Tài liệu Luận văn: nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ acetobacter xylinum

Lời cảm ơn LỜI CẢM ƠN Em chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Vũ Tuân, thầy đã hướng dẫn em suốt quá trình thực hiện đề tài này. Trong quá trình làm việc cùng với thầy, em đã học hỏi được nhiều điều bổ ích, không chỉ là những kiến thức chuyên môn mà còn cả những kinh nghiệm khi làm việc. Khi em gặp khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài, thầy đã kịp thời hướng dẫn, chỉ bảo tận tình. Em gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lưu Thị Ngọc Anh, những lời truyền đạt của cô thật sự bổ ích cho em trong quá trình em làm luận văn tại trường. Em gửi lời cảm ơn đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt, cô đã giúp đỡ chúng em về mặt hóa chất phục vụ cho việc thực hiện đề tài. Em cảm ơn cô Thùy Dương - bộ môn Công nghệ Sinh học của trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em về nguồn vi sinh vật sử dụng trong đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện tốt nhất về mọi mặt giúp chúng em thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp. Tôi cũng muốn bày tỏ sự cảm ơn đến tất cả các bạn bè của tôi, họ đã giúp đỡ, đặc biệt là cho tôi thấy được sự gắn bó, sự chia sẻ, sự cảm thông cũng như là những giây phút thư giãn trong khi làm việc. Tôi xin cảm ơn với tất cả lòng chân thành. Tp. HCM, ngày 07 tháng 01 năm 2008 Phan Anh Tuấn i Tóm tắt luận văn TÓM TẮT LUẬN VĂN Acetobacter xylinum (A. xylinum) là một vi khuẩn Gram âm, có thể sản xuất một loại polysaccharide ngoại bào được gọi là cellulose vi khuẩn. Cellulose vi khuẩn có khả năng được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm và các lĩnh vực khác. Để ứng dụng cellulose vi khuẩn một cách rộng rãi, đòi hỏi có nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi dào và ổn định. Gần đây, ứng dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao thực phẩm đã được phát hiện và ứng dụng thực tế. Với mục đích sản xuất cellulose vi khuẩn phục vụ mục đích màng bao thực phẩm, với đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” dưới điều kiện tĩnh, chúng tôi thực hiện khảo sát các yếu tố sau: - Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum trên môi trường Hestrin- Schramm (HS). - Cải thiện hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum. Để khảo sát sự sinh tổng hợp cellulose, A. xylinum được nuôi cấy dưới điều kiện tĩnh trên môi trường HS ở các điều kiện khác nhau nhằm rút ra điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho chủng A. xylinum có sẵn. Khảo sát ảnh hưởng của pH đối với quá trình tạo cellulose của vi khuẩn A. xylinum được tiến hành và thấy rằng, trong khoảng pH từ 4,0 đến pH 5,5, hiệu suất tổng hợp cellulose của chủng A. xylinum này là thích hợp nhất, lượng cellulose đạt được có thể ~5,2 gl-1. Bên cạnh đó, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon bằng cách thay đổi nguồn carbon trong thành phần môi trường nuôi cấy, chọn được nguồn carbon thích hợp nhất cho chủng A. xylinum sinh tổng hợp cellulose là mannitol. Lượng cellulose đạt được ~7,4 gl-1. Để chọn ra nguồn nitơ tốt nhất cho sự tổng hợp cellulose, một thí nghiệm được thực hiện với nguồn carbon là mannitol, nguồn nitơ được thay đổi, kết quả cho thấy cao nấm men cho kết quả tạo cellulose tốt nhất. Lượng cellulose đạt được ~8 gl-1 g. Khi khảo sát ảnh hưởng đồng thời của mannitol và cao nấm men lên quá trình tổng hợp cellulose của A. xylinum, hàm lượng cellulose thu được có thể đạt được ~8,5 gl-1 khi thành phần môi trường HS được điều chỉnh với hàm lượng mannitol 15,5 gl-1 và hàm lượng cao nấm men là 6,5 gl-1, pH môi trường được chỉnh xung quanh giá trị 5,0. Với kết quả thu được trong các thí nghiệm, môi trường nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum có tại Phòng Thí nghiệm Sinh học trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh với mục đích thu nhận cellulose nên bao gồm các thành phần sau: 15,5 gl-1 mannitol; 6,5 gl-1 cao nấm men; 5,0 gl-1 Na2HPO4; 1,115 gl-1 acid citric; pH được điều chỉnh về 5,0 là thích hợp cho ii Tóm tắt luận văn quá trình nuôi cấy. Các kết quả quả thí nghiệm này cung cấp những thông tin hữu ích cho sự phát triển khả năng sản xuất cellulose vi khuẩn trên quy mô công nghiệp. iii Mục lục MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN.............................................................................................................................i TÓM TẮT LUẬN VĂN............................................................................................................ii MỤC LỤC ............................................................................................................................iv DANH MỤC HÌNH..................................................................................................................vi DANH MỤC BẢNG................................................................................................................vii DANH MỤC VIẾT TẮT....................................................................................................... viii CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU.......