Tài liệu Luận văn Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy bao phấn lúa

B GIÁO D C VÀ ðÀO T O TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I ---------------- ------------------ NGUY N KIM OANH NGHIÊN C U HOÀN THI N QUY TRÌNH NUÔI C Y BAO PH N LÚA LU N VĂN TH C SĨ NÔNG NGHI P Chuyên ngành: CÔNG NGH SINH H C Mã s : 60.42.02.01 Ngư i hư ng d n khoa h c: PGS.TS. PHAN H U TÔN HÀ N I – 2013 L I CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan s li u và k t qu nghiên c u trong lu n văn này là trung th c và chưa h ñư c s d ng ñ b o v m t h c v nào. Tôi xin cam ñoan m i s giúp ñ cho vi c th c hi n lu n văn ñã ñư c c m ơn và các thông tin trích d n trong lu n văn ñã ñư c ch rõ ngu n g c. Hà N i, ngày 25 tháng 3 năm 2013 Tác gi lu n văn Nguy n Kim Oanh Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… i L I C M ƠN ð hoàn thành ñ tài lu n văn cao h c này, ngoài s n l c c g ng c a b n thân, tôi ñã nh n ñư c s giúp ñ t n tình c a th y cô, b n bè và ngư i thân. Tôi xin chân thành c m ơn các th y, cô giáo trong b môn Sinh h c phân t và Công ngh sinh h c ng d ng ñã t n tình giúp ñ trong quá trình th c t p. ð c bi t tôi xin bày t! lòng bi t ơn sâu s c nh"t t#i th y giáo hư#ng d n PGS.TS Phan H$u Tôn - Trư%ng B môn Sinh h c phân t và Công ngh sinh h c ng d ng - Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i, ñã t n tình hư#ng d n, ch b o, giúp ñ và ñ ng viên tôi trong su t quá trình th c hi n ñ tài. Qua ñây tôi cũng xin g i l i c m ơn ñ n Trung tâm B o t n và Phát tri n ngu n gen cây tr ng - Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i ñã t o ñi u ki n và giúp ñ tôi trong quá trình th c hi n ñ tài. Cu i cùng, tôi xin g i l i c m ơn chân thành ñ n gia ñình, ngư i thân và toàn th b n bè ñã ñ ng viên và khích l ñ tôi trong su t quá trình h c t p và hoàn thi n lu n văn. Xin chân thành c m ơn ! Hà N i, ngày 25 tháng 3 năm 2013 H c viên Nguy n Kim Oanh Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… ii M CL C L i cam ñoan i L i c m ơn ii M cl c iii Danh m c các ký hi u, các ch vi t t t vi Danh m c b ng vii Danh m c hình viii 1 M ð U 1 1.1 ð tv nñ 1 1.2 M c ñích c a ñ tài 2 1.3 Yêu c u c a ñ tài 2 2 T NG QUAN TÀI LI U 3 2.1 Gi i thi u v phương pháp nuôi c y bao ph n trong ch n t o gi ng cây tr ng 3 2.2 Tình hình nghiên c u ng d ng k thu t nuôi c y bao ph n lúa 7 2.2.1 Tình hình nghiên c u trên th gi i 7 2.2.2 Tình hình nghiên c u trong nư c 9 2.3 Các y u t 2.3.1 Ki!u gen c a cây cho bao ph n 11 2.3.2 Giai ño n phát tri!n c a h t ph n 13 2.3.3 ði u ki n sinh lý c a cây cho bao ph n 14 2.3.4 Nhi t ñ" và th i gian x# lý ñòng 15 2.3.5 ði u ki n nuôi c y 16 2.3.6 Thành ph n môi trư ng nuôi c y 16 2.3.7 Qúa trình phân hoá callus 20 2.3.8 Hi n tư$ng b ch t ng 21 2.4 Cây ñơn b"i và ñ c ñi!m di truy n c a cây ñơn b"i 22 nh hư ng ñ n quá trình nuôi c y bao ph n lúa Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 11 iii 3 V%T LI U, N I DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C(U 24 3.1 V t li u và ph m vi nghiên c u 24 3.1.1 V t li u nghiên c u 24 3.1.2 Ph m vi nghiên c u 24 3.2 ð)a ñi!m và th i gian ti n hành 24 3.2.1 ð)a ñi!m nghiên c u 24 3.2.2 Th i gian ti n hành: 25 3.3 N"i dung nghiên c u 25 3.4 Phương pháp nghiên c u 25 3.4.1 L y m*u và x# lý