TRƯỜNG ĐẠI HỌC s ư PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC
TRẦN THỊ THAO
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ
HỢP CHẤT LIGNAN TỪ CÂY DỨA DẠI
(PAND A N US ODORA TISSIMUS)
KHÓA LUÂN TỐT NGHIẼP ĐAI HOC
•
•
•
•
C huyên ngành: H óa học hữu cơ
Người hướng dẫn khoa học
TS. Nguyễn Văn Thanh
HÀ NỘI - 2015
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Khoá luận tốt nghiệp được hoàn thành tại phòng Dược liệu Biển, Viện
Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Với lòng biết ơn chân thành, em xin cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của TS.
Nguyễn Văn Thanh, đã trực tiếp hướng dẫn em hoàn thành khoá luận này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tập thể các cán bộ phòng Dược
liệu Biển, Viện Hoá sinh Biển đã tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khoá
luận tốt nghiệp.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Nguyễn Văn Bằng cùng các
thầy cô giáo trong khoa Hoá học trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã tận
tình dạy dỗ và chỉ bảo cho em trong suốt 4 năm học tại trường.
Khóa luận tốt nghiệp không tránh khỏi một số thiếu sót vì vậy em rất
mong nhận được sự góp ý, chỉ bảo cả các thầy cô và các bạn sinh viên quan
tâm.
Em xỉn chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Trần Thi Thao
Sinh viên: Trần Thi Thao
Lớp K37B - Hóa học
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẤT
*
13c NMR
Phổ cộng hưởng tò hạt nhân cacbon 13
Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
1H NMR
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy
COSY
2D-NMR
Chemical Shift Coưelation Spectroscopy
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều
Two-Dimensional NMR
cc
DEPT
EI-MS
Sắc ký cột Column Chromatography
Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
Phổ khối lượng va chạm electron
Electron Impact Mass Spectrometry
HMBC
Heteronuclear Multiple Bond Connectivity
HSQC
Heteronuclear Single Quantum Coherence
IR
Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy
Me
Nhóm metyl
MS
Phổ khối lượng Mass Spectroscopy
TLC
Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography
Sinh viên: Trần Thi Thao
Lớp K37B - Hóa học
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ BẢNG BIỂU
*
Trang
Bảng 4.1: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PT05............................................. 28
Bảng 4.2: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PT07............................................. 32
Bảng 4.3: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất PT09............................................. 37
Hình 2.1: Dứa dại - Pandanus odoratissỉmus...................................................18
Hình 3.1: Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu cây Dứa dại......................................... 21
Hình 4.1: Phổ JH-NMR của PT05......................................................................25
Hình 4.2: Phổ 13C-NMR của P T05....................................................................26
Hình 4.3: Phổ HSQC của PT05.........................................................................26
Hình 4.4: Phổ HSQC và HMBC của PT05.......................................................27
Hình 4.5: Cẩu trúc của hợp chất PT05............................................................. 28
Hình 4.6: Phổ JH-NMR của PT07......................................................................29
Hình 4.7: Phổ 13C-NMR của P T07....................................................................30
Hình 4.8: Phổ HSQC của PT07.........................................................................30
Hình 4.9: Phổ HSQC và HMBC của PT07.......................................................31
Hình 4.10: Cấu trúc của hợp chất PT07........................................................... 32
Hình 4.11: Phổ 1H-NMR của PT09....................................................................33
Hình 4.12: Phổ 13C-NMR của P T09................................................................. 34
Hình 4.13: Phổ HSQC của PT09.......................................................................35
Hình 4.14: Phổ HSQC và HMBC của PT09.....................................................35
Hình 4.15: Cẩu trúc của hợp chất PT09........................................................... 36
Sinh viên: Trần Thi Thao
Lớp K37B - Hóa học
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.................................................................................................................. 1
Chương 1: TỔNG QUAN........................................................................................ 3
1.1. Tổng quan về cây Dứa dại.................................................................................3
1.1.1. Mô tả ...............................................................................................................3
1.1.2. Sinh học, sinh thái........................................................................................... 3
1.1.3. Thành phần hóa học....................................................................................... 3
1.2. Tổng quan về các phương pháp chiết [4]..........................................................5
Ỉ.2.Ỉ. Đặc điểm chung..............................................................................................5
1.2.2. Cơ sở của quá trình chiết.................................................................................5
1.2.3. Quá trình chiết thực vật.................................................................................. 6
1.3. Tổng quan về các phương pháp sắc kí [4].......................................................9
