Tài liệu Khóa luận Giám định loài và định Type độc tố vi khuẩn Clostridium perfringens phân lập từ gà bằng kỹ thuật sinh học phân tử

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Đồ án này Trước hết, tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được gửi đến thầy: TS. Lê Lập - Trưởng Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng - Phân viện Thú y miền Trung, TS. Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Bác sỹ Lê Đình Hải và KS. Lưu Thị Nguyệt Minh - Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng - Phân viện Thú y miền Trung đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Xin cảm ơn ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quý báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt, xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung cùng toàn thể các cô chú, anh chị trong Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng và tập thể cán bộ công nhân viên của Phân viện Thú y miền Trung đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã tạo điều kiện và động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua. Nha Trang, tháng 06, năm 2011 Sinh viên Mai Thị Ly Na GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội i SVTH: Mai Thị Ly Na MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC .........................................................................................................................i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................iii DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................iv DANH MỤC HÌNH ..........................................................................................................v LỜI NÓI ĐẦU ..................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................3 1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C. perfringens và bệnh viêm ruột hoại tử ở gà.....................3 1.1.1. Trên thế giới...................................................................................................3 1.1.2. Ở Việt Nam...................................................................................................5 1.2. Vi khuẩn C. perfringens [10] .....................................................................................5 1.2.1. Đặc điểm hình thái .........................................................................................6 1.2.2. Đặc tính sinh vật hóa học ...............................................................................7 1.2.3. Đặc tính di truyền...........................................................................................8 1.2.4. Cơ chế gây bệnh của C. perfringens ...............................................................9 1.2.5. Phân loại các type độc tố của C. perfringens [14] .............................................9 1.3. Những hiểu biết về gene 16S RNA ..........................................................................13 1.3.1. Giới thiệu rRNA (RNA ribosome)..................................................................13 1.3.2. Cấu trúc và chức năng của 16S RNA..............................................................15 1.4. Phản ứng PCR [2], [9], [37], [38].............................................................................16 1.4.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR .....................................................................17 1.4.2. Các điều kiện của phản ứng PCR..................................................................17 1.4.3. Các giai đoạn của phản ứng PCR..................................................................21 1.4.4. Các hạn chế của phản ứng PCR ....................................................................22 1.5. Điện di - Phát hiện sản phẩm PCR [2], [9] ...............................................................25 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................27 2.1. Đối tượng nghiên cứu ...............................................................................................27 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu..............................................................................27 2.3. Vật liệu nghiên cứu...................................................................................................27 2.3.1. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm...........................................................................27 GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội ii SVTH: Mai Thị Ly Na 2.3.2. Hóa chất, môi trường và thuốc thử .................................................................27 2.4. Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................................27 2.4.1. Phương pháp lấy mẫu.....................................................................................27 2.4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn C. perfringens bằng giám định đặc tính sinh vật hóa học ..............................................................................................................28 2.4.3. Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của C. perfringens .........29 2.4.4. Xác định đặc tính hình thái của C. perfringens ............................................30 2.4.5. Phương pháp giữ giống vi khuẩn....................................................................31 2.4.6. Giám định loài vi khuẩn C. perfringens đã phân lập theo phương pháp phát hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR ...................................................................31 2.4.7. Phương pháp định type vi khuẩn C. perfringens bằng kỹ thuật Multiplex PCR (Songer J.G. và cộng sự, 1999). ...............................................................................34 2.4.8. Phương pháp xử lý số liệu ..............................................................................36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................37 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens .................................................................37 3.2. Kết quả kiểm tra đặc tính hình thái của C. perfringens ..............................................38 3.2. Kết quả kiểm tra đặc tính hình thái của C. perfringens ..............................................39 3.2.1. Hình thái và tính chất bắt màu của vi khuẩn ...................................................39 3.2.2. Kết quả kiểm tra khả năng di động của C. perfringens....................................40 3.3. Kết quả kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của C. perfringens ............................40 3.4. Kết quả giám định loài vi khuẩn C. perfringens đã phân lập theo phương pháp phát hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR...........................................................................45 3.5. Kết quả định type độc tố vi khuẩn C. perfringens phân lập được bằng kỹ thuật Multiplex PCR ................................................................................................................46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN...............................................................................49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................................50 PHỤ LỤC .......................................................................................................................54 GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội iii SVTH: Mai Thị Ly Na DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT C. perfringens Clostridium perfringens E. coli Escherichia coli S. agalactiae Streptococus agalactiae Taq Thermus aquaticus BHI Brain Heart Broth SPS Agar Perfringens Selective Agar TSC Agar Tryptose - Sulfit - Cycloserin Agar PCR Polymerase Chain Reaction dNTP Deoxynucleotide Triphosphate TBE Tris Boric EDTA DNA Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic Acid M Marker - Thang chuẩn DNA Cpa Gene mã hóa Clostridium perfringens Alpha toxin Cpb Gene mã hóa Clostridium perfringens Beta toxin Ext Gene mã hóa Clostridium perfringens Epsilon toxin Itx Gene mã hóa Clostridium perfringens Iota toxin Cpe Gene mã hóa Clostridium perfringens Enterotoxin S Hệ số lắng (Svedberg) Tm Nhiệt độ nóng chảy của một trình tự DNA GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội iv SVTH: Mai Thị Ly Na DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens ..........................................10 Bảng 1.2. Các type độc tố gây bệnh của C. perfringens .........................................13 Bảng 1.3. Các loại enzyme polymerases cho phản ứng PCR ..................................18 Bảng 2.1. Các thành phần của phản ứng PCR ........................................................33 Bảng 2.2. Nội dung các bước tiến hành chạy PCR .................................................33 Bảng 2.3. Các đoạn mồi sử dụng trong phản ứng Multiplex PCR ..........................35 Bảng 2.4. Các thành phần tham gia phản ứng Multiplex PCR................................36 Bảng 3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn C. perfringens ở mẫu phân và mẫu manh tràng của gà..................................................................................................37 Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn C. perfringens.44 Bảng 3.3. Kết quả giám