m*u 26 3.4.2 C y bao ph n ñ! t o callus 26 3.4.3 Tái sinh cây t+ callus 27 3.4.4 Môi trư ng nuôi c y 27 3.5 B trí thí nghi m 27 3.5.1 Thí nghi m 1 27 3.5.2 Thí nghi m 2 27 3.5.3 Thí nghi m 3 28 3.5.4 Thí nghi m 4 29 3.5.5 Thí nghi m 5 29 3.5.6 Thí nghi m 6 30 3.5.7 Thí nghi m7 30 3.5.8 Thí nghi m 8 31 3.6 Phương pháp ñánh giá và x# lý s li u 31 3.6.1 Phương pháp ñánh giá 31 3.6.2 Phương pháp x# lý s li u 32 4 K,T QU- VÀ TH-O LU%N 33 4.1 Giai ño n T o callus 33 4.1.1 Ph n ng c a bao ph n trong quá trình nuôi c y 33 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… iv 4.1.2 -nh hư ng c a ki!u gen t i s. hình thành callus 35 4.1.3 -nh hư ng c a th i gian x# lý l nh ñ n kh năng t o callus 39 4.1.4 -nh hư ng c a n ng ñ" ch t kh# trùng ñ n t0 l s ng c a m*u c y 43 4.1.5 -nh hư ng c a môi trư ng MS và N6 ñ n kh năng t o callus c a m*u c y 4.1.6 45 -nh hư ng c a n ng ñ" 2,4D ñ n kh năng hình thành callus c a bao ph n 47 4.2 Giai ño n tái sinh ch i 50 4.2.1 -nh hư ng ch t lư$ng callus ñ n kh năng tái sinh cây 50 4.2.2 -nh hư ng c a n ng ñ" BAP ñ n kh năng tái sinh ch i 54 4.3 Giai ño n ra r1 hình thành cây hoàn ch2nh 57 4.3.1 -nh hư ng c a n ng ñ" NAA ñ n kh năng ra r1 c a cây tái sinh 57 4.3.2 -nh hư ng c a môi trư ng thu n dư3ng ñ n kh năng sinh trư ng c a cây 63 5 K,T LU%N VÀ ð4 NGH5 70 5.1 K t lu n 70 5.2 ð ngh) 70 TÀI LI U THAM KH-O 72 PH L C 1 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… v DANH M C CÁC KÝ HI U, CÁC CH VI T T T 2,4D Acid 2,4 dichlorophenoxy axetic Cs C"ng s. CT Công th c BAP 6- Benzylaminopurine Kinetin 6- Furfurylaminopurine MS Murashige and Skoog, 1962 N6 Chu & Cs, 1976 NAA Naphlene axetic acid NCBP Nuôi c y bao ph n NXB Nhà xu t b n Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… vi DANH M C B NG STT Tên b ng Trang 4.1 -nh hư ng c a ki!u gen ñ n s. hình thành callus 35 4.2 ð"ng thái hình thành callus sau 5 tu n theo dõi 38 4.3 -nh hư ng c a th i gian x# lý l nh ñ n kh năng t o callus 40 4.4 -nh hư ng c a n ng ñ" ch t kh# trùng ñ n t0 l s ng c a các dòng nghiên c u 43 4.5 -nh hư ng c a môi trư ng ñ n kh năng t o callus t+ bao ph n lúa 46 4.6 -nh hư ng c a n ng ñ" 2,4D ñ n t0 l t o thành callus và t2 l 48 ch t c a các dòng nghiên c u 4.7a -nh hư ng c a n ng ñ" BAP ñ n kh năng tái sinh ch i các công th c nghiên c u thu"c dòng N39 4.7b -nh hư ng c a n ng ñ" BAP ñ n kh năng tái sinh ch i 54 các công th c nghiên c u thu"c dòng N13 4.8 -nh hư ng c a n ng ñ" NAA ñ n kh năng ra r1 c a m*u c y các công th c thí nghi m 2 dòng N39 và N13 4.9 4.11 59 -nh hư ng c a các môi trư ng thu n dư3ng ñ n t0 l s ng c a cây lúa 4.10 56 63 -nh hư ng c a m"t s môi trư ng thu n dư3ng ñ n chi u dài r1, chi u cao cây, s lá và s nhánh 64 Kh năng s ng c a cây in vitro trong ñi u ki n t. nhiên 68 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… vii DANH M C HÌNH STT Tên hình Trang 4.1 Hình nh callus................................................................................. 34 4.2 -nh hư ng c a ki!u gen ñ n kh năng hình thành callus.................. 37 4.3 M i tương quan gi a t0 l bao ph n ch t và t0 l bao ph n t o callus ... 37 4.4a -nh hư ng c a th i gian x# lý l nh ñ n kh năng t o callus và t0 l ch t c a m*u c y dòng N39 .......................................................... 