Tài liệu Kỹ thuật xét nghiệm nhanh trong kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm

KT XN nhanh trong KN ATVSTP ATTP 4 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT Y TẾ HẢI DƯƠNG MÔN KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM NHANH TRONG KIỂM NGHIỆM AN TOÀN VỆ SINH THỰC PHẨM Họ và tên: Lớp: ATTP4 Hải Dương, tháng 11 năm 2011 1/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP ATTP 4 TEST NHANH GIỚI THIỆU CHUNG Test nhanh – Ý nghĩa  Phát hiện nhanh các tác nhân gây bệnh  Phát hiện vi khuẩn gây bệnh có số lượng thấp trong quần thể các vi sinh vật không gây bệnh khác  Kiểm tra, giám sát thực hành vệ sinh trong quá trình sản xuất, chế biến  Giảm nhân công, do đó tiết kiệm được thời gian và tiền bạc CÁC LOẠI TEST NHANH  Phỏng theo và tự động hóa phương pháp cổ truyền  Biosensor’s  Phương pháp miễn dịch  Thử nghiệm dựa trên acid nuclec  Kỹ thuật lai phân tử  Kỹ thuật nhân gen (PCR)  Kỹ thuật chip gen PHỎNG THEO VÀ TỰ ĐỘNG HÓA PP CỔ TRUYỀN  Kỹ thuật đếm đĩa:  Nuôi cấy và đếm tự động theo đường xoắn  Sử dụng chất nền huỳnh quang:  Phát hiện chất nền huỳnh quang gắn với enzym hoặc sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn  Petrifilm:  Môi trường nuôi cấy khô trong đĩa petrifilm  Kỹ thuật màng lọc:  Màng lọc giữ lại vi khuẩn đặt trên môi trường nuôi cấy BIOSENSOR’S  Hợp chất chỉ thị sinh học nhạy cảm với nhiệt độ hoặc như đầu dò DNA và RNA  Phát hiện sản phẩm trao đổi chất, kháng thể, phân tích acid nucleic, phân tích sự tương tác của các tác nhân gây bệnh với tế bào nhân điển hình  ATP bioluminescence: sử dụng hỗn hợp enzym và coenzym phát hiện ATP, ngưỡng phát hiện: 103 vi khuẩn PHƯƠNG PHÁP MIỄN DỊCH  Là phương pháp gắn kháng nguyên, kháng thể đặc hiệu  ELISA: thời gian dài, 16-24h THỬ NGHIỆM DỰA TRÊN ACID NUCLEIC  Lai phân tử:  Sử dụng đầu dò DNA phát hiện sự có mặt của các gen đặc hiệu 2/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP ATTP 4  Kỹ thuật nhân gen (PCR):  Làm tăng số chuỗi DNA đặc hiệu trong mẫu Test nhanh – Định nghĩa (BYT)  Test thử nhanh là những test có: - Thao tác đơn giản - Thời gian ngắn hơn so với phương pháp thông thường - Có thể thực hiện ngoài hiện trường - Không cần đến thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm Ý NGHĨA  Phục vụ cho công tác thanh tra, kiểm tra ngoài hiện trường  Có tác dụng sàng lọc nhanh, cho kết quả sơ bộ để nhận định về một mối nguy vệ sinh an toàn thực phẩm có thể có.  