1.3.1. Đặc điểm chung của các phương pháp sắc k í................................................ 9
1.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí........................................................................ 9
1.3.3. Phân loại các phương pháp sắc k í...............................................................9
1.4. Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ.. 13
1.4.1. Đo điểm chảy..............................................................................................13
1.4.2. Phổ hồng ngoại............................................................................................. 13
1.4.3. Phổ tử ngoại khả kiến................................................................................... 14
1.4.4. Phổ khối lượng.............................................................................................. 15
1.4.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân......................................................................... 15
Chương 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ......................................... 18
2.1. Mau thực vật.....................................................................................................18
2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất................................................................18
2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)...............................................................................18
2.2.2. Sắc ký lớp mỏng điều chế.............................................................................19
Sinh viên: Trần Thi Thao
Lớp K37B - Hóa học
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
2.2.3. Sắc ký cột (CC).............................................................................................19
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các họp chất................................... 19
2.3.1. Điểm nóng chảy (Mp).................................................................................. 19
2.3.2. Độ quay cực [a]D.......................................................................................... 19
2.3.3. Phổ khối lượng (ESI-MS).............................................................................19
2.3.4. Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR)................................................................. 19
2.4. Dụng cụ và thiết bị.........................................................................................20
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết.......................................................................20
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác đmh cấu trúc.......................................................... 20
2.5. Hoá chất..........................................................................................................20
Chinmg 3: THựC NGHIỆM..............................................................................21
3.1. Thu mẫu thực vật và xử lý mẫu....................................................................... 21
3.2. Phân lập các hợp chất...................................................................................... 21
3.3. Hằng số vật lý và các số liệu phổ của các chất............................................... 23
3.3.3. Hợp chất PT09: Balanophonin.....................................................................24
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................25
4.1. Xác định cấu trúc hoá học của các họp chất................................................... 25
4.1.1. Hợp chất PT05: Secoisolaritiresinol............................................................25
4.1.2. Hợp chất PT07: lawsonicm..........................................................................28
4.1.3. Họp chất PT09: balanophonin...................................................................... 33
KẾT LUẬN...........................................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................. 39
■
Sinh viên: Trần Thi Thao
Lớp K37B - Hóa học
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
MỞ ĐẦU
Các sản phẩm thiên nhiên ngày càng được con người quan tâm và ứng
dụng rộng rãi bởi đặc tính ít độc, dễ hấp thụ và không làm tổn hại đến môi
sinh. Theo các tài liệu công bố hiện nay, có khoảng 60% - 70% các loại thuốc
chữa bệnh đang được lưu hành hoặc trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có
ngồn gốc tự nhiên.
Bằng các phương pháp thử hoạt tính sinh học hiện đại, có kết quả cao,
người ta đã tiến hành nghiên cứu các mẫu dịch chiết thực vật, nghiên cứu các
chất đã tách được từ các dịch chiết. Nhờ vậy mà phát hiện ra nhiều hợp chất
có hoạt tính sinh học quý báu, tạo điều kiện vô cùng thuận lợi cho việc phát
triển ngành y dược trong công cuộc chữa bệnh cứu người.
Nằm ừong khu vực nhiệt đới gió mùa, lượng mưa lớn, độ ẩm cao
(khoảng trên 80%), Việt Nam hiện có một hệ thực vật rất phong phú với
khoảng 12000 loài, ừong đó có tới 4000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo
dược cùng các mục đích khác phục vụ cuộc sống con người.
Cùng với bề dày phát triển 4000 năm lịch sử của dân tộc, ngành đông y
đã dành được những thành tựu rực rỡ, nhiều phương thuốc cây cỏ động vật đã
được ứng dụng hiệu quả lưu truyền cho đến ngày nay. Đó là cơ sở rất quan
ừọng cho việc phát triển ngành hoá học các họp chất thiên nhiên.
Tuy nhiên đối với một đất nước còn hạn chế về nguồn vốn và cơ sở vật
chất như Việt Nam thì vấn đề đặt ra là làm thế nào để khai thác và sử dụng
nguồn tài nguyên một cách hiệu quả nhất cho xã hội.
Vì vậy tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu phân lập một số
họp chất lỉgnan từ cây Dứa dại - Pandanus odoratissimus”.
