraceae (Dương đài/Dó đất) Chi: Balanophora 1.1.1.2. Các loài thuộc chi Balanophora Trên thế giới, khoảng 20 loài thuộc chi này đã được phát hiện. Chúng phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á, châu Phi và Australia. Một số loài ở vùng cận nhiệt đới và ôn đới ẩm. [1] - Balanophora abbreviata Blume phân bố ở Campuchia, Ấn Độ, Indonesia. [32] 3 Luận văn Trần Thế Tùng - Balanophora coralliformis phân bố ở Philippines. [36] - Balanophora cucphuongensis Ban là loài đặc hữu của Việt Nam, phân bố ở Vườn Quốc gia Cúc Phương, Ninh Bình. [12] - Balanophora dioica R.Br. ex Royle phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ, Myanmar, Bhutan, Sikkim. [32] - Balanophora elongata Blume phân bố ở Trung Quốc, Indonesia. [32] 4 Luận văn Trần Thế Tùng - Balanophora fargesii (Tiegh.) Harms đã được tìm thấy ở Trung Quốc, Bhutan. [32] - Balanophora fungosa J.R.Forst. & G.Forst. phân bố ở Đài Loan, Nhật Bản, Indonesia, Australia, New Guinea, Philippines. Ở Việt Nam, loài này đã được tìm thấy tại Hà Nội, Hà Nam, Đà Nẵng, Khánh Hòa, Kon Tum, Lâm Đồng, Ninh Thuận, An Giang. [2,5,32] - Balanophora harlandii Hook.f. phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan. [32] 5 Luận văn Trần Thế Tùng - Balanophora indica (Arn.) Griff. phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Myanmar, Thái Lan, Việt Nam, Philippines. [32] - Balanophora involucrata Hook.f. & Thomson phân bố ở Ấn Độ, Nepal, Trung Quốc, Bhutan, Sikkim. [32] 6 Luận văn Trần Thế Tùng - Balanophora japonica Makino phân bố ở Đài Loan, Nhật Bản, Trung Quốc. [32] - Balanophora latisepala (Tiegh.) Lecomte phân bố ở Nhật Bản, Thái Lan. Ở Việt Nam, loài này đã được tìm thấy tại Thanh Hóa, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu, An Giang. [2,5,32] 7 Luận văn Trần Thế Tùng - Balanophora laxiflora Hemsl. (Balanophora spicata Hayata) phân bố ở Đài Loan, Trung Quốc, Lào, Thái Lan. Ở Việt Nam, loài này đã được tìm thấy tại Cao Bằng, Lào Cai, Kon Tum (Ngọc Guga, Ngọc Pan), Ninh Bình (Cúc Phương). [2,5,32] - Balanophora papuana Schltr. phân bố ở Nhật Bản, Malaysia. [32] - Balanophora polyandra Griff. phân bố ở Trung Quốc, Nepal, Myanmar, Bhutan. Ở Việt Nam, loài này đã được tìm thấy tại Kiên Giang, Ninh Bình. [32,47] 8 Luận văn Trần Thế Tùng - Balanophora reflexa Becc. - Balanophora subcupularis P.C.Tam phân bố ở Trung Quốc. [32] - Balanophora tobiracola Makino phân bố ở Đài Loan, Nhật Bản, Trung Quốc. [32] - Balanophora wilderi Setch. - Balanophora yakushimensis Hatus. & Masam. phân bố ở Nhật Bản, Đài Loan. [32] 1.1.1.3. Đặc điểm thực vật Chi Balanophora có dạng hình thái tương đối đặc biệt trong giới thực vật có hoa. Cây thân thảo, màu đỏ nâu sẫm, sống một năm hay nhiều năm, ký 9 Luận văn Trần Thế Tùng sinh trên rễ cây thân lớn thuộc họ Moraceae (Dâu tằm), Sterculiaceae (Trôm), Tiliaceae (Đay/Đoạn/Gia), Leguminosae (Đậu/Cánh bướm), Ericaceae (Đỗ quyên/Thạch nam), Urticaceae (Tầm ma), Fagaceae (Dẻ/Sồi). Bề ngoài trông giống nấm, bao gồm vô số hoa nhỏ, màu nâu, hồng hay hơi tía, không có diệp lục. Phần ngầm dưới đất gắn với vật chủ, trông giống như củ, không phải hệ rễ hoàn hảo. Thân thoái hóa thành củ nguyên hoặc phân nhánh, có nhiều hình dạng khác nhau, sần sùi, không có lá. [1,2,12,49] Cụm hoa phát triển bên trong phần ngầm dưới đất dạng củ của cây, sau đó tách ra và xuất hiện trên bề mặt. Hoa đơn tính cùng gốc hay khác gốc họp thành cụm hoa dạng bông nạc. Nếu cây cùng gốc thì hoa cái tập trung ở phía dưới còn hoa đực tập trung ở phía đỉnh của cụm hoa. [1,2,5,12] 1.1.2. Giới thiệu loài Balanophora laxiflora Hemsl. 1.1.2.1. Tên gọi Tên khoa học: Balanophora laxiflora Hemsl. Tên thường gọi: Ngọc cẩu, Tỏa dương, Dương đài, Dương đài hoa thưa, Gió đất, Dó đất, Dó đất hoa thưa, hoa đất, nấm đất, củ ngọt núi, cu chó, xà cô, cây không lá. [1,5,7,12] 1.1.2.2. Mô tả cây Loại cây cỏ mập, trông như một cây nấm, sống kí sinh trên rễ, màu đỏ nâu sẫm, không có lá. Cấu tạo bởi một cán hoa lớn, trên mang hoa dày đặc, có mo bao bọc, màu tím, mùi hôi. Củ hình trứng, đường kính 2 - 2,5 cm, bề mặt sần sùi và có mụn hình sao nổi rõ. Thân kí sinh (là cuống cụm hoa) mang 5 - 10 lá dạng vảy ở phía gốc; phiến lá hình mũi mác, cỡ 2 - 2,5 x 1 - 1,5 cm. [2,7,12] Hoa đơn tính khác gốc, họp thành cụm hoa dạng bông nạc. Hoa đực và hoa cái riêng. Cụm hoa đực hình trụ, gồm những hoa gần như không cuống, dài từ 10 - 15 cm. Bao hoa gồm 6 mảnh, trong đó 2 mảnh giữa (đối diện nhau) lớn hơn và cụt đầu, các mảnh bên hình trái xoan tròn đầu, khối phấn bị ép ngang. 10