Lên men lactic tạo chế phẩm lactatcalci - sữa - vitamin b12 dùng làm thuốc bồi bổ cho trẻ em

  • Số trang: 37 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 17 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI ea LÊN MEN LACTIC TẠO CHÊ PHAM LACTATCALCI - SỮA -VITAMINB12 DÙNG LÀM THUỐC BỒI BỔ CHO TRẺ EM (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ ĐẠI HỌC KHOÁ 1995-2000) Người thực hiện : rịV/ỉ/ỉ từéềt ^7ổff ^ĨẢĨỈ/ ớ a ti/t Người hướng dẫn : Nơi thực hiện : (Sậ ////?// nợÁ/êp. (Daíte Thời gian thực hiện: ĩTu'0/ / 03/2000 đềh 23/05/2000 TôcÀ Q IỘ 3 - 2000 \ A ^ CĨ - .lỡ y e /ú tỡ H ^2ua ầăl iUếi nchỷ, tôi 4ÙM' bàiỷ tổ- ÌÀtKỷ biết ŨỄH, Ậâu ẩắc nkất tới : PQễ. V ề ừ M útk KwM(f đã tận ŨhẤ ktâỚHCỷ ầỗM, ch ỉ ầẩo-, (ỷUÍỊQ, đ& tữi líứàn tkàn k kkơd luận tẩ i HẹkiêỸ nàiỷ- ^ơi châu ikà n k cẩm <$H. các thcuỷ cà, các cáu ềậ t/ưm(ỷ ũ>ậ mẫn CữU(ỷ ■n<ÝỈ/U&p' ^bitâềc, ■pẦÒMíỷ tk í mỷkíệm tàmuỷ iãm %ạl hạc 2)iđFữ aà B>ẩữ tàncị, (ỷiẩncỷ cituẩk (VGQŨ) jbạl kợe cỹúữc ạía Ethanol + A.lactic + C 0 2 + 2ATP ATP ADP Glucose NADP" NADPH + HT Glucose - 6 - p Ạ (5_ p Gluconic NADP+ N NADPH + H H3PC H3PO4 Ethanol Acetyl-P 9NAD Ribulose-5-P 7Xylulose-5-P 2NAD + H+ Glyceraldehyd-3-P 2NAD A,lactic 2NADH + H+ __ A.pyruvic * Chu trinh Krebs 4 1.3 ứng dụng vi khuẩn lên men lactic : 1.3.1 Trong công nghiệp thực phẩm[5]\ Lên men lactic để bảo quản và chế biến thực phẩm thực chất nhằm tạo cho sản phẩm tích luỹ một hàm lượng acid đủ để làm hạn chế sự hoạt động của các vi sinh vật gây thối, đồng thời cũng là chất phụ gia thực phẩm tạo hương vị chua phù hợp với khẩu vị, chuyển nguyên liệu sống về dạng chín sinh học và tăng hệ số chuyển hoá thức ăn so với nguyên liệu ban đầu. Hơn nữa acid lactic và vi khuẩn lactic còn là những nhân tố giúp ích cho tiêu hoá, tạo sự ngon miệng và góp phần duy trì tốt sự cân bằng của hệ vi sinh vật có lợi sống trong đường ruột Lên men lactic được sử dụng phổ biến trong công nghiệp thực phẩm như: làm nem chua, hoa quả muối, sản phẩm đồ hộp chua, đồ hộp giải khát không có rượu và đặc biệt là công nghiệp sữa và các sản phẩm của sữa như: sữa chua, bơ, fomat... 1.3.2 Trong công nghiệp dược: Acid lactic thường được sử dụng dưới dạng calcilactat hoặc lactatnatri là thành phần chủ yếu của dịch truyền Ringerlactat dùng bù nước và bổ xung chất điện giải. Calcilactat dùng chủ yếu trong các trường hợp bệnh thiếu calci. * Caỉcilactat Calcilactat được tạo ra trong quá trình lên men lactic. Acid lactic tạo thành tạo muối với Ca+ ( Có sẵn trong dịch lên men ngay từ đầu hoặc bổ xung dần từng phần nhỏ trong quá trình lên men ) tạo thành Calcilactat trung tính. * Tính chất của calcilactat [10]: Công thức tổng quát: Ca(C3H50 3)i Công thức cấu tạo: [CH3-CH-COO“] TCa++ ỎH Calcilactat thường tồn tại dưới dạng: Calcilactat pentahydrat C6H | 0CaO6. 