Tài liệu Khóa luận tốt nghiệp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ phần trên mặt đất loài sa sâm nam (launaea sarmentosa (willd.) merr. et chun) thu hái ở thanh hóa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ------ TÔ MINH NGỌC CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT LOÀI SA SÂM NAM (Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun) THU HÁI Ở THANH HÓA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2022 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ------ TÔ MINH NGỌC CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ PHẦN TRÊN MẶT ĐẤT LOÀI SA SÂM NAM (Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun) THU HÁI Ở THANH HÓA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH.2017Y Người hướng dẫn: 1. ThS. NGUYỄN THỊ THU 2. ThS. LÊ HƯƠNG GIANG HÀ NỘI – 2022 LỜI CẢM ƠN Khóa luận này là kết quả của quá trình học tập, rèn luyện của em tại Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và quá trình nghiên cứu, thực hành tại Khoa Hóa Phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu. Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ các Thầy Cô của Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và đội ngũ nghiên cứu viên của Viện Dược liệu cùng gia đình và bạn bè. Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết sâu sắc tới PGS.TS. Đỗ Thị Hà, PGS.TS. Vũ Đức Lợi cùng ThS. Nguyễn Thị Thu, ThS. Lê Hương Giang- những người Thầy đã hết lòng tận tình, chỉ bảo em trong quá trình làm khóa luận. Em cũng xin gửi lời cám ơn chân thành đến ThS. Vũ Thị Diệp, DS. Nguyễn Trà My và các cán bộ nghiên cứu tại Khoa Hóa Phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã giúp đỡ và hướng dẫn em trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn Ban Chủ nhiệm Khoa Y Dược, Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền và các Thầy Cô trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho em được học tập và rèn luyện trong suốt 5 năm học, đồng thời có thể trực tiếp tham gia thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Em xin gửi lời cảm ơn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học loài Sa sâm nam (Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun)”- Đề tài nghiên cứu cấp cơ sở, Viện Dược liệu, Bộ Y tế đã tạo điều kiện và hỗ trợ kinh phí để em thực hiện đề tài này. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình học tập cũng như làm đề tài tốt nghiệp. Do vốn kiến thức còn hạn chế cũng như ảnh hưởng của dịch bệnh Covid-19, quá trình làm khóa luận của em không tránh khỏi thiếu sót. Em rất mong nhận được những lời nhận xét, góp ý của các Thầy Cô để khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Dược của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 02 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Tô Minh Ngọc MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT DANH MỤC HỈNH ẢNH DANH MỤC BẢNG BIỂU MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.....................................................................................2 1.1. Tổng quan về chi Launaea ..........................................................................2 1.1.1. Vị trí phân loại ....................................................................................2 1.1.2. Một số loài thuộc chi Launaea được tìm thấy trên thế giới .............2 1.1.3. Phân bố ...............................................................................................3 1.2. Tổng quan về loài Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun .............4 1.2.1. Danh pháp ..........................................................................................4 1.2.2. Đặc điểm thực vật ...............................................................................4 1.2.3. Phân bố và sinh thái ...........................................................................5 1.2.4. Thành phần