BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LÊN MEN NƢỚC THANH LONG
BẰNG VI KHUẨN ACID LACTIC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:
ThS. HUỲNH XUÂN PHONG
SINH VIÊN THỰC HIỆN:
NGUYỄN THÚY VI
MSSV: 3082567
Lớp: Công nghệ Sinh học TT K34
Cần Thơ, Tháng 5/2013
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
SINH VIÊN THỰC HIỆN
ThS. Huỳnh Xuân Phong
Nguyễn Thúy Vi
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày
tháng 05 năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn đến Trường Đại học Cần Thơ, Viện Nghiên cứu và
Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng Quý Thầy Cô đã tận tình giảng dạy tôi trong thời
gian học tập vừa qua.
Xin đươ ̣c bày tỏ lòng biế t ơn sâu sắ c của min
̀ h đế n ThS . Huỳnh Xuân phong đã
tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn TS . Ngô Thị Phương Dung , anh Nguyễn Ngọc Thạnh
và anh Phạm Hồng Quang
– cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực
phẩm, anh chị cán bô ̣ các phòng thí nghiệm
Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện
Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ , đóng góp ý kiế n và tạo điều
kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài.
Xin ghi ơn gia đình và tất cả bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian qua.
Kính chúc Quý Thầy Cô được nhiều sức khỏe, thành đạt và luôn có những cống
hiến quý báu cho sự nghiệp giáo dục và đào tạo.
Xin chân thành cảm ơn!
Nguyễn Thúy Vi
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
TÓM LƢỢC
Đề tài nhằm phân lập dòng vi khuẩn acid lactic có khả năng ứng dụng để sản
xuất nước thanh long lên men. Nghiên cứu các điều kiện được thực hiện để khảo sát
sản xuất nước thanh long lên men như tỉ lệ pha loãng, tỉ lệ đường phối chế, mật số
giống chủng, nhiệt độ ủ, thời gian lên men và điều kiện bảo quản thích hợp. Kết quả
phân lập được 6 dòng vi khuẩn từ nước thanh long lên men tự nhiên và 3 loại bột men
tiêu hóa. Kết quả cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn này đều có thể phát triển trong
điều kiện pH thấp (1,5 – 3,5) và có khả năng ứng dụng trong sản xuất nước thanh long
lên men (đạt mật số trên 6 log CFU/mL). Trong đó dòng vi khuẩn Lactobacillus
acidophilus A được phân lập từ bột men tiêu hóa Antibio có khả năng lên men nước
thanh long tốt nhất (hàm lượng acid đạt 1,38% w/v và mật số 8,44 log CFU/mL). Xác
định được các điều kiện lên men thích hợp với các điều kiện: dịch thanh long nguyên
chất với tỉ lệ đường phối chế 9%, lên men ở 37˚C trong 48 giờ và nồng độ giống
chủng là 6 log CFU/mL. Sản phẩm được đánh giá tốt về mùi và vị (không quá nồng
của acid và độ ngọt vừa phải), mật số vi khuẩn 9,3 log CFU/mL.. Nhiệt độ tồn trữ sản
phẩm ở 4 − 6ºC trong 3 tuần vẫn đảm bảo được mùi, vị và mật số vi khuẩn (trước khi
trữ là 6,87 log CFU/mL và sau khi trữ là 7,02 log CFU/mL)
Từ khóa: Lactobacillus acidophilus, lên men, probiotic, thanh long, vi khuẩn acid
lactic.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
i
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ...................................................................................................................