5H20 ( PTL: 308,2 ) Calcilactat trihydrat C6H | 0CaO6. 3H20 ( PTL: 272,2 ) Calcilactat monohydrat C6H 10CaO6. lH-,0 ( PTL: 236,2 ) Calcilactat khan C6H 10CaO 6 (PTL: 218,2) Calcilactat là bột kết tinh màu trắng, tan trong nước, tan nhiều trong nước sôi. Calcilactat là một muối của acid hữu cơ, mất nước ở 120°c * Công dụng [15]: Calcilactat được sử dụng chủ yếu trong các trường hợp thiếu Calci gây ra các triệu chứng: tăng kích động cơ dẫn đến co giật, rối loạn tâm thần, viêm da, chảy máu... Mặt khác nó còn được dùng để cung cấp calci cho các trường hợp trẻ em còi xương, chậm lớn, phụ nữ có thai, phụ nữ cho con bú. Trong trường hợp này, calcilactat có thề dùng một mình hoặc dùng kết hợp với calcicacbonat, calcigluconat 1.3.3 Trong công nghiệp nhẹ [14]: Ngoài các ứng dụng trên, người ta còn sử dụng acid lactic trong một số ngành khác như trong công nghiệp dệt, sản xuất các chất sơn, mực in, công nghiệp hoá học. Acid lactic tinh khiết còn sử dụng trong công nghệ sản xuất các sản phẩm cao cấp khác 2. Quá trình lên men propionic và các sản phẩm lên men [4]: 2.1 Vi sinh vật lên men propionic : Nhiều loại vi sinh vật khi lên men propionic có khả năng sinh tổng hợp VitaminBp. Trong công nghiệp lên men người ta sử dụng các chủng như: Propioni bacterium( shermanii hay íreudenreichii), Bacillus megatherium và Streptomyces olevaceus để sinh tổng hợp VitaminBp. Tuỳ thuộc vào đặc điểm 6 mỗi chủng được dùng mà người ta tiến hành lên men trong điều kiện ái khí hay yếm khí. 2.2 Propionỉ Bacterium shermanii và quá trình lên men tạo VitaminBJ 2 2.2.1 Đặc điểm vỉ khuẩn Propioni bacterium sherm anii: - Là những trực khuẩn Gram dương - Không di động - Không tạo bào tử - Kị khí không bắt buộc - Có khả năng lên men glucose và lactat tạo ra acid propionic và acid axetic 2.2.2 Sơ đồ tóm tắt quá trình lên men tạo VừaminB12: Giống Môi trường lên men Lên men 6 ngày 1r -Điẽu c lính pH = 7,0 Dich lém men ị Ly tâm ( k)ại bỏ dịch lọc ) Sinh khối v s v Thuỷ phân ( phá huỷ thành tế bào ) 1 Chiết bằnịị dung môi hữu cơ Dung dịch VitBp 1r Sắc ký VitB l2 tinh khiết ị Kết tinh trong dung môi hữu cơ VitBp tinh thể Sấy khô Sản phẩm VitBp 7 2.3 Tính chất và công dụng của VitaminBJ 2 2.3.1 Tính chất của VitaminB12 [8]: + Dung dịch VitaminBp vững bền ở pH acid( pH tối ưu của dung dịch VitaminBp là 4,5 - 5 ) + Dễ bị ánh sáng phân huỷ 2.3.2 Công dụng của VitaminBJ [1]: 2 + Tác dụng chuyển thymin thành thymidin cần thiết cho cấu tạo nucleoprotêin và sự trưởng thành của hồng cầu. Thiếu VitaminBp cơ thể sẽ thiếu máu Biermer, ưu sắc hồng cầu to do hồng cầu không trưởng thành được + VitaminB 12 giúp phân chia và tái tạo tế bào. VitaminB 12 có tác dụng chuyển hoá nhóm metyl, thiol giúp tổng hợp protit và chuyển hoá lipit, hydratcacbon, do