Tài liệu Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu định lượng đồng thời cortisol và testosteron trong huyết thanh chuột bằng phương pháp sắc lý lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò khối phổ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ĐẶNG THẢO LINH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CORTISOL VÀ TESTOSTERON TRONG HUYẾT THANH CHUỘT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP NỐI ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội - 2022 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CORTISOL VÀ TESTOSTERON TRONG HUYẾT THANH CHUỘT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO GHÉP NỐI ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHOÁ: QH.2017.Y Người hướng dẫn: NCS. ThS Đặng Kim Thu ThS. Nguyễn Văn Khanh Hà Nội – 2022 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực không ngừng của bản thân, em xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy cô thuộc Đại học Y dược- Đại học Quốc gia Hà Nội : Thầy Nguyễn Văn Khanh - giảng viên bộ môn Bào chế và Công nghệ dược phẩm đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo em tìm ra hướng nghiên cứu, tiếp cận thực tế, tìm kiếm tài liệu, xử lý và phân tích số liệu, giải quyết vấn đề để có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình tốt nhất. Cô Đặng Kim Thu - giảng viên bộ môn Dược lâm sàng đã luôn nhiệt tình hỗ trợ, quan tâm, chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm trong suốt thời gian em học tập và hoàn thành khóa luận. Em xin chúc quý thầy cô dồi dào sức khỏe và ngày càng có nhiều thành công trong sự nghiệp và cuộc sống. Bên cạnh đó, em xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè, những người đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ và giúp đỡ em trong cuộc sống cũng như trong học tập để em có thể thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, các Phòng ban cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội vì sự tâm huyết và những kiến thức đã dạy em trong suốt những năm học tập, sinh hoạt và rèn luyện tại trường. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên 1 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................2 1.1. Tổng quan về hormon: .....................................................................................2 1.2. Cortisol: ..........................................................................................................2 1.2.1. Giới thiệu: .................................................................................................2 1.2.2. Tác dụng sinh học của testosteron: ..........................................................3 1.2.3. Công thức, cấu tạo, danh pháp: ................................................................3 1.2.4. Một số bệnh lý liên quan do tăng giảm cortisol: ......................................4 1.3. Tổng quan về testosterol: .................................................................................4 1.3.1. Giới thiệu: .................................................................................................4 1.3.2. Công thức, cấu tạo, danh pháp: ................................................................5 1.3.3. Tác dụng sinh lý của testosteron: .............................................................5 1.3.4. Bệnh lý do tăng giảm testosteron: ............................................................6 1.4. Các phương pháp định lượng hormon steroid trong dịch sinh học: ................6 1.4.