định loài vi khuẩn C. perfringens bằng 16S RNA ............46 Bảng 3.4. Kết quả định type độc tố các chủng vi khuẩn C. perfringens..................47 GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội v SVTH: Mai Thị Ly Na DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Vi khuẩn C. perfringens ...........................................................................4 Hình 1.2. Hiện tượng dung huyết beta .....................................................................6 Hình 1.3. Cấu trúc RNA ribosome.........................................................................14 Hình 1.4. Cấu trúc bậc 2 của 16S RNA..................................................................15 Hình 1.5 Các giai đoạn của phản ứng PCR ...........................................................21 Hình 2.1 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ..........................................................32 Hình 2.2. Chu trình nhiệt của phản ứng Multiplex PCR.........................................35 Hình 3.1. Hình thái của vi khuẩn C. perfringens ....................................................39 Hình 3.2. Vi khuẩn C. perfringens khi soi tươi ......................................................40 Hình 3.3. Vi khuẩn trên môi trường Fluid Thioglycolate .......................................40 Hình 3.4. Khuẩn lạc trên môi trường SPS agar ......................................................41 Hình 3.5. Khuẩn lạc trên môi trường thạch máu ....................................................41 Hình 3.6. Khuẩn lạc trên môi trường Egg yolk ......................................................42 Hình 3.7. Phản ứng CAMP test..............................................................................42 Hình 3.8. Kết quả kiểm tra lên men đường ............................................................43 Hình 3.9. Kết quả giám định loài vi khuẩn C. perfringens bằng 16S RNA.............45 Hình 3.10. Kết quả xác định gene mã hóa độc tố của vi khuẩn C. perfringen.........47 GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội 1 SVTH: Mai Thị Ly Na LỜI NÓI ĐẦU Vi khuẩn Clostridium perfringens (C. perfringens) phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, thường thấy trong đất, nước và chất thải. Vi khuẩn cũng thường cư trú tự nhiên trong đường tiêu hóa của các loài gia súc, gia cầm như dê cừu, trâu bò, heo, gà ... Chúng là nguyên nhân gây nhiễm độc máu, viêm ruột tiêu chảy, hoại thư sinh hơi và gây ngộ độc thực phẩm cho người. C. perfringens là nguyên nhân gây ra bệnh viêm ruột hoại tử ở gà. Đây là loại bệnh truyền nhiễm cấp tính, xảy ra đột ngột với tỷ lệ chết rất cao. Theo Ilenia Drigo (2008), nguyên nhân gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà chủ yếu là do vi khuẩn C. perfringens type A và type C. Trong đó, độc tố alpha đóng vai trò chủ đạo [18]. Tuy nhiên, McDougald (2003) thì lại cho rằng bệnh viêm ruột hoại tử thường kế phát từ bệnh cầu trùng. Theo ông, khi thời tiết hoặc khẩu phần ăn thay đổi đột ngột sẽ làm giảm sức đề kháng của con vật, tạo điều kiện cho cầu trùng gây bệnh. Đây là thời điểm tốt nhất để C. perfringens sinh sôi nẩy nở và sản sinh độc tố gây bệnh. Thiệt hại do bệnh này gây ra cho các hộ gia đình và các trang trại chăn nuôi có thể lên đến 5 - 50 %. Để xác định loài vi khuẩn C. perfringens trong các mẫu thực phẩm hay mẫu bệnh phẩm, người ta thường sử dụng phương pháp thường quy phân lập và giám định các đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn (Quinn và cộng sự, 1994). Ưu điểm của phương pháp này là tách được các chủng vi khuẩn thuần khiết nhưng lại tốn nhiều thời gian và kết quả không thực sự chính xác do trong quá trình nuôi cấy một số vi khuẩn có thể thay đổi đặc tính sinh hóa. Khoa học kỹ thuật mà đặc biệt là sinh học phân tử ngày càng phát triển, các phương pháp thử nhanh (PCR, ELISA…) ra đời giúp rút ngắn thời gian phát hiện, định lượng và định danh vi sinh vật với độ chuẩn xác cao. Hiện nay, sử dụng phương pháp PCR trong việc giám định vi khuẩn C. perfringens bằng phát hiện gene 16S RNA ngày càng ứng dụng rộng rãi. Gene 16S RNA là RNA đơn vị nhỏ (small unit) của ribosome vi khuẩn. Ở vi khuẩn, ribosome được cấu tạo từ hai tiểu đơn vị ribonucleoprotein với hệ số lắng S lần lượt là 50S và 30S. Tiểu đơn vị lớn 50S chứa hai loại RNA là 23S rRNA và 5S rRNA, GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội 2 SVTH: Mai Thị Ly Na tiểu đơn vị nhỏ 30S chỉ gồm một loại 16S rRNA. Gene 16S rRNA có một đặc điểm rất đặc biệt, đó là chúng mang những vùng bảo tồn cao ở cấp độ nhóm xen kẽ với những vùng biến động nhưng lại bảo tồn ở cấp độ loài, có trình tự rất bảo thủ không thay đổi qua thời đại