41 4.4b -nh hư ng c a th i gian x# lý l nh ñ n kh năng t o callus và t0 l ch t c a m*u c y dòng N13 .......................................................... 41 4.5a -nh hư ng c a n ng ñ" ch t kh# trùng ñ n t2 l s ng và t0 l ch t c a m*u c y dòng N39 .............................................................. 44 4.5b -nh hư ng c a n ng ñ" ch t kh# trùng ñ n t2 l s ng và t0 l ch t c a m*u c y dòng N13 .............................................................. 44 4.6 -nh hư ng c a môi trư ng ñ n kh năng t o callus t+ bao ph n lúa 2 dòng N39 và N13 (sau 4 tu n theo dõi) .................................... 46 4.7a -nh hư ng c a n ng ñ" 2,4D ñ n t0 l t o thành callus và t2 l ch t 4.7b các công th c dòng N39......................................................... 49 -nh hư ng c a n ng ñ" 2,4D ñ n t0 l t o thành callus và t2 l ch t các công th c dòng N13......................................................... 49 4.8 -nh callus ch m xanh....................................................................... 52 4.9 -nh tái sinh cây xanh ....................................................................... 52 4.10 -nh r1 cây ăn lan vào môi trư ng th ch ........................................... 52 4.11 -nh callus tái sinh m"t cây xanh và m"t cây b ch t ng .................... 53 4.12 -nh r 4.13 -nh tái sinh cây b ch t ng................................................................ 53 c ch ch i phát tri!n ............................................................ 53 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… viii 4.14a -nh hư ng c a n ng ñ" BAP ñ n kh năng tái sinh ch i các công th c nghiên c u thu"c dòng N39.............................................. 55 4.14b -nh hư ng c a n ng ñ" BAP ñ n kh năng tái sinh ch i các công th c nghiên c u thu"c dòng N13.............................................. 56 4.15 Ch i xanh tái sinh t+ callus sau 25 ngày nuôi c y............................. 57 4.16 Ch i lúa m i ñư$c c y trên môi trư ng ra r1 .................................... 58 4.17a -nh hư ng c a n ng ñ" NAA ñ n kh năng ra r1 c a m*u c y các công th c nghiên c u dòng N39 ................................................. 60 4.17b -nh hư ng c a n ng ñ" NAA ñ n kh năng ra r1 c a m*u c y các công th c nghiên c u dòng N13 ................................................. 60 4.18 Cây lúa N39 sau 10 ngày c y trên môi trư ng ra r1 .......................... 61 4.19 -nh ra r1 trong môi trư ng th ch c a cây tái sinh............................. 61 4.20a -nh hư ng c a các môi trư ng thu n dư3ng ñ n kh năng sinh trư ng c a cây lúa dòng N39 ............................................................ 65 4.20b -nh hư ng c a các môi trư ng thu n dư3ng ñ n kh năng sinh trư ng c a cây lúa dòng N13 ............................................................ 65 4.21 -nh cây in vitro ñ t tiêu chu6n ra cây............................................... 69 4.22 Ra cây ngoài t. nhiên ....................................................................... 