đó giúp cho sự trưởng thành của cơ thể hoặc bảo vệ cho các mổ trong trường hợp nhiễm độc, nhiễm khuẩn... + Một số nghiên cứu cho thấy VitaminBp làm tăng cảm giác ngon miệng, người bệnh thấy khoẻ hơn, do vậy VitaminBp còn được sử dụng rộng rãi làm thuốc bồi bổ và có tác dụng phục hồi sức khoẻ. 2.4 Nguyên nhân gây thiếu và nhu cầu về VitaminB12 [1]: 2.4.1 Nguyên nhàn gây thiếu VitaminBl2 + Thiếu cung cấp: Thiếu ăn, cắt dạ dày, cắt hoặc mở thông hồi tràng + Rối loạn hấp thu: Bệnh gan, bệnh đường một. Tiêu thụ quá nhiều do vi khuẩn hoặc ký sinh trùng( nhiễm sán hoặc túi ruột thừa có thể phát sinh một chủng vi khuẩn bất thường tiêu thụ thêm VitaminBp ) 2.4.2 Nhu cầu vê VitamỉnBI2 Trong một số trường hợp, ví dụ: ở người già, người có bệnh. Hoặc trong trường hợp cơ thể có nhu cầu cao về VitaminBp, ví dụ: trong giai đoạn mang thai của người mẹ hoặc ở tuổi phát triển của trẻ em hoặc ở một số cá thể bất thườnơ thì nhu cầu về VitaminB l2 sẽ vượt quá lượng cung cấp trong quá trình điều trị Nhu cầu bình thường: lmcg/24h đủ để chống lại bệnh thiếu máu Trung bình cơ thể cần 1-5 mcg/24h 3. Các ch ế phẩm có chứaVitaminB 12 và Calci dùng trong y học ♦ Chế phẩm Arphos của hãng Laboratoies Foumier S.CA.(Pháp) [8 ] Trong đó thành phần chính là VitaminB12( với hàm lượng 20mcg/ml ) và Calciglucoheptonat (với hàm lượng Ca+2 là 8 m g/m l) + Công dụng: Điều trị chứng suy nhược chức năng(cung cấp muối khoáng, vitamin ) + Liều dùng : • Người lớn (2-3Ống) X lOml / ngày 400-600mcg VitaminBịọ / ngày 1,6-2,4gCa+2/ ngày • Trẻ em (2-3ống) X 5ml / ngày 200-300mcg VitaminB 12 / ngày 0,8-l,2gCa +2 /ngày Nhiều xí nghiệp dược phẩm Việt Nam trước đây cũng đã bào chế một sản phẩm tương tự có tên là Calci-Bp trong đó gồm Calcilactat và VitaminBp. ♦ Chế phẩm B-HemaBp [17] Với hàm lượng VitaminB 12 là 2,5mcg/ml + Công dụng: Thiếu máu, thiếu sắt liên quan đến thai nghén, phụ nữ sau khi sinh, cho con bú... Mệt mỏi thể chất, suy nhược, bệnh nhân trong thời kỳ dưỡng bệnh hay do làm việc trí óc quá mức. + Liều dùng: Người lớn (2-3ống) X lOml / ngày <-» 50-75mcgVitaminBp/ ngày Trẻ em (l-2ống) X lOml / ngày 25-50mcgVitaminBp/ ngày 9 <-> PHẦN III: THỰC NHIỆM VÀ KẾT QUẢ 1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 1 . 1 Nguyên vật liệu 1.1.1 Chủng vi sinh vật + Lactobacillus sp., được cấy ra từ ống giống đông khô của công ty sữa Vinamilk Hà nội + Lactobacillus acidophilus tự phân lập từ chế phẩm Antibio. + Các chủng Lactobacillus: Xin từ bảo tàng giống chuẩn( V C C I) của Trung tâm vi sinh vật học ứng dụng thuộc Đại học khoa học tự nhiên Hà nội 1.1.2 Hoá chất: Sữa bột, glucose, cao ngô, cao nấm men, thạch, KH 2P 0 4, M gS0 4.7H 20 , FeS0 4.7H20 , M nS0 4.H20 , NaOH 0,1N, phenolphtalein( 0,1% trong cồn 90% ) metanol, n-butanol, metyl da cam. 1.1.3 Dụng cụ máy móc: Máy đo pH Meter (MP220), tủ ấm điều nhiệt(Hung), máy hút chân không, tủ cấy vô trùng(SANYO), nồi hấp(Japan), cân phân tích GL-152(Satorius), tủ lạnh(SANYO), cân kỹ thuật, bình nón thuỷ tinh, cốc thuỷ tinh, buret... 