Tài liệu Khóa luận tốt nghiệp bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của mẫu rễ tóc nuôi cấy của sâm việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC PHÙNG TIẾN HẢI BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MẪU RỄ TÓC NUÔI CẤY CỦA SÂM VIỆT NAM KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC Hà Nội – 2022 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC Người thực hiện: PHÙNG TIẾN HẢI BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MẪU RỄ TÓC NUÔI CẤY CỦA SÂM VIỆT NAM KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƢỢC HỌC) Khoá: QH.2017.Y Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. NGUYỄN HỮU TÙNG 2. ThS. ĐẶNG THỊ NGẦN Hà Nội – 2022 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực nghiệm và hoàn thành khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ vô cùng quý báu của các thầy cô giáo, Ban giám hiệu của Trường Đại học PHENIKAA và Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội cùng với gia đình và bạn bè. Trước tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Hữu Tùng – Khoa Dược, Trường Đại học PHENIKAA, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian, quan tâm chỉ bảo tận tình, tạo điều kiện và đóng góp ý kiến cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Đặng Thị Ngần – Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội vì đã dành thời gian hướng dẫn, góp ý cho em trong quá trình hoàn thiện khóa luận. Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến hai thầy TS. Vũ Văn Tuấn và TS. Nguyễn Ngọc Hiếu – Trường ĐH PHENIKAA, hai thầy đã nhiệt tình, giúp đỡ chỉ bảo, hướng dẫn, góp ý cho em trong suốt quá trình thực nghiệm và hoàn thiện đề tài ở trường ĐH PHENIKAA. Và em cũng muốn gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới TS. Nguyễn Thị Thanh Bình, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã trao cho em cơ hội để em có thể làm và hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp của mình. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới Trường ĐH PHENIKAA và Trường ĐH Y Dược – ĐHQGHN đã tạo điều kiện để em hoàn thành khóa luận của mình, cảm ơn tập thể lớp Dược học khóa QH.2017.Y đã đồng hành cùng em trong suốt 5 năm học qua. Và lời cảm ơn đặc biệt nhất là tới gia đình em, em vô cùng biết ơn gia đình đã luôn ở bên động viên, khích lệ và sát cánh, giúp em có thêm động lực cố gắng để em vượt qua những giai đoạn khó khăn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 24 tháng 06 năm 2022 Sinh viên Phùng Tiến Hải DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT CH3CN CCl4 DAD D-GalN G-Rb1 G-Rd G-Re G-Rg1 HPLC IL LPS MC MeOH M-R2 n-BuOH OT PPD PPT PRT4 TNF-α TPA SVN VG Acetonitrile Cacbon tetrachloride Detector mảng điốt (Diode array detector) D-galactosamine Ginsenosid-Rb1 Ginsenosid-Rd Ginsenosid-Re Ginsenosid-Rg1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performace liquid chromatography) Interleukin Lipopolysaccharide Tế bào 2 lá (mitral cells) Methanol Majonosid-R2 n-butanol Occotillol Protopanaxadiol Protopanaxatriol Pseudoginsenoside RT4 Yếu tố hoại tử khối u-alpha (Tumor Necrosis Factors anpha) Chất hoạt hóa plasminogen mô (tissue plasminogen activator) Sâm Việt Nam Vietnamese ginseng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol ............................ 9 Bảng 1.2. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol .......................... 11 Bảng 1.3. Các saponin có cấu trúc Ocotillol ................................................... 13 Bảng 1.4. Các saponin dẫn chất của acid oleanolic ........................................ 14 Bảng 1.5. Thành phần acid béo phần dưới mặt đất sâm Việt Nam ................ 