Tài liệu KHẢO SÁT VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÂY LỤC BÌNH [EICHHORNIA CRASSIPES (MART.) SOLMS]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ĐÀO THỊ KIM ANH KHẢO SÁT VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÂY LỤC BÌNH [EICHHORNIA CRASSIPES (MART.) SOLMS] LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH ĐÀO THỊ KIM ANH KHẢO SÁT VỀ MẶT THỰC VẬT HỌC VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÂY LỤC BÌNH [EICHHORNIA CRASSIPES (MART.) SOLMS] Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS. Trương Thị Đẹp TS. Nguyễn Tú Anh Thành phố Hồ Chí Minh - 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được các tác giả công bố trong bất kì công trình nào. Các trích dẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của những tác giả khác; tài liệu tham khảo trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng quy định. TP. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 11 năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Đào Thị Kim Anh LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Trương Thị Đẹp, TS. Nguyễn Tú Anh - người đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô của Trường, Phòng Sau đại học, Khoa Sinh học, bộ môn Sinh học thực nghiệm - Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh, bộ môn Thực vật, bộ môn Vi sinh - Kí sinh - Trường Đại học Y dược TP. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn này. Qua đây, tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã giúp đỡ, động viên, cổ vũ tinh thần cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này. TP. Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 11 năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Đào Thị Kim Anh MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 I. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI ....................................................................................... 1 II. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ............................................................................. 1 III. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................ 1 IV. NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU ........................................................................... 2 V. PHẠM VI NGHIÊN CỨU ............................................................................... 2 VI. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN ..................................................... 2 Chương 1. TỔNG QUAN ..................................................................................... 3 1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CỦA CÂY LỤC BÌNH .............................. 3 1.1.1. Phân loại ................................................................................................. 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật học............................................................................. 3 1.1.3. Phân bố ................................................................................................... 3 1.1.4. Thành phần hóa học ................................................................................ 4 1.1.5. Bộ phận dùng .......................................................................................... 4 1.1.6. Tác dụng dược lí ..................................................................................... 4 1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÂY LỤC BÌNH .................................................................... 5 1.2.1. Một số nghiên cứu trên thế giới về hoạt tính kháng vi sinh vật của Lục bình ...................................................................................... 5 1.2.2. Nghiên cứu ở Việt Nam về hoạt tính kháng vi sinh vật của Lục bình.................................................................................................... 6 1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT HOẠT CHẤT TỪ DƯỢC LIỆU .......................................................................................................... 7 1.3.1. Các quá trình xảy ra trong chiết xuất ..................................................... 7 1.3.1.1. Sự hòa tan ......................................................................................... 7 1.3.1.2. Sự khuếch tán ................................................................................... 8 1.3.1.3. Sự thẩm thấu .................................................................................... 8 1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất ...................................... 8 1.3.2.1. Nguyên liệu ...................................................................................... 8 1.3.2.2. Dung môi .......................................................................................... 9 1.3.2.3. Kĩ thuật chiết .................................................................................. 10 1.3.3.1. Phương pháp ngâm ........................................................................ 10 1.3.3.2. Phương pháp ngấm kiệt ................................................................. 