TÓM LƢỢC .................................................................................................................... i
MỤC LỤC ......................................................................................................................ii
DANH SÁCH BẢNG .................................................................................................... iv
DANH SÁCH HÌNH ...................................................................................................... v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................. vi
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU ........................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu đề tài .................................................................................................... 1
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................... 3
2.1. Giới thiệu về probiotic......................................................................................... 3
2.2. Sơ lƣợc về vi khuẩn acid lactic ........................................................................... 4
2.2.1. Vi khuẩn acid lactic ......................................................................................... 4
2.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn acid lactic ................... 5
2.3. Lên men acid lactic .............................................................................................. 6
2.3.1. Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men acid lactic ........................................... 6
2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men .................................................. 7
2.3.3. Ứng dụng thực tế của lên men acid lactic ....................................................... 7
2.4. Giới thiệu về cây thanh long ............................................................................... 8
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP.............................................. 10
3.1. Phƣơng tiện ........................................................................................................ 10
3.1.1. Thời gian và địa điểm .................................................................................... 10
3.1.2. Phương tiện .................................................................................................... 10
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................. 11
3.2.1. Phân lập và định danh ở mức độ giống các dòng vi khuẩn acid lactic ......... 11
3.2.2. Khảo sát khả năng chịu pH thấp của vi khuẩn acid lactic được phân lập ..... 12
3.2.3. Khảo sát khả năng lên men nước thanh long bằng vi khuẩn acid lactic ....... 12
3.2.4. Khảo sát tỷ lệ pha loãng dịch thanh long và tỷ lệ phối chế đường saccharose . 13
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
ii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
3.2.5. Khảo sát mật số giống chủng và nhiệt độ lên men ........................................ 15
3.2.6. Khảo sát nhiệt độ và thời gian tồn trữ sản phẩm ........................................... 16
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................. 17
4.1. Phân lập và định danh ở mức độ giống các dòng vi khuẩn acid lactic ............. 17
4.2. Khả năng chịu pH thấp của vi khuẩn acid lactic được phân lập ....................... 18
4.3. Khả năng lên men nước thanh long bằng vi khuẩn acid lactic .......................... 20
4.4. Tỷ lệ pha loãng dịch thanh long và tỷ lệ phối chế đường saccharose ............... 22
4.5. Ảnh hưởng của mật số giống chủng, nhiệt độ và thời gian lên men ................. 26
4.6. Nhiệt độ và thời gian tồn trữ sản phẩm ............................................................. 29
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 31
5.1. Kết luận.............................................................................................................. 31
5.2. Đề nghị .............................................................................................................. 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 32
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Các phƣơng pháp phân tích
Phụ lục 2. Phƣơng pháp đánh giá cảm quan
Phụ lục 3. Các kết quả phân tích thống kê
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
iii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Thành phần acid béo của hai giống thanh long.............................................. 9
Bảng 2. Tỉ lệ thành phần môi trường MRS agar ....................................................... 11
Bảng 2. Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn acid lactic ................................. 17
Bảng 4. Mật số vi khuẩn trong môi MRS lỏng có pH thấp ....................................... 19