15 Bảng 1.6. Thành phần acid amin phần dưới mặt đất sâm Việt Nam .............. 16 Bảng 1.7. Thành phần các nguyên tố đa và vi lượng ở phần dưới mặt đất sâm Việt Nam ......................................................................................................... 16 Bảng 3.1. Chương trình rửa giải pha động sắc ký lỏng hiệu năng cao ........... 32 Bảng 3.2. Kết quả nồng độ và diện tích pic của các mẫu chuẩn..................... 37 Bảng 3.3. Kết quả nồng độ và diện tích pic của các mẫu thử ......................... 37 Bảng 3.4. Kết quả định lượng hàm lượng các chất có trong mẫu dược liệu .. 38 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Nhân sâm Việt Nam (Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha and Grushv). Sơ lược về nhân sâm Việt Nam và sự phân bố tự nhiên của nhân sâm Việt Nam ở Việt Nam (A). Bản phác thảo màu sắc của nhân sâm Việt Nam (B) ............................................................................................................. 4 Hình 1.2. Hình ảnh cây sâm Việt Nam (P. vietnamensis Ha & Grushv).......... 5 Hình 1.3. Hình ảnh lá và quả của sâm Việt Nam ............................................. 6 Hình 1.4. Cấu trúc dẫn xuất của 20(S)-protopanaxadiol .................................. 8 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của ginsenoside-Rb1 ........................................... 10 Hình 1.6. Cấu trúc của các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol ...... 10 Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của ginsenoside-Rg1 và ginsenoside-Re ........... 12 Hình 1.8. Cấu trúc của các saponin dẫn chất của Ocotillol ............................ 12 Hình 1.9. Cấu trúc hóa học của majonoside-R2 ............................................ 13 Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của Hemsloside –Ma3 ...................................... 14 Hình 2.1. Mẫu dược liệu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam được sử dụng trong nghiên cứu.............................................................................................. 25 Hình 2.2. Hệ thống máy cất quay Rotavapor R-100 (BUCHI)....................... 26 Hình 2.3. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn Butanol của mẫu rễ tóc SVN .............. 28 Hình 3.1. Hệ thống máy sắc kí lỏng cao áp Agilent 1260 Infinity LC ............ 31 Hình 3.2. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn M-R2 ..................................................... 32 Hình 3.3. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn G-Rb1 .................................................... 33 Hình 3.4. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn G-Rd ...................................................... 33 Hình 3.5. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn G-Rg1 .................................................... 34 Hình 3.6. Sắc ký đồ của hỗn hợp các mẫu chuẩn ........................................... 35 Hình 3.7. Sắc ký đồ các chất của mẫu rễ tóc nghiên cứu trong phân đoạn Butanol ............................................................................................................ 36 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN........................................................................... 3 1.1. Tổng quan về Sâm Việt Nam ............................................................. 3 1.1.1. Lịch sử phát hiện và đặc điểm phân bố .......................................... 3 1.1.2. Thực vật học của Sâm Việt Nam ................................................... 5 1.1.3. Đặc điểm thực vật và sinh thái của Sâm Việt Nam ....................... 