và rất chuyên biệt cho mỗi loại vi khuẩn. Chính vì vậy, gene này đã trở thành “một thước đo tiến hóa”, là sự lựa chọn hàng đầu của các nhà khoa học trong việc định danh và phân loại các vi khuẩn [7, 9, 20]. Từ những thực tế trên đây, được sự đồng ý của Lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung và Ban giám đốc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, chúng tôi thực hiện đề tài: “Giám định loài và định type độc tố vi khuẩn Clostridium perfringens phân lập từ gà bằng kỹ thuật sinh học phân tử”. Mục tiêu của đề tài : Phát hiện nhanh vi khuẩn C. perfringens, từ đó đề xuất biện pháp phòng trị bệnh có hiệu quả cho gà và giúp giảm thiểu tối đa những thiệt hại do C. perfringens gây ra. Nội dung của đề tài: 1) Phân lập vi khuẩn Clostridium perfringens từ gà theo phương pháp thường quy. 2) Giám định loài vi khuẩn Clostridium perfringens đã phân lập theo phương pháp phát hiện gene 16S RNA bằng kỹ thuật PCR. 3) Định type độc tố vi khuẩn Clostridium perfringens đã phân lập bằng kỹ thuật Multiplex PCR. Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của quý thầy cô và các bạn để báo cáo thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn! GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội 3 SVTH: Mai Thị Ly Na CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn C. perfringens và bệnh viêm ruột hoại tử ở gà 1.1.1. Trên thế giới Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về C. perfringens gây bệnh cho người và các loại gia súc, gia cầm. Theo Long J. R (1973), bệnh viêm ruột hoại tử (Necrotic Enteritis) do C. perfringens gây ra ở gà được biết đến lần đầu tiên vào năm 1961 trên gà trống non 6 - 7 tuần tuổi tại Anh, sau đó bệnh xuất hiện ở Úc, Canada, Mỹ và Thụy Điển. Bệnh thường xảy ra trên gà từ 2 - 4 tuần tuổi [23]. Hofshagen và cộng sự (1992), đã tiến hành phân lập vi khuẩn C. perfringens từ 192 mẫu phân của 99 con gà thịt và 93 con gà rừng. Kết quả cho thấy, tỷ lệ phân lập vi khuẩn C. perfringens và khả năng sản sinh độc tố alpha ở gà thịt cao gấp 1,7 lần so với gà rừng [17]. Năm 2004, Hakan Kalender, Viện nghiên cứu và kiểm soát thú y, ElazÝÛThổ Nhĩ Kỳ, đã nghiên cứu phân lập vi khuẩn C. perfringens từ manh tràng gà và phát hiện gene mã hóa độc tố alpha do vi khuẩn này gây ra bằng phản ứng PCR. Kết quả của nghiên cứu này là tác giả đã phân lập được vi khuẩn C. perfringens từ 8 mẫu manh tràng gà trong số 160 mẫu đem phân tích (5%). Và trong 8 mẫu phân lập được, sau khi tiến hành phản ứng PCR, có 6 mẫu mang gene độc tố type A và 2 mẫu còn lại không thể định type [16]. Effat và cộng sự (2007) đã phân lập vi khuẩn C. perfringens từ các mẫu gà bị bệnh tại các trang trại gà ở Cario - Ai Cập bị bệnh viêm ruột hoại tử. Ông đã định type vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật Multiplex PCR với 4 cặp mồi đặc hiệu mã hóa cho 4 gene sản sinh độc tố alpha, beta, epsilon, iota. Kết quả là type A với độc tố alpha là nguyên nhân gây bùng phát bệnh viêm ruột hoại tử ở các trang trại này [15]. Cũng trong năm 2007, I. Svodosová và cộng sự, Đại học Brno - Cộng hòa Séc đã phân lập 609 mẫu manh tràng của những con gà thịt từ 23 trang trại. Kết quả là tác giả thu được 112 mẫu dương tính với vi khuẩn C. perfringens (chiếm 18,39%). GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội 4 SVTH: Mai Thị Ly Na Thực hiện phản ứng Multiplex PCR để định type độc tố của vi khuẩn, tác giả xác định tất cả vi khuẩn C. perfringens phân lập được đều thuộc type A. Trong đó có 4 chủng mang gene cpb2 mã hóa độc tố beta 2 [19]. Rocio Crespo và cộng sự (2007) đã tiến hành so sánh 31 mẫu gia cầm (gà, gà tây, chim cút và vẹt) bị viêm ruột hoại tử từ năm 1997 và 2005 với 19 mẫu gia cầm không có triệu chứng về bệnh này. Qua nghiên cứu cho thấy, tất cả các chủng C. perfringens phân lập từ các gia cầm này đều thuộc type A. Tuy nhiên, trong số đó chỉ có 54% sản sinh độc tố trong ống nghiệm khi phân tích bằng kỹ thuật Western Blot. Và đáng ngạc nhiên là một lượng lớn các chủng vi khuẩn phân lập từ gia cầm khỏe mạnh (90%) có khả năng sản sinh cpb2, trong khi đó hơn một nửa các chủng vi khuẩn phân lập từ gia cầm bị bệnh lại không thể sản sinh loại độc tố này. Từ những điều tra này, tác giả kết luận rằng không có mối liên hệ nào giữa độc tố β2 và bệnh viêm ruột hoại tử ở gia cầm [27]. Theo Ilenia Drigo và cộng sự (2008), với nghiên cứu về các gene độc tố của các chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập từ những con gà khỏe mạnh và gà bị bệnh. Tác giả cho rằng: Type A và type C là hai type độc tố gây bệnh viêm ruột hoại tử ở gà [18]. Năm 2008, TS. Anthony Keyburn, Nghiên cứu sinh của Đại học Monash và cộng sự đã có phát hiện đột phá rằng độc