Cây Dứa dại - Pandanus odoratissimus thuộc họ Pandanaceae là loại
cây phổ biến ở các quần thể cây ngập mặn. Tuy nhiên, hiện chưa có nhiều tài
liệu công bố về thành phần hoá học cũng như ứng dụng dược lý của loài này.
Sinh viên: Trần Thi Thao
1
Lớp K37B - Hóa học
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Khoá luận này tập trung nghiên cứu thành phàn lignan của quả cây Dứa
dại tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo ừong lĩnh vực tìm kiếm thuốc
mới, các giải pháp điều trị bệnh.
Nhiêm vu của đề tài:
•
•
1. Phân lập hợp các hợp chất lignan từ quả cây Dứa dại bằng các
phương pháp sắc ký.
2. Xác định cấu trúc hoá học của các họp chất đã phân lập được bằng
các phương pháp phổ.
Sinh viên: Trần Thi Thao
2
Lớp K37B - Hóa học
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây Dứa dại
1.1.1. Mô tả
Cây bụi cao đến 5 m, đường kính thân cỡ 15 cm; thân có nhiều nhánh
và nhiều rễ phụ. Lá hình máng, dài đến 1,5 m, rộng cỡ
6 -8
cm, mép và gẫn
giữa có gai, chóp lá có đuôi dài đến 10 cm. Cụm hoa ở nách lá hoặc ở ngọn,
hình đầu, mang 2-3 lá bắc cụm hoa. Lá bắc cụm hoa dạng lá, dài đến 25 cm.
Chùm quả hình cầu hoặc hình trứng, đường kính đến 20 cm, dài đến 25 cm,
mang đến 100 quả. Quả hình răng ngựa, dài 5-6 cm, rộng 3-4 cm, có vòi nhụy
tồn tại, vòi nhụy xẻ đôi; mặt cắt ngang quả phía đính hình lục giác; khi chín
màu vàng cam, có mùi thơm.
1.1.2. Sinh học, sinh thái
Ở Vườn Quốc gia Xuân Thủy, cây có quả tháng 5-8. Chúng phân bố
một số điểm ừên bờ đê và cồn cát phía ngoài cồn Lu.
Đọt non và rễ được dùng trong nhân dân làm thuốc thông tiểu dùng trong
những trường hợp đái dắt, đái ra sỏi, sạn. Còn dùng đắp chữa bệnh trĩ. [1]
1.1.3. Thành phần hóa học
Năm 1998 Ting ting Jong và các cộng sự Đài Loan đã công bố 10 họp
chất từ rễ cây dứa dại Pandanus odoratissimus, trong đó có 2 hợp chất
phenolic và benzofuran mới là 4-hydroxy-3-(2',3'-dihydroxy-3'-methyl-butyl)benzoic acid methyl ester và 3-hydroxy-2-isopropenyl-dihydrobenzofuran-5carboxylic acid methyl ester. Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa cho thấy
các
họp
chất
pinoresinol
và
3,4-bis(4-hydroxy-3-methoxy-benzyl)-
tetrahydrofuran có hoạt tính mạnh. [2 ]
Sinh viên: Trần Thi Thao
3
Lớp K37B - Hóa học
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
o
HO
H
2 . ( E ) - 3 - ( 3 ' - m e t h o x y - 4 ’- h y d r o x y p h e n y l ) p r o p -2 -e n a l
1 . V a n illin
0 CH3
1
1
l^ O H
^
OH
---------- 0
OH
3. 4 - h y d r o x y - 3 - ( 2 ' ,3 ' - d i h y d r o x y - 3 ' - m e t h y l -
4 . 3 -h y d r o x y -2 -is o p r o p e n y ld ih y d r o b e n z o fu r a n -5 -c a r b o x y lic a c id
b u t y l) - b e n z o ic a c id m e th y l e s te r
m e th y l e ster
OCH3
V
HIM.A—
7
5 “
1 ^
(V
V
ễ /.MIH
HiM.A—
s/ .M H
j x
OCH3
0CH3
5 . e u d e s m in
6 . k o b u s in
OCH3
0CH3
f j 0H
rJ y
H I„ „\
r
7^
-----/.IIIIH
X T '
OCH3
OCH3
7 . p in o r e s in o l
8 . e p ip in o r e s in o l
OCH3
J^^O C H 3
\9
H3CO
OCH3
0
1
7/
" x X
je ? * *
OCH3
i
7
X T
10. 3 , 4 - b i s ( 4 - h y d r o x y - 3 - m e t h o x y - b e n z y l ) te tr a h y d r o f u r a n
9 . d e -4 '-0 -m e th y le u d e s m in
Sinh viên: Trần Thi Thao
4
Lớp K37B - Hóa học
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Năm 2010 nhóm nghiên cứu của Dinesh Kumar (Ấn Độ) đã nghiên cứu
hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết phân đoạn của lá cây Dứa dại ừên các
chửng vi khuẩn Bacillus subtiỉis, Escherìchia coli, Staphlococcus aureus và
Candỉda albicans. Kết quả cho thấy cả ba dịch chiết ete dầu hỏa, CHCI3 và
methanol đều có tính kháng khuẩn tốt với các chủng vi khuẩn gram dương với
nồng độ ức chế tối thiểu MIC làn lượt là 50 mg/ml, 50 mg/ml và 25 mg/ml. [3]
1.2. Tổng quan về các phương pháp chiết [4]
1.2.1. Đặc điểm chung
Khái niệm: Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình
chuyển một chất hoà tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không
hoà tan với nó.