11 1.3.3.3. Phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng ........................................ 11 1.4. MỘT SỐ VI SINH VẬT GÂY BỆNH ........................................................ 12 1.4.1. Staphylococcus aureus .......................................................................... 12 1.4.2. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) .......................... 12 1.4.3. Streptococcus faecalis ........................................................................... 13 1.4.4. Escherichia coli ..................................................................................... 13 1.4.5. Pseudomonas aeruginosa ..................................................................... 13 1.4.6. Candida albicans .................................................................................. 14 1.5. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG VI SINH VẬT .............................................................................................. 14 1.5.1. Phương pháp khuếch tán ...................................................................... 14 1.5.2. Phương pháp pha loãng ........................................................................ 14 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 15 2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................................. 15 2.1.1. Thời gian nghiên cứu ............................................................................ 15 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 15 2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ......................................................................... 15 2.2.1. Vật liệu khảo sát về thực vật học .......................................................... 15 2.2.2. Nguyên liệu chiết xuất ........................................................................... 15 2.2.3. Vi sinh vật thử nghiệm........................................................................... 16 2.2.4. Hóa chất ................................................................................................ 16 2.2.5. Môi trường nuôi cấy và thử hoạt tính kháng vi sinh vật ....................... 16 2.2.5.1. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật ..................................................... 16 2.2.5.2. Môi trường thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật ...................... 17 2.2.6. Thiết bị sử dụng ..................................................................................... 17 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 18 2.3.1. Phương pháp khảo sát về mặt thực vật học .......................................... 18 2.3.1.1. Đặc điểm hình thái ......................................................................... 18 2.3.1.2. Đặc điểm giải phẫu ........................................................................ 18 2.3.2. Phương pháp chiết xuất cao dược liệu ................................................. 19 2.3.2.1. Phương pháp chiết nguội ............................................................... 19 2.3.2.2. Phương pháp chiết nóng................................................................. 19 2.3.2.3. Phương pháp chiết phân đoạn ........................................................ 20 2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật .............................. 21 2.3.5. Phương pháp xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi sinh vật ................. 22 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................. 24 3.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC ................................................................... 24 3.1.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................ 24 3.1.2. Đặc điểm giải phẫu ............................................................................... 30 3.2. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT ................................... 38 3.2.1. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của dịch chiết ............................. 38 3.2.2. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao Lục bình sau khi chiết phân đoạn........................................................................................ 43 3.3. XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ TỐI THIỂU ỨC CHẾ SỰ PHÁT TRIỂN VI KHUẨN (MIC) .................................................................................. 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 49 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Chú giải ATCC American Type Culture Collection - Bộ sưu tập chủng chuẩn của Mĩ CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute - Tiêu chuẩn thử nghiệm tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh DMSO Dimethyl sulphoxide EtOH Ethanol OD Optical Density - Mật độ quang MHA Mueller - Hinton Agar MHB Mueller - Hinton Broth MIC Minimum Inhibitory Concentration - Nồng độ tối thiểu ức chế sinh trưởng vi sinh vật SDA Sabouraud Dextro Agar TP.HCM Thành phố Hồ Chí Minh TSA Trypticase Soy Agar TSB Trypticase Soy Broth DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Tỉ lệ khối lượng khô từng bộ phận của cây Lục bình .................................. 