Tài liệu Khóa luận tốt nghiệp đánh giá kết quả điều trị của tia plasma lạnh áp suất khí quyển với tổn thương da trên mô hình chuột cống trắng mắc đái tháo đường – rối loạn lipid

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THU HÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ CỦA TIA PLASMA LẠNH ÁP SUẤT KHÍ QUYỂN VỚI TỔN THƯƠNG DA TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT CỐNG TRẮNG MẮC ĐÁI THÁO ĐƯỜNG – RỐI LOẠN LIPID KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2022 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THU HÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ CỦA TIA PLASMA LẠNH ÁP SUẤT KHÍ QUYỂN VỚI TỔN THƯƠNG DA TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT CỐNG TRẮNG MẮC ĐÁI THÁO ĐƯỜNG – RỐI LOẠN LIPID KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Khóa: QH.2017.Y Người hướng dẫn: ThS.BS. Đỗ Thị Quỳnh ThS.BSNT. Hồ Mỹ Dung HÀ NỘI - 2022 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất đến ThS.BS Đỗ Thị Quỳnh và ThS.BSNT Hồ Mỹ Dung – Bộ môn Y dược học cơ sở, Trường Đại học Y Dược, đã giao đề tài, trực tiếp hướng dẫn và luôn tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành đề tài này Đồng thời, tôi xin cảm ơn đề tài “Nghiên cứu xây dựng mô hình tổn thương trên chuột cống trắng gây đái tháo đường và rối loạn lipid”, mã số nhiệm vụ CS.21.06 – Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã hỗ trợ nghiên cứu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề này. Tiếp đến, tôi xin gửi lời cảm ơn đến bạn Nguyễn Thị Hạnh – sinh viên lớp Dược học khoá QH.2017.Y đã cùng tôi thực hiện nghiên cứu và nhiệt tình hỗ trợ tôi rất nhiều. Qua đây, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban chủ nhiệm Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, cùng toàn thể các thầy cô giáo công tác tại trường đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và đã luôn tận tâm truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học tại trường. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô tại Bộ môn Y dược học cơ sở đã tạo điều kiện để tôi được thực hiện đề tài khoá luận tốt nghiệp này. Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè, những người đã luôn quan tâm, chăm sóc, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tuy có nhiều cố gắng, nhưng kiến thức và kinh nghiệm của tôi còn hạn chế nên không tránh khỏi những thiếu sót trong đề tài nghiên cứu này. Kính mong nhận được những lời nhận xét, góp ý của các quý thầy cô để Khoá luận tốt nghiệp của tôi được hoàn thiện hơn. Trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Nguyễn Thu Hà DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT ĐTĐ Đái tháo đường IDF Liên đoàn Đái tháo đường Quốc tế – International Diabetes Federation DFS Hội chứng bàn chân do đái tháo đường – Diabetic Foot Syndrome CAP Plasma lạnh áp suất khí quyển – Cold Atmospheric Plasma RLLP Rối loạn lipid ECM Chất nền ngoại bào – Extracellular matrix HIF-1α Yếu tố cảm ứng thiếu oxy – Hypoxia-inducible factor 1-alpha VEGF-A Các yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu – Vascular endothelial growth factor A MMPs Metalloproteinase TIMPS Chất ức chế của Metalloproteinase – Tissue inhibitors of metalloproteinase STZ Streptozocin ROS Các hoạt chất chứa oxy – Reactive oxygen species RNS Các hoạt chất chứa nito – Reactive nitrogen species TG Triglyceride CHO Cholesterol toàn phần HDL-C Lipoprotein tỉ trọng cao – High Density Lipoprotein cholesterol LDL-C Lipoprotein tỉ trọng thấp – Low Density Lipoprotein cholesterol CRP Protein C phản ứng – C-reactive protein DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1. Các tiêu chí đánh giá vết thương trên da chuột trong thời gian gây làm thí nghiệm ....................................................................................................................... 19 Bảng 3.1. Thay đổi cân nặng chuột trong quá trình làm thí nghiệm ............................ 23 Bảng 3.2. Nồng độ các chỉ số lipid máu trong hai lô thí nghiệm ................................. 23 Bảng 3.3. Sự thay đổi nồng độ glucose máu trước và sau khi tiêm STZ ...................... 