hóa học ..........................................................................5 1.2.5. Tác dụng dược lý ................................................................................6 1.2.6. Công dụng ...........................................................................................8 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................9 2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................9 2.2. Hóa chất, thiết bị ..........................................................................................9 2.2.1. Hóa chất ..............................................................................................9 2.2.2. Thiết bị ..............................................................................................10 2.3. Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................10 2.3.1. Phương pháp định tính các nhóm chất thường gặp .......................10 2.3.2. Phương pháp chiết xuất và phân lập...............................................14 2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất ................................14 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ...................................................16 3.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp..........................................16 3.2. Chiết xuất và phân lập các chất ...............................................................17 3.2.1. Chiết xuất cao toàn phần .................................................................17 3.2.2. Chiết xuất và phân lập hợp chất ......................................................18 3.3. Xác định cấu trúc hợp chất phân lập được .............................................20 3.3.1. Hợp chất SS-1C ................................................................................20 3.3.2. Hợp chất SS-3B ................................................................................24 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ......................................................................................25 4.1. Về định tính ................................................................................................25 4.2. Về chiết xuất ...............................................................................................25 4.3. Về phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất ......................................25 4.3.1. Hỗn hợp của Stigmasterol và β-sitosterol .......................................25 4.3.2. Hợp chất Esculetin ...........................................................................28 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................................................................32 Kết luận ................................................................................................................32 Đề xuất..................................................................................................................32 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT Ký hiệu, viết tắt STT 1 13 Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy C-NMR 2 (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13) Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 1 3 Chữ viết đầy đủ H-NMR ABCA1 (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) ATP Binding Cassette transporter A1 (Kênh vận chuyển A1 gắn ATP) 4 ABCG1 ATP Binding Cassette transporter G1 (Kênh vận chuyển G1 gắn ATP) 5 AMPK Adenosine Monophosphate (AMP)-activated Protein Kinase (AMP hoạt hóa protein kinase) 6 BuOH Butanol 7 CD3OD Deuterated methanol 8 DCM Dicloromethane 9 DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer 10 DMSO Dimethyl sulfoxid 11 DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl 12 DTH Delayed-type hypersensitivity (Mô hình quá mẫn kiểu chậm) 13 EtOAc Ethyl acetate 14 EtOH Ethanol 15 GOT Glutamic