Mục đích: Sử dụng phương pháp chiết để chuyển một lượng nhỏ chất
nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi
khác nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm
giàu. Ngoài ra còn dung phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các chất
ừong một hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp. Phương pháp này thường
được dung để phân tách các hợp chất tự nhiên có trong thực vât.
1.2.2. Cơ sở của quá trình chiết
Cơ sở của quá trình chiết là dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất
ừong hai chất lỏng không tan lẫn với nhau. Sự phân bố khác nhau là do tính
tan khác nhau của các chất trong pha lỏng.
Quá trình chiết dựa trên định luật phân bố Nerst:
Ka = Ca/C b
với
KA: hằng số phân bố.
Ca»Cb : nồng độ chất hoà tan ừong hai pha lỏng A, B không tan lẫn.
Sinh viên: Trần Thi Thao
5
Lớp K37B - Hóa học
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
1.2.3. Quá trình chiết thực vật
1.2.3.1. Hợp chất tự nhiên trong cây
Dựa vào chức năng sinh học, người ta chia các hợp chất trong cây
thảnh hai nhỏm lớn:
-
Chất chuyển hoá sơ cấp (primary metabolite).
-
Chất chuyển hoá thứ cấp (secondary metabolite).
Chất chuyển hoá sơ cấp là chất tham gia vào quá trình sinh trưởng của
cây như các hydrat cacbon, lipit, axit amin. Nói chung chúng là thành phần
không thể thiếu trong cây cỏ.
Chất chuyển hoá thứ cấp là những chất mà vai trò chủ yếu của chúng
không phải để nuôi sống và phát triển cây cỏ, chúng có thể có ở cây này và
vắng mặt ở cây kia. Có rất nhiều giả thiết về vai trò của chúng ừong thực vật.
Có ý kiến cho rằng chúng là những chất thải, góp phần giải độc cho cây
(ancaloid, tinh dầu), góp phần bảo vệ chống các tác nhân làm hại cây
(ílavonoid, saponin, tinh dầu, terpenoid...), hoặc góp phần tạo màu sắc, quyến
rũ ong bướm giúp cho sự phát triển nòi giống (ílavonoid, carotenoid...) v.v...
Do có các tác dụng sinh lý và dược lý như tác dụng kháng sinh, diệt
nấm, tác dụng ức chế hoặc gây độc đối với tế bào, tác dụng kích thích hoặc ức
chế sinh trưởng và các tác dụng khác mà các chất trao đổi bậc hai là đối tượng
nghiên cứu quan trọng trong các lĩnh vực như y dược học, nông nghiệp.
Trong cây các họp chất hữu cơ có tính chất hoá lý rất khác nhau, chúng
tồn tại ở dạng hoà tan ừong nước, dầu béo hoặc tinh dầu. Các chất hoà tan
ừong nước (dịch tế bào) là các hydro cacbon phân tử bé (monosacarit,
oligosacarit), một số polysacarit (pectin, gôm), các glycozit (saponin,
ílavonoid...), muối ancaloid của các axit hữu cơ, axit hữu cơ, axit amin, muối
amin. Các chất tan trong dầu béo và tinh dầu là các hydro cacbon,
monoterpen, secquiterpen, sterol, carotenoid và các dẫn xuất phenyl
Sinh viên: Trần Thi Thao
6
Lớp K37B - Hóa học
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
propanoid. Dầu béo và tinh dầu được khu trú trong các bộ phận riêng biệt của
cây như ở hạt (dầu béo), ở hạch tiết của lá, vỏ thân (tinh dầu).