24 Bảng 3.4. Các chỉ số công thức máu sau khi gây mô hình vết thương ngoài da ........... 25 Bảng 3.5. Điểm tổn thương trong quá trình theo dõi vết thương ngoài da ................... 27 Bảng 3.6. Sự thay đổi diện tích vết thương trong quá trình nghiên cứu ....................... 28 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Streptozocin ................................................................ 8 Hình 1.2: Máy phát tia Plasma lạnh PlasmaMed ® ..................................................... 10 Hình 2.1. Quy trình gây mô hình và điều trị vết thương ngoài da trên chuột cống trắng ĐTĐ/RLLP ................................................................................................................ 15 Hình 2.2. Mô hình vết thương cắt da trên chuột cống trắng ĐTĐ/RLLP ..................... 17 Hình 2.3. Điều trị vết thương bằng CAP trên chuột cống trắng ĐTĐ/RLLP................ 18 Hình 3.1. Hình ảnh đại thể vết thương trong quá trình liền thương giữa lô chứng bệnh (A) và lô mô hình (B) ................................................................................................. 26 Hình 3.2. Tỷ lệ co hồi vết thương của 2 nhóm thử nghiệm trong nghiên cứu .............. 29 Hình 3.3. Hình ảnh mô da của nhóm chứng bệnh (A) và nhóm CAP (B) ngày thứ 7 và ngày thứ 14................................................................................................................. 30 Hình 3.4. Phân bố số lượng dạng khuẩn lạc giữa trên mẫu vi sinh ở vết thương.......... 31 Hình 3.5. Tỉ lệ xuất hiện tụ cầu vàng trên mẫu vi sinh da chuột ở hai lô chứng bệnh và lô mô hình .................................................................................................................. 32 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về bệnh đái tháo đường ................................................................. 3 1.1.1. Định nghĩa và phân loại bệnh đái tháo đường ........................................... 3 1.1.2. Cơ chế bệnh sinh ...................................................................................... 3 1.1.3. Các biến chứng vết thương da mạn tính của đái tháo đường...................... 5 1.2. Phương pháp nghiên cứu mô hình đái tháo đường trên động vật thực nghiệm . 7 1.3. Plasma áp suất khí quyển lạnh – Cold atmospheric plasma .............................. 8 1.3.1. Tổng quan chung ...................................................................................... 8 1.3.2. Tác dụng sinh học của CAP trong điều trị liền thương ............................ 10 1.3.3. Các nghiên cứu về hiệu quả của CAP trong điều trị vết thương trên da ... 12 CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 14 2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 14 2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm ....................................................... 14 2.2.1. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ................................................................... 14 2.2.2. Hóa chất ..................................................................................................... 14 2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 15 2.3.1. Phương pháp gây vết thương ngoài da trên mô hình chuột ĐTĐ/RLLP ...... 16 2.3.2. Phương pháp đánh giá hiệu quả của tia plasma lạnh trên chuột ĐTĐ/RLLP mang vết thương ngoài da .................................................................................... 17 2.3.3. Theo dõi, đánh giá kết quả sau khi tiến hành thí nghiệm............................ 18 2.3.4. Xử lý số liệu .............................................................................................. 22 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ........................................................................................... 23 3.1. Đặc điểm sinh trắc học của hai nhóm nghiên cứu ......................................... 23 3.2. Kết quả theo dõi quá trình liền vết thương sử dụng CAP trên các tổn thương da ở chuột cống trắng mắc bệnh đái tháo đường – rối loạn lipid ................................... 24 3.3. Bước đầu đánh giá kết quả tái cấu trúc mô da vi thể và khử khuẩn của CAP trên các tổn thương da ở chuột cống trắng mắc bệnh đái tháo đường – rối loạn lipid ...... 