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................... 3 2.1 CELLULOSE VI KHUẨN VÀ VI SINH VẬT TỔNG HỢP CELLULOSE......................... 3 2.1.1 Lịch sử nghiên cứu sự sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn................................ 3 2.1.2 Cellulose vi khuẩn và tính chất của cellulose vi khuẩn.................................. 3 2.1.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulose.........................................................................6 2.2 SINH TỔNG HỢP CELLULOSE TỪ VI KHUẨN A. XYLINUM....................................10 2.2.1 Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở A. xylinum............................................ 10 2.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn...................................................... 11 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp cellulose...............................13 2.3 ỨNG DỤNG CỦA CELLULOSE VI KHUẨN.............................................................. 24 2.3.1 Thực phẩm.................................................................................................... 24 2.3.2 Y học............................................................................................................. 25 2.3.3 Các ngành công nghiệp khác........................................................................ 25 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP....................................................... 28 3.1 NGUYÊN LIỆU....................................................................................................... 28 3.1.1 Chủng vi sinh vật.......................................................................................... 28 3.1.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật....................................................................28 3.2 THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM.........................................................................................29 3.2.1 Khảo sát quá trình nhân giống...................................................................... 29 3.2.2 Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose................................................... 30 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum.......................................................................................................... 30 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng độc lập của nguồn carbon và nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum.................................................................31 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời của nguồn carbon và nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum..........................................................31 3.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH...........................................................................33 3.3.1 Số lượng vi khuẩn......................................................................................... 33 iv Mục lục 3.3.2 3.3.3 Hiệu suất cellulose........................................................................................ 33 Phân tích thống kê.........................................................................................34 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN..........................................................................35 4.1 4.2 4.3 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG VI KHUẨN A. XYLINUM............................. 35 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CELLULOSE..........................................36 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA PH LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN A. XYLINUM..................................................................................38 4.4 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CARBON VÀ NITƠ LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN A. XYLINUM...........................................40 4.4.