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò khối phổ: .......6 1.4.2. Kỹ thuật miễn dịch ...................................................................................8 1.4.3. Kỹ thuật sắc ký khí - khối phổ: ................................................................8 1.4.4. So sánh tính chất của các phương pháp xét nghiệm hormon steroid: ......9 CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................11 2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................11 2.1.1. Mẫu nghiên cứu ......................................................................................11 2.1.2. Nguyên vật liệu thí nghiệm ....................................................................11 2.1.3. Máy móc, dụng cụ ..................................................................................11 2.2. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................11 2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu huyết thanh chuột .......................................11 2.2.2. Phương pháp định lượng đồng thời 2 hormon steroid (cortisol và testosteron) bằng LC-ESI-MS/MS ...................................................................12 2 CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................15 3.1. Tối ưu hóa điều kiện khối phổ .......................................................................15 3.2. Thẩm định phương pháp phân tích ................................................................15 3.2.1. Khoảng định lượng và tính tuyến tính....................................................15 3.2.2. Độ đặc hiệu, độ chọn lọc ........................................................................16 3.2.3. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) .........................................................18 3.2.4. Độ thu hồi và độ lặp lại ..........................................................................20 3.2.5. Độ ổn định ..............................................................................................21 3.3. Ứng dụng phân tích một số mẫu huyết thanh chuột ......................................21 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ......................................................................................24 KẾT LUẬN ..............................................................................................................29 3 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Tên viết tắt HPLC LC-MS/MS GC-MS Ias ELISA Sắc ký lỏng hiệu năng cao Sắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ hai lần Sắc ký khí ghép nối đầu dò khối phổ Xét nghiệm miễn dịch Phương pháp xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym FSH Hormon kích thích nang trứng LH Hormon kích thích hoàng thể m Khối lượng z Điện tích LLOQ Giới hạn định lượng dưới CV Hệ số biến thiên độ lặp lại S/N Giá trị tín hiệu/nhiễu đường nền LC-UV Sắc ký lỏng với phát hiện tia cực tím 4 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cortisol .................................................................. 3 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của testosteron ...................................................... 5 Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC của mẫu phân tích.. ............................................. 16 Hình 3.2. Sắc ký đồ các mẫu phân tích. .......................................................... 17 Hình 3.3. LLOQ của cortisol (0,1 ng/mL) và testosteron (0,025 ng/mL) ...... 