29 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ........................................................................................ 33 4.1. Một số đặc điểm về chỉ số sinh trắc học của hai nhóm thí nghiệm ................. 33 4.2. Hiệu quả sử dụng CAP trong quá trình liền thương trên mô hình vết thương ngoài da trên chuột cống trắng ĐTĐ/RLLP ............................................................. 34 4.3. Đánh giá kết quả tái cấu trúc mô da vi thể và khử khuẩn khi sử dụng CAP trên các tổn thương da ở chuột cống trắng mắc bệnh ĐTĐ/RLLP ................................... 36 KẾT LUẬN ............................................................................................................... 39 KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 41 ĐẶT VẤN ĐỀ Đái tháo đường là một bệnh lý rối loạn chuyển hóa không đồng nhất, đặc trưng bởi nồng độ glucose trong máu ở mức cao. Tăng glucose mạn tính trong thời gian dài gây ra những rối loạn về chuyển hóa carbohydrate, protide, lipid, gây tổn thương ở nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt ở tim, mạch máu, thận, các chi, mắt và thần kinh 1. Theo Liên đoàn Đái tháo đường Quốc tế (International Diabetes Federation Diabetes Atlas IDF), năm 2019 toàn thế giới có 463 triệu người (trong độ tuổi 20 – 79) mắc bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) và dự kiến năm 2030 có khoảng 578 triệu người mắc ĐTĐ và 2045 sẽ là 700 triệu người. Ngoài ra, ước tính năm 2019, có khoảng hơn 4 triệu người đã tử vong vì các nguyên nhân liên quan đến ĐTĐ 2. Tại Việt Nam, theo dữ liệu cập nhật của IDF, năm 2019 tỷ lệ người trưởng thành mắc ĐTĐ chiếm 6% dân số và dự báo ĐTĐ sẽ trở thành một trong bảy căn bệnh gây tử vong và tàn tật hàng đầu ở Việt Nam vào năm 2030 3. Những con số biết nói trên cho thấy dấu hiệu đáng báo động về sự gia tăng nhanh chóng số người mắc ĐTĐ, gây ra nhiều ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người, kéo theo các gánh nặng về kinh tế và xã hội nhằm kiểm soát, điều trị bệnh và các biến chứng của bệnh. Khi mắc ĐTĐ, sức đề kháng của cơ thể bệnh nhân thường suy giảm, dẫn đến người bệnh có nguy cơ nhiễm trùng cao hơn. Trong đó, hội chứng bàn chân do đái tháo đường (Diabetic Foot Syndrome – DFS) và các tổn thương loét da mạn tính là một trong những biến chứng mạch máu thường gặp trên bệnh nhân ĐTĐ. Các vết loét trên bệnh nhân ĐTĐ thường khó điều trị (do rối loạn liền thương) và thường dẫn đến những biến chứng nặng hơn như nhiễm trùng toàn thân hoặc phải cắt cụt chi để bảo toàn 4,5. Do vậy, nhiều nhóm nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới vẫn đang tiếp tục nghiên cứu các phương pháp tiếp cận chữa lành vết thương trên bệnh nhân ĐTĐ để cải thiện hiệu quả điều trị, gia tăng chất lượng cuộc sống cho người bệnh. Các phương pháp điều trị thông thường như băng bó vết thương, liệu pháp tế bào hay liệu pháp oxy bước đầu nghiên cứu cho thấy hiệu quả trong việc cải thiện tình trạng mô tại vết thương, hỗ trợ quá trình liền vết thương người mắc ĐTĐ tuy nhiên hiệu quả vẫn chưa cao, chưa gia tăng được tác dụng kháng khuẩn, chi phí điều trị tốn kém và vẫn cần tiếp tục cải thiện để tối ưu hóa điều trị 6. 1 Trong những năm gần đây, plasma lạnh áp suất khí quyển (Cold Atmospheric Plasma – CAP) được áp dụng như một phương pháp điều trị hỗ trợ liền thương, có tính khả thi trong điều trị các vết thương mạn tính, đặc biệt là vết thương ĐTĐ. Các nghiên cứu in vitro 7, các nghiên cứu tiền lâm sàng đối với vết thương mạn tính ở động vật 8 và thử nghiệm bước đầu trên người 9,10 đã cho thấy CAP làm giảm số lượng vi khuẩn trên vết thương, thúc đẩy quá trình tái tạo mô và chữa lành vết thương mà không gây tổn hại nào trên các mô xung quanh 4. Trên thế giới một số nghiên cứu đã tiến hành sử dụng phương pháp CAP trong điều trị vết thương trên bệnh nhân ĐTĐ trên một số thiết bị phát tia CAP của các nước sáng chế, tuy nhiên các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng vẫn còn hạn chế về số lượng và thiết kế nghiên cứu. Tại Việt Nam, năm 2019 Bộ Y tế đã cấp phép cho sử dụng máy PlasmaMed do Việt Nam sản xuất cho việc điều trị