oxalacetic transaminase 16 GPT Glutamic pyruvic transaminase 17 HAEC Human aortic endothelial cell (Tế bào nội mô động mạch chủ người) 18 HDL High Density Lipoprotein (Lipoprotein tỉ trọng cao) 19 IC50 50% Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế 50%) 20 LDL Low Density Lipoprotein (Lipoprotein tỉ trọng thấp) 21 Ls-ME L. sarmentosa methanolic extract (Cao chiết methanol từ L. sarmentosa) 22 MeOH Methanol 23 MMP-9 Matrix Metalloproteinase-9 24 ROS Reactive Oxygen Species (Các gốc oxy hóa hoạt động) 25 SC50 50% Stimulation Concentration (Nồng độ kích thích 50%) 26 SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn) 27 TLC Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) 28 TNF-α Tumor Necrosis Factor-α (Yếu tố hoại tử khối u alpha) 29 v/v Volume by volume (Thể tích/ thể tích) 30 v/v/v Volume by volume by volume (Thể tích/ thể tích/thể tích) 31 VSMCs Vascular smooth muscle cells (Các tế bào cơ trơn mạch máu) DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Bản vẽ thực vật Launaea sarmentosa vào thế kỷ XIX ...............................4 Hình 1.2: Hình ảnh thực tế của Launaea sarmentosa .................................................4 Hình 1.3: Cấu trúc của một số hợp chất phân lập từ rễ L. sarmentosa .......................6 Hình 2.1: Dược liệu Sa sâm nam khô. ........................................................................9 Hình 3.1: Quy trình chiết xuất cao tổng và các cao phân đoạn từ phần trên mặt đất của Sa sâm nam .........................................................................................................18 Hình 3.2: Quy trình phân lập các hợp chất từ cao EtOAc từ cao chiết Sa sâm nam 20 Hình 3.3: Cấu trúc của hợp chất SS-1C ....................................................................21 Hình 3.4: Cấu trúc của hợp chất SS-3B ....................................................................24 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Một số loài thuộc chi Launaea trên thế giới ...............................................2 Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ thường gặp trong Sa sâm nam .16 Bảng 3.2: Dữ liệu phổ của chất SS-1C và hợp chất tham khảo ................................22 Bảng 3.3: Dữ liệu phổ của chất SS-3B và hợp chất tham khảo ................................24 MỞ ĐẦU Nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa cùng vị trí địa lý trải dài trên 15 vĩ tuyến, Việt Nam sở hữu nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Theo ước tính nước ta có trên 12.000 loài thực vật bậc cao, chiếm khoảng 4 5% tổng số loài thực vật bậc cao đã biết trên thế giới. Trong số đó, có khoảng 5.000 loài thực vật và nấm, 408 loài động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc [4]. Từ xa xưa, ông cha ta đã sử dụng những bài thuốc cổ truyền từ các loại cây để chữa trị một số bệnh thường gặp cũng như nâng cao sức khỏe. Những bài thuốc này được sử dụng rất rộng rãi và cho thấy tính hiệu quả tốt, tuy nhiên đa số chỉ dựa trên kinh nghiệm dân gian mà chưa có cơ sở khoa học vững chắc. Ngày nay, sự xuất hiện của các bệnh truyền nhiễm mới và sự gia tăng các bệnh rối loạn chuyển hóa đã thúc đẩy sự quan tâm mới trong việc nghiên cứu và phát hiện ra các hợp chất tiềm năng từ thảo dược. Các nhà khoa học, các tập đoàn dược phẩm lớn hiện đang chú trọng vào sàng lọc từ thiên nhiên để tìm ra các hoạt chất sinh học mới có dược tính mạnh hơn, ít độc hơn và với chi phí cho nghiên cứu phát triển thấp hơn so với tổng hợp hóa học. Sa sâm nam (Launaea sarmentosa (Willd.)) được biết đến với nhiều công dụng như hạ sốt, giảm ho, long đờm, lợi sữa, nhuận tràng, lợi tiểu [1]. Các tác dụng sinh học bao gồm: chống viêm, chống oxy hóa, bảo vệ gan, tác dụng lên hệ thần kinh trung ương,… đã được chứng minh bằng thử nghiệm in vitro. Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu cụ thể về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Sa sâm nam trên thế giới và ở Việt Nam còn rất hạn chế. Do vậy, để góp phần xây dựng cơ sở khoa học nhận biết loài, về thành phần hóa học của loài, ứng dụng cây Sa sâm nam nhiều hơn nữa trong việc chăm sóc sức khỏe, đề tài: “Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ phần trên mặt đất loài Sa sâm nam (Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun) thu hái ở Thanh Hóa” đã được thực hiện với những mục tiêu sau: 1. Định tính được các nhóm chất có trong phần trên mặt đất của Sa sâm nam. 2. Chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của một số hợp chất từ phần trên mặt đất loài Sa sâm nam. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về chi Launaea 1.1.1. Vị trí phân loại Vị trí phân loại của chi Launaea trong giới thực vật [1] theo “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam” như sau: Giới: Thực vật (Plantea) Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida) Bộ: Cúc (Asterales) Họ: Cúc (Asteraceae) Chi: Launaea 1.1.2. Một số loài thuộc chi Launaea được tìm thấy trên thế giới Hiện nay người ta đã tìm thấy và định danh khoảng 50 loài thuộc chi Launaea. Các loài thuộc chi thực vật này được liệt kê theo Bảng 1.1 dưới đây. Bảng 1.1: Một số loài thuộc chi Launaea trên thế giới STT Tên khoa học STT Tên khoa học 1. Launaea acaulis (Roxb.) Babc. ex Kerr 20. Launaea mucronata (Forssk.) Muschl. 2. Launaea amal-aminiae N.Kilian 21. Launaea nana (Baker) Chiov. 3. 4. 5. 6. 7. Launaea angustifolia (Desf.) 22. Kuntze. Launaea arborescens (Batt.) Murb. 23. Launaea benadirensis Chiov. 24. Launaea bornmuelleri (Hausskn. ex Bornm.) Bornm. 25. Launaea brunneri (Webb) Amin 26. ex Boulos 2 Launaea nudicaulis (L.) Hook.f. Launaea petitiana (A.Rich.) N.Kilian Launaea picridioides (Webb) B.L.Rob. Launaea piestocarpa (Boiss.) Rech.f. Launaea popovii Krasch. 8. 9. 10. Launaea cabrae (De Wild.) 27. N.Kilian Launaea capitata (Spreng.) Dandy. 28. Launaea cervicornis (Boiss.) 29. Font Quer & Rothm Launaea procumbens (Roxb.) Ramayya & Rajagopal Launaea pseudoabyssinica (Chiov.) N.Kilian Launaea pumila (Cav.) Kuntze 11. Launaea cornuta (Hochst. ex Oliv. & Hiern) C.Jeffrey 30. Launaea quercifolia (Desf.) Pamp. 12. Launaea crassifolia (Balf.f.) C.Jeffrey 31. Launaea rarifolia (Oliv. & Hiern) Boulos 32. Launaea rogersii (Humbert) Humbert & Boulos 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. Launaea fragilis (Asso) Pau Launaea gorgadensis (Bolle) 33. N.Kilian Launaea hafunensis Chiov. Launaea intybacea (Jacq.) Beauverd Launaea lackii N.Kilian Launaea lanifera Pau Launaea microcephala Hook.f. Launaea rueppellii (Sch.Bip. ex Oliv. & Hiern) Amin ex Boulos 34. Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun* 35. Launaea secunda (C.B.Clarke) Hook.f. 36. Launaea spinosa (Forssk.) Kuntze 37. Launaea taraxacifolia (Willd.) Amin ex C.Jeffrey 38. Launaea viminea (Batt.) Batt. 1.1.3. Phân bố Launaea là một chi nhỏ của họ Cúc (Asteraceae) gồm khoảng 50 loài, hầu hết đều thích nghi với môi trường sống khô, mặn và cát [36]. Chi Launaea phân bố chủ yếu ở Nam Địa Trung Hải, Châu Phi và Tây Nam Á và đặc biệt, rất phổ biến ở các khu vực Bắc Phi [20]. Ở Việt Nam có một số loài thuộc chi này, phân bố ở vùng ven biển và các đảo lớn, từ Quảng Ninh, Hải Phòng vào đến Đồng Nai, Bến Tre. 3 1.2. Tổng quan về loài Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun 1.2.1. Danh pháp Danh pháp của Sa sâm nam theo “Cây thuốc và Động vật làm thuốc ở Việt Nam” [1] như sau: • Tên tiếng Việt: Sa sâm nam, Cỏ chân vịt, Hải cúc • Tên khoa học: Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun • Họ thực vật: Cúc (Asteraceae) • Tên đồng nghĩa: Launaea sarmentosa (Willd.) Sch. Bip. Ex Kuntze, Launaea pinnatifida Cass 1.2.2. Đặc điểm thực vật Launaea sarmentosa (L. sarmentosa) hay còn được biết đến với cái tên Sa sâm nam là cây thảo, sống lâu năm. Cây thân leo có rễ bên mang chồi