Không sử dụng test nhanh trong trường hợp đánh giá về chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm của một sản phẩm hoặc trong trường hợp có tranh chấp, khiếu kiện. Các trường hợp này cần sử dụng các phương pháp phân tích trong phòng thí nghiệm GIỚI THIỆU TEST THỬ NHANH 3M PETRIFILM  3M petrifilm là một loại đĩa môi trường khô chuẩn bị sẵn để nuôi cấy đếm vi khuẩn và nấm, bao gồm:  Gel tan và đông đặc nhanh trong nước lạnh  Các chất dinh dưỡng cần thiết  Chỉ thị màu Ưu điểm của 3M petrifilm  Không phải chuẩn bị môi trường, kỹ thuật ổn định  Giảm các thiết bị cần thiết như autoclave water-bath, incubator  Giảm tiêu hao năng lượng  Giảm không gian thao tác  Giảm chi phí xử lý chất thải ra môi trường  Được coi là phương pháp chính thức áp dụng  Nâng cao tính hiệu quả – dễ dàng hơn trong sử dụng và đọc kết quả 3M petrifilm  Cấu tạo - Gồm một túi đựng các đĩa môi trường - Dụng cụ dàn mẫu (spreader)  Các dụng cụ, môi trường kèm theo - Dung dịch pha loãng mẫu - Kéo, thìa xúc mẫu vô trùng - Túi xử lý mẫu 3/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP ATTP 4 - Pipet - Ống nghiệm và giá cắm - Cân điện tử - NaOH và HCl 1N 3MTM PetrifilmTM - Cách sử dụng 1. Bảo quản các túi chưa sử dụng ở ≤ 8°C. Sử dụng trước ngày hết hạn ghi trên túi. Để đạt hiệu quả tốt nhất, cần đưa các túi về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng 2. Mở túi theo hướng dẫn 3. Bảo quản các túi còn lại ở chỗ khô ráo, nhiệt độ ≤ 25°C trong vòng một tháng. 4. Pha loãng mẫu theo tỷ lệ 1/10 trong túi đồng nhất mẫu vô trùng 5. Sử dụng nước đệm pepton hoặc pepton muối để pha loãng mẫu. Không sử dụng nước đệm có citrat, bisulphite hoặc thiosulphate vì ức chế sự phát triển của vi khuẩn 6. Đồng nhất mẫu, chỉnh pH trong khoảng 6-8. Sử dụng NaOH 1N cho sản phẩm acid, HCl 1N cho sản phẩm kiềm 7. Đặt đĩa trên mặt phẳng ngang. Nâng màng đậy đĩa lên, dùng pipet man nhỏ nhẹ nhàng 1ml mẫu vào giữa đĩa 8. Cẩn thận đặt màng phim xuống sao cho không tạo thành bọt khí 9. Nhẹ nhàng đặt spreader lên và dàn đều mẫu trước khi gel đông đặc. Không xoắn hoặc trượt spreader. Nhấc spreader ra và để yên 1 phút. Chú ý làm tuần tự từng đĩa một 4/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP ATTP 4 10. Ủ ấm các đĩa đã nuôi cấy ở 24h/37°C ±1°C. Mỗi chồng để tối đa 20 đĩa 11. Nếu không có khuẩn lạc nào xuất hiện sau 24 ± 2h, kết quả trả lời (-) 12. Nếu có, đếm các khuẩn lạc điển hình theo đặc trưng của từng loại vi khuẩn 3MTM PetrifilmTM Enterobacteriaceae Count Plate Bảo quản và thải bỏ:  Bảo quản các đĩa Petrifilm chưa mở ở ≤ 8°C  Để tránh làm ẩm các túi đã mở, không để lại vào tủ lạnh  Giữ các túi đã mở ở nơi khô ráo, mát, chỉ trong vòng một tháng.  Không sử dụng các đĩa đã ngả màu vàng hoặc nâu.  Không sử dụng các đĩa đã lây nhiễm vi khuẩn. Việc thải bỏ phải tuân theo hướng dẫn hiện hành của nhà sản xuất. Giới thiệu chung  Đây là một loại môi trường nuôi cấy sẵn  Bao gồm: VRB, Gel (hòa tan trong nước lạnh), Tetrazolium(chỉ thị màu)  Phạm vi áp dụng: Đếm Enterobacteriaae trong thực phẩm và công nghiệp sữa  Không áp dụng cho nước, dược phẩm, mỹ phẩm Dụng cụ và thuốc thử  Đĩa Petrifilm đếm Enterobacteriaceae 5/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP         ATTP 4 Spreader nhựa Pipet 1-10 ml Máy đếm khuẩn lạc Dung dịch pha loãng