các vết thương ngoài da trên bệnh nhân. Theo công bố gần đây, chủ yếu các cơ sở y tế dùng CAP cho việc điều trị vết thương phẫu thuật hoặc vết bỏng, dữ liệu nghiên cứu hiệu quả của CAP trên vết thương mạn tính trong đó có ĐTĐ còn rất hạn chế. Do đó, để mở rộng, cung cấp những dữ liệu cho việc phát triển, xây dựng phương pháp điều trị mới an toàn và hiệu quả trên vết thương ĐTĐ, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá kết quả điều trị của tia plasma lạnh áp suất khí quyển với tổn thương da trên mô hình chuột cống trắng mắc đái tháo đường – rối loạn lipid” với hai mục tiêu sau: Mô tả quá trình liền vết thương sử dụng CAP trên các tổn thương da ở chuột cống trắng mắc bệnh đái tháo đường – rối loạn lipid. Đánh giá sơ bộ kết quả tái cấu trúc mô da vi thể và khử khuẩn của CAP trên các tổn thương da ở chuột cống trắng mắc bệnh đái tháo đường – rối loạn lipid. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh đái tháo đường 1.1.1. Định nghĩa và phân loại bệnh đái tháo đường Theo định nghĩa của Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ năm 2020 – American Diabetes Associatione: “Đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh lý rối loạn chuyển hóa không đồng nhất, đặc trưng bởi sự tăng đường huyết, gây ra do giảm bài tiết insulin, và/hoặc giảm hoạt tính của insulin. Tăng đường huyết mãn tính trong thời gian dài gây ra những rối loạn về chuyển hóa và suy giảm chức năng nhiều cơ quan khác nhau, đặc biệt là tim, thận, mắt, thần kinh và mạch máu 11. Theo “Tiêu chuẩn chăm sóc y tế cho bệnh nhân đái tháo đường” năm 2021 của ADA, bệnh ĐTĐ được phân loại thành các loại chung sau 12:  ĐTĐ tuýp 1: bệnh do phản ứng tự miễn dịch, phá hủy tế bào β tự miễn, dẫn đến thiếu hụt insulin tuyệt đối.  ĐTĐ tuýp 2: đặc trưng bởi sự đề kháng insulin, dẫn đến mất dần sự bài tiết insulin của tế bào β.  ĐTĐ thai kỳ: xuất hiện lần đầu tiên trong thời kỳ mang thai, được chẩn đoán vào khoảng giữa hoặc cuối thai kỳ.  ĐTĐ do các nguyên nhân khác như: Hội chứng ĐTĐ đơn nguyên (ở trẻ sơ sinh và khởi phát ở tuổi trưởng thành), các bệnh liên quan tuyến tụy ngoại tiết (xơ nang, viêm tụy), do thuốc hoặc do hóa chất gây ra bệnh ĐTĐ (sử dụng glucocorticoid, đang điều trị HIV/AIDS hoặc sau cấy ghép nội tạng). 1.1.2. Cơ chế bệnh sinh Đái tháo đường tuýp 1 và tuýp 2 là hai loại ĐTĐ phổ biến nhất. Trong số này, tuýp 2 cho đến nay là thường gặp nhất, chiếm khoảng 90% tổng số các trường hợp mắc ĐTĐ. 3 1.1.2.1. Bệnh sinh đái tháo đường tuýp 1 Đái tháo đường tuýp 1 còn được gọi là ĐTĐ phụ thuộc insulin. Bệnh được cho là xảy ra khi hệ thống miễn dịch của cơ thể tự tấn công và phá hủy tế bào β sản xuất insulin của tuyến tụy. Kết quả là tuyến tụy sản xuất rất ít hoặc không có insulin dẫn đến lượng đường trong máu tăng cao không kiểm soát 14 – 16. ĐTĐ tuýp 1 chỉ chiếm khoảng 10% các trường hợp mắc ĐTĐ trên toàn thế giới, chủ yếu xảy ra ở trẻ em và người trẻ tuổi. Nguyên nhân chính xác của ĐTĐ tuýp 1 vẫn chưa xác định được, tuy nhiên bệnh được cho là có liên quan đến yếu tố di truyền và sự tác động của môi trường. Quá trình tự miễn dịch diễn ra ở người nhạy cảm về di truyền dưới tác động kích hoạt của một hoặc nhiều yếu tố môi trường và sẽ tiến triển trong khoảng thời gian từ nhiều tháng đến nhiều năm 15. 1.1.2.2. Bệnh sinh đái tháo đường tuýp 2 ĐTĐ tuýp 2 còn gọi là ĐTĐ không phụ thuộc insulin, đặc trưng bởi sự đề kháng insulin, là bệnh ĐTĐ phổ biến với tỷ khoảng lệ 90% tổng số các trường hợp mắc ĐTĐ. Bệnh thường gặp ở người trên 40 tuổi, tuy nhiên bệnh đang ngày càng trở nên phổ biến ở những người trẻ hơn. Có 2 yếu tố liên quan mật thiết với nhau trên những bệnh nhân mắc ĐTĐ tuýp 2 đó là sự đề kháng insulin và rối loạn bài tiết insulin 2. Thông thường, với ĐTĐ tuýp 2, tuyến tụy vẫn còn khả năng sản xuất insulin, tuy nhiên lượng insulin này sản xuất không đủ hoặc cơ thể không sử dụng được insulin hoặc có thể do cả hai nguyên nhân dẫn đến tình trạng kháng insulin. Cơ chế kháng insulin hiện nay chưa rõ, tuy nhiên, khả năng là do bất thường tại các vị trí trước, sau và ngay tại thụ thể insulin ở mô đích. Ngoài ra do giảm hoạt tính của tyrosine kinase của vùng sau thụ thể insulin làm cho insulin khi gắn vào thụ thể không phát huy được tác dụng sinh học 16. Tình trạng béo phì và thừa cân đóng vai trò quan trọng trong việc gia tăng tình trạng kháng insulin ở bệnh nhân ĐTĐ tuýp 2. Chế độ ăn uống sinh hoạt thiếu khoa học, dẫn đến việc cơ thể tích lũy mỡ và dư thừa năng lượng trong thời gian dài dẫn đến tăng acid béo tự do và tăng cao lượng đường huyết trong máu. Ban đầu lượng insulin bài tiết ra vẫn đủ đáp ứng nhưng dần dần sự đề kháng insulin tăng lên, insulin trong cơ thể không đủ duy trì chuyển hóa đường huyết trong máu ở mức bình thường. 