19 5 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 So sánh tính chất của phương pháp xét nghiệm miễn dịch và GC / MS và LC - MS / MS để phân tích hormon steroid ..............................................................10 Bảng 3.1 Một số thông số MS cho chất phân tích ....................................................15 Bảng 3.2 Khoảng định lượng và tính tuyến tính của cortisol và testosteron ............15 Bảng 3.3 Nồng độ cortisol và testosteron trong mẫu huyết thanh ............................17 Bảng 3.4 Mỗi tương quan tuyến tính giữa thể tích huyết thanh với hàm lượng cortisol và testosteron ................................................................................................18 Bảng 3.5 Kết quả xác định giá trị LLOQ của cortisol và testosteron .......................19 Bảng 3.6: Độ thu hồi và độ lặp lại của phương pháp ...............................................20 Bảng 3.7: Độ ổn định của cortisol và testosteron trong các điều kiện khác nhau ....21 Bảng 3.8: Nồng độ cortisol và testosteron trong huyết thanh chuột khỏe mạnh ......22 Bảng 3.9: Nồng độ cortisol và testosteron trong một số dịch sinh học khác nhau ...22 6 MỞ ĐẦU Hormon steroid được sản xuất bởi vỏ thượng thận, các tuyến sinh dục, hoàng thể và đơn vị thai- nhau thai, đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các hành vi và sự phát triển ở động vật. Ví dụ, testosteron, hormon sinh dục nam thúc đẩy sản xuất tinh trùng, phát triển đặc điểm sinh dục và cạnh tranh sinh sản nam. Cortisol điều hòa phản ứng căng thẳng, điều chỉnh sự trao đổi chất, phản ứng viêm và chức năng miễn dịch. Sự thay đổi nồng độ hormon testosteron và cortisol có liên quan tới một số bệnh lý như sự già hóa, stress, Addison, hội chứng Cushing… [39]. Hiện nay có nhiều phương pháp để xác định nồng độ hormon steroid như sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lỏng ghép nối đầu dò khối phổ hai lần (LC-MS/MS), Sắc ký khí ghép nối đầu dò khối phổ (GC-MS), miễn dịch. Trong đó, LC-MS/MS là phương pháp ưu việt hơn cả. Với những ưu điểm như có độ đặc hiệu cao, tính chọn lọc tốt; độ nhạy cao với giới hạn định lượng thấp; khoảng tuyến tính rộng; độ thu hồi; độ lặp lại và độ ổn định đạt yêu cầu. Phương pháp ngày càng được sử dụng nhiều hơn trong phòng thí nghiệm để thay thế cho các phương pháp xét nghiệm miễn dịch hoặc GC-MS. Vì chúng có nhược điểm về độ nhạy và độ đặc hiệu, thời gian chuẩn bị mẫu phức tạp hơn. Ví dụ GC-MS cần tạo dẫn xuất để dễ bay hơi, thời gian chuẩn bị mẫu dài. [65] Xét nghiệm miễn dịch thiếu tính đặc hiệu, đặc biệt khi steroid có mặt ở nồng độ rất thấp [44, 60]. Tuy đơn giản vì không yêu cầu các bước tiền xử lý, nhưng cần khối lượng mẫu lớn. Các nhà khoa học chỉ ra rằng, nếu chỉ xét về mặt hiệu suất, một số kỹ thuật miễn dịch có thể là tối ưu, nhưng xét về tổng thể, phương pháp LC-MS/MS được khuyến cáo để thay thế cho các kỹ thuật miễn dịch trong định lượng nồng độ các hormon steroid [66], [64], [63]. Vì những lý do trên, em thực hiện đề tài “nghiên cứu định lượng đồng thời cortisol và testosteron trong huyết thanh chuột bằng phương pháp sắc lý lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò khối phổ” với 01 mục tiêu là: Xây dựng được phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò khối phổ (LC-ESI-MS/MS) để định lượng đồng thời 2 hormon steroid là cortisol và testosteron trong huyết thanh chuột theo hướng dẫn của FDA. 1 CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về hormon: Hormon là những “thông tín viên” của hệ nội tiết, được tiết ra từ những tế bào tiết của 1 tuyến đặc biệt gọi là tuyến nội tiết. Chúng mang các tín hiệu tới cơ quan thực hiện (cơ quan đích) là một tuyến khác, nhưng cũng có thể là các tế bào không phải nội tiết. Có các đặc tính: - Được tiết ra từ các tế bào chuyên biệt (tế bào tiết/tuyến