5 1.1.4. Thành phần hóa học ....................................................................... 7 1.1.5. Tác dụng sinh học ........................................................................ 17 1.1.6. Công dụng .................................................................................... 22 1.1.7. Nguồn dược liệu thay thế ............................................................. 23 CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 25 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ......................................................................... 25 2.1.1. Mẫu rễ tóc Sâm Việt Nam nuôi cấy................................................ 25 2.1.2. Chất chuẩn ...................................................................................... 25 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất.............................................................. 25 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................... 26 2.2.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu .................................................... 26 2.2.2. Phương pháp phân tích sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................................................................................................... 28 CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................ 31 3.1. Phân tích các thành phần saponin chính trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của sâm Việt Nam bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................ 31 3.1.1. Cài đặt chương trình chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích các thành phần saponin có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam. ................................................................................................................... 31 3.1.2. Kết quả phân tích các mẫu chuẩn ................................................... 32 3.1.3. Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích một số saponin chính có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy sâm của sâm Việt Nam. . 36 3.1.4. Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng một số saponin chính có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy sâm của sâm Việt Nam. . 37 3.2. Bàn luận ............................................................................................... 39 3.2.1. Phương pháp định tính một số saponin chính có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam bằng HPLC ................................................. 39 3.2.2. Phương pháp định lượng một số saponin chính có trong mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam bằng HPLC ................................................. 40 3.2.3. Hạn chế của nghiên cứu ............................................................... 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những thập kỷ gần đây, con người dần có xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc thảo dược để phòng và điều trị bệnh vì đặc tính an toàn, ít gây tác dụng phụ và hiệu quả điều trị cao, do đó việc đi sâu vào nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao đang rất được quan tâm. Đặc biệt là Việt Nam, một quốc gia có hệ sinh thái vô cùng phong phú, đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc với 4000 loài cây thuốc, hơn 50 loài tảo biển, 75 loài khoáng vật và gần 410 động vật làm thuốc [7]. Sâm Việt Nam là một loài thảo dược quý hiếm, có nhiều tác dụng và là loại nhân sâm thứ 20 được tìm thấy trên thế giới, đây là loài đặc hữu của hệ thực vật Việt Nam, được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1973 tại vùng núi Ngọc Linh. Ngoài 26 hợp chất saponin tương tự sâm Mỹ và sâm Triều Tiên, trong sâm Ngọc Linh còn phát hiện được hơn 20 loại saponin khác như majonosid R1-2, vinaginsenosid R1-11 và các saponin khác thuộc nhóm glycosid, các saponin chính phải kể đến như majonosid-R2, ginsenosid-Rb1, ginsenosid-Rg1 và ginsenosid-Rd. Những saponin quý này có tác dụng bồi bổ sức khỏe, tăng cường sinh lực, điều hòa huyết áp, chống oxy hóa, phòng chống ung thư, chống lão hóa, kích thích hệ miễn dịch, chống trầm cảm, giảm căng thẳng, gan, thận...