1.1.4 Môi trường: * Môi trường nhân giống cho Lactobacillus. sp( qiốno đông khô ) [LJ Glucose 4g Cao ngô 0,4g Cao nấm men 0, 4g k h 2p o 4 0,05g M gS0 4.7H20 0,03g FeS0 4.7H20 0 ,001 g M nS0 4.H20 0 ,001 g 10 Nước máy vừa đủ lOOml pH chỉnh về 6 ,3-6,5 Khử trùng ở 0,9atm / 30phút ( glucose khử trùng riêng ) * Môi trường định lượng VitaminB 12 bằng Lactobacilus sp. [ Lo] k h 2p o 4 0 ,lg M gS04. 7H20 0,05g Glucose lg Thạch 2g Thêm nước vừa đủ lOOml pH chỉnh về 6,5 Khử trùng ở 0,9atm/30 phút 1.2 Phương pháp thực nghiệm 1.2.1 Chuẩn bị giông Môi trường nhân giống( Sữa ) sau khi khử trùng để nguội xuống nhiệt độ 40°C- 45°c thì tiến hành cấy Lactobacilus sp. trong tủ cấy vô trùng. Đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 42°c. Sau 24h nuôi cấy thu được giống cần thiết. Giống này đang ở trạng thái hoạt động cần phải tiến hành cấy vào môi trường lên men ngay Thường chủng giống ban đầu khả năng lên men yếu nên thời gian lên men rất dài. Để rút ngắn thời gian lên men trong sản xuất công nghiệp, người ta thường cấy chuyển tiếp 2, 3 lần • Nhản °iốno cấp ỉ: + Sữa qua tiệt trùng, làm nguội đến nhiệt độ lên men. + Cấy chủng để tủ ấm 42°c/ 14 - 20h. + Bảo quản ở 4 - 6°c • Nhân giống cấp II: + Sữa qua thanh trùng 92 - 95°c/ 20 - 30 phút. + Làm nguội, cấy 5% giống ủ (đã nhân giống cấp I) + Để tủ ấm 42°C/6 - lOh. + Bảo quản ở 4 - 6 °c • Nhân giống cấp III: + Làm tương tự như lần 2. Lấy 5% lượng sữa cần sản xuất cho lên men. + Lượng chủng (đã nhân giống cấp II): 4 - 5% so với lượng sữa cần lên men. + Lên men ở 42°C/5 - 6 h. + Bảo quản ở 4 - 6°c 1.2.2 Phương pháp lên men lactic tạo sữa chua * Thanh trùng : Ngoài mục đích tiêu diệt vi khuẩn lạ , thanh trùng còn có ý nghĩa làm tăng khả năng hydrat hoá cazein trong sữa, tạo cho sản phẩm có độ quện tốt, bền và không bị tách nước [ 12 ] Thường dùng chế độ 85 - 87°c/ 5-10 phút hoặc 90 - 92°c/ 2-3 phút * Làm nguội: Sữa được làm nguội đến nhiệt độ lên men ngay trong thiết bị thanh trùng * Cấy chủng vi sinh vật: Chất lượng sữa chua phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của chủng giống. Đối với từng loại sữa chua, người ta dùng các chủng khác nhau, đảm bảo sao cho sữa chua có mùi vị đặc trưng. Chủng dùng lên men sữa chua có thể ỉà một loại vi sinh vật hoặc kết hợp 2-3 loại vi sinh vật. * Lên men [3] [9]: Lên men lactic là quá trình sinh hoá đặc trưng của sữa dưới tác dụng của các vi khuẩn gây chua( Vi khuẩn lactic ) lên men đường sữa ( lactose ) để tạo thành acid lactic Giai đoạn đầu của quá trình lên men lactic là sự