Bảng 5. Một số chỉ tiêu sau lên men nước thanh long .............................................. 21
Bảng 6. Giá trị pH và độ Brix của các tỉ lệ nước thanh long và phối chế đường ..... 23
Bảng 7. Mô tả các chỉ tiêu đánh giá sản phẩm nước thanh long lên men ................. 25
Bảng 8. Kết quả đánh giá cảm quan về dạng dịch thanh long và đường phối chế .... 25
Bảng 9. Kết quả khảo sát nồng độ giống chủng và nhiệt độ ủ .................................. 26
Bảng 10. Kết quả đánh giá cảm quan về nồng độ, nhiệt độ và thời gian ủ ............... 28
Bảng 11. Kết quả khảo sát nhiệt độ và thời gian tồn trữ sản phẩm ........................... 29
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
iv
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Hylocereus undatus (thanh long ruột trắng) ....................................................... 8
Hình 2. Hylocereus polyrhizus (thanh long ruột đỏ) ....................................................... 8
Hình 3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỷ lệ pha loãng dịch thanh long và phối chế
đường saccharose ............................................................................................... 14
Hình 4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ giống chủng, nhiệt độ và thời gian
lên men ............................................................................................................... 15
Hình 5. Sự thay đổi hàm lượng acid theo dạng nước thanh long và nồng độ đường .... 24
Hình 6. Sự thay đổi mật số vi khuẩn theo dạng dịch thanh long và nồng độ đường .... 24
Hình 7. Hàm lượng acid thay đổi theo nhiệt độ và thời gian chủng giống ................... 27
Hình 8. Mật số vi khuẩn thay đổi theo nhiệt độ và nồng độ giống chủng .................... 28
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
v
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CFU
Colony Forming Unit
FAO
Food and Agriculture Organization of the United Nations
LAB
Lactic Acid Bacteria
MRS
De Man, Rogosa and Sharpe
tb
tế bào
WHO
World Health Organization
HL
Hàm lượng
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
vi
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Thực phẩm là một nhu cầu thiết yếu không thể thiếu đối với con người. Xã hội
ngày càng phát triển, đời sống của con người ngày càng được nâng cao. Vì vậy, nên
việc ăn no không còn là nhu cầu chính mà nhu cầu thưởng thức và tìm hiểu tác dụng
của thực phẩm đối với sức khỏe được đặt lên hàng đầu. Từ đó, mối quan hệ giữa các
sản phẩm thực phẩm và chế độ dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe cũng như giúp cơ thể
chống lại được bệnh tật đã trở thành khuynh hướng nghiên cứu của các chuyên gia
dinh dưỡng và các nhà khoa học nhằm tạo ra các sản phẩm có giá trị cao về mặt sinh
học, được gọi là sản phẩm “probiotic” (chế phẩm sinh học). Sản phẩm probiotic được
định nghĩa là “những vi sinh vật không gây bệnh có khả năng tồn tại sau quá trình tiêu
hóa có tác động tích cực đến sức khỏe và sinh lý của vật chủ”. Hiện nay có nhiều sản
phẩm probiotic sử dụng cho người, vật nuôi, cây trồng được sản xuất và sử dụng dưới
dạng lỏng hoặc dạng bột.
Vi khuẩn acid lactic là nhóm vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong các sản
phẩm probiotic như sữa chua, nem chua, rau cải muối chua,… Những sản phẩm này
không chỉ dùng để ăn uống mà còn dùng để chữa bệnh đường ruột, dạ dày, do vi khuẩn
acid lactic có khả năng tạo ra kháng sinh ngăn chặn, tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh.
Nước trái cây là môi trường tốt cho sự phát triển các vi khuẩn và các sản phẩm
probiotic. Trái cây và rau cải là những thực phẩm có lợi cho sức khỏe bởi chúng chứa
nhiều chất chống oxy hóa, vitamin, chất xơ và khoáng. Hơn nữa, chúng không chứa
bất kỳ chất gây dị ứng cho người tiêu dùng. Trong các loại trái cây thì thanh long là
một loại trái cây phổ biến và có giá trị dinh dưỡng cao. Quả thanh long chín có màu
đặc trưng hấp dẫn, vị chua ngọt, mùi thơm ngon; chứa nhiều vitamin A, C, đường, các
acid hữu cơ nên thanh long được sử dụng phổ biến dưới dạng trái cây tươi.
Nhằm để tận dụng nguồn nguyên liệu phổ biến và có giá trị dinh dưỡng cao
cũng như làm đa dạng hóa các sản phẩm chế biến từ thanh long. Đề tài này thực hiện
nhằm sản xuất nước thanh long lên men bằng vi khuẩn acid lactic tạo sản phẩm có giá
trị về mặt sinh học.
1.2. Mục tiêu đề tài
Phân lập, tuyển chọn một số dòng vi khuẩn acid lactic và nghiên cứu qui trình
sản xuất nước thanh long lên men bằng vi khuẩn aicd lactic..
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
1
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Nội dung thực hiện
-
Phân lập và định danh ở mức độ giống các dòng vi khuẩn acid lactic.
-
Khảo sát khả năng chịu pH thấp của vi khuẩn acid lactic được phân lập.
-
Khảo sát khả năng ứng dụng trong sản xuất nước thanh long lên men bằng
vi khuẩn acid lactic.