nội tiết) với một lượng rất nhỏ. - Đổ thẳng vào dòng máu và được vận chuyển tới những nơi mà chúng phát huy tác dụng ở cách xa nơi chúng được tiết ra. - Tác động trên những tế bào đặc hiệu (tế bào đích/ tuyến đích) để tạo ra những hiệu quả đặc hiệu. Một hormon duy nhất có thể tác động trên nhiều đích và tạo ra nhiều hiệu quả khác nhau. - Phối hợp với hệ thần kinh để đóng vai trò của các người điều tiết sinh lý của quá trình chuyển hóa và tích hợp của cơ thể; có thể có sự đồng tác động của nhiều hormon khác nhau. Dựa vào cấu trúc hóa học của hormon người ta chia chúng thành ba nhóm: - Hormon có cấu trúc peptid và glycoprotein. - Hormon là các dẫn xuất của tyrozin (acid amin). - Hormon có cấu trúc steroid và cấu trúc tương tự. Hormon steroid được sản xuất bởi vỏ thượng thận, các tuyến sinh dục, hoàng thể và đơn vị thai- nhau thai. Chúng rất khó tan trong nước. Trong máu được gắn vào những protein đặc hiệu gọi là protein vận chuyển đặc hiệu. Vd: transcortin cho cortisol; globulin gắn với hormon sinh dục cho testosteron và estrogene;…. [1] 1.2. Cortisol: 1.2.1. Giới thiệu: Cortisol là hormon căng thẳng của cơ thể, được tổng hợp từ cholesterol và được tổng hợp trong lớp zona fasciculata của vỏ thượng thận. Cortisol có nhiều tác động đến các chức năng trên toàn cơ thể và tham gia vào các hoạt 2 động duy trì nội môi khác nhau: điều hòa phản ứng căng thẳng, điều chỉnh sự trao đổi chất, phản ứng viêm và chức năng miễn dịch. Trục dưới đồi - tuyến yên - thượng thận điều hòa cả sản xuất và bài tiết cortisol. Mất khả năng điều tiết có thể dẫn đến rối loạn dư thừa cortisol, chẳng hạn như hội chứng Cushing hoặc suy vỏ não, như bệnh Addison[53]. 1.2.2. Tác dụng sinh học của testosteron: a. Đáp ứng miễn dịch Glucocorticoid có một số hoạt động trong hệ thống miễn dịch. Ví dụ, chúng gây ra quá trình apoptosis của các tế bào T tiền viêm, ngăn chặn sản xuất kháng thể của tế bào B và giảm sự di chuyển của bạch cầu trung tính trong quá trình viêm. [16] b. Phản ứng căng thẳng Cơ thể con người liên tục phản ứng với các tác nhân gây căng thẳng bên trong và bên ngoài. Khi cơ thể tiếp tục nhận thức các kích thích như một mối đe dọa, vùng dưới đồi sẽ kích hoạt trục HPA. Cortisol được giải phóng từ vỏ thượng thận và cho phép cơ thể tiếp tục ở trạng thái cảnh giác cao[29]. c. Cân bằng nội môi glucose và protein: Mức đường huyết thúc đẩy các con đường quan trọng trong hệ thống và nội bào. Sự hiện diện của glucocorticoid, chẳng hạn như cortisol, làm tăng khả năng cung cấp glucose trong máu lên não. Trong gan, nồng độ cortisol cao làm tăng gluconeogenesis và giảm tổng hợp glycogen[23]. 1.2.3. Công thức, cấu tạo, danh pháp: Hình 1.1. Cấu trúc hóa học cortisol [11] 3 Công thức hóa học: C 21 H 30 O 5 Tên IUPAC: 11β,17α,21-Trihydroxypregn-4-ene-3,20-dione. Cortisol là chất thuộc nhóm glucocorticoid, công thức cấu tạo gồm 21 nguyên tử cacbon có nhân cơ bản là prenan, nhóm “-OH” gắn ở vị trí 11, 17 và 21, được tiết ra chủ yếu ở vùng bó và một số ít ở vùng lưới của vỏ thượng thận [11]. 1.2.4. Một số bệnh lý liên quan do tăng giảm cortisol: Nếu sản xuất quá mức cortisol sẽ dẫn đến hội chứng Cushing: U tuyến thượng thận hoặc u tuyến yên là hai yếu tố kích hoạt cơ thể tăng sản xuất cortisol quá mức. Do dư thừa lượng hormon cortisol trong cơ thể dẫn đến những rối loạn chuyển hóa, gây nên những ảnh hưởng nghiêm trọng, có thể gây ra hội chứng Cushing với các biểu hiện: Cơ địa dễ nhiễm trùng do suy yếu hệ miễn dịch, chậm lành vết thương. Rối loạn kinh nguyệt ở nữ giới, giảm ham muốn ở nam giới. Suy giảm khả năng sinh sản. Rối loạn cảm xúc, tâm thần, chậm tăng trưởng ở trẻ em. Tăng