[16]. Loài sâm quý và có giá trị kinh tế cao này thuộc danh mục sách đỏ cần được bảo tồn, mặc dù nhà nước đã có chủ trương bảo vệ nguồn cây thuốc quý này nhưng nguồn sâm tự nhiên vẫn bị khai thác lén lút, trái phép một cách nghiêm trọng, ảnh hưởng đến nguồn gen quý, có thể dẫn đến cạn kiệt, đồng thời tạo áp lực cho ngành dược liệu nước ta hiện nay. Hơn nữa, việc sử dụng các hợp chất từ sâm Việt Nam vào sản xuất dược phẩm vẫn còn gặp rất nhiều khó khăn vì nguồn cung cấp cây sâm Việt Nam chỉ giới hạn ở vùng núi Ngọc Linh, và việc trồng trọt phải mất nhiều thời gian, thường từ 5–7 năm trước khi thu hoạch thân rễ và rễ vì thế sâm Việt Nam khó nuôi trồng và nhân rộng [8]. Đứng trước những thách thức đó, nuôi cấy rễ được xem là một giải pháp thay thế đầy tiềm năng để thu nhận hoạt chất thứ cấp từ loài sâm quý hiếm này, do khả năng sản xuất ổn định được một lượng lớn sinh khối sạch 1 trong thời gian ngắn. Việc nghiên cứu thành phần hóa học của mẫu rễ nuôi cấy của sâm Việt Nam đem lại ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn cao. Hiện nay các kỹ thuật sắc ký được sử dụng rộng rãi, phổ biến dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp và được ứng dụng trong các lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm, môi trường,… vì nhiều lý do như có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt [11]. Trên cơ sở đánh giá các thành phần hóa học có trong mẫu rễ được nuôi cấy của sâm Việt Nam trong phòng thí nghiệm, chúng tôi tiến hành đề tài “Bƣớc đầu nghiên cứu thành phần hóa học của mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam” với 2 mục tiêu chính: 1. Phân tích các thành phần saponin chính của mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao. 2. Định lượng sơ bộ các thành phần saponin chính của mẫu rễ tóc nuôi cấy của Sâm Việt Nam bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao. Dựa trên những kết quả đó, bước đầu đưa ra được những kết luận sơ bộ về tiềm năng của phương pháp nuôi cấy mẫu rễ tóc của Sâm Việt Nam này trong tương lai. 2 1.1. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN Tổng quan về Sâm Việt Nam 1.1.1. Lịch sử phát hiện và đặc điểm phân bố 1.1.1.1. Lich sử phát hiện Sâm Việt Nam được biết đến như một loại thuốc quý đặc hữu của nước ta, trước khi được phát hiện và công bố rộng rãi từ phía các nhà khoa học thì loại Sâm này đã được các đồng bào dân tộc thiểu số ở vùng Trung bộ Việt Nam, đặc biệt là dân tộc Xê Đăng, sử dụng như một loại củ rừng, mà họ gọi là củ ngải rọm con hay cây thuốc giấu, chữa nhiều loại bệnh theo các phương thuốc cổ truyền. Dựa trên những thông tin được lưu truyền trong cộng đồng đồng bào dân tộc thiểu số ở Quảng Nam, Kon Tum về loại củ quý hiếm ở trên núi Ngọc Linh có tác dụng tốt đối với sức khỏe con người vì thế các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu và tìm hiểu về loại cây này [6]. Năm 1973, khu Y tế Trung Trung bộ cử một tổ gồm 4 cán bộ do dược sĩ Đào Kim Long làm trưởng đoàn, kỹ sư Nguyễn Bá Hoạt, dược sĩ Nguyễn Châu Giang, dược sĩ Trần Thanh Dân là thành viên, đi điều tra phát hiện cây sâm theo hướng chân núi Ngọc Linh thuộc huyện Đắc Tô tỉnh Kon Tum. Khi đoàn lên tỉnh Kon Tum, Ban Dân y Kon