-
Khảo sát tỷ lệ pha loãng dịch thanh long và tỷ lệ phối chế đường saccharose.
-
Khảo sát mật số giống chủng và nhiệt độ lên men.
-
Khảo sát nhiệt độ và thời gian tồn trữ sản phẩm.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
2
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về probiotic
Từ probiotic có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa là “cho cuộc sống”. Theo Tổ
chức lương nông thế giới (FAO) hay Tổ chức Y tế thế giới (WHO) thì probiotic là
những vi sinh vật còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức
khỏe của ký chủ. Có rất nhiều định nghĩa về probiotic, “những vi sinh vật sống với số
lượng đủ sau quá trình tiêu hóa có tác dụng tốt cho sức khỏe ngoài những giá trị dinh
dưỡng căn bản” (Guarner và Schaafsma, 1998). Ngoài ra, theo Schrezenmeir và De
Vrese (2001) thì probiotic được định nghĩa là “những vi sinh vật không gây bệnh có
khả năng tồn tại sau quá trình tiêu hóa có tác động tích cực đến sức khỏe và sinh lý của
vật chủ”.
Theo Gregor (1999) thì các vi sinh vật dùng trong các sản phẩm probiotic
thường có các đặc điểm sau: có khả năng bám vào tế bào; loại trừ hoặc làm giảm sự
bám của mầm bệnh; bảo tồn và nhân nhanh số lượng; sản sinh acid, H2O2, chất kháng
sinh từ vi khuẩn có khả năng ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh; chịu được chất
khử trùng âm đạo, bao gồm cả chất diệt trùng; an toàn và không viêm nhiễm, không
sinh chất gây ung thư và không là mầm bệnh. Ngoài ra, các vi sinh vật này còn phải
chịu được pH thấp ở dạ dày và muối mật ở ruột non. Các vi sinh vật sử dụng trong các
sản phẩm probiotic phổ biến hiện nay là nhóm vi khuẩn acid lactic, trong đó chủ yếu là
nhóm Lactobacilli (L. acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. rhamnosus) và nhóm
Bifidobacteria (B. longum, B. bifidum, B. breve, B. infantis).
Theo Guarner và Schaafsma (1998), một trong những tiêu chuẩn của sản phẩm
probiotic là khả năng sống sót của vi sinh vật sau quá trình tiêu quá. Trong hệ thống
tiêu hóa, pH của dạ dày rất thấp, khoảng 1 – 2 cho nên đa số vi sinh vật đều khó tồn tại
ở pH này. Tuy nhiên các vi sinh vật chỉ tồn tại ở pH này chỉ trong 1 – 2 giờ trong dạ
dày sau đó xuống ruột già có pH gần trung tính hơn
Các sản phẩm probiotic có tác động tích cực về mặt sức khỏe như: điều tiết hệ
miễn dịch, tăng cường quá trình sinh tổng hợp các vitamin nhóm B, tăng hấp thụ chất
khoáng, giảm cholesterol trong máu, tăng cường sức khỏe âm đạo đối với phụ nữ, điều
trị chứng viêm khớp, ngăn ngừa bệnh ung thư, cải thiện sự không dung nạp lactose,
ngăn ngừa hoặc làm giảm tác động của bệnh viêm da dị ứng, táo bón cũng như sự
viêm nhiễm của hệ thống bài tiết. Đã có rất nhiều nghiên cứu về vai trò của probiotic
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
3
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
đối với sức khỏe vật nuôi đối với hệ thống miễn dịch ở niêm mạc ruột (Hershberg and
Mayer, 2000); Đối với sự thay đổi của niêm mạc ruột non ở vật nuôi (Glick, 1995;
Fontaine et al., 1996; Dai et al., 2000; McCracken and Lorenz., 2001).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
4
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
2.2. Sơ lƣợc về vi khuẩn acid lactic
2.2.1. Vi khuẩn acid lactic
Vi khuẩn acid lactic (LAB) là những vi khuẩn lên men acid lactic, Gram dương,
không sinh bào tử, hầu hết không di động, oxydase và catalase âm tính. Chúng không
có khả năng tổng hợp nhân hem của porphyrin và không chứa cytochrom. Khả năng
sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần thiết cho sự sống của những vi khuẩn này là rất yếu,
cho nên đa số vi khuẩn acid lactic rất kén chọn thành phần dinh dưỡng, chúng chỉ phát
triển khi trên môi trường có đầy đủ các yếu tố dinh dưỡng cần thiết như acid amin,
peptide, protein, vitamin,… vì vậy môi trường nuôi vi khuẩn có thành phần khá phức
tạp. Vi khuẩn acid lactic có thể lên men được các đường monosaccharide và
disaccharide nhưng không có khả năng lên men tinh bột (chỉ có loài L. delbrueckii là
đồng hóa được tinh bột). Chúng là những vi sinh vật sống kỵ khí tùy nghi, vi hiếu khí,
có khả năng lên men ở những điều kiện hiếu khí cũng như kỵ khí.