nguy cơ các bệnh lý mạn tính như tăng huyết áp, tim mạch, đái tháo đường típ 2, loãng xương, sỏi thận…[37] Nếu cơ thể không tạo ra đủ lượng cortisol cần thiết sẽ dễ dẫn đến bệnh Addison: Bệnh Addison (suy tuyến thượng thận nguyên phát) là lúc tuyến thượng thận sản xuất rất ít cortisol và aldosteron dẫn đến thiếu hụt glucocorticoid và mineralcorticoid, gây ra tình trạng muối và nước của cơ thể sẽ bị đào thải ra bên ngoài thông qua nước tiểu, khiến huyết áp giảm xuống rất thấp. Đồng thời, lượng kali tăng nhanh đến mức nguy hiểm. Hạ huyết áp thế đứng, sốt và hạ đường huyết đặc trưng cho suy tuyến thượng thận cấp tính, trong khi suy tuyến thượng thận mãn tính biểu hiện với tiền sử khó chịu, chán ăn, tiêu chảy, sụt cân, đau khớp và đau lưng [41]. 1.3. Tổng quan về testosterol: 1.3.1. Giới thiệu: Testosteron là hormon sinh dục chủ yếu ở nam giới. Nó chịu trách nhiệm về sự phát triển của các giới tính phụ: râu, giọng trầm, cơ bắp, tác phong ngổ ngáo. Chúng được tiết ra ở tế bào Leydig ở tinh hoàn nam giới, và 4 được tiết ra ở buồng trứng ở phụ nữ, tác dụng vào vùng hạ đồi. Đối với nam giới thì chiều hướng hoạt động sinh dục khác phái được kích thích bởi estrogen và cả androgen. Hoạt động giới tính bị giảm hoặc mất hẳn khi bị hoạn. Không đủ lượng testosteron ở nam giới có thể dẫn đến các bất thường bao gồm gầy và mất xương[7] 1.3.2. Công thức, cấu tạo, danh pháp: Công thức phân tử: C19H28O2 Tên IUPAC: 17β-Hydroxyandrost-4-ene-3-one 4-Androsten-17β-ol-3one. Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của testosteron [31] Testosteron là một steroid từ lớp androstan chứa một nhóm xeton và một nhóm hydroxyl ở vị trí 3 và 17 tương ứng. Nó được sinh tổng hợp theo nhiều bước từ cholesterol và được chuyển hóa trong gan thành các chất chuyển hóa không hoạt động. Nó phát huy tác dụng thông qua liên kết và kích hoạt thụ thể androgen [26]. 1.3.3. Tác dụng sinh lý của testosteron: Testosteron ảnh hưởng đến cơ thể con người trong suốt cuộc đời, ngay từ lúc thụ thai đến khi trưởng thành. Testosteron cũng chịu trách nhiệm đối với chất lượng và tốc độ tăng trưởng của các mô cơ cũng như sức mạnh ở nam giới. Nó cũng chịu trách nhiệm cho phần lớn các hoạt động của não, như kỹ năng nhớ và học tập. Các mức năng lượng cần thiết cho các hoạt động thể chất cũng được quy định bởi hormon này. Ở tuổi dậy thì, testosteron gây ra những thay đổi sinh lý như sự, thay đổi mùi cơ thể, tăng trưởng của lông mu, và phát triển xương. Nó cũng gây ra 5 những thay đổi như tăng khối lượng cơ và sức mạnh, xuất hiện yết hầu, mất lớp mỡ dưới da ở mặt. 1.3.4. Bệnh lý do tăng giảm testosteron: Hội chứng thiếu hụt testosteron, còn được gọi là thiểu năng sinh dục khởi phát muộn, là một hội chứng lâm sàng và sinh hóa có thể xảy ra ở nam giới liên quan đến tuổi cao. Tình trạng này được đặc trưng bởi tinh hoàn bị thiếu hụt sản xuất testosteron. Thiếu hụt testosteron có liên quan đến nhiều triệu chứng không cụ thể bao gồm suy giảm ham muốn tình dục, rối loạn cương dương, tăng lắng đọng chất béo, giảm khối lượng cơ, giảm năng lượng và trầm cảm [33] Suy sinh dục nam được định nghĩa là sự thiếu hụt testosteron kết hợp với các triệu chứng hoặc giảm sinh tinh trùng, hoặc cả hai. Suy sinh dục có thể là kết quả của một tinh hoàn bất thường (tiên phát) hoặc do trục dưới đồi, tuyến yên (thứ phát). Suy sinh dục tiên phát liên quan đến sự kém đáp ứng của tinh hoàn với hormon kích thích nang trứng (FSH) và hormon kích thích hoàng thể (LH). Suy sinh dục tiên phát ảnh hưởng đến sản xuất testosteron và nồng độ testosteron thấp không đủ để ức chế sản xuất FSH và LH; do đó, nồng độ FSH và LH tăng lên [61]. 