4 Rối loạn bài tiết insulin là khi mới mắc bệnh, lúc này insulin có thể ở mức bình thường hoặc tăng tiết nhưng tốc độ tiết insulin chậm và không theo kịp với mức tăng đường huyết trong máu. Nếu lượng đường huyết trong máu vẫn tiếp tục tăng thì ở giai đoạn sau, sự bài tiết insulin để đáp ứng với lượng đường huyết sẽ giảm sút, dẫn tới suy giảm bài tiết insulin 17. Ngoài ra, sự tăng mạn tính các acid béo tự do ở bệnh nhân ĐTĐ tuýp 2 cũng gây ra hiện tượng apoptosis ở các tế bào β đảo tụy, làm tăng tích tụ amyloid và giảm các tế bào sản xuất insulin ở tiểu đảo Langerhans 18. 1.1.3. Các biến chứng vết thương da mạn tính của đái tháo đường Đái tháo đường là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Người mắc bệnh ĐTĐ có rất nhiều nguy cơ phát triển một số vấn đề nghiêm trọng về sức khỏe. Lượng đường huyết luôn ở mức cao có thể dẫn đến các bệnh nghiêm trọng ảnh hưởng đến tim, mắt, mạch máu, thận, thần kinh và nguy cơ mắc các bệnh nhiễm trùng cao hơn nhiều 19. Các biến chứng mạch máu của ĐTĐ bao gồm tổn thương hệ thần kinh (bệnh thần kinh), tổn thương hệ thống thận (bệnh thận), tổn thương mắt (bệnh võng mạc), các biến chứng về tim mạch (đột quỵ, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim) và bệnh mạch máu ngoại vi. Trong đó, bệnh mạch máu ngoại vi có thể dẫn đến các vết bầm tím gây hoại tử mô, tạo các vết loét hoặc vết thương khó lành, gây gia tăng nguy cơ nhiễm trùng, thậm trí phải cắt cụt chi 20. Thông thường quá trình chữa lành vết thường có 4 giai đoạn đan xen nhau: quá trình đông máu, viêm, giai đoạn tăng sinh (hình thành mô hạt) và giai đoạn tái tạo hoặc hình thành sẹo. Giai đoạn viêm bắt đầu bằng việc đông máu, vùng da bị tổn thương kích hoạt dòng đông máu bao gồm cả tiểu cầu, hình thành nút fibrin để cầm máu cũng như che phủ và bảo vệ vết thương tạm thời. Tiến triển của giai đoạn viêm dẫn đến giải phóng một số cytokine và các yếu tố tăng trưởng giúp thu hút các dòng bạch cầu và đại thực bào đến để dọn dẹp ổ viêm. Sự di chuyển của các tế bào sừng, tăng sinh nguyên bào sợi, mô hạt và hình thành chất nền ngoại bào (Extracellular matrix – ECM) gây ra sự co lại dần của vết thương. Kết quả của sự tăng sinh tích cực các tế bào nội mô là cơ sở của quá trình tân tạo mạch, các yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (Vascular endothelial growth factor A – VEGF-A) là một trong những đích tác dụng chính của yếu tố cảm ứng thiếu oxy (Hypoxia-inducible factor 1-alpha – HIF-1α) làm tăng mật độ mao mạch ở vết 5 thương, phục hồi lưu lượng máu dẫn đến sửa chữa, làm lành vết thương hoặc hình thành các mô sẹo 21,22. Khi quá trình sinh lý liền thương không được diễn ra thuận lợi, vết thương mạn tính sẽ xảy ra với sự xuất hiện của các vết loét hoặc có thể hình thành sẹo lồi. Phần lớn các vết thương mạn tính ở bệnh nhân ĐTĐ được đặc trưng bởi giai đoạn viêm kéo dài hoặc quá mức, nhiễm trùng dai dẳng, mất cân bằng trong điều hòa ECM, các tế bào biểu bì hoặc da không có khả năng phản ứng với các kích thích. Trong bệnh ĐTĐ, sự cân bằng giữa việc thúc đẩy hình thành mạch máu mới và sự trưởng thành của chúng bị xáo trộn do việc tăng đường huyết quá mức làm ảnh hưởng đến sự ổn định và hoạt hóa HIF1α, ngăn chặn hoạt động gen đích VEGF-A 23. Ngoài ra, quan sát ở bệnh nhân ĐTĐ cho thấy khả năng điều hòa ECM bị suy giảm nghiêm trọng. Sự tích tụ ECM được điều chỉnh bởi metalloproteinase (MMPs) – một enzym phân hủy collagen, phá hủy protein và chất ức chế mô của metalloproteinase (Tissue inhibitors of metalloproteinase – TIMPs). Lượng đường huyết trong máu ở bệnh nhân ĐTĐ tăng cao trực tiếp làm tăng MMPs và giảm TIMPs, phá vỡ sự cân bằng giữa 2 chất