Dung dịch natri hydroxyde vô trùng Máy đồng nhất mẫu Tủ ấm Cân Hướng dẫn sử dụng  Chuẩn bị mẫu: - Sử dụng nước pha loãng vô trùng thích hợp. - Đồng nhất mẫu - Để cho vi khuẩn hồi phục và phát trieent tốt nhất, chỉnh pH về 6,5-7,5 (mẫu nguyên hoặc đã pha loãng) - Với sản phẩm kiềm, chỉnh pH bằng HCl 1N  Chuẩn bị mẫu thử - Cân vô trùng 11,0g mẫu vào bình hoặc túi đồng nhất mẫu - Thêm 99ml nước pha loãng - Đồng nhất mẫu ở 6000- 18000rpm/2 phút - Chỉnh pH tới 6,5-7,5 with NaOH 1M, khoảng 0,1ml/g mẫu - Trộn đều bằng cách lắc 25 lần/7 giây với khoảng lắc là 30 cm. Enterobacteriaceae – Đặc điểm     Trực khuẩn Gram âm Lên men glucose Oxidase âm Khuẩn lạc màu đỏ với một vùng xung quanh màu vàng/ hoặc khuẩn lạc đỏ có bóng hơi, có hoặc không có vùng bao quanh màu vàng. Các loại nước pha loãng:  Đệm Butterfield’s phosphate - Đệm IDF phosphate (KH2PO4: 0,0425g/l), pH 7,2 - Nước pepton 0,1% - Dung dịch pepton muối (ISO method 6887) - Nước đệm pepton (ISO method 6579) - Nước muối sinh lý Chú ý:  Không sử dụng nước pha loãng có citrate, bisulfite hoặc thiosulfate (ức chế sự phát triển của vi khuẩn)  Nếu trong quy trình sử dụng nước đệm có citrate thì thay bằng nước đệm Butterfield’s phosphate đã làm ấm ở 40 – 45°C Đổ đĩa:  Đặt đĩa Petrifilm EB trên mặt phẳng ngang 6/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP ATTP 4  Nâng màng đậy petrifilm và nhỏ 1ml mẫu thử hoặc dung dịch mẫu thử vào giữa đĩa  Cẩn thận cuốn và đặt tấm film xuống sao cho không tạo thành bọt khí.  Dàn mẫu trong vùng đường kính 20cm2 bằng spreader.  Đặt nhẹ spreader vào giữa đĩa  Ấn nhẹ để dàn đều mẫu  NHấc spreader ra và để ít nhất 1 phút để gel đông đặc Chú ý: - Phải dàn nhanh mẫu trước khi gel đông đặc - Không đưa spreader từ bên này sang bên kia đĩa Ủ ấm:  Ủ ấm các đĩa ở 24h±2h/ 30°C ± 1; 35°C±1 hoặc 37°C± 1, mỗi chồng không quá 20 đĩa  Phải làm ẩm buồng ủ mẫu sao cho lượng hơi ẩm thoát ra từ các đĩa không vượt quá 15% trong quá trình ủ ấm 3MTM PetrifilmTM - Cách sử dụng Giải thích kết quả:  Đĩa Petrifilm EB có thể đếm trên máy đếm khuẩn lạc hoặc nguồn sáng có kính phóng đại.  Khuẩn lạc Enterobacteriaceae có màu đỏ với vùng màu vàng bao quanh/ hoặc khuẩn lạc màu đỏ có bòng hơi, có hoặc không có vùng màu vàng bao quanh  Đường kính vùng phát triển khoảng 20 cm2  Nếu ước tính trên đĩa có nhiều hơn 100 khuẩn lạc thì đếm một vài ô đại diện rồi tính kết quả trung bình cho một ô  Nhân số trung bình của một ô với 20 để tính ra số khuẩn lạc trên cả đĩa. Chú ý:  Không đếm những bóng hơi sinh ra trong quá trình thao tác  Không đếm nhứng khuẩn lạc trên mép ranh giới của đĩa vì những khuẩn lạc này không chịu tác động ức chế của môi trường nuôi cấy chọn lọc  Hơi sinh ra do Enterobactericeae có thể phá vỡ các khuẩn lạc, do đó không đếm những khuẩn lạc nằm ngoài bóng hơi hoặc không có vùng màu vàng  Đôi khi, trên các đĩa có nhiều hơn 100 khuẩn lạc, khuẩn lạc và bóng hơi có thể không rõ ràng; acid sinh ra sẽ làm thay đổi toàn bộ đĩa thành màu vàng, trường hợp này cần tăng độ pha loãng mẫu và thử lại.  