Tum cử thêm dược tá Nguyễn Thị Lê trợ giúp cho đoàn, dẫn đường lên núi Ngọc Linh. Sau nhiều ngày vượt suối băng rừng [6], đến 9 giờ sáng ngày 19 tháng 03 năm 1973, trên con đường đi từ làng Ku-gia theo sườn Đông Nam dãy Ngọc Linh ở độ cao 1.500 mét so với mặt biển, đoàn đã phát hiện hai cây Panax đầu tiên, một cây 9 tuổi, một cây 11 tuổi và ngay buổi chiều cùng ngày đã phát hiện được một vùng sâm rộng lớn thuộc phía Tây núi Ngọc Linh [5]. Sau 15 ngày nghiên cứu toàn diện về hình thái, sinh thái, quần thể, quần lạc, phân bố, di cư và phát tán, dược sĩ Đào Kim Long đã xác định núi Ngọc Linh là quê hương của cây sâm mới, đặc biệt quý hiếm, chưa từng xuất hiện tại bất cứ nơi nào khác trên thế giới và bổ sung cho chi Panax họ Araliaceae một loài mới [6]. 12 năm sau vào khoảng tháng 9 - 1985, tên Nhân sâm Việt Nam với tên khoa học là Panax vietnamesis Ha et Grushy, họ Ngũ gia bì Araliaceae, được công bố tại Viện Thực vật Kamarov (Liên Xô cũ) năm 1985, do Hà Thị Dung và I. V. Grushvistky đặt tên sau khi đã nghiên cứu 50 mẫu vật đối chiếu với 3 những mẫu vật của thế giới và đã kết luận sâm Ngọc Linh là một loài mới, một loài Panax đặc hữu của khu hệ thực vật Việt Nam [5, 6]. 1.1.1.2. Đặc điểm phân bố (A) (B) Hình 1.1. Nhân sâm Việt Nam (Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha and Grushv). Sơ lƣợc về nhân sâm Việt Nam và sự phân bố tự nhiên của nhân sâm Việt Nam ở Việt Nam (A). Bản phác thảo màu sắc của nhân sâm Việt Nam (B) [30] Cây sâm được phát hiện mọc tự nhiên từ độ cao 1500m đến 2200m, đạt mật độ cao nhất ở khoảng từ 1.800-2.000m dưới tán rừng già, thuộc địa bàn của hai huyện Đăk Tô (tỉnh Kon Tum) và Trà My (tỉnh Quảng Nam) [4]. Sâm mọc tập trung dưới chân núi Ngọc Linh, một ngọn núi cao 2.598m với lớp đất vàng đỏ trên đá granit dày trên 50cm, có độ mùn cao, tơi xốp và rừng nguyên sinh còn rộng, nên được gọi là sâm Ngọc Linh vì thế ngoài tên riêng là Sâm Việt Nam ra loại cây này còn có tên thường gọi khác là Sâm Ngọc Linh [4, 6], tuy nhiên giới hạn phân bố của Sâm Việt Nam hiện nay đã có những thay đổi, những nghiên cứu thực địa mới nhất cho thấy sâm còn mọc cả ở núi Ngọc Lum Heo thuộc xã Phước Lộc, huyện Phước Sơn, tỉnh Quảng Nam, đỉnh núi Ngọc Am thuộc Quảng Nam, Đắc Glây thuộc Kon Tum, núi Langbian ở Lạc Dương tỉnh Lâm Đồng cũng rất có thể có loại sâm này [1, 6]. 4 1.1.2. Thực vật học của Sâm Việt Nam Sâm Việt Nam với danh pháp khoa học là Panax vietnamensis Ha et Grushv, ngoài tên gọi chính thống là Sâm Việt Nam ra loài sâm này còn có những tên gọi khác như sâm Ngọc Linh, sâm Khu Năm (sâm K5), sâm trúc (sâm đốt trúc, trúc tiết nhân sâm), củ ngải rọm con, rơm con (Xê Đăng) hay cây thuốc giấu [1, 4-6], và có vị trí phân loại theo hệ thống phân loại thực vật như sau: Giới: Thực vật (Plantae) Ngành: Mộc lan (Magnoliophyta) Lớp: Mộc lan (Magnoliopsida) Bộ: Hoa tán (Apiales) Họ: Ngũ gia bì (Araliaceae) Chi: Sâm (Panax) Loài: Panax vietnamensis Ha et Grushv Hình 1.2. Hình ảnh cây sâm Việt Nam (P. vietnamensis Ha & Grushv) (https://caythuoc.org/sam-ngoc-linh.html) 1.1.3. Đặc điểm thực vật và sinh thái của Sâm Việt Nam 1.1.3.1. Đặc điểm thực vật Sâm Việt Nam là loài cây thân thảo, sống lâu năm, cao đến 1m. Thân rễ nạc, có đường kính từ 1,5 - 3,5 cm, mọc bò ngang như củ gừng, có nhiều đốt, không phân nhánh, dài 30 - 40 cm, có thể hơn, có nhiều vết sẹo do thân khí 5 sinh lụi hàng năm để lại, căn cứ vào các vết sẹo trên thân rễ, người ta tính được tuổi của các cây sâm, mặt ngoài thân rễ màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phần cuối thân rễ ở một số cây đôi khi có củ gần hình cầu, đường kính đến 5 cm [4, 5, 15]. Đốt trên cùng của thân rễ tồn tại 1 - 4 thân. Thân khí sinh