kéo dài, mỗi rễ có từ 2-3 thân. Thân mọc bò, cao khoảng 20-90 cm, phân nhánh [1, 32]. Lá mọc thành chùm, kích thước 3-8 × 0,6-1 cm, hình răng cưa thành thùy hình chùy, nhỏ dần về phía gốc, có răng cưa rõ rệt, đỉnh nhọn, tù hoặc tròn. Tận cùng lá thứ cấp xếp hình hoa thị dọc theo thân, thường có 14-18 bông hoa; với cánh hoa dài khoảng 1-3 cm. Quả sa sâm nam có rìa vảy màu trắng rõ rệt, đỉnh nhọn đến tù; bên ngoài hình con thoi hoặc hình trứng đến hình mũi mác [1, 32]. Hình 1.1: Hình ảnh thực tế của Launaea sarmentosa Hình 1.2: Bản vẽ thực vật Launaea sarmentosa vào thế kỷ XIX 4 Rễ của L. sarmentosa có màu vàng nhạt, khi trưởng thành có màu nâu nhạt. Rễ có mùi thơm, hơi tròn, hình trụ, xốp, ít rễ con, không có mấu và được nghiên cứu rằng có chứa alkaloid, acid amin, glycosid, tanin, cacbohydrat và steroid [32, 48]. 1.2.3. Phân bố và sinh thái Ở Việt Nam, L. sarmentosa tìm thấy ở vùng ven biển và các đảo lớn từ Quảng Ninh, Hải Phòng vào đến Bến Tre. Cây cũng phân bố ở vùng ven biển phía nam Trung Quốc, Ấn Độ, Ai Cập và một số nơi ở châu Phi [1]. L. sarmentosa có phần trên mặt đất thường lụi vào mùa đông. Toàn bộ phần rễ và phần gốc sẽ mọc lên chồi mới vào mùa xuân hoặc đầu mùa hè năm sau. Cây ưa sáng, chịu được mặn; thường mọc trên bãi cát ven biển, thành từng đám hoặc rải rác thành khóm riêng rẽ. Cây ra hoa quả hàng năm; quả có túm lông thuận lợi cho việc phát tán nhờ gió [1]. 1.2.4. Thành phần hóa học Các nghiên cứu về thành phần hóa học của L. sarmentosa được thực hiện chủ yếu trên lá và rễ của loài thực vật này [12]. Kiểm tra sơ bộ hóa thực vật cho thấy rễ cây L. sarmentosa có mặt các hợp chất thuộc nhóm alkaloid, flavonoid, triterpenoid, saponin [14]; lá có chứa steroid, alkaloid, terpenoid, đường khử, flavonoid, saponin và tannin [51] … Trong báo cáo bước đầu về thành phần hóa học của Sa sâm nam trồng tại trang trại của công ty Sa sâm việt, huyện Thạnh Phú, tỉnh Bến Tre, nhóm tác giả Lê Tiến Dũng và cộng sự đã tiến hành định lượng các thành phần hóa học từ lá cây L. sarmentosa. Kết quả định lượng cho thấy, polyphenol chiếm 290,90 mg/g cao chiết, flavonoid 85,47 mg/g cao chiết và saponin 10,8%/trên dược liệu lá khô [12]. Hàm lượng các chất này trong Sa sâm nam ở Ấn Độ tương ứng là 179,46 mg/g và 87,46 mg/g [33]. Đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu sâu về mặt hóa học của cây Sa sâm nam, mới chỉ có một số hợp chất được phân lập từ dược liệu này, gồm: α-amyrin acetat (1), β-amyrin acetat (2), lupeol acetat (3), Ψ-taraksasterol acetat (4), luteolin (5), 4-allyl-2,6-dimethoxyphenol glucopyranosid (6), scorzosid (7), ixerisosid D (8), 9α-hydroxypinoresinol (9) từ rễ; taraxasterol (10) được phân lập từ lá, glutenol (11), 3-O-L-rhamnopyranosyl-(13)-O-L-arabinopyranosyl(13)-O-D-galactopyranosyl spergulatriol (12) và hopenol-b (13) từ hạt [56]. 5 1. α-Amyrin acetat 2. β-Amyrin acetat 3. Lupeol acetat 4. ψ-Taraksasterol acetat 5. Luteolin 6. 4-Allyl-2,6dimethoxyphenol glucopyranosid 7. Scorzosid 8. Ixerisosid D 9. 9α-Hydroxypinoresinol Hình 1.3: Cấu trúc của một số hợp chất phân lập từ rễ L. sarmentosa 1.2.5. Tác dụng dược lý 1.2.5.1. Chống oxy hóa Hoạt tính chống oxy hóa của L. sarmentosa đã được nghiên cứu bằng cách đánh giá tác dụng của nó với các gốc tự do DPPH, OH•, Fe3+. Khả năng ức chế gốc DPPH của cao chiết ethanol (liều 200 μg) là 71,22%, của mẫu chứng dương BHA là 89,1%. Khả năng ức chế gốc OH• của cao chiết ethanol và nước (liều 200 μg) là 72,46% và 71,23%, cao hơn nhiều so với BHA (% ức chế là 24,26%) [33]. Trong một nghiên cứu khác, giá trị SC50 trong việc dọn gốc DPPH của cao chiết methanol của L. sarmentosa (Ls-ME), tương ứng với nồng độ cần thiết để dọn 50% các gốc tự do trong mẫu là 26,7 µg/mL (tương đương với 5,5 µg/mL vitamin C). Những kết quả này đã chứng minh rằng Ls-ME thể hiện khả năng chống oxy hóa một cách hiệu quả [35]. 