Ngoài ra trong cây còn chứa các muối vô cơ. Các muối vô cơ này ít
tham gia vào tác dụng sinh lý của dược liệu, tuy nhiên đây chính là các nguồn
nguyên tố vi lượng không thể thiếu đối với cây cỏ. Ở một số loài các muối vô
cơ cũng có một số tác dụng như tác dụng lợi tiểu của muối kali (natri) trong
râu ngô, tác dụng trị vi khuẩn của lưu huỳnh trong họ cải, tác dụng trị bướu cổ
của các họp chất iốt của các loại tảo biển.
Mặt khác trong cây cũng có mặt các loại enzyme, do đó trong quá trình
nghiên cứu, nếu không khống chế sự hoạt động của các enzyme này thì các
glycozit có thể bị thuỷ phân một phàn hoặc toàn phần làm thay đổi tính phân
cực, do đó thay đổi độ hoà tan của họp chất trong dung môi.
1.2.3.2. Chọn dung môi chiết
Các họp chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau,
dung môi dùng cho các quá trình chiết phải được lựa chọn rất cẩn thận với các
đặc điểm là cần hoà tan tốt những chất đang nghiên cứu, dễ dàng được loại
bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), những dung môi này càn
được chưng cất trước khi sử dụng vì nếu lẫn các chất khác sẽ làm ảnh hưởng
đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết. Một số chất dẻo lẫn trong dung
môi như diankylphtalat, tri-n-butyl-axetylcitrat, tributylphosphat... do trong
quá trình sản xuất hay bảo quản, sẽ làm sai lệch kết quả phân lập ừong các
quá trình nghiên cứu hoá thực vật. Cloroform, etanol và metanol là những
dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một bộ phận của
cây như lá, thân, rễ, hoa...
Người ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên
màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được triệt để hơn
các thành phần có ừong tế bào. Ngược lại, khả năng phân cực của cloroform
thấp hơn, có thể rửa các chất nằm ngoài tế bào.
Sinh viên: Trần Thi Thao
7
Lớp K37B - Hóa học
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các
họp chất phân cực trung bình và thấp, vì vậy khi chiết với ancol thì các chất
này sẽ bị hoà tan đồng thời. Thường thì dung môi cồn trong nước dường như
có đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Sau khi chiết, dung môi được tách ra bằng máy cô quay ở nhiệt độ
không quá 45°c, với các hợp chất chịu nhiệt thì có thể thực hiện ở nhiệt độ
cao hơn.
1.2.3.3. Quá trình chiết
Có thể thực hiện một trong hai phương pháp sau:
* Quá trình chiết sử dụng bình chiết Soxhlet:
Đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với
chất rắn một thời gian rồi rút ra, dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục
và để tiết kiệm dung môi.
* Chiết ngâm:
Ngâm chất rắn vào dung môi trong một thời gian rồi chiết dung môi ra
(chiết nguội). Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất ừong quá trình
chiết thực vật vì nó không đòi hỏi nhiều công sức. Thông thường bình chiết
ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục vì mẫu được ngâm
ừong dung môi khoảng 24h sau đó lấy chất chiết ra. Việc kết thúc quá trình
chiết được xác định bằng một số cách như:
- Với các ancaloid, có thể kiểm ừa sự xuất hiện của các họp chất này
bằng sự tạo kết tủa với các tác nhân đặc trưng như: Dragendorff, M ayer...
- Với các ílavonoid, do chúng thường là các chất màu nên khi dịch
chảy ra không còn màu cho biết đã rửa hết chất này trong quá trình chiết.
- Trong trường họp các lacton của secquiterpen và các glycozit ừợ tim
phản ứng Kedde có thể sử dụng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi
cho phản ứng với anilin axetat cho biết sự xuất hiện của các Hydratcacbon và
từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Sinh viên: Trần Thi Thao
8
Lớp K37B - Hóa học
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Như vậy tùy thuộc vào mục đích cần lấy chất gì để lựa chọn dung môi
thích họp và thực hiện quy trình chiết họp lý để đạt hiệu quả cao nhất.