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon....................................................................... 40 4.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ........................................................................... 43 4.5 TỐI ƯU HOÁ NỒNG ĐỘ NGUỒN CARBON VÀ NITƠ............................................... 45 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...........................................................................49 5.1 5.2 KẾT LUẬN............................................................................................................. 49 ĐỀ NGHỊ................................................................................................................ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................... 51 PHỤ LỤC ...........................................................................................................................55 v Danh mục hình DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn.................................................................................. 4 Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b)..........................................................6 Hình 2.3: SEM của A. xylinum....................................................................................................8 Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose trong A. xylinum.......................................................11 Hình 2.5: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn.................................................................. 12 Hình 2.6: Sự giải phóng cellulose ra môi trường ngoài từ A. xylinum......................................13 Hình 2.7: Cellulose được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh và có khuấy đảo................ 15 Hình 2.8: Cấu trúc trong điều kiện nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo ........................... 16 Hình 4.1: Đường cong sinh trưởng của A. xylinum..................................................................35 Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn trọng lượng cellulose thu được và giá trị pH tại các ngày lên men thứ 4, 5, 6, 7 ............................................................................................................ 36 Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum .............. 39 Hình 4.4: Trọng lượng cellulose thu được khi nguồn carbon thay đổi..................................... 42 Hình 4.5: Trọng lượng cellulose thu được khi nguồn nitơ thay đổi..........................................44 vi Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose.......................................................... 7 Bảng 2.2: Đặc tính cấu trúc St-BC và Ag-BC ......................................................................... 16 Bảng 2.3: Tính chất St-BC và Ag-BC của A. xylinum IFO 13693 ..........................................17 Bảng 2.4: Aûnh hưởng của nguồn carbon lên sự tổng hợp cellulose của................................. 23 Bảng 2.5: Các ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cellulose vi khuẩn......................................26 Bảng 3.1: Bảng thiết kế thí nghiệm tối ưu nguồn carbon và nguồn nitơ.................................. 33 Bảng 3.2: Bảng mã hoá các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát..................................................... 34 Bảng 4.1: Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu ............................................................................... 47 Bảng 4.2: Bảng mã hoá các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát..................................................... 47 vii Danh mục viết tắt DANH MỤC VIẾT TẮT - Ag-BC: agitated bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận được dưới điều kiện nuôi cấy có khuấy đảo) - A. xylinum: Acetobacter xylinum - A. xylinus: Acetobacter xylinus - ATP: adenosine triphosohate - BASYC®: bacterial synthesised cellulose - Cel-: non-producing mutants – chủng vi khuẩn đột biến không tổng hợp cellulose. - cfu: cololy-forming units – khuẩn lạc - CS: cellulose synthase - CSL: corn steep liquor - DAP: diamon phosphate - DP: degree of polymerization - FK: Fructosekinase - FBP: Fructose-1,6-biphosphate phosphatase - Fru-bi-P: Fructose-1,6-bi-phosphate - Fru-6-P: Fructose-6-phosphate - GK: Glocosekinase - G6PDH: Fructose-1-phosphate kinase - Glc-6-P: Glucose-6-phosphate - Glc-1-P: Glucose-1-phosphate - HS: Hestrin-Schramm - HR/MAS 