69 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… ix 1. M ð U 1.1. ð t v!n ñ# Cây lúa (Oryza sativa.L) là cây lương th.c gi vai trò r t quan tr ng, thu"c nhóm cây t. th ph n. ð! t o ra m"t gi ng m i ñ i v i cây t. th ph n thư ng ngư i ta ti n hành lai h u tính sau ñó cho các th h ñ i sau t. th . Tuy nhiên, ñ! t o ñư$c dòng thu n ñ ng h$p t# t t c các gen theo cách này thư ng ph i m t t+ 7 ñ n 8 ñ i. N u b m7 khác xa nhau v m t di truy n thì s ñ i t. th c n thi t có th! ph i dài hơn nhi u, khi c n t. th liên t c trên 10 th h th m chí v*n còn phân ly. ð! rút ng n th i gian t o dòng thu n, hi n nay ngư i ta ñã ti n hành k thu t nuôi c y bao ph n, ho c bào t# h t ph n thư ng là t+ cây F1 và F2 ñ! t o ra cây ñơn b"i, sau ñó lư3ng b"i hoá b8ng x# lý Colchicine ñ! t o cây nh) b"i, ñ ng h$p t# v h u h t các gen. Như v y, nuôi c y bao ph n là m"t k thu t h u hi u ñ! t o ra các dòng ñ ng h$p t# ngay t+ th h ñ u tiên (dòng ñơn b"i kép), do ñó ti t ki m ngu n l.c và rút ng n th i gian c n thi t ñ! t o ra gi ng m i (Javed, 2007)[32]. Trên th gi i cũng như t i Vi t Nam, k thu t nuôi c y bao ph n ñã thành công nhi u ñ i tư$ng cây tr ng trong ñó có cây lúa.Tuy nhiên, hi u qu c a quá trình nuôi c y bao ph n lúa ph thu"c nhi u y u t : ki!u gen c a cây ñưa vào nuôi c y, y u t môi trư ng: nhi t ñ", ánh sáng, thành ph n các ch t trong môi trư ng nuôi c y và các k thu t x# lý trư c và sau khi nuôi c y bao ph n (Tr n Duy Quý, 1999; Asoliman, 2007) [13] [23]. Trong nhi u năm qua ñã có hàng lo t nh ng nghiên c u v v n ñ này, t p trung vào hai hư ng chính là c i t o v m t di truy n ph n ng trong nuôi c y bao ph n thông qua ch n l c, lai t o (Herath, 2007) [31] và t i ưu hóa môi trư ng nuôi c y (Bidhan, 2005; Chen, 2007) [24] [27]. Có nhi u nghiên c u v nuôi c y bao Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 1 ph n lúa ñã ñư$c công b nhưng còn chưa th ng nh t. Chính vì v y ñ! kh:ng ñ)nh l i nh ng y u t nh hư ng t i k t qu nuôi c y bao ph n lúa và ng d ng chúng trong ch n t o dòng thu n chúng tôi ti n hành nghiên c u ñ tài: “Nghiên c u hoàn thi n quy trình nuôi c"y bao ph"n lúa”. 1.2. M$c ñích c%a ñ# tài Xác ñ)nh ñư$c ñi u ki n nuôi c y t i ưu nh t cho quá trình t o callus và tái sinh cây xanh. Hoàn thi n quy trình k thu t nuôi c y bao ph n lúa. 1.3. Yêu c&u c%a ñ# tài Nghiên c u 3 giai ño n: Giai ño n t o callus: Nghiên c u nh hư ng c a ki!u gen, th i gian x# lý l nh, n ng ñ" ch t kh# trùng, lo i môi trư ng và n ng ñ" ch t kích thích sinh trư ng (2,4D) ñ n kh năng t o callus c a m*u c y. Giai ño n tái sinh cây: Nghiên c u nh hư ng c a n ng ñ" BAP ñ n kh năng tái sinh ch i xanh. Giai ño n ra r' hình thành cây hoàn ch nh: Nghiên c u nh hư ng c a n ng ñ" NAA ñ n kh năng ra r1 c a cây tái sinh và nh hư ng c a môi trư ng thu n dư3ng ñ n kh năng sinh trư ng c a cây. Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 2 2. T'NG QUAN TÀI LI U 2.1. Gi i thi(u v# phương pháp nuôi c!y bao ph!n trong ch n t*o gi ng cây tr+ng Nuôi c y mô t bào và b" ph n cơ quan th.c v t trong môi trư ng dinh dư3ng vô trùng nh8m t o cây hoàn ch2nh là m"t hư ng nghiên c u cơ b n và ng d ng quan tr ng trong công tác ch n t o và nhân gi ng cây tr ng. Ý tư ng này ñư$c ñ xu t vào năm 1838 – 1839 trong n"i dung h c thuy t t bào c a Schleiden và Schwann. Tuy nhiên, v*n chưa ñư$c ng d ng cho ñ n ñ u th k0 20 Haberlant – nhà sinh lý h c th.c v t ngư i ð c nh n m nh tính toàn năng c a t bào th.c v t. Theo ông thì m;i t bào c a cơ th! sinh v t nào cũng ñ u mang toàn