1.3.
Tổng quan về các phương pháp sắc kí [4]
1.3.1. Đặc điểm chung của các phương pháp sắc kí
Sắc kí là một phương pháp vật lý dùng để tách riêng các thảnh phần ra
khỏi hỗn họp bằng cách phân bố chúng ra hai pha: một pha có bề mặt rộng gọi
là pha tĩnh (hay là pha cố định) và pha kia là một chất lỏng hoặc khí gọi là pha
động (hay là pha di động), di chuyển đi qua pha tĩnh. Trong quá trình sắc kí,
pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh
khác, quá trình hấp phụ và giải hấp phụ lặp đi lặp lại. Kết quả là các chất có ái
lực lớn hơn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn so với chất tương tác yếu
hơn. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí.
1.3.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí
Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa
pha động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ
thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ dung dịch gọi là
định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:
n = ĩioo bc/(l + bC)
Với:
-
n: lượng chất bị hấp phụ lên pha tình lúc đạt cân bằng.
-
riooi lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào
đó.
-
b: hằng số...
-
C: nồng độ của dung dịch.
1.3.3. Phân loại các phương pháp sắc kí
Trong phương pháp sắc kí, pha động là các lưu thể (các chất ở trạng
thái khí hay lỏng), còn pha tĩnh là các chất ở ừạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa
vào trạng thái tập họp của pha động người ta chia sắc kí thành hai nhóm: sắc
kí khí và sắc kí lỏng.
Sinh viên: Trần Thi Thao
9
Lớp K37B - Hóa học
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
1.3.3.1. sắc kí lỏng
Đây là phương pháp sắc kí dùng chất lỏng làm pha động. Trong sắc kí
lỏng có các loại cụ thể sau:
a. Sắc kí giấy:
Sắc kí giấy là phương pháp phân tích với pha tĩnh là một loại giấy đặc
hiệu dùng trong sắc kí. Chất thử được chấm lên giấy rồi triển khai sắc kí bằng
dung môi thích họp trong một bình triển khai kín. Sau khi đã triển khai xong,
giấy được làm khô rồi làm hiện màu để xác định các vết chất có trong hỗn
họp chất thử. Trừ các chất có màu có thể phát hiện ngay bằng mắt thường, các
chất không màu có thể được phát hiện bằng 2 phương pháp: hóa học và vật lý.
Với phương pháp hóa học, người ta dùng các thuốc thử hiện màu đặc
trưng cho từng loại họp chất. Thuốc thử được pha thành dung dịch có nồng độ
thích họp rồi cho tác dụng lên giấy bằng cách phun lên bề mặt giấy hoặc
nhúng giấy vào thuốc thử.
Với phương pháp vật lý, có thể hiện màu bằng cách soi vào đèn u v vì
nhiều hợp chất hữu cơ hấp thụ được các tia cực tím.
b. Sắc kí lớp mỏng
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) là phương pháp phân tích dung dịch chất
phân tích di chuyển trên một lớp mỏng chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ,
theo một chiều nhất định. Trong quá trình di chuyển, mỗi thành phần chuyển
dịch với tốc độ khác nhau tùy theo bản chất của chúng và cuối cùng dừng lại
ở các vị trí khác nhau.
Chất hấp phụ thường được sử dụng trong SKLM là silicagel tráng trên
đế nhôm hay đế thủy tinh. Trong quá trình hấp phụ, sẽ xảy ra sự tranh giành
giữa dung môi và chất tan để chiếm chỗ trên bề mặt chất hấp phụ, và khi đạt
được cân bằng, mỗi chất tan sẽ ở một vị trí khác nhau ừên bản mỏng.
Để tiến hành sắc kí, chất tan được chấm lên bản thành từng vết chấm
nhỏ, sấy cho dung môi bay hơi hết rồi triển khai với hệ dung môi thích hợp
Sinh viên: Trần Thi Thao
10
Lớp K37B - Hóa học
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
trong một bình triển khai kín. Để kiểm tra vết chất có thể sử dụng thuốc thử
hiện màu hoặc soi bằng đèn u v . Thuốc thử hiện màu có thể là hơi ammoniac
hoặc dung dịch axit sunfuric 10%. Để hiện vết người ta nhúng bản vào thuốc
thử hoặc phun lên bản mỏng sau đó hơ bản trên bếp điện hoặc sấy nóng để vết
xuất hiện tò tò. Phương pháp này thường được sử dụng để kiểm ừa và định
hướng cho sắc kí cột.