1H NMR: high resolution/magic angle spinning hidrogen-1 nuclear magnetic resonance. - PGI: Phosphoglucoisomerase - PGM: Phosphoglucomutase viii Danh mục viết tắt - PTS: Phosphatransferase - PGA: Phosphogluconic acid - S/V: surface/volume ratio - tỉ lệ diện tích/thể tích - SEM: Scanning electronic microscopy - St-BC: Static bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận được dưới điều kiện nuôi cấy tĩnh) - SA: Sulfate amon - UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase - UDPG: Uridine diphosephoglucose - YPM: Yeast extract Peptone Mannitol - YE: Yeast extract – cao nấm men ix Chương 1. Mở đầu Chương 1: MỞ ĐẦU Cellulose là một hợp chất hóa học thường được biết đến với vai trò là bộ khung xương quan trọng trong cơ thể thực vật. Không những cellulose được tổng hợp bởi thực vật, mà cellulose còn được tổng hợp nên bởi vi sinh vật, với tên gọi là cellulose vi khuẩn. Một trong những loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose rất tốt đó là A. xylinum. Cellulose vi khuẩn ngày càng được quan tâm nhiều hơn bởi khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học: công nghiệp thực phẩm, y học, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, âm thanh, xử lý nước thải, bảo vệ môi trường… Gần đây, khả năng ứng dụng cellulose vi khuẩn không ngừng được nghiên cứu, cải tiến bởi các nhà khoa học trên thế giới (Otomo et al., 2000). Trong công nghệ đồ uống và thực phẩm, cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng làm nhiều sản phẩm như: nước trái cây, thực phẩm chức năng… Đặc biệt, một ứng dụng của cellulose vi khuẩn mới được phát hiện gần đây là khả năng ứng dụng làm màng bao thực phẩm chống vi sinh vật rất hiệu quả (Yoshinaga et al., 1997; Okiyama et al., 1993). Việc ứng dụng cellulose vi khuẩn vào sản xuất công nghiệp nói chung và làm màng bao thực phẩm nói riêng đòi hỏi phải có được các nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi dào, ổn định, và phù hợp với tính chất của các ứng dụng. Nhiều kết quả nghiên cứu đã cho thấy khi nuôi cấy dưới điều kiện có khuấy đảo thì hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum sẽ cao hơn khi nuôi cấy tĩnh. Tuy nhiên, với mục đích sử dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao chống vi sinh vật trong công nghệ thực phẩm, yêu cầu cellulose thu được phải ở dạng màng. Với mục đích đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” dưới điều kiện nuôi cấy tĩnh với mong muốn thu được các kết quả hữu ích cho các nghiên cứu trong tương lai. Trong nội dung thực hiện, chúng tôi tập trung khảo sát các yếu tố sau: - Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS. - Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum trên môi trường HS. - Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. 1 Chương 1. Mở đầu - Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. - Tối ưu hoá thành phần môi trường lên men thu nhận cellulose vi khuẩn nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum. Với kết quả thu được, phần nào sẽ cung cấp những thông tin hữu ích cho các nghiên cứu tiếp theo, đầy đủ hơn để có thể ứng dụng sản xuất cellulose vi khuẩn trên quy mô công nghiệp. 2 Chương 2. Tổng quan tài liệu Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cellulose vi khuẩn và vi sinh vật tổng hợp cellulose 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu sự sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn. Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A. xylinum lần đầu tiên được báo cáo bởi Brown et al. (1986). Theo đó, khi nghiên cứu về vi khuẩn acetic, Brown đã phát hiện và quan sát thấy một khối rắn mà theo ông lúc đó khối rắn này không nằm trong các kết quả nghiên cứu ông dự định trước. Khối rắn này khó bị phân hủy và giống với mô động vật. Hợp chất đó sau này được xác định là cellulose và vi khuẩn tổng hợp ra nó là Bacterium xylinum (Brown et al., 1986). Đến nửa thế kỷ XX các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu nhiều về cellulose vi khuẩn. Đầu tiên, Hestrin et al. (1954) đã nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum. Ông đã chứng minh rằng vi khuẩn này có thể sử dụng đường để tổng hợp cellulose. Sau đó, Next và Colvin (1957) chứng minh rằng cellulose được A. xylinum tổng hợp trong môi trường có đường và ATP. Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, cấu trúc của cellulose vi khuẩn ngày càng được hiểu khá rõ, đó là các chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan. Saxena (1990) đã giải thích cơ chế tổng hợp cellulose của A. xylinum bằng việc giải trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose. Ông đã tách chiết được đoạn polypeptide liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose tinh khiết dài 83kDa. Từ đó đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm cấu trúc, cơ chế tổng hợp, ứng dụng… của cellulose vi khuẩn. 