tố alpha không phải là yếu tố chính gây bệnh viêm ruột hoại tử trên gà, ông phát hiện ra một loại độc tố mới NetB mới là yếu tố độc lực chính. Đến nay, ông và nhóm cộng sự đang tiếp tục nghiên cứu để tìm ra một loại vắc-xin thực sự có hiệu quả để chống lại căn bệnh này [12]. Năm 2009, Leen Timbermont và cộng sự đã phân lập được 26 chủng C. perfringens từ gà khỏe mạnh và 24 chủng C. perfringens từ gà nghi bệnh viêm ruột hoại tử. Tiến hành đem nuôi trong ống nghiệm và nhận thấy rằng một tỷ lệ lớn (55 67%) chủng vi khuẩn C. perfringens phân lập từ gà nghi bệnh có khả năng ức chế sự phát triển của các chủng C. perfringens phân lập từ gà khỏe mạnh. Vì vậy, tác giả đã đưa ra kết luận: vi khuẩn C. perfringens phân lập từ gà bệnh có khả năng sản sinh độc tố có hoạt lực mạnh hơn vi khuẩn C. perfringens phân lập từ gà khỏe mạnh [22]. GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội 5 SVTH: Mai Thị Ly Na Saad Gharaibeh và cộng sự (2010) đã phân lập được 67 chủng vi khuẩn C. perfringens từ 155 mẫu phân gà thịt nuôi tại Jordan (chiếm 43,2%). Thực hiện phản ứng Multiplex PCR thì nhận thấy 100% các chủng vi khuẩn C. perfringens đều thuộc type A. Tác giả cũng tiến hành kiểm tra sự mẫn cảm của 67 chủng vi khuẩn C. perfringens với kháng sinh và kết quả cho thấy C. perfringens mẫn cảm mạnh với Penicillin, với Oxytetracycline chiếm 82,3% và với Amoxicillin là 67,4% [28]. 1.1.2. Ở Việt Nam Bệnh viêm ruột hoại tử ở gà do vi khuẩn C. perfringens gây ra vẫn chưa được nghiên cứu nhiều ở nước ta, các nghiên cứu chủ yếu về vi khuẩn C. perfringens gây bệnh trên bò, dê, cừu, lợn. Theo Giáo sư Đào Trọng Đạt và các tác giả như Trần Thị Hạnh, Đặng Phương Kiệt (1998), C. perfringens type C có thể phân lập được trong chất chứa đường ruột của động vật khỏe. Kết quả kiểm tra vi khuẩn học các mẫu phân lấy từ các động vật trâu bò, cừu, lợn và gia cầm có thể phát hiện được C. perfringens. Nhóm tác giả cũng nhận thấy vi khuẩn này có thể dễ dàng tìm thấy trong thức ăn, dụng cụ chăn nuôi, môi trường xung quanh chuồng trại gia súc, trong đất và nguồn nước [2]. Theo TS. Lê Lập và cộng sự (2007), khi phân lập và xác định type độc tố của vi khuẩn C. perfringens ở động vật nhai lại bằng kỹ thuật Multiplex PCR. Tác giả cho biết, những chủng vi khuẩn phân lập từ phân đều thuộc type A, mang gene cpa mã hóa sản sinh độc tố alpha; những chủng phân lập từ phủ tạng của dê, cừu bị bệnh viêm ruột hoại tử lại thuộc type D, mang gene cpa và etx [6]. Theo nghiên cứu của Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cộng sự (2009), các chủng vi khuẩn C. perfringens mang đầy đủ các đặc tính sinh học của loài, sản sinh độc tố gây chết chuột. Kết quả của việc định type bằng Multiplex PCR cho thấy các chủng C. perfringens phân lập từ bò thuộc type A (48,1%) và type D (51,9%); các chủng phân lập từ lợn thuộc type A, mang độc tố ruột (37,8%) và độc tố beta 2 (18,9%) [5]. 1.2. Vi khuẩn C. perfringens [10] C. perfringens phân bố rộng khắp trong môi trường đất, nước, không khí và thường được tìm thấy trong ruột động vật. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì vi khuẩn SVTH: Mai Thị Ly Na 6 GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội này phát triển và sinh bệnh lý trong cơ thể vật chủ. C. perfringens đã được phân lập bởi Welch và Nuttall (năm 1892) từ vết thương bị hoại tử và được đặt tên là Baccillus aerogenes capsulatus. Sau đó đổi thành Bacillus perfringens, tiếp theo là Clostridium welchii. Và hiện nay là Clostridium perfringens. Hệ thống phân loại khoa học của C. perfringens: Giới (regnum) : Bacteria Ngành (phylum) : Lớp (class) Bộ (ordor) Họ (familia) Chi (genus) Loài (species) Firmicutes : Clostridia : Clostridiales : Clostridiaceae : Clostridium : C. perfringens 1.2.1. Đặc điểm hình thái C. perfringens là trực khuẩn Gram dương, hình que, yếm khí và có khả năng tạo bào tử. C. perfringens có đặc tính giúp dễ phân biệt với các loài khác thuộc chi Clostridium là hình que lớn (0,6 - 2,4 × 1,3 - 19 µm), có vỏ kết nang và không di động. Khuẩn lạc của C. perfringens tròn, nhẵn và bóng, được bao bởi một vòng bên trong dung huyết hoàn toàn (do độc tố theta) và một vòng bên ngoài không dung huyết hoàn toàn (do độc tố alpha). Người ta gọi hiện tượng này là hiện tượng dung huyết beta trên môi trường nuôi cấy có bổ sung máu động vật. Hình 1.1. Vi khuẩn C. perfringens Hình 1.2. Hiện tượng dung huyết beta GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội 7 SVTH: Mai Thị Ly Na Vi khuẩn C. perfringens có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ 12 - 50oC, phát triển chậm ở 20oC. Và ở 43 - 47oC vi khuẩn phát triển nhanh cực độ, có thể tạo ra một thế hệ trong 8 - 10 phút và sản sinh