1.2.5.2. Tan huyết khối, ổn định màng Ảnh hưởng của L. sarmentosa đối với quá trình ly giải cục máu đông trên lâm sàng được chứng minh trong một nghiên cứu vào năm 2016. Người ta quan sát thấy tỷ lệ ly giải cục máu đông là 45,49% khi sử dụng 100 µl Streptokinase (30.000 I.U.) làm đối chứng dương tính. Mặt khác, nếu sử dụng nước là đối chứng âm, tỷ lệ ly giải 6 cục máu đông là không đáng kể (6,03%). Vì vậy, phần trăm ly giải cục máu đông phụ thuộc vào liều lượng và nồng độ. Trong đó, tại nồng độ 10mg/ml cho thấy mức ý nghĩa (p <0,001) ly giải cục máu đông cao nhất (22,57%). [31] Hoạt động ổn định màng của dịch chiết methanol của L. sarmentosa (Ls-ME) cũng được thực hiện trong nghiên cứu này. Nồng độ cao hơn (10 mg/ml) của dịch chiết methanol của L. sarmentosa tạo ra % ức chế đáng kể quá trình tan máu tương ứng bằng dung dịch nhược trương (12,11 ± 0,037) và nhiệt (20,55 ± 0,87). [31] Trong khi đó, ASA (dung dịch chứa hoạt chất ethanol natri salicylat và acid acetylsalicylic) được sử dụng làm tiêu chuẩn (0,10 mg/ml) trong ổn định màng, cho thấy khả năng ức chế tan máu do dung dịch nhược trương là 70,01 ± 0,017% và ức chế tan máu do nhiệt tương ứng là 56,32 ± 0,228% [31]. 1.2.5.3. Chống viêm, giảm đau, hạ sốt Cao chiết methanol của L. sarmentosa ở các mức liều 100 - 400 mg/kg đều thể hiện tác dụng hạ sốt, giảm đau và chống viêm, tác dụng mạnh nhất ở liều 400 mg/kg. Nhiệt độ cơ thể chuột từ 38,4℃ giảm còn 36,38℃ sau 5h khi dùng Sa sâm nam ở liều 400 mg/kg, còn 35,89℃ khi dùng aspirin liều 30 mg/kg. Thời gian phản ứng đau của chuột trong thử nghiệm ngâm đuôi trong nước nóng tăng khi dùng Sa sâm nam, thời gian phản ứng khi dùng liều 400 mg/kg là 6,93 giây (khi dùng pentazocine 30 mg/kg là 7,62 giây). Trong thử nghiệm gây đau quặn bằng acid acetic, Sa sâm nam (400 mg/kg) làm giảm số cơn đau quặn, tỉ lệ ức chế đau là 63,10% (tỉ lệ ức chế của aspirin (30 mg/kg) là 69,23%). Sa sâm nam (400 mg/kg) ức chế 32,48% độ phù chân chuột và ức chế 34,7% sự hình thành u hạt, tỉ lệ ức chế tương ứng của indomethacin là 40,13% và 63,22%. Các kết quả này cho thấy, Sa sâm nam có tác dụng hạ sốt, giảm đau, chống viêm cấp hiệu quả, gần như tương đương với các thuốc chứng dương [46]. 1.2.5.4. Kháng khuẩn Một số thí nghiệm cho thấy rằng các cao chiết methanol của L. sarmentosa thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, chống lại cả vi khuẩn gram âm (Salmonella typhi ở nồng độ 100 µg/ml) và vi khuẩn gram dương (Escherichia coli ở nồng độ 50-100 µL, và Pseudomonas aeruginosa ở nồng độ 100 µL). Cao chiết ethanol của cây Sa sâm nam kháng trực khuẩn lao ở nồng độ 50 µg/ml [30] Nhiều bộ phận của L. sarmentosa, đặc biệt là lá, có đặc tính kháng khuẩn do sự hiện diện của tannin và flavonoid [9, 49]. Có thể đó là lý do tại sao các cao chiết 7 thô của L. sarmentosa có hoạt động kháng khuẩn đáng kể, chống lại cả vi khuẩn gram âm và gram dương một cách đáng ngạc nhiên [45]. 1.2.5.5. Các tác dụng khác Ngoài các tác dụng chính đã liệt kê ở trên, L. sarmentosa còn được nghiên cứu có tác dụng bảo vệ gan. Cao chiết ethanol 70% lá Sa sâm nam (i.p., 0,66 g/kg/ngày) khi sử dụng trong 7 ngày, các chỉ số chức năng gan bao gồm GOT, GPT, alkalin phosphat, glucose máu, cholesterol máu và protein tổng số của chuột bị nhiễm độc CCl4 được duy trì ở mức gần như bình thường. Khả năng hạ men GOT, GPT, alkalin phosphat, glucose máu và protein tổng số của cao chiết này hiệu quả hơn so với thuốc chứng dương Silymarin [40]. Sa sâm nam thể hiện tác dụng ức chế enzym α-glucosidase với IC50 = 67,09 μg/ml, tốt hơn so với thuốc chứng dương acarbose (IC50 = 138,2 μg/ml). Cùng với khả năng bảo vệ gan, L. sarmentosa được cho là cây thuốc hiệu quả trong điều trị tiểu đường type 2 và các biến chứng liên quan đến bệnh tiểu đường, hạn chế tác dụng phụ của các thuốc ức chế α-glucosidase [12]. Ngoài ra, hợp chất saponin triterpen phân lập từ hạt của cây Sa sâm nam thể hiện tác dụng ức chế với nhiều chủng nấm khác nhau, bao gồm Penicillium notatum, Aspergillus fumigatus, Fusarium oxysporum và Trichoderma viride [56]. 