Vi khuẩn acid lactic thường có dạng hình cầu hoặc hình que, đường kính của
dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 – 1,5 µm, các tế bào hình cầu xếp thành từng cặp hoặc
chuỗi có chiều dài khác nhau.
Theo Rachel và Adebayo-Tayo (2012) trích dẫn từ Oliveira (2008) thì vi khuẩn
acid lactic có khả năng sản sinh ra các hợp chất kháng vi sinh như ethanol, acid
formic, hydrogen perocide, diacetyl và bacteriocin. Vi khuẩn acid lactic có khả năng
sản sinh ra probiotic (Temmerman et al., 2002). Hơn nữa, vi khuẩn acid lactic cũng tạo
ra những hợp chất hữu cơ giúp tạo mùi và hương vị cho sản phẩm lên men (Caplice và
Fitzgerald, 1999).
Vi khuẩn acid lactic có đặc điểm là sinh acid lactic trong sự biến dưỡng chất bột
đường. Dựa vào sự biến dưỡng glucose vi khuẩn acid lactic được chia làm 2 loại: vi
khuẩn acid lactic đồng hình và vi khuẩn acid lactic dị hình.
- Vi khuẩn acid lactic đồng hình: sản phẩm chủ yếu là acid lactic. Một số vi
khuẩn acid lactic lên men đồng hình (Lê Mỹ Hồng, 2000): Streptococcus lactis,
Streptococcus thermophilus , Lactobacillus acidophilus, Pediococcus cereviceae,…
- Vi khuẩn acid lactic dị hình: ngoài acid lactic còn có thêm các sản phẩm
khác như acid acetic, acid formic, acid succinic, ethanol và CO2. Một số vi khuẩn acid
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
5
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
lactic lên men dị hình: Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus pentoaceticus,
Lactobacillus brevis, Lactobacillus lycopersici, Betabacterium brevis,…
Vi khuẩn acid lactic có mặt ở rất nhiều nơi trong tự nhiên như trong đất, trong
nước, không khí nhưng chủ yếu ở thực vật và một số thực phẩm (rau, quả, thịt,
sữa,…). Vi khuẩn acid lactic là một trong những nhóm vi sinh vật có vai trò quan
trọng trong lên men thực phẩm (sữa chua, nem chua, kim chi, rau cải muối chua, bơ,
phô mai,…). Ngoài ra cũng có một số giống vi khuẩn được tìm thấy trong khoang
miệng và màng nhầy ruột của người và động vật.