1.4. Các phương pháp định lượng hormon steroid trong dịch sinh học: 1.4.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối đầu dò khối phổ: Khối phổ là loại thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa,…Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử hợp chất. Máy khối phổ MS/MS hay máy đo khối phổ hai lần liên tiếp gồm hai hệ máy khối phổ riêng biệt độc lập nhau được nối liền với nhau cách nhau bởi một buồng va chạm (collision cell). MS đầu tiên được sử dụng để cô lập ion sơ cấp (precursor ion), ion này liền ngay sau đó sẽ bị phân mảnh tại buồng va chạm collision cell để cho ra các ion thứ cấp (product ion) tiếp theo MS thứ hai sẽ phân tách các ion này. Những ion mong muốn sẽ đi đến 6 detector và chuyển thành tín hiệu[5, 6]. Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính để xử lý và lưu trữ. Ứng dụng của LC-MS/MS trong định lượng hormon steroid trong dịch sinh học: Bất chấp tất cả những ưu điểm của phương pháp GC-MS đối với việc lập hồ sơ steroid nước tiểu, những trở ngại do thông lượng chậm và các phân tích phức tạp đã hạn chế ứng dụng rộng rãi hơn của GC-MS steroid vào nội tiết lâm sàng. LC-MS/MS có tiềm năng cho thông lượng cao, vì steroid trong huyết thanh không cần tạo dẫn xuất trước khi xét nghiệm và giống như GCMS, nhiều steroid có thể được đo đồng thời. Có rất nhiều ứng dụng của LC-MS/MS được sử dụng hiện nay vào việc định lượng hormon steroid trong dịch sinh học: Ở nghiên cứu định lượng đồng thời 17α-OH progesterone, 11deoxycortisol, Δ4-androstenedion, cortisol và cortison trong các đốm máu trẻ sơ sinh bằng cách sử dụng sắc ký lỏng-khối phổ song song [41]. Kết quả cho thấy không có đỉnh nhiễu từ các chất phân tích trong mẫu vết máu trắng. Do đó, phương pháp này có khả năng cung cấp dữ liệu có ý nghĩa đối với các mẫu có nồng độ steroid thấp (trong phạm vi bình thường) cũng như đối với những mẫu có nồng độ cao. Trong nghiên cứu định lượng tự động, nhanh chóng và nhạy cảm của 17 alpha-hydroxyl-progesterone, androstenedione và testosteron bằng phương pháp khối phổ song song với chiết xuất trực tuyến đã đưa ra kết quả tốt cho thấy phương pháp LC- MS/MS có thời gian định lượng nhanh hơn so với GCMS. Giới hạn phát hiện dưới thấp và khối lượng mẫu cũng thấp hơn rất nhiều so với GC-MS [38]. Kouwa Yamashita đã nghiên cứu phát triển phương pháp định lượng testosteron và dihydrotestosteron trong huyết thanh người và mô tuyến tiền liệt bằng phương pháp LC-ESI-MS/MS, chứng minh phương pháp có độ nhạy cao cho phép xác định testosteron và dihydrotestosteron với LLOQ là 1pg/2ml huyết thanh. Với độ đúng và độ chính xác <15%. Ứng dụng vào chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt và thiểu năng sinh dục nam [57]. Chính tác giả cũng đã phát triển phương pháp định lượng estrone và estradiol trong huyết thanh người bằng phương pháp LC-ESI-MS. Đưa ra kết quả với LLOQ 7 là 1pg/ml với estrone và 0,5pg/ml với estradiol. Nghiên cứu cung cấp kết quả phân tích với độ chính xác cao lần lượt tương ứng là 96% và 84,4% và khả năng tái lập tốt [58]. Phương pháp LC-MS/MS ngoài việc định lượng đồng thời cortisol và testosterone trong một số dịch sinh học ở người nhằm phát hiện hoặc chuẩn đoán một số bệnh có liên quan tới sự thay đổi nồng độ hormone trong cơ thể, nó còn đóng góp quan trọng trong chẩn đoán rối loạn nội tiết [25]. 