này góp phần làm chậm quá trình chữa lành vết thương ở bệnh nhân ĐTĐ 22. Suy giảm khả năng chữa lành vết thương trong bệnh ĐTĐ là kết quả của quá trình sinh lý bệnh phức tạp, liên quan đến các thành phần mạch máu, bệnh thần kinh, miễn dịch và hóa sinh. Biến chứng bàn chân do ĐTĐ hay còn được gọi là loét chi mạn tính là những vết thương phổ biến nhất ở bệnh nhân ĐTĐ. Theo thống kê, khoảng 15 – 25% số bệnh nhân ĐTĐ có nguy cơ bị loét bàn chân, trong đó 40-80% bệnh nhân bị nhiễm trùng nặng liên quan đến xương và dẫn đến viêm tủy xương. Nhiều trường hợp loét bàn chân phải nhập viện và can thiệp phẫu thuật cắt cụt chi dưới, ước tính 50 – 70% các trường hợp phải cắt cụt chi là do vết thương của bệnh ĐTĐ, mặc dù vậy tỷ lệ tái phát vết loét vẫn lớn hơn 50% sau 3 năm phẫu thuật 22,24,25. Hiện nay trên thực tế, điều trị các vết thương mạn tính là ngăn chặn sự xuất hiện của nhiễm trùng. Bởi nhiễm trùng có thể làm lớp da bị mất đi hàng rào bảo vệ, mầm bệnh tích tụ ở vùng bị tổn thương sẽ cản trở quá trình liền thương. Các phương pháp điều trị vết thương mạn tính ĐTĐ hiện dùng như giảm ổ loét, màng sinh học, loại bỏ ổ loét, thuốc kháng sinh tại chỗ và toàn thân,… Tuy nhiên chưa có phương pháp nào thực sự hiệu quả trong việc điều trị vết loét, dứt điểm và không tái phát. Do đó nhu cầu phát triển hoặc tìm các giải pháp điều trị thay thế mới là xu hướng ưu tiên trong tương lai 22. 6 Loét chi mạn tính ở bệnh nhân ĐTĐ gây ra những cơn đau, ảnh hưởng trực tiếp tới khả năng vận động và sức khỏe của người bệnh. Hiểu biết cặn kẽ về các yếu tố nguy cơ làm tăng khả năng phát triển tổn thương bàn chân là điều cần thiết để giảm nguy cơ cắt cụt chi ở bệnh nhân ĐTĐ. Ngoài ra, còn tạo tiền đề thực hiện các nghiên cứu mới để tìm ra những phương pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh nhân 26. 1.2. Phương pháp nghiên cứu mô hình đái tháo đường trên động vật thực nghiệm Hơn một phần ba dân số thế giới bị thừa cân hoặc béo phì, do đó nguy cơ phát triển bệnh ĐTĐ sẽ ngày một gia tăng 2. Thử nghiệm các mô hình trên động vật là điều cần thiết để khám phá, tối ưu hóa các phương pháp điều trị an toàn và hiệu quả hơn cho con người. Ngày này, việc thử nghiệm trên động vật là một việc gây tranh cãi và phải tuân theo các hạn chế về pháp luật và đạo đức khác nhau trên toàn thế giới vì vậy hầu hết các mô hình thí nghiệm động vật được thực hiện trên các loài gặm nhấm 27. Hiện nay, xây dựng mô hình bệnh lý ĐTĐ trên động vật được sử dụng phổ biến bằng các phương pháp: di truyền, phẫu thuật, hóa chất 28. Với điều kiện thực tế tại Việt Nam, giống động vật mắc ĐTĐ di truyền không có sẵn và phương pháp phẫu thuật cũng quá phức tạp để thực hiện trong phòng thí nghiệm, vì vậy trong đề tài này, phương pháp tối ưu nhất được chúng tôi sử dụng để gây mô hình động vật mắc ĐTĐ là xây dựng chế độ dinh dưỡng giàu chất béo kết hợp sử dụng hóa chất STZ cho chuột. Nguyên lý chung của phương pháp này là mô phỏng đặc điểm chính của ĐTĐ tuýp 2: sự đề kháng insulin và rối loạn bài tiết insulin. Động vật thường được sử dụng là chuột cống trắng hoặc chuột nhắt. Chuột được nuôi ổn định bằng chế độ dinh dưỡng giàu năng lượng, đường và chất béo trong khoảng 4 – 8 tuần để gây ra các rối loạn về chuyển hóa, đưa đến tình trạng kháng insulin, sau đó sử dụng hóa chất tiêm vào khoang bụng để phá hủy tế bào β đảo tụy để gây nên tình trạng thiếu hụt insulin. Hóa chất thường được sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu về bệnh ĐTĐ là Streptozocin (STZ) có đặc tính gây độc cho tế bào β đảo tụy 29. 7 Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Streptozocin Streptozocin (STZ) là một dẫn xuất của N-nitrosourea, được phân lập từ Streptomyces achromoges. STZ có hoạt tính kháng sinh và đặc tính là chất chống ung thư, thường được sử dụng để gây đái tháo đường trên động vật thông qua tác dụng gây độc với tế bào β đảo tụy. STZ là một tác nhân alkyl hóa mạnh nên nó tác động tới các đại phân tử sinh học bằng cách gây tổn thương DNA dẫn tới phá hủy tế bào β đảo tụy. STZ được tích lũy trong tế bào β đảo tụy qua kênh vận chuyển glucose GLUT2 ái lực thấp nằm trong màng sinh chất. Tính độc của STZ còn được thể hiện khi tạo ra nitric oxide (NO) làm tổn thương ADN và ức chế chu trình Krebs 30,31. 