Có thể sử dụng các khuẩn lạc này cho những bước xác định tiếp theo bằng cách nâng tấm film đậy lên và lấy khuẩn lạc trên gel. Vi sinh vật E.Coli ATCC 51813 Kết quả Mẻ chấp nhận Độ lệch chuẩn số đếm thấp hơn Phát triển sinh hơi và 3 so với số đếm trên thạch đĩa acid VRB-Glucose 7/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP ATTP 4 Enterobacter amnigenus Phát triển sinh hơi và ATCC 51816 acid Pseudomonas aeruginosaATCC 35554 Phát triển nhưng không sinh hơi và acid Salmonella sp. ATCC 51812 Phát triển sinh hơi và acid Enterococcus faecalis ATCC 14506 Không phát triển 3MTM PetrifilmTM E.coli/Coliforms Count Plate Petrifilm đếm E.coli/Colifrom  Cao men  Gelatin  Muối mật số #3  Pepton  Lactose  Natri Chlorua  Crystal Violet  Neutral Red  Guar Gum (tan trong nước lạnh)  5-Bromo-4-Chloro-3-Indoxyl…  2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride Petrifilm đếm Coliform  Cao men  Gelatin  Muối mật số #3  Pepton  Lactose  Natri Chlorua  Crystal Violet  Neutral Red  Guar Gum 8/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP ATTP 4  2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride Coliforms: Sinh hơi và acid khi lên men đường lactose (ĐN cổ điển)  Escherichia coli  Klebsiella  Enterobacter  Citrobacter - Lên men lactose sinh hơi và acid ở 37°C : 95% là coliform. - Lên men lactose sinh hơi và acid ở 44°C : 90 % là E.coli Định nghĩa hiện nay về Coliforms  Coliforms thuộc họ Enterobacteriaceae, sinh acid và hơi khi lên men lactose (2448h/36±2°C)  Thermotolerant (Fecal) coliform : thuộc họ Enterobacteriaceae, có khả năng phát triển và lên men lactose ở 44,5±2°C bao gồm E.coli, Klebsiella, Enterobacter và Citrobacter (E.coli sinh Indol từ tryptophan) Coliforms được coi là nhóm vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh Coliforms – Phát triển và nơi cư trú Nhóm coliform: bao gồm vi khuẩn đường ruột & và vi khuẩn sống tự do Fecal coliform, được giả thiết là sống trong ruột của động vật máu nóng •E. coli chỉ phát triển ở ruột động vật. Mô tả  Các đĩa đã sẵn có môi trường Violet Red Bile (VRB)  Gel có thể hòa tan trong nước lạnh  Chất chỉ thị cho hoạt tính của Glucuronodase (5-bromo-4chloro-3-indolyl-ß-DGlucoronidase) 9/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP ATTP 4  Tetrazolium, chất chỉ thị để đếm khuẩn lac Phạm vi: thích hợp để đếm E.coli and Coliform trong thực phẩm và công nghiệp sữa không thanh trùng. Cảnh báo:  Không sử dụng riêng loại đĩa để phát hiện E.coli O157  Loại đĩa này không phải là chỉ thị đặc biệt để phát hiện E.coli O157 vì hầu hết các chủng E.coli O157 không điển hình khuẩn lạc không có màu đỏ và sinh hơi  Không sử dụng đĩa Petrifilm EC plates để chẩn đoán ở người và động vật. Bảo quản và thải bỏ:  Bảo quản các túi chưa mở ở ≤ 8°C (460 F)  Để các túi đạt đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.  