thuỷ phân đường lactoza dưới tác dụng của lactaza. Sản phẩm tạo thành là glucoza và galactoza. Các hecxoza sẽ bị chuyển hoá tiếp theo qua nhiều phản ứng trung gian phức tạp. cho sản phẩm là acid piruvic. Từ acid piruvic sẽ bị khử hydro tạo thành acid lactic +H20 c i; h 22o „ Lactoza 2C6H 120 6 -------------► Lactaza Q H ,A C6H |20 6 Glucoza -p. 4 C3H 4O 3 Hecxoza + +H + ^ a. piruvic Galactoza 4C 3H60 3 a. lactic Ngoài sản phẩm chính là acid lactic còn các sản phẩm phụ khác như: các acid bay hơi ( a. formic, a. axetic...), khí C 0 2, este thơm, diaxetyl... Kết quả tạo cho sản phẩm có mùi thơm đặc trưng. Các VitaminA, B, c, D, E... hầu như không bị mất đi mà còn được tăng lên do vi khuẩn gây chua lactic tạo ra như VitaminB,, VitaminC... Lên men tạo acid lactic làm pH môi trường giảm. Trong môi trường pH thấp mối liên kết giữa H20 với tiểu phân cazein bị yếu đi và xẩy ra sự đông tụ cazein. Đó là hiện tượng hydrat hoá. Đồng thời dưới tác dụng của acid lactic, Ca+2 được tách ra, liên kết muối phức bị phá huỷ và tạo thành kết tủa, sữa từ dạng lỏng chuyển sang dạng đông tụ NH 2-R-(COOH)2(COO)4Ca + C3H 60 3 ------ ►NH2-R-(COOH )6 ị + (C3H 50 3)2Ca (Tuỳ theo từng chủng mà thời gian lên men có thể từ 3, 4h - 12h) * Làm lạnh, bảo quản: Tiến hành từ từ trong vài giờ. Quá trình lên men lactic yếu dần. Trong quá trình làm lạnh các protid trương nở làm giảm lượng ẩm tự do, trạng thái sản phẩm trở nên mịn Bảo quản ở 4-6°C 1.2.3 Phương pháp lẻn men lactỉc tạo lactatcalci có chứa VừaminBI2 Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn chịu acid( pH tối thích 3,5-5 ), ở pH này vi khuẩn lactic phát triển mạnh mẽ với tốc độ lên men diễn ra nhanh chóng. Nếu cứ để quá trình diễn ra tự nhiên, lượng acid tích tụ nhiều làm giảm pH trong dịch lên men gây ức chế hoạt động của vi sinh vật làm ngăn cản việc tạo sản phẩm tiếp theo của chúng trong khi lượng cơ chất trong môi trường vẫn chưa được chuyển hoá hoàn toàn. Đây là nguyên nhân chính làm giảm hiệu suất của quá trình. Để khắc phục ta có thể trung hoà lượng acid lactic tạo ra trong quá trình lên men bằng cách bổ sung thêm vào các chất đệm kiềm tính như calci, natri, amoniac... do đó giá trị pH của dịch lên men khá ổn định. Trong thực tế thường sử dụng CaC0 3 làm chất điều chỉnh pH. Lên men lactic tạo lactatcalci được tiến hành gần tương tự như phương pháp lên men lactic tạo sữa chua. Gồm các bước như sau: - Thanh trùng sữa - Làm nguội - Cấy chủng vi sinh vật, đồng thời bổ xung thêm chất đệm CaC0 3 vàVitaminB 12 - Tiến hành lên men - Làm lạnh và bảo quản 1.2.4 Phương pháp xác định độ acid (°T) và pH dịch lên men. Chất lượng của sữa được đánh giá bằng chỉ tiêu *cảm quan: Màu sắc Hương vị Độ dịu Độ bền vững của sản phẩm *Đợ acid [17]: 14 Độ acid của sữa chua được biểu thị bằng