2.2.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát triển của vi khuẩn acid lactic
a. Dinh dƣỡng carbon
Vi khuẩn acid lactic có thể sử dụng được nhiều carbohydrate như glucose,
lactose, saccharose, maltose,… để cung cấp năng lượng và tham gia vào cấu trúc của
tế bào. Khi không có mặt cơ chất nguồn carbon, vi khuẩn sẽ sử dụng nguồn năng
lượng và vật liệu tế bào là các acid amin (acid glutamic, arginine, tyrosine,…).
b. Dinh dƣỡng nitơ
Đa số vi khuẩn acid lactic không có khả năng sinh tổng hợp được các hợp chất
hữu cơ phức tạp có chứa nitơ. Do đó, vi khuẩn acid lactic phải sử dụng nguồn nitơ có
sẵn trong môi trường để đảm bảo cho sự phát triển của chúng.
c. Nguồn vitamin
Vitamin rất cần cho sự phát triển của vi khuẩn acid lactic, các vitamin này đóng
vai trò là coenzyme trong quá trình trao đổi chất của chúng. Vi khuẩn acid lactic nói
chung, đặc biệt là trực khuẩn rất cần vitamin làm nguồn chất sinh trưởng. Rất ít vi
khuẩn acid lactic có khả năng tổng hợp vitamin, phần lớn chúng cần nhiều loại vitamin
như: riboflavin, thiamin, biotin.
d. Các chất vô cơ
Các hợp chất vô cơ như đồng, sắt, phospho, natri, iot, mangan, lưu huỳnh cần
cho sự phát triển và hoạt động sống của vi khuẩn acid lactic. Đặc biệt là mangan có tác
dụng trong việc phòng ngừa sự tự phân của tế bào.
Vi khuẩn làm giảm độ acid có trong môi trường cần có phức hợp các chất
khoáng. Cầu khuẩn lên men acid lactic dị hình không phát triển được trên môi trường
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
6
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
đã làm sạch các chất khoáng nhờ trao đổi ion. Ở các môi trường có bổ sung ion K+,
Mg2+, Mn2+ sẽ giúp hoạt hóa các vi khuẩn đã kém hoạt lực.
e. Oxy
Quan hệ giữa các loài vi khuẩn với oxy ở mức độ hiếu khí của môi trường khác
nhau là rất khác nhau. Trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt sẽ làm cho trực khuẩn lên
men dị hình chậm phát triển ở giai đoạn đầu, sự sinh trưởng của trực khuẩn lên men
đồng hình giảm 10%, lên men giảm 23%. Các loài lên men dị hình sinh trưởng tốt nhất
ở điều kiện kỵ khí.
f. Nhiệt độ
Nhiệt độ phát triển của các vi khuẩn acid lactic khác nhau thì khác nhau, tuy
nhiên đại bộ phận vi khuẩn acid lactic bị ức chế hoạt động ở nhiệt độ 45ºC trở lên.
Riêng loài Lactobacillus delbrueckii là loài phát triển và hoạt động mạnh ở nhiệt độ
50ºC. Khi gia nhiệt đến 60 - 80ºC hầu hết vi khuẩn acid lactic bị chết sau 10 - 30 phút.
g. pH môi trƣờng
Các chủng vi khuẩn acid lactic chịu được pH thấp khác nhau, đối với vi khuẩn
phân lập từ rượu vang có thể chịu được pH 3,0 - 3,5 hoặc thấp hơn (Kiều Hữu Ảnh,
1999).
2.3. Lên men acid lactic
2.3.1. Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men acid lactic
Lên men acid lactic là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ vi sinh
vật, điển hình là vi khuẩn acid lactic. Lên men acid lactic là một trong những loại hình
lên men điển hình nhất trong tự nhiên. Dựa vào sản phẩm tạo thành sau lên men mà
người ta chia chúng ra thành hai nhóm vi khuẩn: lên men đồng hình và lên men dị
hình.
- Lên men đồng hình: quá trình lên men tạo acid lactic theo chu trình EmbdenMeyerhorf. Trong tế bào vi khuẩn lên men acid lactic đồng hình có đầy đủ enzyme
carboxylase, do vậy pyruvate không bị phân giải sâu hơn, thay vào đó nó nhận
hydrogen được tách ra và chuyển tới pyruvate để tạo thành acid lactic. Lượng acid
lactic tạo thành chiếm hơn 90% sản phẩm, chỉ một phần nhỏ pyruvate còn lại bị khử
carbon chuyển thành các sản phẩm phụ khác.