Cất các đĩa chưa sử dụng vào túi  Để ngăn ngừa sự hút ẩm, không để lại các túi đã mở vào tủ lạnh.  Bảo quản các túi ở nơi khô ráo, thoáng mát trong vòng một tháng.  Các đĩa nuôi cấy giữ ở >25°C và/hoặc độ ẩm>50% dễ dàng cho việc thực hiện thao tác  Không sử dụng cấc đĩa đã ngả màu vàng hoặc màu nâu.  Việc thải bỏ sau khi sử dụng tuân theo quy định hiện hành của nhà sản xuất. Hướng dẫn sử dụng Chuẩn bị mẫu: - Sử dụng dung dịch pha loãng vô trùng thích hợp. - Đối với sản phẩm acid, chỉnh pH của mẫu thử tới 6.6 – 7.2 bằng NaOH 1N - Đối với sản phẩm kiềm, chỉnh pH bằng HCl 1N - Trộn đều hoặc đồng nhất mẫu Chú ý: - Không sử dụng nước pha loãng có citrate, bisulfite hoặc thiosulfate (ức chế sự phát triển của vi khuẩn) - Nếu trong quy trình sử dụng nước đệm có citrate thì thay bằng nước đệm Butterfield’s phosphate đã làm ấm ở 40 – 45°C Đổ đĩa: - Đặt đĩa Petrifilm EB lên mặt phẳng ngang - Nhấc màng film lên và nhỏ 1ml dung dịch mẫu thử vào giữa đĩa - Từ từ đặt tấm film xuống sao cho không tạo thành bọt khí. - Đặt mặt nhẵn của spreader vào giữa đĩa. - Nhẹ nhàng ấn spreader để dàn đều mẫu. Không đưa spreader ngang qua mặt đĩa. - Nhấc spreader ra, để ít nhất một phút cho gel đông đặc - Mỗi chồng đĩa không để quá 20 đĩa. Buồng ủ ấm nên làm ẩm để hạn chế sự bốc hơi mẫu. Hơi ẩm từ các đĩa không vượt quá 15% trong 48 h nuôi cấy. Thời gian ủ ấm và nhiệt độ nuôi cấy:  AOAC method: Ủ ấm đĩa Petrifilm EC 48±2h ở 35±1°C Giải thích kết quả:  Đĩa Petrifilm EC có thể đếm trên máy đếm khuẩn lạc hoặc nguồn sáng có kính 10/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP      ATTP 4 phóng đại. Không đếm các khuẩn lạc trên bờ ranh giới vì không chịu tác động của môi trường chọn lọc. Không đếm các bóng hơi hình thành do thao tác Xấp xỉ 95% E.coli có sinh hơi Thông thường, khuẩn lạc E.coli có màu xanh hoặc đỏ xanh, sinh hơi (đường kính khoảng 1 mm) Khuẩn lạc Coliform màu đỏ sáng, sinh hơi (đường kính khoảng 1mm) 3MTM PetrifilmTM E.coli/Coliforms Count Plate 11/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP ATTP 4 Giải thích kết quả  Khuẩn lạc có sinh hơi  Coliform = 7  Số khuẩn lạc  Vòng số 1 = Khuẩn lạc Coliformcount = 69  Vòng 1, 2 và 3 có thể cho thấy sự khác nhau của các kiểu bóng hơi. không sinh hơi  Vòng 2 = Bóng hơi do thao tác  Vòng 3 = Khuẩn lạc sinh hơi 12/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP ATTP 4 Giải thích hình ảnh Tổng số = 13 Coliform Số E. coli = 17 Số coliform = 150 E.coli E. coli = 49 (màu xanh có sinh hơi) Tổng số coliform = 87 (khuẩn lạc đỏ và xanh sinh hơi) 3MTM PetrifilmTM E.coli Count Plate 13/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP ATTP 4 Đếm đĩa Petrifilm  Đếm các khuẩn lạc màu đỏ  Phạm vi 25-250 khuẩn lạc 3MTM PetrifilmTM