1.1.2 Cellulose vi khuẩn và tính chất của cellulose vi khuẩn 1.1.2.1 Cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan. Những chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp nối lại với nhau thành thớ sợi thứ cấp, có bề rộng 1,5 nm. Đây là những thớ sợi tự nhiên mảnh nhất khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong tượng tầng ở một vài loài thực vật. Các thớ sợi thứ cấp kết lại thành những vi sợi, những vi sợi tạo thành bó sợi, những bó sợi tạo thành dải. Dải có chiều dày 3 – 4 nm, và chiều dài 130 – 177 nm (Yamanaka et al., 2000). Các dải siêu mịn của cellulose vi 3 Chương 2. Tổng quan tài liệu khuẩn có chiều dài từ 1 µm đến 9 µm tạo thành cấu trúc mắt lưới dày đặc, được ổn định nhờ các liên kết hydro, đó là lớp màng film (Bielecki et al., 2001) Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn (Yamanaka et al., 2000) 1.1.2.2 Mức độ polymer hoá (Degree of polymerization - DP) Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật tương tự nhau về mặt hóa học, cellulose bao gồm các liên kết β-1,4-glucan, nhưng mức độ polymer hoá khác nhau. DP của cellulose thực vật khoảng 13000 – 14000, và của cellulose vi khuẩn khoảng 2000 – 6000. Tuy nhiên, trong một số trường hợp DP của cellulose vi khuẩn có thể đạt 16000 đến 20000 phân tử glucose (Watanabe et al., 1998). Đường kính của bacterial cellulose chỉ vào khoảng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (Bielecki et al., 2001) (hình 2.2). 1.1.2.3 Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn. Ngày nay nhờ vào các kỹ thuật công nghệ hiện đại người ta đã xác định được cấu trúc của cellulose vi khuẩn. Chẳng hạn như kỹ thuật nhiễu xạ tia X giúp xác định được kích thước và phân biệt cấu trúc cellulose vi khuẩn. Những kỹ thuật khác như phổ hồng ngoại, phổ Raman, và phổ cộng hưởng từ hạt nhân giúp xác định các dạng kết tinh của cellulose (Bielecki et al., 2001). Như các cellulose tự nhiên khác, cellulose vi khuẩn được tạo thành bởi hai loại cấu trúc tinh thể riêng biệt, cellulose Iα và Iβ. Trong vi sợi cellulose đều có sự tham gia của hai 4 Chương 2. Tổng quan tài liệu loại cấu trúc tinh thể này (Yamamoto & Horii, 1993). Trong khi hầu hết tinh thể Iβ tinh khiết thu được từ cellulose thực vật thì vẫn chưa có cách nào thu nhận được các tinh thể Iα tinh khiết từ nguồn này. Cấu trúc của cellulose được tổng hợp từ vi khuẩn A. xylinum chứa nhiều tinh thể Iα hơn cellulose thực vật, hàm lượng loại tinh thể này có thể lên đến hơn 60%. Tỉ lệ này có thể dao động trong khoảng 64% đến 71% tuỳ vào chủng vi sinh vật và nhiệt độ môi trường (Yamamoto & Horii, 1994). Ngược lại Iβ chủ yếu có trong thành phần cellulose hình thành nên thành tế bào của một số loài thực vật bậc cao như cotton và gai. Ở đó, cellulose Iα chỉ chiếm khoảng 20%. Nhìn chung, cấu trúc tinh thể được coi như là một yếu tố quan trọng trong việc xác định các tính chất của cellulose mặc dù cho đến bây giờ vẫn có rất ít các nghiên cứu về sự tương quan giữa cấu trúc tinh thể và những đặc tính riêng biệt của cellulose được thực hiện. 1.1.2.4 Tính chất của cellulose vi khuẩn (El-Saied et al., 2004; Bielecki et al., 2001) - Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn, thành phần tỉ lệ Iα cao. - Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao, đặc biệt là cellulose I. - Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc. - Có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và hemicellulose. - Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài nguyên có thể phục hồi. - Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt. - Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có độ bền cao, ứng suất dài lớn, trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao. - Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản xuất một số sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bước trung gian. Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp được cellulose dưới dạng màng mỏng hoặc dưới dạng các sợi chỉ cực nhỏ. 5 Chương 2. Tổng quan tài liệu - Có thể kiểm soát được đặc điểm lý học của cellulose theo mong muốn bằng cách tác động vào quá trình sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. Từ đó có thể kiểm soát các dạng kết tinh và trọng lượng phân tử cellulose. Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b) (Bielecki et al., 2001) 1.1.