khí. Vi khuẩn phát triển trong khoảng pH 5 - 8 và hoạt tính nền của nước là 0,93 - 0,97. C. perfringens có thể sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt nhờ sự biến đổi thích nghi của hệ thống biến dưỡng tế bào với khả năng chịu đựng cao và sản sinh nội bào tử. Nội bào tử có thể sống sót trong những môi trường khắc nghiệt như nóng, khô, acid, chất tẩy rửa. 1.2.2. Đặc tính sinh vật hóa học C. perfringens là vi khuẩn yếm khí nhưng điều kiện nuôi cấy yếm khí không đòi hỏi khắt khe như các vi khuẩn khác: - Điều kiện nuôi cấy: C. perfringens phát triển tốt ở môi trường yếm khí, thông thường từ 2 - 10% CO2. - Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp là 37 - 42oC. - Vi khuẩn này có thể phát triển trên các môi trường:  Trên môi trường Fluid Thioglycolate: Sau 6 - 8 giờ nuôi cấy ở 37°C, vi khuẩn phát triển tốt làm đục môi trường.  Trên môi trường SPS agar hoặc TSC agar: Vi khuẩn phát triển cho khuẩn lạc tròn, màu đen do vi khuẩn sinh H2S kết hợp với Fe (Fe có sẵn trong môi trường) tạo thành FeS có màu đen.  Trên môi trường thạch máu: Sau 24 - 28 giờ nuôi cấy ở 37°C, khuẩn lạc của C. perfringens tròn, nhẵn và bóng, được bao bởi một vòng dung huyết kép (vòng bên trong dung huyết hoàn toàn (do độc tố theta) và một vòng bên ngoài dung huyết không hoàn toàn (do độc tố alpha)). Hiện tượng này là dung huyết beta trên môi trường nuôi cấy thạch máu.  Trên môi trường Litmus milk: Vi khuẩn phát triển tạo thành dạng vẩn mây điển hình do đường lactose trong môi trường bị lên men, tạo ra acid, làm đông vón casein và làm chuyển màu môi trường, từ tím sang nâu rồi sang trắng với chỉ thị pH Litmus. Sau đó, các đám vẩn acid bị vỡ, nứt ra do sự hình thành hơi. GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội 8 SVTH: Mai Thị Ly Na  Trên môi trường lòng đỏ trứng (Egg yolk): Vi khuẩn C. perfringens phát triển sản sinh men lecithinase phân giải lecithine tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc.  Phản ứng CAMP test: Khi nuôi cấy vi khuẩn C. perfringens và S. agalactiae trên môi trường thạch máu thành một đường vuông góc thì các khuẩn lạc của S. agalactiae sản sinh ra yếu tố có khả năng khuếch tán sẽ làm rõ hơn vùng dung huyết không hoàn toàn tạo ra bởi độc tố alpha của C. perfringens.  Trên môi trường nước thịt gan yếm khí: Vi khuẩn phát triển rất nhanh làm đục môi trường.  Vi khuẩn có khả năng lên men các loại đường: glucose, lactose, maltose, sucrose. Không lên men mannitol, không sinh indol. 1.2.3. Đặc tính di truyền Trong các loài có khả năng gây độc của chi Clostridium, C. perfringens là loài điển hình cho các nghiên cứu di truyền vì tốc độ tăng trưởng nhanh và khả năng thao tác di truyền dễ dàng. Năm 2002, cấu trúc genome hoàn chỉnh của chủng C. perfringens đã được công bố bởi Shimizu và cộng sự. Bộ nhiễm sắc thể của chủng này gồm 3.031.430 bp, 2660 vùng mã hóa cho các protein và 10 loại rRNA; tổng hàm lượng G + C là 28,6%. Khi cấu trúc genome của C. perfringens được so sánh với genome của những vi khuẩn không gây bệnh như C. acetabutylicum, sự khác biệt rõ ràng nhất có liên quan đến các gene sinh độc tố của C. perfringens. Ngoài các gene độc tố đã biết, Shimizu cũng tìm thấy nhiều gene gây độc khác, kết hợp trong hệ gene của C. perfringens. Năm gene dung huyết đã được xác định dựa trên sự tương đồng về khả năng dung huyết đã được mô tả trong các loài vi khuẩn đã phân loại trước đây. Hai type có gene quy định protein liên kết với fibronectin là tương đồng với gene của vi khuẩn Listeria monocytogenes và Bacillus subtilis đã cho thấy có sự liên quan đến các yếu tố gây độc. Trình tự genome của C. perfringens cho thấy các gene độc lực không có tác động cộng gộp với nhau. Chỉ có một vài yếu tố di truyền di động có thể được phát hiện và những dấu hiệu của gene theo chiều ngang là khó phát hiện trong genome GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội 9 SVTH: Mai Thị Ly Na của C. perfringens. Do đó, có thể thấy rằng các type độc tố khác nhau của C. perfringens được tiến hóa từ type A bằng cách nhiễm vào các yếu tố ngoài nhiễm sắc thể như plasmid và gene nhảy. Gene mã hóa độc tố alpha và theta nằm trên nhiễm sắc thể, nhiều gene mã hóa các loại độc tố khác cũng nằm trên plasmid. Gene mã hóa độc tố enterotoxin có thể nằm trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid. Biểu hiện của alpha toxin và theta toxin được quy định bởi một hệ thống dẫn truyền tín hiệu hai thành phần (VirR/VirS), một bộ cảm biến histidine kinase, VirS, và các yếu tố cần cho một phản ứng, VirR. Cơ chế điều hòa xảy ra ở cấp độ phiên mã và các đột biến có thể thay đổi việc sản sinh cả độc tố alpha và theta. 