Phương trình tổng quát của quá trình lên men acid lactic đồng hình :
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
7
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
C6H12O6 → 2CH3-CHOH-COOH + năng lượng
- Lên men dị hình: xảy ra khi vi khuẩn acid lactic không có đủ các enzyme cơ
bản của chu trình Embden-Meyerhorf là aldolase và trizaphosphattizomerase, vì vậy
chúng đi theo con đường pentose phosphate. Sản phẩm của quá trình ngoài acid lactic
còn có các sản phẩm phụ như acid acetic, acid formic, acid succinic, ethanol và CO2.
2.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men
a. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy
Vi khuẩn acid lactic thuộc loại vi sinh vật dị dưỡng. Nguồn năng lượng cần thiết
cho hoạt động sống và phát triển của chúng là nguồn năng lượng do trao đổi chất với
môi trường bên ngoài. Để điều hòa các quá trình chuyển hóa trong tế bào và duy trì sự
sống, vi khuẩn acid lactic cần sử dụng nguồn glucid có trong môi trường dinh dưỡng
làm nguồn carbon, nguồn nitơ (peptone, acid amin), vitamin (B1, B2, B6, PP và
Biotin), muối khoáng và các nguyên tố vi lượng (Mn, Mo, Zn, Cu,…).
b. Các yếu tố môi trƣờng
- Nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của vi sinh vật, tốc độ
hình thành và giải phóng sản phẩm cuối cùng.
- pH: mỗi loài vi sinh vật sẽ phát triển tối ưu trong một giới hạn pH nhất định.
Đối với cùng một tác nhân vi sinh vật nhưng nuôi ở những môi trường pH khác nhau
sẽ tạo ra các sản phẩm lên men khác nhau.
- Nồng độ dịch lên men: Nồng độ chất tan quá cao dẫn đến làm tăng áp suất thẩm
thấu và làm mất cân bằng sinh lý của vi sinh vật, kết quả làm ức chế hoạt động của vi
sinh vật.
- Hàm lượng giống: Hàm lượng giống sử dụng nhiều sẽ làm tăng tốc độ lên men
và rút ngắn thời gian sản xuất. Tuy nhiên nếu sử dụng quá nhiều sẽ ảnh hưởng đến
chất lượng sản phẩm.
2.3.3. Ứng dụng thực tế của lên men acid lactic
- Trong công nghiệp thực phẩm: acid lactic được sử dụng như là một chất gia vị
đối với các loại đồ uống nhẹ, dịch quả, mứt, sirô. Thay thế acid citric trong sản xuất
kẹo, đồ hộp,... Ngoài ra, acid lactic còn dùng để acid hóa rượu vang hoa quả nghèo
acid, acid hóa dịch đường hóa trong công nghiệp sản xuất rượu mạnh và sản xuất bột
chua trong ngành bánh mì.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
8
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
- Trong công nghiệp thực nhẹ: là dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn,
nhuộm, thuộc da.
- Vi khuẩn acid lactic có vai trò quan trọng trong sản xuất sữa chua, phomat,
muối chua rau quả, sản xuất tương, ủ chua thức ăn gia súc.
- Trong y học: chữa bệnh đường ruột, acid lactic được ứng dụng trong phẫu thuật
chỉnh hình, người ta thường sử dụng một loại vật liệu có tên là purasorb đây là một
hợp chất cao phân tử được sản xuất từ acid lactic.
2.4. Giới thiệu về cây thanh long
Thanh long một loài cây được trồng chủ yếu để lấy quả và cũng là tên của một
vài chi của họ xương rồng. Thanh Long là loài thực vật bản địa tại Mexico, các
nước Trung Mỹ và Nam Mỹ. Hiện nay, loài cây này cũng được trồng ở các nước trong
khu vực Đông Nam Á như Việt Nam, Malaysia, Thái Lan, Philippines, Indonesia (đặc
biệt là ở miền tây đảo Java); miền nam Trung Quốc, Đài Loan và một số khu vực
khác.