1.2.6. Công dụng Theo y học cổ truyền, Sa sâm nam có vị ngọt, nhạt, hơi đắng, tính mát, vào kinh phế, có tác dụng bổ, mát phổi, giảm ho, long đờm, lợi sữa, nhuận tràng, lợi tiểu. Do thuộc tính galactagogue, Sa sâm nam thường được sử dụng như một thức uống giúp lợi sữa sau khi sinh cho cả người và động vật [57]. Loại cây này chủ yếu được biết đến nhiều trong điều trị về rối loạn tiêu hóa và nhiễm trùng đường tiết niệu. Toàn cây có hiệu quả trong bệnh viêm khớp dạng thấp, các vấn đề về khớp và bệnh gút [48]. Các chế phẩm từ lá được dân gian sử dụng để làm dịu các vết thương ngoài da. Lá tươi giã nát uống trị tiêu chảy [53]. Rễ cây phơi khô sao vàng chữa sốt, ho khan, ho có đờm [1]. Nước ép quả dùng trị thấp khớp, giúp dễ ngủ ở trẻ em [20]. 8 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất của cây Sa sâm nam (Hình 2.1) thu hái tại phường Quảng Thành, thành phố Thanh Hóa, tỉnh Thanh Hóa vào ngày 2.1. 05/02/2022. Tên khoa học của mẫu nghiên cứu được ThS. Nguyễn Quỳnh Nga và ThS. Phan Văn Trường, Viện Dược liệu giám định là Launaea sarmentosa (Willd.) Merr. et Chun, họ Cúc (Asteraceae), tên Việt Nam là Sa sâm nam. Mẫu được lưu tại Phòng Tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu – Viện Dược liệu với số hiệu: DV050222. Dược liệu được sấy khô và bảo quản trong túi nilon để nơi khô ráo, tránh ẩm. Hình 2.1: Dược liệu Sa sâm nam khô. 2.2. Hóa chất, thiết bị 2.2.1. Hóa chất - Hóa chất dùng trong định tính: Thuốc thử Mayer, Dragendorff, Bouchardat, diazo, FeCl3 5%, gelatin 1%, chì acetat 5%, n-hexan, dicloromethan (DCM), ethyl acetat (EtOAc), methanol (MeOH), ethanol (EtOH), n-butanol (BuOH), NaOH, HCl, cloroform, …. - Dung môi dùng trong chiết xuất và phân lập: EtOH, EtOAc, MeOH, DCM, aceton, n-hexan, ... đạt tiêu chuẩn công nghiệp - Dung môi đo phổ: DMSO-d6, CDCl3 Dung dịch H2SO4 10% trong EtOH 96% để phát hiện vết chất trên bản mỏng. 9 - Silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck), silica gel đảo (75 μm, YMC - Co., Ltd, Nhật).. Bản mỏng tráng DC-Alufolien 60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm). 2.2.2. Thiết bị - Cân kĩ thuật Ohaus PA2102 (Mỹ), cân phân tích Precisa XT 220A (Precisa, Thụy Sỹ). - Bếp cách thủy Memmert WNB14 (Đức). - Bể siêu âm Vevor Ultrasonic Cleaner 10L (Ruianshisuikangxieyeshanghang). - Máy cất quay Rotavapor R-124, Rotavapor R-210 (Buchi, Swichzerland, Thụy - Sỹ). Máy cất quay chân không Rotavapor R-220 Pro 20L (Buchi, Thụy Sỹ). Tủ sấy Binder FD 115 (Đức), Memmert UF110 (Đức). - Đèn tử ngoại VL-6.LC hai bước sóng 254 nm và 366 nm (Vilber, Pháp) Bộ dụng cụ chiết hồi lưu gồm bếp đun bình cầu (Daihan), bình cầu 5L, sinh - hàn thẳng. Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AM 500 FT-NMR Spectrometer (Billerica, Massachusetts, Hoa Kỳ). - Sắc ký cột: Các loại cột sắc kí có kích cỡ khác nhau. - Các dụng cụ thí nghiệm thường quy: Ống nghiệm, bình nón, bình gạn, phễu thủy tinh, cốc có mỏ, pipet… - Các thiết bị khác: Tủ hút, bếp điện, máy chụp ảnh UV… 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp định tính các nhóm chất thường gặp Một số nhóm chất thường gặp trong dược liệu được định tính bằng các phản ứng hóa học theo các tài liệu [2, 3]. 2.3.1.1. Định tính các thành phần trong dịch chiết n-hexan Cân khoảng 10 g bột dược liệu cho vào bình chiết soxhlet. Chiết bằng n-hexan đến khi dung môi trong bình chiết không màu. Dịch chiết đem cất thu hồi bớt dung môi. Dịch chiết đậm đặc thu được dùng làm các phản ứng định tính chất béo, tinh dầu, phytosterol và carotenoid. (1) Định tính chất béo Nhỏ vài giọt dịch chiết ethanol lên giấy lọc. Phản ứng dương tính khi hơ khô thấy để lại vết mờ trên giấy. 10 (2) Định tính carotenoid Cô 5 ml dịch chiết tới cắn. Thêm 1-2 giọt acid sulfuric đặc, thấy xuất hiện màu xanh ve thì phản ứng dương tính. (3) Định