1.2.4. Cơ chế gây bệnh của C. perfringens Vi khuẩn C. perfringens có khắp nơi trong thiên nhiên và là một phần của hệ vi sinh vật đường ruột bình thường của người và động vật. Thường có hai dạng cơ bản hình thành nên bệnh là vi khuẩn có sẵn trong ruột hoặc thức ăn bị nhiễm vi khuẩn này. Ngoài ra, những thay đổi về môi trường, khẩu phần thức ăn thay đổi đột ngột như cho ăn quá nhiều, thức ăn chứa quá nhiều protein và năng lượng cũng là những nguyên nhân gây bệnh. Hoặc do vận động quá mức đã làm chậm nhu động ruột, giữ lại lâu các vi khuẩn trong ruột làm tăng sự hấp thụ của độc tố. Carbonhydrate không tiêu hóa được là môi trường thuận lợi cho C. perfringens phát triển nhanh chóng. Một số tác giả khác lại cho rằng C. perfringens thừờng xuyên sống cộng sinh ở dạ dày. Bình thường các vi khuẩn này cũng có nhiều ở ruột già, nhưng trong những điều kiện thuận lợi thì nó phát triển quá mức, có thể xâm nhập lên ruột non và sản sinh ra một lượng lớn độc tố ruột gây nhiễm độc máu và trở thành tác nhân chính gây bệnh. 1.2.5. Phân loại các type độc tố của C. perfringens [14] Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn C. perfringens sản sinh hơn 17 loại độc tố khác nhau như: độc tố alpha (α), beta (β), epsilon (ε), iota (i), beta 2, enterotoxin, theta, vv…. Dựa vào khả năng sản sinh 4 loại độc tố chính (alpha, beta, epsilon, SVTH: Mai Thị Ly Na 10 GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội iota) người ta phân chia vi khuẩn C. perfringens thành 5 type độc tố (toxinotype) khác nhau (A, B, C, D, E). Trong đó, type A sản sinh độc tố alpha; type B sản sinh độc tố alpha, beta, epsilon; type C sản sinh độc tố alpha, beta; type D sản sinh độc tố alpha, epsilon và type E sản sinh độc tố alpha và iota. Bảng 1.1. Các type độc tố của vi khuẩn C. perfringens Độc tố chủ yếu C. perfringens Type Alpha Beta Epsilon Iota A + - - - B + + + - C + + - - D + - + - E + - - +  Alpha toxin (Gene mã hóa là cpa - Gene này nằm trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn): Đây là loại độc tố gây chết chính, có hoạt tính enzyme phospholipase C. Nó có khả năng thủy phân màng phospholipid của các loại tế bào khác nhau, làm tan màng hoặc tạo ra dạng cytotoxicity. Vai trò của độc tố là gây xuất huyết, hoại tử với hoạt tính kết dính tiểu cầu và ảnh hưởng đến tính thấm của mao mạch. Alpha toxin tinh chế có khối lượng phân tử là 43 kDa và pH ở điểm đẳng điện là 5,4. Năm 1989, ba phòng thí nghiệm ở Anh, Hoa Kỳ và Nhật Bản đã đồng thời có báo cáo về việc nhân dòng gene alpha toxin từ C. perfringens. Titball và cộng sự ở Anh đã chèn đoạn gene mã hóa độc tố alpha của vi khuẩn này vào plasmid của E. coli và phát hiện vi khuẩn E. coli mang plasmid tái tổ hợp có phản ứng phân giải lecithinase trên môi trường Egg yolk. Các gene mã hóa cho một loại protein có khối lượng 44,5 kDa và dường như giống với alpha toxin cũng được mô tả. TSO và Seibel tại Hoa Kỳ cũng với phương pháp tương tự đã phát hiện độc tố alpha được sản xuất từ plasmid của các sinh vật có phản ứng dung huyết trên môi trường thạch máu. Họ đã tìm thấy một đoạn gene dài 2 kb chèn vào plasmid của C. perfringens có chứa một chuỗi dài 1197 nucleotide mã hóa cho 399 amino acid với khối lượng GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội 11 SVTH: Mai Thị Ly Na phân tử là 43 kDa. Okabe và cộng sự ở Nhật Bản cũng đã thành công trong việc nhân dòng gene vô tính alpha toxin của C. perfringens và cũng cho biết chiều dài của gene cpa và trình tự acid amin trùng với hai nghiên cứu nói trên.  Beta toxin (Gene mã hóa là Cpb - nằm trên plasmid của vi khuẩn): Đây là loại độc tố gây chết người lớn, được sản xuất bởi cả type B và C. Beta toxin là một protein mẫn cảm cao với trypsin, gây hoại tử tế bào biểu mô ruột và tế bào màng trong ruột. Ngoài ra, độc tố beta còn tác động đến mô thần kinh làm ảnh hưởng đến trao đổi Ca2+ của màng gây ra rối loạn chức năng thần kinh bình thường. Loại độc tố này có thể được thu hồi từ môi trường lỏng và tinh chế bằng phương pháp sắc ký ái lực, sử dụng một cột có chứa kẽm nhiệt phân, cột thứ hai bằng nhựa vinyl ưa nước. Độc tố beta tinh chế có trọng lượng phân tử 40 kDa và pH đẳng điện là 5,6. Gene mã hóa cpb gồm 1113 nucleotid mã hóa cho 371 amino acid. Nó có tính chất tương tự alpha toxin, do đó rất khó để tách riêng hai loại độc tố này. Beta toxin có độc tính rất mạnh: Khi tiêm vào chuột gây tăng huyết áp và nhịp tim, liều gây chết LD50 cho chuột trưởng thành là 310 và 4500 ng/kg; và chỉ cần 2 ng độc tố này có thể gây bệnh trên lợn con.  