Một hình thức SKLM khác cũng được sử dụng trong nghiên cứu hợp
chất tự nhiên là SKLM điều chế, dung để điều chế, thu chất trực tiếp. Ở
phương pháp này, quá trình thực hiện tương tự SKLM và sau khi triển khai
xong, soi u v để xác định vết rồi cạo lấy lớp silicagel chứa chất càn điều chế,
tiến hành rửa giải để thu chất,
c. Sắc kí cột
Đây là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm
các loại silicagel (có kích thước hạt rất khác nhau) pha thường và pha đảo
(YMC, ODS, dianion). Chất hấp phụ được nhồi vào cột (phổ biến nhất là cột
thủy tinh). Độ mịn của chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ảnh số đĩa lý
thuyết hay kha năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ
thì số đĩa lý thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên,
nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm. Trong
một số trường hợp nếu lực trọng trường không đủ lớn thì sẽ gây hiện tượng
tắc cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất để
kích thích dung môi chảy (áp suất trung bình - MPC, áp suất cao - HPLC).
Tỷ lệ đường kính so với chiều cao cột (L/D) phụ thuộc vào yêu cầu
tách (phụ thuộc vào lượng chất và chất cụ thể).
Tỷ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của
dung môi là Rf, với mỗi chất khác nhau giá trị Rf khác nhau. Nhờ sự khác
nhau này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn họp.
Sinh viên: Trần Thi Thao
11
Lớp K37B - Hóa học
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Tùy thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa lên cột
bằng các phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ
biến là tẩm chất vào silicagel rồi làm khô tơi hoàn toàn sau đó đưa lên cột.
Neu tách tinh, thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan chất vào dung
môi chạy cột với lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
- Nhồi cột khô: theo cách này chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột
khi còn khô sau đó gõ nhẹ lên thành cột để đưa chất hấp phụ xếp chặt trong
cột. Dùng dung môi chạy cột để rửa giải.
- Nhồi cột ướt: chất hấp phụ được hòa tan trong dung môi chạy cột với
lượng dung môi tối thiểu. Sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết
Khi chuẩn bị cột cần lưu ý không được để có bọt khí ừong cột (nếu có
bọt khí sẽ gây nên hiện tượng chảy rối trong cột, và giảm hiệu quả tách). Và
cột không được nứt, gãy, rò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc
độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Nếu tốc độ chảy quá chậm
thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc.
1.3.3.2. Sắc kí khỉ
Đây là phương pháp sắc kí dùng chất khí làm pha động. Chất thử có thể
là chất khí lỏng hoặc chất rắn được chuyển thành thể bay hơi và nhờ một
luồng khí trơ làm chất tải dẫn đi qua pha tĩnh. Nếu pha tĩnh là một chất rắn thì
gọi là sắc kí khí - rắn. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì gọi là sắc kí khí - lỏng. Ở
sắc kí khí - rắn, chất rắn được dùng là những chất có tính hấp phụ như
silicagel, than hoạt tính, oxit nhôm. Ở sắc kí khí - lỏng, chất lỏng được phân
tán mỏng như một lớp phim ừên bề mặt một chất rắn ừơ gọi là nền. Khi chất
thử được khí tải dẫn đi qua pha tĩnh, chúng bị tách riêng ra tùy theo hệ số
phân bố của mỗi thành phần trong hỗn họp chất thử đối với pha tĩnh.
Sinh viên: Trần Thi Thao
12
Lớp K37B - Hóa học
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
1.4. Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc của các họp chất
hữu cơ [5]
Khi đã phân lập được một hợp chất hữu cơ, điều quan trọng là phải xác
định được cấu trúc của chúng. Đe có thể thực hiện được điều này càn phải
phân tích bằng nhiều phương pháp kết hợp với nhau.
1.4.1. Đo điểm chảy
Đối với chất rắn kết tinh thì điểm chảy là một tiêu chuẩn lý học rất
quan trọng, nó là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ tinh khiết của họp chất. Nếu
điểm chảy của hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chỉ chênh lệch
nhau không quá 0.5°c thì có thể xem sản phẩm kết tinh đã tinh khiết. Nếu một
hợp chất kết tinh có điểm chảy còn thấp rất xa so với điểm chảy lí thuyết thì
chứng tỏ sản phẩm thu được chưa tỉnh khiết và phải tinh chế và kết tinh lại.