1.3. Plasma áp suất khí quyển lạnh – Cold atmospheric plasma Plasma lạnh áp suất khí quyển (Cold atmospheric plasma – CAP) đang được biết đến là một trong những bước tiến mới của nền y học thế kỷ 21, đây là một kỹ thuật tiên tiến, đã được công bố là một phương pháp điều trị mới, có tính khả thi trong điều trị các vết thương mạn tính. 1.3.1. Tổng quan chung Plasma được mô tả là trạng thái thứ tư của vật chất bên cạnh ba trạng thái rắn, lỏng, khí được tạo ra khi đưa dòng khí trơ (Heli, Argon…) hoặc khí phân tử (Oxy, Nitơ,…) qua điện trường. Ở điều kiện áp suất khí quyển, do tần suất va chạm lớn nên plasma thường có nhiệt độ khá cao từ vài trăm đến vài nghin độ Celsius, thường chỉ dùng trong công nghệ khử trùng vật liệu, thiết bị. Tuy nhiên, hiện nay người ta đã có thể chế tạo ra tia plasma lạnh với nhiệt độ nhỏ hơn 40oC ở điều kiện áp suất khí quyển phù hợp với các nhu cầu đáp ứng trong công nghệ y sinh 32. Chùm tia plasma bao gồm nhiều thành phần như hoạt chất chứa oxy, hoạt chất chứa nito, các gốc tự do, electron, tia UV mật độ thấp không có tính chất đâm xuyên, không gây hại tế bào và mô da. Các hoạt chất sinh ra từ plasma, đặc biệt là các hoạt chất 8 chứa oxy (Reactive oxygen species – ROS) và các hoạt chất chứa nitơ (Reactive nitrogen species – RNS) đóng vai trò quan trọng trong những tác động sinh học của plasma 33. Năm 2005, plasma lạnh áp suất khí quyển lần đầu tiên được sử dụng để điều trị lâm sàng tại Đức. Dù công nghệ này còn khá mới nhưng đã đáp ứng được những đòi hỏi khắt khe của ngành y học thực chứng và hệ thống chăm sóc sức khỏe. Cho đến nay, nhiều thử nghiệm lâm sàng đều khẳng định plasma lạnh là một kỹ thuật mới mang lại hiệu quả tích cực trong điều trị vết thương 34. Tại Việt Nam, công ty cổ phần Công nghệ Plasma Việt Nam là một trong năm công ty đầu tiên trên thế giới sản xuất được máy phát tia plasma lạnh trong y tế. Sản phẩm máy PlasmaMed-GAP đã được Hội đồng khoa học của Viện Vật lý, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam đăng ký bằng độc quyền sáng chế năm 2014. PlasmaMedGAP là máy phát hiện tia plasma nhiệt độ thấp ở áp suất khí quyển dựa trên nguyên lý hồ quang trượt. Phiên bản máy này áp dụng cho việc điều trị, hỗ trợ làm liền thương là một hệ thống hoàn chỉnh bao gồm đầu phát tia plasma chất lượng cao, trục khuỷu, nguồn điện, pedal điều khiển và hệ cung cấp khí bao gồm hai bình khí Argon Med. PlasmaMed® dễ dàng được điều khiển ở hai chế độ: tự động phát xung và tùy chỉnh thông qua màn hình cảm ứng. Năm 2019, Bộ Y tế đã cấp phép sử dụng máy PlasmaMed® cho việc điều trị tại chỗ các vết thương cấp và mạn tính, các bệnh nhiễm khuẩn ngoài da tại các cơ sở y tế ở Việt Nam 35. 9 Hình 1.2: Máy phát tia Plasma lạnh PlasmaMed ® 35 1.3.2. Tác dụng sinh học của CAP trong điều trị liền thương Theo nhiều nghiên cứu, tia plasma lạnh gồm nhiều thành phần như các gốc tự do chứa oxi (ROS), gốc tự do chứa nito (RNS), hạt tích điện, ion, bức xạ UV,…ở nồng độ và cường độ đủ để phá vỡ và xâm nhập vào màng tế bào vi khuẩn để tiêu diệt hoặc gây ức chế hoạt động của chúng trên bề mặt mô và cơ thể 33. Trong số các thành phần trên, gốc hydroxyl (OH), hydrogen peroxide (H2O2), ozon (O3), superoxide anion (O2-), nitric oxide (NO), peroxynitrite anion (NO3-) là những thành phần chính liên quan đến tác dụng sinh học do CAP gây ra. Plasma xúc tác cho phản ứng của N2 và O2 trong không khí hình thành NO – chất đóng vai trò quan trọng trong tiến trình liền thương của cơ thể 36. 10 Trong cơ thể, L-Arginine trong máu là nguồn cung cấp NO, nó là một hợp chất hữu cơ, một acid amin dẫn xuất từ arginine, kích thích sản xuất hormon tăng trưởng và tham gia quá trình chuyển hóa của cơ thể. NO nhanh chóng bị oxy hóa thành nitrit hoặc nitrat trong cơ thể người. Dưới điều kiện axit hoặc tác động của tia UV vùng A (UVA > 365nm) cân bằng sinh hóa dịch chuyển về phía hình thành NO. Trong điều kiện khác thường như thiếu máu cục bộ, nhiều enzym và protein trong cơ thể cũng tham gia vào quá trình khử nitrit, NO được giải phóng có ảnh hưởng tới quá trình liền thương thông qua việc kích thích sự phát triển của các tế bào da và nguyên bào sợi, tăng cường tổng hợp collagen để tái tạo biểu mô, tái thiết lập da bị hư hỏng 36,37. Plasma lạnh sản sinh NO và UVA đồng thời axit hóa và cố định hàm lượng nitrit, nitrat trong pha lỏng trên bề mặt vết thương, từ đó giúp kích thích liền thương và bảo vệ tế bào da 38. Kết quả trong một số nghiên cứu cho thấy, CAP hỗ trợ làm lành vết thương với 3 tác động toàn diện, bao gồm: khử khuẩn, làm sạch vết thương, tạo màng bảo vệ và kích thích tái tạo liền thương nhanh chóng. Việc kiểm soát nhiễm trùng da do vi khuẩn là điều tối quan trọng trong việc điều trị liền thương nhanh chóng. Sau khi chiếu CAP, nhờ cơ chế polyme hóa dịch cơ thể, một lớp màng protein sẽ xuất hiện trên nền vết thương giúp chống việc tái xâm nhập của vi khuẩn 39. Các nghiên cứu trong thập kỷ qua cho thấy việc áp dụng CAP có thể cải thiện làn da bị tổn thương nhẹ, tăng sinh collagen và giảm thiểu nếp nhăn mà không để lại sẹo. Hiện nay CAP được ứng dụng thực tế phổ biến trong ngành da liễu. Người ta thử nghiệm trong các cơ sở lâm sàng thực hiện điều trị loét tĩnh mạch mạn tính, so sánh với vết thương tiêu chuẩn, thì khi sử dụng CAP kích thước vết thương giảm nhanh chóng và không gây hại cho bệnh nhân 40. Trong nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để đánh giá hiệu quả của CAP trên các vi khuẩn gây bệnh khác nhau, khi sử dụng CAP trên màng sinh học có Pseudomonas aeruginosa, kết quả cho thấy không có tế bào vi khuẩn nào sống sót được phát hiện sau 5 phút và không có màng sinh học nào có thể nhìn thấy dưới kính hiển vi sau 10 phút sử dụng CAP 41. Một số loại màng sinh học chứa vi sinh vật khác như Escherichia coli, Listeria monocytogenes, and Staphylococcus aureus cũng cho thấy sự giảm số lượng vi khuẩn đáng kể khi sử dụng CAP từ 60 – 300 giây 42,43. Plasma áp suất khí quyển lạnh (CAP) là một phương pháp hiện đại trong quá trình chữa lành vết thương, Nghiên cứu in vitro và các nghiên cứu lâm sàng ban đầu với vết 11 thương mạn tính ở động vật và người chỉ ra rằng sử dụng CAP mang lại hiệu quả trong điều trị vết thương với nhiều ưu điểm vượt trội 35,40:  Diệt khuẩn: Giảm lượng vi khuẩn, bao gồm cả một số vi khuẩn kháng thuốc, nấm.  Làm sạch: Giảm mùi hôi và khử trùng bề mặt vết thương  Kích thích tăng sinh tế bào da, tăng tốc độ lành vết thương, hạn chế để lại sẹo.  Giảm sưng, chống viêm, chống nhiễm trùng  Phục hồi tái tạo da an toàn, không gây tổn thương, không có tác dụng phụ nào đáng kể tới các mô cơ quan xung quanh 1.3.3. Các nghiên cứu về hiệu quả của CAP trong điều trị vết thương trên da 1.3.3.1. Trên mô hình tế bào Nghiên cứu của Stephanie Arndt (2013) trên mô hình nuôi cấy tế bào in vitro với nguyên bào sợi sơ cấp ở da người được chiếu CAP trong vòng 2 phút, với mục đích đánh giá ảnh hưởng của CAP lên nguyên bào sợi, xác định những thay đổi của các phân tử liên quan chữa lành vết thương và các hiệu ứng chức năng sau điều trị. Kết quả cho thấy sau khi điều trị bằng CAP, trong nguyên bào sợi tăng giải phóng các yếu tố tăng trưởng và các cytokine đóng vai trò quan trọng trong quá trình liền vết thương. Việc quan trọng trong quá trình liền thương là sản xuất các thành phần cấu trúc ECM. Nghiên cứu này chỉ ra CAP kích hoạt nguyên bào sợi biểu hiện các yếu tố gây viêm quan trọng như IL6, IL-8, MCP-1, TGF-ß1, TGF-ß2, thúc đẩy sản xuất collagen I và alpha-SMA là những tế bào chịu trách nhiệm sản xuất và tái tạo ECM trong quá trình chữa lành vết thương. Việc tăng biểu hiện và bài tiết các phân tử được đề cập là bởi nguyên bào sợi sau khi điều trị CAP có thể chịu trách nhiệm cho việc bảo vệ miễn dịch tốt hơn và nhanh hơn trong giai đoạn viêm 44. Ngoài ra, nghiên cứu của Stephanie Arndt (2013) cũng cho thấy, biểu hiện của TGF-β1 và TGF-β2 là các yếu tố tăng trưởng được nghiên cứu nhiều nhất trong quá trình chữa lành vết thương giúp kích hoạt nhiều quá trình bao gồm di chuyển, tăng sinh tế bào, tổng hợp chất nền ngoại bào, hình thành mạch, tái cấu trúc, tăng tốc độ liền thương và độ bền của mô được sửa chữa. Ngoài ra quan sát sau 24 giờ, nguyên bào sợi được chiếu bằng CAP và 48 giờ khi phân tích bằng ELISA cũng cho thấy CAP hỗ trợ tăng sinh yếu tố tăng trưởng trong nguyên bào sợi một cách tích cực 44. 12