b" lư$ng thông tin di truy n c n thi t và ñ y ñ c a sinh v t ñó. Vì v y, khi g p ñi u ki n thích h$p m;i t bào ñ u có th! phát tri!n thành cá th! hoàn ch2nh. ði u này ñã thu hút nhi u nhà khoa h c trên th gi i quan tâm chú ý ñ n hư ng nghiên c u này và h ñã thu ñư$c nhiêù thành t.u to l n. [17] Nuôi c y bao ph n là k thu t nuôi c y invitro bao ph n ch a các bào t# ho c các h t ph n chưa chín trên môi trư ng dinh dư3ng nhân t o nh8m t o cây ñơn b"i. S lư$ng nhi1m s c th! (NST) c a cây ñơn b"i ñư$c lư3ng b"i hoá lên b8ng th thu t thích h$p t o cây lư3ng b"i ñ ng h$p t# hoàn toàn g i là cây nh) b"i hoá [17]. Nuôi c y bao ph n thành công ñ u tiên vào năm 1950 do Morel ngư i Pháp th.c hi n thành công trên cây Kho t# (cây m"t lá m m), trên môi trư ng có b< sung nư c d+a t o thành mô s7o. ð n năm 1964 hai nhà khoa h c ngư i =n ð" là Guha và Maheshawari nuôi c y thành công cây cà ñ"c dư$c (Datura innoxia) [9], hình thành phôi và t+ phôi này cho cây hoàn ch2nh. Thành công này ñã kh i ñ u cho nhi u nghiên c u v nuôi c y h t ph n c a các lòai th.c v t h t kín khác. Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 3 Năm 1967 v i công trình c a Bouirgin và Nistch, ñã nuôi c y thành công bao ph n cây thu c lá (Nicotiana) t o thành cây ñơn b"i. ð c bi t, năm 1968 Niizeki và Oono thu ñư$c cây ñơn b"i t+ bao ph n lúa (Oryza sativa), ñã t o ra kh năng ng d ng l n cho công ngh ch n t o gi ng lúa. Nuôi c y bao ph n là phương pháp h u hi u t o dòng ñ ng h$p t# tuy t ñ i, hoàn toàn không phân ly trong các th h sau. Bên c nh ñó, thông qua k thu t nuôi c y bao ph n có th! c ñ)nh ñư$c ưu th lai và các gen h u tính t+ con lai F1, có ưu th lai cao, làm tăng năng su t lúa (M.S.Swaminathan, 1995; Chen et al, 1978; Narayanan et al,1996; Siddiq et al, 1994; Zhu De Yao, 1998) [36]. M t khác, trong quá trình nuôi c y có th! phát sinh t o các ñ"t bi n, các ñ"t bi n này cung c p ngu n nguyên li u cho ch n l c. ðây là l i thoát kỳ di u ñ i v i lĩnh v.c ng d ng cây ñơn b"i vào công tác ch n gi ng cây tr ng. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi c y mô t bào th.c v t th.c ch t là k t qu c a quá trình phân hoá và ph n phân hoá c a t bào. Vì v y k thu t nuôi c y bao ph n cũng chính là k thu t ñi u khi!n s. phát sinh hình thái c a t bào th.c v t m"t cách có ñ)nh hư ng d.a vào quá trình phân hoá và ph n phân hoá c a t bào trên cơ s tính toàn năng c a t bào th.c v t.. Trong quá trình nuôi c y có r t nhi u y u t nh hư ng t i s. phân hoá t bào và mô th.c v t, trong ñó nhân t ch y u là ch t ñi u hoà sinh trư ng thu"c 2 nhóm là auxin và cytokinin. Qúa trình nuôi c y bao ph n tr i qua 2 giai ño n là giai ño n mô s7o và giai ño n tái sinh cây. giai ño n 1: Các t bào x y ra quá trình ph n phân hóa, các ti!u bào t# phân chia hình thành mô s7o, giai ño n 2: Các mô s7o phân chia liên t c và có kh năng phân hóa thành phôi, ch i và cây hoàn ch2nh (thân, lá và r1). M;i giai ño n có nh ng ñ c ñi!m khác nhau và yêu c u v ñi u ki n nuôi c y Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… 4 khác nhau. K t qu c a quá trình nuôi c y ta nh n ñư$c cây ñơn b"i ho c cây t. lư3ng b"i hóa. T0 l cây ñơn b"i nh n ñư$c ph thu"c vào các y u t như: giai ño n phát tri!n c a h t ph n và th i gian duy trì giai ño n mô s7o (tu - Xem thêm -