Trong nhiều trường họp, với việc xác định được điểm chảy có thể đưa
ra được kết luận hoặc nhận định sơ bộ về hợp chất cần nghiên cứu bằng các
đem đi so sánh, đối chiếu với các tài liệu đã có sẵn.
1.4.2. Phổ hồng ngoại
Các hợp chất hữu cơ hấp thụ bức xạ hồng ngoại ở những tần số trong
vùng
1 0
0 0 0
-
1 0 0
0 0 0
cm ' 1 và biến thành năng lượng của dao động phân tử.
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa ừên sự khác nhau của các dao động của
các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của các tia hồng ngoại,
như vậy phổ hồng ngoại là phổ hấp thụ của
2
dạng năng lượng là năng lượng
dao động và năng lượng quay.
Tần số hay độ dài sóng hấp thụ của mỗi chất phụ thuộc vào khối lượng
tương đối của các nguyên tử, liên kết và vào cấu trúc hình học của chúng. Với
mỗi hợp chất khác nhau chứa các liên kết khác nhau thì sự hấp thụ hồng ngoại
là khác nhau. Dựa trên những đặc điểm này mà ta có thể xác định được các
nhóm chức trong hợp chất hữu cơ bằng cách đo và phân tích phổ hồng ngoại.
Sinh viên: Trần Thi Thao
13
Lớp K37B - Hóa học
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2
Khóa Luận Tốt Nghiệp
Dưạ vào sự hấp thụ đặc trưng của các nhóm chất mà có thể chia phổ
hồng ngoại thành 3 vùng: vùng sóng ngắn từ 4000 - 1300 em ', vùng sóng dài
tò 909 - 650 cm' 1 và vùng sóng trung bình từ 1300 - 909 cm' 1
Trong vùng sóng ngắn các nhóm chức hữu cơ bị hấp thụ là OH, NH,
CO,... Nếu không có dải hấp thụ trong vùng 1850 - 1540 cm ' 1 là không có
nhóm CO, không có dải hấp thụ ở 3650 - 3200 cm' 1 là không có nhóm OH
phenol hoặc ancol. Các hợp chất thơm hoặc tạp thơm thường có dải hấp thụ
nằm trong khoảng 1600 - 1300 cm' 1 .
Vùng sóng dài đặc trưng cho các hấp thụ của dao động biến dạng. Nếu
không có dải hấp thụ trong khoảng 909 - 605 c m 1 là hợp chất không có cấu
trúc thơm. Các hấp thụ của dao động biến dạng của vòng thơm và biến dạng
c
- H ngoài mặt phẳng của các hợp chất thơm và tạp thơm xuất hiện với
cường độ mạnh và thường có liên quan đến nhóm thế của các họp chất. Nếu
có dải hấp thụ rộng với cường độ mạnh thì rất có thể có mặt các dime của axit
cacboxilic, của amin, amit. Nếu có các dải ở gần 1000 cm ' 1 thì rất có thể có
cấu trúc olefin.
Vùng sóng trung binhg được gọi là vùng chỉ vân tay vì nó được dùng
để so sánh hình dạnh các dải hấp thụ với mẫu chuẩn xem có đồng nhất hay
không. Ví dụ: nếu có dải hấp thụ OH ở 3550 - 3200 cm' 1 thì vị trí dải hấp thụ
c-o
tại đây sẽ giúp ta phân biệt được chi tiết hơn về cấu trúc của phenol
hoặc ancol đó.
1.4.3. Phổ tử ngoại khả kiến
Sự hấp thụ trong vùng tử ngoại và vùng khả kiến của hợp chất hữu cơ phụ
thuộc vào cấu trúc điện tử của phân tử. Sự hấp thụ ấy gây ra sự chuyển dịch các
điện tử từ orbitan ở ừạng thái cơ bản lên các orbtan có năng lượng cao hơn ở
trạng thái kích thích. Tuy nhiên chỉ có một số dạng cấu trúc trong hợp chất hữu
cơ mới có sự hấp thụ ấy nên việc ứng dụng phổ u v cũng chỉ giới hạn ừong một
số lớp chất mà chủ yếu là các chất có cấu trúc dây nối đôi liên hợp.
Sinh viên: Trần Thi Thao
14
Lớp K37B - Hóa học
- Xem thêm -