mảnh, mọc thẳng đứng, nhẵn, cao 40 - 80 cm, rỗng, có 3 mặt hơi tròn có những rãnh nhỏ theo chiều dọc [4-6, 15]. Trên đỉnh của thân mang lá là lá kép hình chân vịt, mọc vòng thường có 4 (hiếm khi 3,5 hoặc 6), ở ngọn, mỗi lá kép gồm 5 lá chét (ít khi có 6,7), lá dài 7 - 12 cm; lá chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8 14 cm, rộng 3 - 5 cm, đầu lá thường nhọn đột ngột, mũi nhọn kéo 1,5 – 2 cm, góc lá hình nêm, mép lá có răng cưa nhỏ đều, gân bên ở mặt trên của lá chét có nhiều lông cứng dạng gai dài đến 3 mm, mặt dưới ít hơn [4, 5, 15]. Hình 1.3. Hình ảnh lá và quả của sâm Việt Nam (https://caythuoc.org/sam-ngoc-linh.html) Cụm hoa dài 25 cm, gấp 1,5 - 2 lần chiều dài của cuống lá, thường mang một tán đơn, đôi khi có thêm 1 - 4 tán phụ [4, 5]. Cuống hoa dài 1,5 – 2 cm, có nhiều lông. Tán hoa chính đường kính 2,5 - 4 cm, có 50 - 120 hoa, hoa màu vàng lục nhạt, đường kính hoa nở 3 - 4 mm; đài 5 răng hình tam giác dài 1 – 1,5 cm; tràng có 5 cánh hoa hình trứng dài 2 mm; bao phấn hình trái xoan dài 1 mm và có 5 nhị [4, 5, 15]. Quả mọng, hình trứng, khi chín màu đỏ và thường có 1 chấm đen ở trên đỉnh quả. Quả 1 hạt hình thân, quả 2 hạt có hình 6 cầu hơi dẹt dài 7 – 10 mm. Hạt lớn dài 8 mm, vỏ hạt cấu tạo bởi nhiều vết xốp lồi lõm [5, 15]. Ra hoa vào tháng 4 - 6, quả có vào tháng 7 – 9 [4, 15]. 1.1.3.2. Đặc điểm sinh thái Sâm Việt Nam là loại cây thảo đặc biệt sinh trưởng ở độ cao từ 1500 – 2200 m so với mặt nước biển, cây đặc biệt ưa ẩm và bóng, thường mọc rải rác hay tập trung thành từng đám nhỏ dưới tán rừng kín thường xanh cây lá rộng, nhất là dọc theo hành lang ven suối ở độ cao từ 1900 m. Môi trường rừng nơi có sâm Việt Nam mọc tự nhiên luôn ẩm ướt, thường xuyên có mây mù. Nhiệt độ trung bình ước tính từ 15⁰C đến 18⁰C; lượng mưa xấp xỉ khoảng 3000 mm/năm. Đất rừng ở đây được tạo từ lá cây mục lâu ngày nên đất có màu nâu rêu, tơi xốp, độ mùn cao và chứa nhiều nước trong đất. Sâm Việt Nam sinh trưởng mạnh trong khoảng thời gian từ mùa xuân đến hè. Cây ra hoa quả thường từ tháng 4 đến tháng 9 hàng năm, tương đối đều. Khi quả chín sẽ rụng xuống đất, tồn tại qua mùa đông và nảy mầm vào mùa xuân năm sau [1, 4]. 1.1.4. Thành phần hóa học Sâm Việt Nam đã được tập trung nghiên cứu ngay từ khi loài này được phát hiện ở Việt Nam vào những năm cuối của thế kỉ XX. Từ 1974 đến 1990, các tác giả Nguyễn Thời Nhâm và Trần Công Luận đã nghiên cứu về thành phần hợp chất saponin trong Sâm Việt Nam hoang dại, khởi đầu cho những nghiên cứu toàn diện hơn và sâu hơn của các thành phần hóa học có ở loài cây này [5, 9, 15]. Kể từ báo cáo đầu tiên vào năm 1993, cho đến nay đã có 52 hợp chất saponin trong Sâm Việt Nam đã được phân lập và xác định cấu trúc [9, 30]. Các hợp chất này chủ yếu được phân lập từ rễ và thân rễ của Sâm Việt Nam. Ngoài saponin, trong Sâm Việt Nam các tác giả cũng xác định được trong sâm có chứa các polyacetylen, acid béo, acid amin, glucid, tinh dầu và một số yếu tố vi lượng khác có trong loài sâm này [4, 9, 15]. 1.1.4.1. Các hợp chất saponin trong sâm Việt Nam Saponin là một nhóm glycosid lớn mà cấu trúc hóa học gồm hai phần: phần đường và phần không đường thường được gọi là aglycon, gặp rộng rãi 7 trong thực vật. Và không ngoại lệ Saponin cũng là thành phần hoạt chất chủ yếu của Sâm Việt Nam cũng như của các loài sâm khác trên thế giới. Từ những nghiên cứu về phần dưới mặt đất của Sâm Việt Nam đã phân lập và xác định được cấu trúc protopanaxadiol oxid II và 52 hợp chất saponin bao gồm 26 saponin đã biết và 26 saponin có cấu trúc mới đã phát hiện trong Sâm Việt Nam được đặt tên là vina – ginsenosid-R1-R25 và 20-O-Me-G.Rh1 [9, 10]. Các saponin của Sâm Việt Nam được xác định hầu hết thuộc loại dammarane triterpene chúng có thể được phân loại thêm thành các nhóm protopanaxadiol (PPD), protopanaxatriol (PPT) và occotillol (OT) ngoại trừ cho hai saponin loại oleanane (ginsenosid Ro và hemslosid Ma3) [15, 30]. Các saponin dammaran này là hoạt chất quyết định cho các tác dụng sinh học, chiếm tỉ lệ rất cao về hàm lượng và số lượng trong thành phần saponin của Sâm Việt Nam. Trong đó, các saponin dẫn chất của 20(S)protopanaxadiol gồm 22 hợp chất với đại diện chính là G-Rb1 chiếm 2,0% về hàm lượng [9, 20]. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol Hình 1.4. Cấu trúc dẫn xuất của 20(S)-protopanaxadiol 8 Bảng 1.1. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol [4, 9, 15, 19, 20, 30] STT Tên Kiểu R1 R2 Hàm lƣợng (%) 1 G-Rb1* (A) -Glc2-Glc -Glc6-Glc 2.0 2 G-Rb2 (A) -Glc2-Glc -Glc6-Ara(P) 0.012 3 G-Rb3* (A) -Glc2-Glc -Glc6-Xyl 0.11 2 6 4 G-Rc (A) -Glc -Glc - Glc -Ara(f) 0.013 5 G-Rd* (A) -Glc2-Glc -Glc 0.87 6 PG-Rc1 (A) -Glc2-Glc6-Ac -Glc 0.001 6 7 GY-IX (A) -Glc -Glc -Xyl 0.002 8 GY-XVII (A) -Glc -Glc6-Glc 0.036 9 Q-R1 (A) -Glc2-Glc6-Ac -Glc6-Glc 0.012 6 2 2 10 N-Fa (A) -Glc -Glc -Xyl -Glc -Glc 0.072 11 M-F1 (B) -Glc2-Glc -Glc 0.001 12 VG-R3 (H) -Glc2-Glc -Glc 0.009 13 VG-R7 (A) -Glc2-Glc2-Xyl -Glc 0.01 14 VG-R8 (C) -Glc2-Glc -Glc 0.004 2 15 VG-R9 (B) -Glc -Glc -Glc 0.004 16 VG-R13 (E) -Glc2-Glc -Glc 0.002 17 VG-R24 (A) -Glc2-Xyl -Glc 0.001 2 18 VG-R23 (A) -Glc -Glc -Ara 0.001 19 VG-R22 (A) -Glc2-Glc -Xyl 0.001 20 VG-R16 (D) -Glc2-Glc -Glc 0.003 2 21 VG-R21 (G) -Glc -Glc -Glc 0.001 22 VG-R20 (F) -Glc2-Glc -Glc 0.003 Ghi chú: G = ginsenosid; PG = pseudo-ginsenosid; GY=gypenosid Q = quinquenosid; N = notoginsenosid; M = majonosid; VG = vina ginsenosid. *: các saponin chính 9 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của ginsenosid-Rb1 [25] Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol gồm 17 hợp chất với các đại diện là: Ge-Re, -Rg1. Trong đó G-Rg1 chiếm tỷ lệ cao nhất 1,37% và G-Re chiếm 0,17% [9, 20]. Hình 1.6. Cấu trúc của các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol 10 Bảng 1.2. Các saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol [4, 9, 15, 19, 20] STT Tên Kiểu R1 R2 R3 Hàm lƣợng (%) 23 (I) -H -Glc2-Rha -Glc 0.17 (I) -H -Glc2-Glc -Glc 0.01 25 G-Re* 20-Glc-GRf G-Rg1* -H -Glc -Glc 1.37 26 G-Rh1 -H -Glc -H 0.008 27 G-Rh1 (I) (I) 20(R),20(S) (I) -H -Glc Glc2-Glc -H 0.021 28 PG-RS1 (I) -H 6 -Glc 0.013 -Glc -Glc6αGlc 0.36 24 29 N-R1* (I) -H Ac -Glc2-Xyl 30 N-R6 (I) -H -Glc -Glc2Glc -H -H -H -H -Glc2Glc -H -Glc 0.004 -Glc -Glc -Glc -Glc -H -Glc -Glc -Glc 0.005 0.003 0.002 0.002 -H -Glc 0.006 (I) -H -Glc -CH3 0.015 (G) (M) -H -H -Glc -Glc -Glc -H 0.003 0.014 31 VG-R4 (I) 32 33 34 35 VG-R12 VG-R15 VG-R17 VG-R18 (K) (J) (K) (K) 36 VG-R19 (L) 37 38 39 OMeGRh1 VG-R25 G-Rh4 0.01 Ghi chú: *: các saponin chính trong thành phần saponin dẫn chất protppanaxatriol. Glc: β-D-glucopyranosyl; α-Glc: α-glucopyranosyl; GlcA: β-Dglucoronopyranosyl; Rha: α-L-rhamnopyranosyl; Xyl: β-D-xylopyranosyl; Ara: αarabinopyranosyl; Ara(f): α-L-arabinofuranosyl; Ara(p): α-L-arabinopyranosyl; Ac: acetyl. 11 Ginsenosid-Rg1 Ginsenosid-Re Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của ginsenosid-Rg1 và ginsenosid-Re [25] Các saponin có cấu trúc Ocotillol Các saponin có cấu trúc Ocotillol bao gồm 11 hợp chất với các đại diện là: majonosid-R1 và -R2. Đặc biệt M-R2 chiếm 5,29% hàm lượng saponin và là hợp chất chủ yếu của Sâm Việt Nam so với thành phần saponin trong các loài sâm khác trên thế giới và gấp 48 lần hiệu suất chiết được từ Panax japonicum C.A. Mey. var. major (Burk.) C.Y.Wu et K.M.Feng [9]. Hình 1.8. Cấu trúc của các saponin dẫn chất của Ocotillol 12