tính phytosterol Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết n-hexan. Bốc hơi dung môi đến khô. Cho vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ. Để ống nghiệm nghiêng 45°, thêm từ từ H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm. Kết quả dương tính cho thấy mặt phân cách có vòng màu tím đỏ, lắc nhẹ, lớp chất lỏng phía trên có màu xanh. 2.3.1.2. Định tính các thành phần trong dịch chiết cồn Bã dược liệu sau khi chiết bằng n-hexan để bay hơi dung môi đến khô. Chiết hồi lưu với 50 ml cồn 90º trong 30 phút. Dịch chiết được lọc và cô còn 10 ml để làm các phản ứng định tính flavonoid, coumarin, saponin, acid hữu cơ, acid amin và đường khử tự do. (4) Định tính saponin Phản ứng tạo bọt: Cho 0,5 g bột dược liệu vào ống nghiệm có dung tích 20 ml, thêm vào đó 5 ml nước cất, đun sôi nhẹ, lọc nóng qua bông vào ống nghiệm có dung tích 20 ml, thêm 2 ml nước cất. Bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh ống nghiệm theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát. Phản ứng dương tính khi bọt bền sau 10 phút. Phản ứng Salkowski: Cho vào bình nón 2 g dược liệu, thêm 20 ml ethanol 90%, đun sôi cách thủy. Lọc lấy dịch lọc và cho vào một ống nghiệm, bốc hơi dịch lọc đến cắn. Hòa tan một ít cắn trong 1 ml anhydrid acetic, thêm vào dung dịch 0,5 ml cloroform. Dùng pipet nhỏ từ từ 1-2 ml H2SO4 vào thành ống nghiệm. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng tím đỏ ở mặt ngăn cách. Phân biệt saponin steroid và saponin triterpenoid: Lấy khoảng 1g bột dược liệu, chiết bằng EtOH 90% trên nồi cách thủy trong 10 phút, lọc nóng được dịch chiết cồn. Cho dịch chiết cồn vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 5 giọt + Ống 1: thêm 5 ml dung dịch NaOH 0,1 N. + Ống 2: thêm 5 ml dung dịch HCl 0,1 N. 11 Lắc mạnh đồng thời 2 ống trong 1 phút và quan sát. Nếu cột bọt ống 1 cao hơn ống 2, sơ bộ xác định là saponin steroid. Nếu cột bọt trong 2 ống cao ngang nhau thì sơ bộ xác định là saponin triterpenoid. (5) Định tính coumarin Phản ứng mở và đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết cồn, ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên. Sau đó đun cả 2 ống nghiệm trên cách thủy sôi trong vài phút. Ống thứ nhất có màu vàng xuất hiện. Sau đó cho thêm vào mỗi ống 2 ml nước cất thấy ống thứ nhất trong hơn ống thứ 2, nhưng sau khi acid hóa thì cả 2 ống đều đục như nhau (phản ứng dương tính). Quan sát huỳnh quang: Nhỏ 1 giọt dung dịch chiết lên giấy thấm, nhỏ tiếp lên đó 1 giọt dung dịch NaOH 5%, sấy nhẹ. Che ½ vết bằng đồng xu rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút, sau đó cất đồng xu đi, quán sát thấy nửa hình tròn không che và nửa hình tròn bị che sáng như nhau. Phản ứng với thuốc thử diazo: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn, thêm vào đó 2 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy tới sôi, để nguội, thêm vài giọt thuốc thử diazo (mới pha), thấy xuất hiện tủa màu đỏ gạch (phản ứng dương tính). (6) Định tính flavonoid Phản ứng cyanidin: Cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại, rồi thêm vài giọt HCl đặc. Đun nóng trên cách thủy sau vài phút thấy xuất hiện màu tím đỏ (phản ứng dương tính). Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho 2 ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm 2-3 giọt FeCl3 5%, thấy dung dịch có màu xanh sẫm. Phản ứng với kiềm: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, phản ứng dương tính khi màu vàng của dung dịch tăng thêm. (7) Định tính acid hữu cơ Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn và cô tới cắn. Hòa cắn trong 1 ml nước và thêm vài tinh thể Na2CO3 thấy có bọt khí nổi lên. (8) Định tính acid amin Lấy 3 ml dịch chiết cồn cho vào ống nghiệm. Thêm 1-3 mảnh ninhydrin, đun sôi 2 phút, phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển màu tím. 2.3.1.3. Định tính các thành phần trong dịch chiết nước 12