Epsilon toxin (Etx - nằm trên plasmid): Epsilon toxin được sản sinh ra dưới dạng 1 tiền độc tố và được hoạt hóa bằng men proteolytic ở lượng thấp. Đích của độc tố này là nhóm lipid: cholesterol và sphingolipid có mặt trên màng tế bào của động vật Eukaryote, vì vậy độc tố này tập trung ở não và thận. Độc tố gây hoại tử và gây chết. Epsilon toxin được tạo ra bởi vi khuẩn C. perfringens type B và type D. Nó là một protein gồm 311 acid amin với trọng lượng phân tử là 34,25 kDa. Loại độc tố này chủ yếu ảnh hưởng đến ruột bằng việc tăng tính thấm của thành mạch. Do đó, tăng cường sự hấp thu độc tố và đóng vai trò như là một chất độc gây chết người. Sau khi lưu thông vào các cơ quan bên trong cơ thể, nó gây sưng thận, phù nề ở phổi, màng ngoài tím và làm cho lượng chất lỏng dư thừa. Ảnh hưởng của việc tăng tính thấm thành mạch có thể được chứng minh bằng cách tiêm loại độc tố này vào một vị trí sau đó nó sẽ đi vào hệ tuần hoàn. Buxton đã GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội 12 SVTH: Mai Thị Ly Na đề xuất một cơ chế hoạt động của độc tố epsilon trực tiếp hoặc gián tiếp liên quan đến hệ thống adenylcyclase (hệ thống xúc tác tổng hợp AMP mạch vòng từ ATP) trong các tế bào bị ảnh hưởng. Kĩ thuật ELISA đã phát hiện được độc tố epsilon và được đề xuất để thay thế việc gây chết chuột và thử nghiệm cho việc sản xuất một loại kháng thể đặc hiệu.  Iota toxin (Itx - nằm trên plasmid) có 2 vị trí: vị trí gắn độc tố với tế bào biểu mô đích (Ib) và vị trí hoạt hóa enzyme (Ia). Sau khi độc tố được gắn vào thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào, Ia xâm nhập vào tế bào chất và gây chết tế bào. Độc tố làm tăng tính thấm của mao mạch và tác động lên màng tế bào. Độc tố này được tạo ra bởi vi khuẩn C. perfringens type E. Ia và Ib được phân cách bởi điểm đẳng điện. Ia có pH đẳng điện là 5,2; khối lượng phân tử 47,5 kDa. Và Ib có pH đẳng điện là 4,2; khối lượng phân tử là 71,5 kDa. Một hỗn hợp gồm cả hai thành phần Ia và Ib cần thiết cho hoạt động sinh học quan trọng được đo bằng việc gây chết. Chuỗi nhẹ Ia là một enzyme làm nhiệm vụ tổng hợp ADP, cơ vân, và protein actin không co rút. Ngoài 4 độc tố chính trên, có 2 độc tố cũng đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh là độc tố beta 2 và enterotoxin: Beta 2 là độc tố được mô tả nhiều nhất trong thời gian gần đây, gây bệnh về ruột cho động vật nuôi, đặc biệt là heo con và ngựa. Độc tố thường gây triệu chứng tiêu chảy có liên quan đến kháng sinh và tiêu chảy tự nhiên. Enterotoxin là độc tố được mô tả nhiều nhất khi nói đến C. perfringens, có tác động đến tế bào biểu mô và gây bệnh về đường ruột. Độc tố gây tiêu chảy làm mất nước và chất điện giải trong cơ thể. Enterotoxin được sản sinh trong quá trình hình thành bào tử của vi khuẩn và độc tố sẽ tăng khi tế bào sinh dưỡng bị phá hủy. SVTH: Mai Thị Ly Na 13 GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội  Mỗi type độc tố khác nhau gây ra các loại bệnh khác nhau trên các đối tượng khác nhau. Các type độc tố gây bệnh được trình bày ở bảng 1.2. Bảng 1.2. Các type độc tố gây bệnh của C. perfringens Type A B C Bệnh Đối tượng gây bệnh - Hoại thư sinh hơi - Người, động vật, gà - Viêm ruột hoại tử - Heo, gà. - Viêm ruột nhiễm độc máu - Bò và cừu non - Ngộ độc thực phẩm - Người - Viêm ruột kết - Ngựa - Viêm dạ dày xuất huyết - Chó - Bệnh lỵ - Cừu con - Viêm ruột nhiễm độc máu - Ngựa con, cừu và dê - Viêm ruột hoại tử - Người - Viêm ruột nhiễm độc máu - Cừu, bê con, cừu con, heo con D - Viêm ruột nhiễm độc máu - Cừu con, cừu (mềm thận), dê và trâu bò E - Viêm ruột - Thỏ - Viêm ruột nhiễm độc máu - Bê con và cừu con 1.3. Những hiểu biết về gene 16S RNA 1.3.1. Giới thiệu rRNA (RNA ribosome) rRNA kết hợp với protein chuyên biệt cấu tạo nên ribosome, một thành phần của bộ máy dịch mã của tế bào. rRNA chiếm đến 80% tổng số RNA của tế bào. Ở các ribosome khác nhau có các rRNA khác nhau, chúng được đặc trưng bởi hệ số lắng S. Tùy theo hệ số lắng S, rRNA được chia thành nhiều loại. Ribosome của mọi 14 GVHD: TS. Lê Lập TS. Vũ Ngọc Bội SVTH: Mai Thị Ly Na tế bào đều gồm một tiểu đơn vị nhỏ và một tiểu đơn vị lớn. Mỗi tiểu đơn vị có mang nhiều protein và rRNA có kích thước khác nhau. - Ở eukaryote: Ribosome có hệ số lắng khi ly tâm là 80S, gồm hai tiểu đơn vị: + Tiểu đơn vị lớn (60S) có rRNA 28S; 5,8S; 5S. + Tiểu đơn vị nhỏ (40S) có rRNA 18S. - Ở prokaryote và lục lạp, ty thể có hệ số lắng khi ly tâm là 70S, gồm 2 tiểu đơn vị + Tiểu đơn vị lớn (50S) có rRNA 23S; 5S. + Tiểu đơn vị nhỏ (30S) chỉ có rRNA 16S. RNA ribosom có cấu trúc bậc 1 (mạch thẳng) và cấu trúc bậc 2. Trong ribosome, các rRNA tồn tại ở dạng cấu trúc bậc 2. RNA ribosom có cấu tạo là một sợi xoắn có nhiều vùng liên kết đôi theo nguyên tắc bổ sung: A liên kết với U, G liên kết với C và có khi G liên kết với U. Các RNA ribosome là sự kết hợp của rRNA, các enzyme và protein cấu trúc. Hình 1.3. Cấu trúc RNA ribosome