Hình 1: Hylocereus undatus (Thanh long ruột trắng)
(Nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/Thanh_long_(th%E1%BB%B1c_v%E1%BA%ADt, 20/01/2013)
Hình 2. Hylocereus polyrhizus (Thanh long ruột đỏ)
(Nguồn:http://vi.wikipedia.org/wiki/Thanh_long_(th%E1%BB%B1c_v%E1%BA%ADt, 20/1/2013)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
9
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
Giá trị dinh dưỡng trong 100 g quả thanh long (trong đó có 55 g ăn được) như
sau:
- Nước: 80 – 90 g
- Cacbohydrate: 9 – 14 g
- Protein: 0,15 – 0,5 g
- Chất béo: 0,1 – 0,6 g
- Chất xơ: 0,3 – 0,9 g
- Tro: 0,4 - 0,7 g
- Năng lượng: 35 – 50 Cal
- Canxi: 6 – 10 mg
- Sắt: 0,3 – 0,7 mg
- Phospho: 16 – 36 mg
- Caroten (Vitamin A): dạng vết
- Thiamin (Vitamin B1): dạng vết
- Riboflavin (Vitamin B2): dạng vết
- Niacin (Vitamin B3): 0,2 – 0,45 mg
- Acid ascorbic (Vitamin C): 4 – 25 mg
Các giá trị nêu trên có thể thay đổi theo giống và điều kiện trồng trọt.
Bảng 1. Thành phần acid béo của hai giống thanh long
Thành phần
Hylocereus polyrhizus
(Thanh long ruột đỏ)
Hylocereus undatus
(Thanh long ruột trắng)
Acid myristic
0,2%
0,3%
Acid palmitic
17,9%
17,1%
Acid stearic
5,49%
4,37%
Acid palmitoleic
0,91%
0,61%
Acid oleic
21,6%
23,8%
Cis-Acid vaccenic
3,14%
2,81%
Acid linoleic
49,6%
50,1%
Acid linolenic
1,21%
0,98%
(Nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/Thanh_long_(th%E1%BB%B1c_v%E1%BA%ADt)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
10
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013
Trường Đại học Cần Thơ
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Phƣơng tiện
3.1.1. Thời gian và địa điểm
- Thời gian thực hiện: từ 01/2013 đến 05/2013
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu
và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ
3.1.2. Phƣơng tiện
a. Vật liệu
- Men vi sinh sống dạng đông khô:
Bột Antibio: Sản phẩm của Han Wha Pharma Co., Ltd. (Số 472, Namgog-Ri,
Yangji - Myon, Yongin - Si, Kyonggi - Do, Korea).
Bột Probio: Sản xuất tại Công Ty Cổ phần Dược phẩm Imexpharm (Số 4,
đường 30/4, thị xã Cao Lãnh, Đồng Tháp).
Bột Lactomin plus: Sản phẩm của RexGene Biotech Co., Ltd. (Số 641 - 2,
Ochang - Myun, Cheongwon - Kun, Chungbuk, Korea).
- Thanh long: được mua tại chợ Xuân Khánh, Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần
Thơ
b. Thiết bị - dụng cụ
- pH kế (Sartorius, PB - 20, Đức)
- Brix kế (Refractometer, FG 103/113, Euromex - Hà Lan)
- Máy chuẩn độ điện thế (SCHOTT, Đức)
- Máy ép trái cây (PANASONIC, Nhật Bản)
- Lò vi sóng (SANYO, Nhật Bản)
- Nồi hấp khử trùng nhiệt ướt (Breukelen, Hà Lan)
- Water bath & Shaker (GESELLSCHAFT, Đức)
- Kính hiển vi (Olympus U - CMAD3, Nhật Bản)
- Tủ cấy (Telstar Bio-II-A, Tây Ban Nha)
- Tủ ủ (Herich, Đức)
- Các dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, pipet, cốc thuỷ tinh,...
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
11
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Xem thêm -