độ acid chung và chỉ số acid hoạt động + Độ acid chung Ký hiệu bằng độ Tecne (°T): Đo bằng số ml kiềm cần thiết( NaOH or KOH ) có nồng độ 0,1N để trung hoà acid có trong lOOml dịch lên men Phương pháp xác định: Phương pháp chuẩn độ Lấy lOml dịch lên men( sữa lên men ). Bổ sung 20ml H20 cất và thêm vào 1-2 giọt phenolphtalein( nồng độ 0,1% trong cồn 90% ). Rồi đem chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30-60 giây Đọc số ml NaOH 0,1N đã chuẩn rồi ghi lại Độ acid được tính: °T = số ml NaOH 0,1N tiêu tốn X 10 % acid lactic = °T X 0,009 + Chỉ sốacid hoạt độn%: Biểu thị cho nồng độ ion H+ trong 1 lít sữa và ký hiệu bằng pH. Nồng đô acid xác định bằng máy đo pH. 1.2.5 Phương pháp định lượng calcilactat Lấy chính xác 50ml dịch lên men, đun nóng cách thuỷ ìophútđể diệt tế bào. Cho dung dịch Ca(OH)o 10% vào để chỉnhpH về khoảng 9-10. Lọcnóng để loại tủa protein và các thành phần không tan. Dịch lọc đem tẩy màu bằng than hoạt 2% trong 20phút ở 80°c. Lọc loại than hoạt. Cô cách thuỷ còn 1/3 thể tích, để kết tinh ở nhiệt độ 4-10°C qua đêm. Lọc hút chân không lấy tinh thể. Tinh thể được sấy khô ở nhiệt độ 70°c trong 24h. Cân tinh thể tính toán kết quả. 1.2.6 Phương pháp sắc ký phán tích dịch lên men Dịch lên men được lắc đều và lọc trong qua phễu G5 trên máy hút chân không để loại bỏ các thành phần không tan. 15 Acid lactic tồn tại trong dung dịch dưới dạng hợp chất calcilactat do đó phải xử lý dịch trong với acid suníuric 25% điều chỉnh pH=4, phản ứng xảy ra tạo thành acid lactic. CH3CHOHCOO Ca + H2S 0 4 _> 2 CH 3CHOHCOOH + CaS0 4 CH 3CHOHCO Tiến hành chạy sắc ký để phân tích dịch lên men. Nếu trong mẫu có mặt nhiều loại acid chứng tỏ chủng vi khuẩn sử dụng là chủng dị hình. Nếu kết quả sắc ký chỉ cho duy nhất lvết của acid lactic, chứng tỏ chủng vi khuẩn là đồng hình • Sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng để định tính dịch lên men của sản phẩm. - Chuẩn bị: + Bản mỏng silicagen để sắc ký. (Các bản mỏng đều phải được sấy hoạt hoá ở 1 10°c trong 30phút trước khi sử dụng chấm mẫu). + Hệ dung môi được pha theo tỷ lệ quy định(n-butanol / metanol / HoO = 20 : 1: 20), và đổ vào bình sắc ký thích hợp có nắp đậy. - Chấm dung dịch lên bản mỏng: đánh dấu đường xuất phát cách mép dưới bản mỏng 1 cm, dùng ống mao quản chấm dịch mẫu và dịch chuẩn lên các điểm cách nhau ít nhất lcm. Vết chấm gọn, nhỏ, chứa lượng chất thử khoảng 1lOmcg. - Khai triển sắc ký: Dưới tác dụng của lực mao dẫn, dung môi chạy kéo theo các chất di chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau và có vị trí khác nhau trên pha tĩnh tạo thành sắc ký đồ. Bản mỏng có chứa mẫu chấm khô được đặt vào bình sắc ký đã bão hoà dung môi pha động sao cho điểm xuất phát không chạm trực tiếp vào dung môi. Khai triển 16
- Xem thêm -