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulose. Cellulose vi khuẩn được nhiều loài vi sinh vật tổng hợp trong đó chủng A. xylinum được biết đến nhiều nhất, đây cũng là loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose hiệu quả nhất và được tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Cấu trúc của cellulose được tổng hợp bởi các vi sinh vật khác nhau là khác nhau. Sau đây là bảng tổng quan về các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose. Bảng 2.1 Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose (Jonas et al., 1998) Vi sinh vật Acetobacter Cấu trúc cellulose Lớp màng ngoại bào Vai trò sinh học Để giữ vi khuẩn trong môi trường Dải cellulose hiếu khí Achromobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải Aerobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải Agrobacterium Alcaligenes Pseudomonas Rhizobium Sarcina Sợi ngắn Tham gia vào mô thực vật Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải Các sợi không tách biệt Sự kết bông trong nước thải Sợi ngắn Cellulose dị hình Tham gia vào hầu hết thực vật Không rõ 6 Chương 2. Tổng quan tài liệu Zoogloea Chưa xác định rõ cấu trúc Sự kết bông trong nước thải Trong đó, Acetobacter được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất trong việc sản xuất cellulose. Đặc biệt là A. xylinum vì những đặc điểm ưu việt của nó như: năng suất tạo cellulose cao, cấu trúc cellulose phù hợp cho các mục đích sử dụng… 1.1.3.1 Phân loại A. xylinum A. xylinum là một vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này bao gồm các giống sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter, Gluconobacter và Kozakia. Các loài vi khuẩn này trước đây được gọi với các tên gọi Acetobacter xylinus hay Acetobacter xylinum, sau đó được xếp lại vào giống Gluconacetobacter với tên gọi Gluconacetobacter xylynus. A. xylinum có thể được phân lập từ các nguồn khác nhau như từ nước quả (Kahlon & Vyas, 1971), hay từ một số loài thực vật như lá của cây cọ (Faparusi et al., 1974), từ giấm (Passmore & Carr, 1975), từ thạch dừa (Bernado et al., 1998), từ nấm Kombucha và trà (Hermann et al., 1928). 1.1.3.2 Đặc điểm hình thái của A. xylinum.  A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay không di động, không sinh bào tử. Là vi khuẩn Gram âm, chúng có thể đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi.  Nếu A. xylinum phát triển trên môi trường thiếu chất dinh dưỡng, chúng biến đổi thành dạng có hình thái đặc biệt như: dạng tế bào phình to, kéo dài, phân nhánh hoặc không phân nhánh và dần dần sẽ gây thoái hóa giống làm giảm hoạt tính một cách đáng kể.  Khuẩn lạc của A. xylinum có kích thước nhỏ, bề mặt nhầy và trơn, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn. 7 Chương 2. Tổng quan tài liệu Hình 2.3: SEM của A. xylinum (Forge & Preston, 1977) 1.1.3.3 Đặc điểm sinh lý của A. xylinum (Jonas et al., 1998)  Oxy hóa ethanol thành acid acetic, CO2, H2O.  Phản ứng catalase dương tính: tạo bọt khí trong dung dịch lên men.  Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer.  Chuyển hóa glucose thành acid gluconic.  Chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton.  Không sinh sắc tố nâu.  Tổng hợp cellulose. 1.1.3.4 Đặc điểm sinh trưởng của A. xylinum Lớp màng cellulose tạo ra gây trở ngại đến khả năng biến dưỡng, vận chuyển chất dinh dưỡng và oxi đến tế bào. Tuy nhiên lớp màng này có thể giữ nước nên giúp vi khuẩn có thể phân hủy chất dinh dưỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại tia UV. A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau và tùy thuộc vào chủng vi khuẩn mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Chẳng hạn chủng A. xylinum BPR 2001 sử dụng fructose tốt nhất (Matsuoka et al., 1993) trong khi chủng A. xylinum IFO 13693 sử dụng glucose hiệu quả hơn (Masaoka et al., 1993)… A. xylinum có thể chuyển hóa glucose thành 8 Chương 2. Tổng quan tài liệu acid gluconic, điều này là nguyên nhân làm cho pH của môi trường nuôi cấy giảm từ 1 đến 2 đơn vị trong quá trình nuôi cấy. Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển từ 250C đến 300C và pH từ 5,4 đến 6,3. Theo Hestrin (1947) thì pH tối ưu để A. xylinum phát triển là 5,5 và không phát triển ở nhiệt độ 370C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Theo Maccormide et al. (1996) cho rằng A. xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 đến 8, nhiệt độ từ 120C đến 350C và có thể phát triển trong môi trường có nồng độ ethanol lên tới 10%. Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, lúc còn non khuẩn lạc mọc riêng lẻ, khuẩn lạc nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày. Khi già tế bào mọc dính thành cụm, và chúng mọc theo đường cấy giống. A. xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế người ta thường bổ sung thêm acid acetic hay acid citric vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ và tăng hiệu suất tổng hợp cellulose. 1.1.3.5 Vai trò của cellulose vi khuẩn đối với A. xylinum. Màng cellulose được sản xuất bởi A. xylinum đóng nhiều vai trò cho sự phát triển và tồn tại của vi sinh vật trong tự nhiên.  Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn trong điều kiện thiếu thức ăn (Bielecki et al., 2001).  Sự tổng hợp và tiết cellulose bởi A. xylinum giúp tế bào lơ lửng và tới được bề mặt giàu khí oxy vì đây là vi khuẩn hiếu khí. Do đó chỉ những tế bào gần ranh giới lỏng khí của môi trường mới sản xuất cellulose (Krystynowicz et al., 2002; Watanabe et al., 1998)  Màng cellulose xúc tiến sự hình thành tập đoàn của A. xylinum trên cơ chất và bảo vệ vi khuẩn trước những đối thủ cạnh tranh sử dụng cùng cơ chất.  Vì độ nhớt và đặc tính ưa nước của lớp cellulose nên khả năng chống chịu với những thay đổi bất lợi (thay đổi pH, sự có mặt của chất độc và vi sinh vật gây bệnh…) trong môi trường sống tăng lên.  Sợi cellulose giúp chống ảnh hưởng gây chết của tia UV. 23% vi khuẩn acetic được bao bọc bởi màng cellulose có thể sống sót hơn 1 giờ khi bị chiếu tia UV (Bielecki et al., 2001). 9 Chương 2. Tổng quan tài liệu 1.2 Sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn A. xylinum 1.2.1 Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở A. xylinum Theo Ross et al. (1991), con đường sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn từ glucose thành các sợi kết tinh đòi hỏi phải có sự tổng hợp uridine diphosphoglucose (UDP-Glucose), sau đó là một phản ứng tổng hợp cellulose và cuối cùng là sự tập hợp lại thành sợi cellulose nhỏ để hình thành nên các dải tinh thể cellulose. UDP-Glucose là một nucleotide tiền thân của sự tổng hợp cellulose trong A. xylinum. Như sơ đồ duới đây, quá trình sinh tổng hợp UDP-Glucose từ glucose là một quá trình trải qua 3 bước có sự tham gia của 3 loại enzyme. Những bước này là sự phosphoryl hoá của glucose bởi xúc tác của enzyme glucokinase thành glucose-6-phosphate, sự izomer hoá của glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate bởi phosphoglucomutase, và sự tổng hợp UDP-Glucose bởi UDP-Glucose pyrophosphorylase. UDP-Glucose pyrophosphorylase đóng vai trò then chốt trong sự sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum trong khi các chủng A. xylinum đột biến không có khả năng tổng hợp cellulose bị thiếu enzyme này (Valla & Kjosbakken, 1981). Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose trong A. xylinum (Canon & Anderson, 1991) 1.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum trên được chia thành hai giai đoạn chính: giai đoạn polymer hóa và giai đoạn kết tinh. 1.2.2.1 Giai đoạn polymer hóa Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển glucose thành glucose-6-phosphate (Glc-6-P). Sau đó enzyme phosphoglucomutase (PGM) tiếp tục chuyển hóa glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate (Glc-1-P) thông qua phản ứng isomer hóa. Glucose-1-phosphate được enzyme UDP-Glucose pyrophospholyase chuyển hóa 10 Chương 2. Tổng quan tài liệu thành UDP-Glucose. Cuối cùng, UDP-Glucose được polymer hóa thành cellulose và cellulose được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là cellulose synthase (Iguchi et al., 2000). Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng đường fructose hiệu quả hơn sẽ tạo cellulose theo con đường sau: lúc này hệ thống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển fructose thành fructose–1-phosphate. Sau đó fructose-1-phosphate sẽ được chuyển hóa thành fructose-1,6biphosphate nhờ enzyme fructose–1-phosphatekinase. Sau đó, enzyme phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển hóa fructose-6-phosphate thành glucose-6phosphate. Tiếp theo glucose-6-phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hóa tương tự như trên để tạo ra cellulose (Iguchi et al., 2000). Hình 2.5: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn (Iguchi et al., 2000) 1.2.2.2 Giai đoạn kết tinh Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết β-1,4-glucan. Các chuỗi glucan kết hợp với nhau tạo thành lớp chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der Waals. Lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan. Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi và được phun ra ngoài môi trường thông qua các lỗ trên bề mặt của vi khuẩn (hình 2.6). Ảnh chụp 11