Yeast and Mold Count Plate Hướng dẫn bảo quản  Bảo quản ở 8°C  Trước khi sử dụng phải để đạt tới nhiệt độ phòng  Bảo quản nơi khô, mát Chuẩn bị mẫu  Chuẩn bị dung dịch pha loãng  Cân mẫu vào túi  Đổ một lượng thích hơp dung dịch Butterfield’s phosphate vào túi  Đồng nhất mẫu Nuôi cấy  Đặt đĩa petrifilm trên bề mặt phẳng, nâng tấm phim lên  Nhẹ nhàng nhỏ 1ml mẫu đã pha loãng vào giữa đĩa  Hạ tấm phim xuống sao cho không tạo thành bóng hơi  Không sử dụng nước pha loãng có citrat, thiosulfate, bisulfate vì ức chế sự phát triển 14/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP ATTP 4 15/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP ATTP 4 Trường hợp 1 Thành phần:  Một loại gel hòa tan trong nước lạnh  Chất dinh dưỡng  Chất nhuôm màu  Thích hợp để đếm cả nấm mốc và men - VD: Tổng số 20 KL - 16 KL mốc - 4 KL men Trường hợp 2  Âm tính Trường hợp 3     Khi số KL lớn hơn 150, ước tính số đếm Xác định số KL trung bình/cm2 Để tính cho toàn bộ đĩa, nhân số KL trung bình/cm2 x30. VD hình bên: Ước tính tổng số đếm được là 500 Ước tính số nấm men là 480 Ước tính số nấm men là 21 KL nấm men có màu từ nâu nhạt tới hồng hoặc xanh tím 16/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP ATTP 4 Trường hợp 4  Ước tính số KL nấm men >104  Đĩa này quá nhiều Kl không thể đếm được  Các Kl nhỏ mầu xanh ở rìa đĩa không được tính Trường hợp 5  Ước tính số KL nấm mốc bằng 64  Đếm số Kl ở ¼ đĩa rồi nhân với 4 để ra tổng số Trường hợp 6  Hình 6a và 6 b là của cùng một mẫu  6a: độ pha loãng 1/10, số Kl quá nhiều không đếm được  6b: độ pha loãng 1/100, số KL quan sát được <150 6a 6b 17/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP ATTP 4  Kết quả (-) Trường hợp 7  Đĩa petrifilm sử dụng   - - thuốc nhuộm màu phosphate. Các SP thực phẩm có chứa phosphate làm cho đĩa có màu xanh tối Để làm giảm phản ứng phosphate: Cần tăng thêm độ pha loãng Xử lý mẫu: trộn đều và để lắng 3-5 phút trước khi đổ đĩa để tránh các hạt trong trường hợp 8 Quan sát sau 24 – 36h Trường hợp 8  Điểm xanh sẫm trong trường hợp 8 thường gặp ở các mẫu gia vị, các mẫu hạt xay nhỏ. 18/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP ATTP 4 Trường hợp 9  Phân biệt nấm men: - Khuẩn lạc nhỏ, lồi - Có viền mép rõ ràng - Màu nâu vàng đến xanh lục - Màu sắc đồng đều, không có tâm đen Trường hợp 10  Phân biệt nấm mốc - Khuẩn lạc lớn - Viền mép không đều - Màu sắc khác nhau: nâu, be, vàng cam, xanh lục… - Bề mặt KL phẳng - Vùng tâm thường có màu sẫm 19/36 KT XN nhanh trong KN ATVSTP ATTP 4 Trường hợp 11  Đôi khi nhìn mắt thường không phân biệt được nấm men, nấm mốc nên cần soi vi thể bằng kính hiển vi  Nâng tấm film lên, dùng que cấy lấy KL trên lớp gel  Hòa khuẩn lạc vào giọt nước cất vô trùng trên lam kính, đậy lamen và soi kính Trường hợp 12  Soi vi thể nấm men: hình ovan, đôi khi có chồi  Soi vi thể nấm mốc có dạng hệ sợi, có mầm 20/36