1.4.2. Kỹ thuật miễn dịch Kỹ thuật miễn dịch thường được dùng phổ biến trong các phòng xét nghiệm hiện nay nhằm định lượng từng hormon steroid hoặc tiền chất riêng lẻ. Nguyên lý: Cơ chế là phản ứng miễn dịch đặc hiệu giữa kháng nguyên là các hormon cần định lượng và kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các kháng nguyên trên. Kỹ thuật miễn dịch được thực hiện thường quy nhờ các hệ thống máy miễn dịch có công suất lớn, thời gian phân tích nhanh, giá thành hợp lý và không đòi hỏi người sử dụng phải được đào tạo chuyên biệt. Kỹ thuật miễn dịch được ứng dụng trong định lượng nhiều hormon giúp nhận định ban đầu về bệnh lý tuyến thượng thận và sinh dục bao gồm testosteron, estradiol, cortisol, ACTH, androstenedion, 17-OHP. Phương pháp có độ nhạy cao với thời gian phân tích nhanh được áp dụng rộng rãi tại nhiều phòng xét nghiệm. Tuy nhiên, các kỹ thuật miễn dịch định lượng steroid huyết thanh có thể bị ảnh hưởng bởi các steroid nguồn gốc từ nhau thai, từ mẹ truyền sang ở trẻ sơ sinh [13]. Phản ứng chéo giữa hormon steroid với các tiền chất có cấu trúc kháng nguyên tương tự. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng định lượng kém chính xác nồng độ cortisol ở người bệnh thiếu 21-OH, thiếu 11β-OH do phản ứng chéo giữa 11-deoxycortisol với 39 kháng thể kháng cortisol gây tăng giả tạo nồng độ cortisol [8]. 1.4.3. Kỹ thuật sắc ký khí - khối phổ: Định lượng steroid niệu bằng GC/MS có nhiều ưu điểm nhờ chuẩn bị mẫu qua nhiều bước trong đó có quá trình thủy phân, tạo dẫn xuất, tách chiết 8 steroid tự do và quá trình sắc ký khí với thời gian dài hơn so với sắc ký lỏng khối phổ. Nhờ vậy, sắc ký khí khối phổ có khả năng phân tách các đồng phân của steroid trong mẫu, mỗi steroid được đặc trưng bằng một đỉnh trên sắc ký đồ. Kỹ thuật định lượng steroid niệu đạt độ nhạy và độ đặc hiệu cao, giúp chẩn đoán nhiều bệnh lý rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid bẩm sinh cũng như mắc phải. Ứng dụng kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS giúp chẩn đoán rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid. [2] Nguyên lý: Sắc ký khí giúp phân tách các thành phần khác nhau trong mẫu thành các chất nhờ ái lực của mỗi chất trong hỗn hợp mẫu có sự tương tác khác nhau với pha tĩnh. Các phân tử có trọng lượng nhỏ hơn sẽ xuất hiện trước, các phân tử có trọng lượng lớn hơn sẽ xuất hiện sau trên sắc ký đồ. Phần khối phổ có nhiệm vụ xác định định tính và định lượng các chất. Ở bộ phận khối phổ các phân tử mẹ được chọn lọc trước khi bị ion hóa và bị bắn phá thành các mảnh ion. Các ion chọn lọc đặc trưng cho mỗi chất được chuyển đến bộ phận lọc. Dựa trên khối lượng, bộ lọc lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua. Thiết bị cảm biến có nhiệm vụ đếm số lượng các hạt có cùng khối lượng. Thông tin này sau đó được chuyển đến 4 máy tính để tính toán các tín hiệu do bộ cảm biến cung cấp và đưa ra kết quả khối phổ. 1.4.4. So sánh tính chất của các phương pháp xét nghiệm hormon steroid: LC-MS/MS là một phương pháp ưu việt những ưu điểm như có độ đặc hiệu cao, tính chọn lọc tốt; độ nhạy cao với giới hạn định lượng thấp; khoảng tuyến tính rộng; độ thu hồi; độ lặp lại và độ ổn định đạt yêu cầu. Phương pháp ngày càng được sử dụng để bổ sung cho các phương pháp xét nghiệm miễn dịch hoặc GC-MS có nhược điểm về độ nhạy và độ đặc hiệu. Hạn chế quan trọng nhất trong xét nghiệm miễn dịch là thiếu tính đặc hiệu, đặc biệt khi steroid có mặt ở nồng độ rất thấp [44, 60]. Xét nghiệm miễn dịch chỉ cho phép một phân tích steroid cho mỗi lần chạy. Nó đơn giản vì nó không yêu cầu các bước tiền xử lý, nhưng cần khối lượng mẫu lớn. Nhược điểm của phương pháp GC-MS là không có độ nhạy cao để phân tích nhanh chóng của các hợp chất cụ thể độ đặc hiệu và khoảng định lượng kém hơn, không đạt độ tuyến tính ở nồng độ thấp, không phát hiện 9 được liên hợp steroid, chuẩn bị mẫu phức tạp và tốc độ phân tích khá chậm [22]. Bảng 1.1 So sánh tính chất của phương pháp xét nghiệm miễn dịch và GC / MS và LC - MS / MS để phân tích hormon steroid Chỉ tiêu Miễn dịch GC / MS LC - MS / MS Thời gian chuẩn bị Lâu mẫu Nhiều Ít Chuẩn bị mẫu Phức tạp Phức tạp Đơn giản (Thực hiện bởi người có chuyên môn) Dẫn xuất hóa Không cần Cần thiết Không cần thiết Tự động hóa Không Giai mẫu Tốc độ phân tích Chậm Chậm Nhanh Độ nhạy Tốt Tốt Tốt Phát hiện liên hợp Không steroid Không Tốt Tính đặc hiệu Trung bình Cao Thấp 10 đoạn tiêm Tất cả các giai đoạn. CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Mẫu nghiên cứu Các mẫu huyết thanh được thu thập từ chuột cống trắng, giống đực, chủng Sprague-Dawley khoẻ mạnh. Động vật thí nghiệm được cung cấp bởi Học viện Quân Y, Việt Nam. 2.1.2. Nguyên vật liệu thí nghiệm Dung môi, hóa chất gồm: - Chuẩn testosteron và cortisol (Steroid Company, Hoa Kỳ, ≥ 98%), chuẩn nội testosteron-13C3 và cortisol-2H4 (Otuka Company, Nhật Bản, ≥ 98%). - Nước tinh khiết dùng cho LC-MS/MS (Merck, Đức). - Methanol, Acetonitrile, Acid formic, Ethyl acetat (Merck, Đức). - Nước tinh khiết. 2.1.3. Máy móc, dụng cụ - Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối đầu dò khối phổ LCMS/MS 6420 Triple Quad (Agilent Technologies). - Cân phân tích Sartorius QUINTIX224 – 1S (Đức). - Máy siêu âm Elmasonic S100H (Đức). - Hệ thống cô quay ly tâm CVE-3110 (Eyela, Nhật Bản). - Máy ly tâm Biocen 22R (Tây Ban Nha). - Máy ly tâm HSCEN-204 (MRC – Israel). - Máy Vortex (IKA, Đức) - Cột chiết xuất pha rắn Bond Elut C18 3 mL (Agilent Technologies). - Màng lọc cellulose acetat 0,2 µm. - Ống vial 1 mL và insert, Ống ly tâm Eppendorf 1.5mL - Các dụng cụ thủy tinh khác: ống nghiệm có nắp 10 mL, bình định mức, micropipet, đầu côn, cốc có mỏ, ống đong, … 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu huyết thanh chuột 11 Mẫu máu chuột cống trắng, giống đực, chủng Sprague-Dawley khoẻ mạnh (Học viện Quân Y) được lấy cho vào ống chống đông chứa EDTA, ly tâm lạnh ở 5oC với tốc độ 18000 vòng/phút, lấy phần chất lỏng bên trên thu được mẫu huyết thanh chuột, bảo quản ở -70oC cho tới khi phân tích. 2.2.2. Phương pháp định lượng đồng thời 2 hormon steroid (cortisol và testosteron) bằng LC-ESI-MS/MS a. Quy trình phân tích Điều kiện sắc ký: - Cột: Poroshell C18 2.7μm, 2.1×100 mm. Nhiệt độ cột: 50 oC - Pha động: 0,1% acid formic (A) và acetonitrile (B), chế độ gradient như sau: 0-2 phút (50 – 55% B), 2-3 phút (55 – 75% B), 3-3,8 phút (75 - 95% B), 3,8-4,5 phút (95 – 100% B), 4,5-5,2 phút (100% B), 5,2-5,21 phút (100 – 35% B), 5,21-6,5 phút (35% B), 6,5-8 phút (35 - 50% B). - Tốc độ dòng: 0,5 mL/phút. - Thể tích tiêm mẫu: 10 µL Điều kiện khối phổ: - Nguồn ion ESI: ion hóa tia điện (+). - Capillary Voltage: 4000 V. - Áp suất Nebulizer: 30 psi. - Tốc độ dòng khí N2: 11 L/phút. - Nhiệt độ nguồn: 300oC. - Chế độ MRM (Multiple Reaction Monitoring). Phần mềm Optimizer được sử dụng để tối ưu hóa m/z ion mẹ (precusor ion) và m/z ion con (product ion), thế phân mảnh (fragmentation), năng lượng bắn phá tạo ion (collision energy, CE). b. Quy trình xử lý mẫu Tham khảo các tài liệu [19-21] phương pháp xử lý mẫu như sau: 0,2 mL huyết thanh chuột đã được rã đông ở nhiệt độ phòng hoặc dung dịch chuẩn được thêm 0,1 mL hỗn hợp chuẩn nội testosteron-13C3 và cortisol2 H4 đều có nồng độ 10 ng/mL, 0,1 mL methanol, 1 mL nước tinh khiết và 2,5 mL Ethyl acetat, vortex khoảng 1 phút, ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút, lấy phần dịch trên, cô quay ly tâm chân không ở 40 oC tới cắn. Cắn được hòa tan trong 0,5 mL methanol, 2 mL nước, vortex khoảng 1 phút. Dịch 12