38 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của cao toàn phần ................. 39 Bảng 3.3. Tác động kháng khuẩn của cao EtOH từ căn hành với phương pháp chiết và dung môi khác nhau ................................................................. 42 Bảng 3.4. Tác động kháng khuẩn của các phân đoạn cao chiết từ căn hành của cây chưa ra hoa ở môi trường nước đứng .................................................... 43 Bảng 3.5. Tác động kháng khuẩn của các phân đoạn cao chiết toàn cây của cây đang ra hoa ở môi trường nước đứng .................................................... 43 Bảng 3.6. MIC của mẫu căn hành ở cây chưa ra hoa trong môi trường nước đứng ..... 44 Bảng 3.7. MIC của mẫu toàn cây ở cây đang ra hoa trong môi trường nước đứng ...... 45 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1. Phương pháp chiết nguội ............................................................................ 19 Hình 2.2. Phương pháp chiết nóng ............................................................................. 20 Hình 2.3. Sơ đồ chiết phân đoạn ................................................................................ 21 Hình 3.1. Cây Lục bình với lá mọc thành hình hoa thị .............................................. 25 Hình 3.2. Phiến lá hình thận hoặc hình tim ................................................................ 26 Hình 3.3. Lục bình ở các môi trường sống khác nhau ............................................... 26 Hình 3.4. Các cá thể Lục bình nối với nhau nhờ căn hành ......................................... 27 Hình 3.5. Lục bình với rễ chùm .................................................................................. 27 Hình 3.6. Rễ Lục bình ................................................................................................ 27 Hình 3.7. Cụm hoa ...................................................................................................... 28 Hình 3.8. Hoa màu xanh nhạt hoặc xanh tím ............................................................. 28 Hình 3.9. Các phiến rời của bao hoa .......................................................................... 29 Hình 3.10. Đài và tràng hoa ......................................................................................... 29 Hình 3.11. Hoa có 6 nhị (3 dài, 3 ngắn) ..................................................................... 29 Hình 3.12. Hạt phấn .................................................................................................... 30 Hình 3.13. Bầu noãn cắt ngang .................................................................................. 30 Hình 3.14. Vi phẫu rễ Lục bình ................................................................................... 32 Hình 3.15. Một phần vi phẫu căn hành ở các môi trường sống khác nhau ................. 33 Hình 3.16. Vi phẫu căn hành ...................................................................................... 34 Hình 3.17. Vi phẫu phiến lá ......................................................................................... 35 Hình 3.18. Một phần vi phẫu cuống lá ....................................................................... 36 Hình 3.19. Một phần vi phẫu phần phình cuống lá .................................................... 37 Hình 3.20. Tác động của cao chiết nguội EtOH 96% trên S. aureus .......................... 41 Hình 3.21. Tác động của cao chiết nguội EtOH 96% trên S. faecalis......................... 41 Hình 3.22. MIC của mẫu căn hành ở cây chưa có hoa trong môi trường nước đứng ............ 46 Hình 3.23. MIC của mẫu toàn cây ở cây có hoa trong môi trường nước đứng ...................... 46 1 MỞ ĐẦU I. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI Kháng sinh là một trong những nhóm thuốc được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh nhiễm trùng. Kháng sinh có nguồn gốc tổng hợp hay bán tổng hợp thường có độc tính cao, nhiều tác dụng phụ không mong muốn. Bên cạnh đó, thực trạng kháng thuốc kháng sinh ngày càng tăng, đã và đang trở thành một thách thức đối với các bác sĩ lâm sàng. Do đó, các nhà khoa học luôn nỗ lực tìm kiếm các hoạt chất mới có tính kháng vi sinh vật, đặc biệt là các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc thực vật. Vì hợp chất thiên nhiên thường an toàn trong sử dụng và hiện tượng kháng thuốc xảy ra chậm hơn. Cây Lục bình [Eichhornia crassipes (Mart.) Solms] có xuất xứ từ Brasil, được du nhập và trồng làm cảnh ở Hà Nội (Việt Nam) từ năm 1905. Với đặc điểm sinh sản rất nhanh, Lục bình lan ra khắp nơi một cách nhanh chóng và phổ biến ở ao, hồ, kênh, rạch trong cả nước. Lục bình từ lâu đã được người dân biết đến như là một loài cây có nhiều công dụng: dùng làm thức ăn cho người, vật nuôi, làm phân bón hoặc dùng làm thuốc chữa sưng tấy, viêm đau. Ngoài ra, nhờ khả năng hấp thu một số kim loại nặng mà Lục bình được sử dụng để giảm ô nhiễm môi trường, đặc biệt là môi trường nước. Tuy nhiên, khi Lục bình sinh sản quá mức, chúng có thể gây tắc nghẽn dòng chảy. Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về công dụng của cây Lục bình nhưng phần lớn đều tập trung vào tác dụng xử lí môi trường và chống ô nhiễm nguồn nước. Trên thế giới cũng có một số nghiên cứu đề cập đến khả năng kháng vi sinh vật của Lục bình. Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng kháng vi sinh vật của loài cây này. Vì vậy, đề tài này tiến hành khảo sát về mặt thực vật học và tác dụng kháng vi sinh vật của cây Lục bình [Eichhornia crassipes (Mart.) Solms]. II. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Sàng lọc những dược liệu có nguồn gốc từ thực vật thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm. III. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Cây Lục bình [Eichhornia crassipes (Mart.) Solms]. 2 IV. NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU 1. Mô tả đặc điểm hình thái và giải phẫu của cây Lục bình ở môi trường nước đứng và môi trường nước chảy, bổ sung những điểm khác biệt của Lục bình ở hai môi trường (nếu có); tìm hiểu nguyên nhân ảnh hưởng đến sự sai khác. 2. Khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của cao chiết từ cây Lục bình với các dung môi khác nhau. Từ đó, xác định nồng độ ức chế tối thiểu của cao dược liệu đối với các chủng vi sinh vật trên. V. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Khảo sát về mặt thực vật học và khả năng kháng vi sinh vật của Lục bình được thu hái tại sông Sài Gòn (TP.HCM) và các ao nước đọng ở Bình Dương, tại các vị trí môi trường nước đứng và môi trường nước chảy trên các chủng vi sinh vật thử nghiệm gồm các chủng vi khuẩn chuẩn của ATCC được lưu giữ tại Bộ môn Vi sinh – Kí sinh (Khoa Dược – Trường Đại học Y dược TP.HCM): Staphylococcus aureus ATCC 29213, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) ATCC 43300, Streptococcus faecalis ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 và nấm men Candida albicans ATCC 10231. VI. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 1. Ý nghĩa khoa học: góp phần xây dựng thư viện dữ liệu về các cao chiết có khả năng kháng vi sinh vật có nguồn gốc từ thực vật ở Việt Nam. 2. Ý nghĩa thực tiễn: cung cấp số liệu thực nghiệm nhằm giải thích dựa trên những bằng chứng khoa học một số bài thuốc dân gian sử dụng Lục bình để chữa một số bệnh nhiễm khuẩn ngoài da. Kết quả của đề tài sẽ làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo đánh giá khả năng kháng khuẩn in vivo của cao chiết từ Lục bình. 3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC CỦA CÂY LỤC BÌNH 1.1.1. Phân loại Vị trí phân loại của cây Lục bình [3], [9] Giới Thực vật (Plantae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Hành (Liliopsida) Phân lớp Hành (Liliidae) Bộ Lục bình (Pontederiales) Họ Lục bình (Pontederiaceae) Chi Lục bình (Eichhornia) Loài Lục bình [Eichhornia crassipes (Mart.) Solms] Tên khác: Bèo tây, Bèo sen, Bèo Nhật Bản hay Lộc bình. Tên nước ngoài: Water hyacinth (Anh), Jacinthe d’eau (Pháp) [4], [8]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật học Cây thảo sống nhiều năm, nổi ở nước hoặc bám trên đất bùn, căn hành dài, mang một chùm rễ dài và rậm ở phía dưới. Kích thước cây thay đổi tùy theo môi trường sống có nhiều hay ít chất màu. Lá mọc thành hoa thị, có cuống phồng lên thành phao nổi, gân lá hình cung, phiến lá hình tròn hay hình tim. Cụm hoa bông hay chùy ở ngọn thân. Hoa không đều, màu xanh nhạt hay tím; đài và tràng cùng màu, dính liền với nhau ở gốc, cánh hoa trên có một đốm vàng; 6 nhị (3 dài, 3 ngắn); bầu trên, 3 ô, chứa nhiều noãn nhưng chỉ có một cái sinh sản. Quả nang [4], [8]. Lục bình thường ra hoa từ khoảng tháng 10 đến tháng 11 hàng năm [8]. 1.1.3. Phân bố Cây gốc ở Brasil, năm 1905 được đem về trồng làm cảnh ở Hà Nội. Về sau lan ra khắp nơi một cách nhanh chóng. Phổ biến ở các ao, hồ, kênh, rạch trong cả nước. Ngoài ra còn phân bố ở nhiều nước nhiệt đới trên thế giới, đặc biệt là các nước vùng 4 Nam Á và Đông Nam Á. Do khả năng tạo nhánh khỏe từ các chồi gốc, cây nhanh chóng phát triển thành những đám hay bè mảng lớn. Cây còn được nuôi trồng hạn chế trên các ao hồ thả cá, làm thức ăn cho lợn, trâu bò và là nguồn phân xanh tốt [4], [8]. Ở Bengal (Ấn Độ) người ta ước tính diện tích mặt nước có Lục bình chiếm giữ đến 30.000 hecta [8]. 1.1.4. Thành phần hóa học Toàn cây Lục bình chứa 92,6% là nước, 2,9% protein, 0,9% đường, 2,2% xơ, 1,4% tro – trong đó có 40,8% calci, 0,8% phospho, 0,86% carotenoid, 20% vitamin C. Thành phần vô cơ trong cây là SiO2, Ca, Mg, K, Na, Cl, Cu, Mn, Fe. Trong lá có Ca, Fe, P, Mg, Zn, Cu, Na, K, S. Ngoài ra, còn có các vitamin B2, B1, E, B6, B12, protein, acid béo tự do, đường, acid amin. Trong hoa có delphinidin diglucosid [4], [8]. 1.1.5. Bộ phận dùng Dùng phần cuống lá phồng lên thành phao nổi để làm thuốc. Sau khi lấy cây về, rửa sạch, bỏ thân và rễ, chỉ lấy lá, chủ yếu là phần phình của cuống lá. Có nơi dùng toàn cây [6]. 1.1.6. Tác dụng dược lí Vị nhạt, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, chống nóng, lợi tiểu, giải độc, giảm sưng, giảm đau. Dùng chữa sưng tấy, viêm đau như sưng bắp chuối, bị áp xe sau khi tiêm, sưng nách, viêm khớp ngón tay, viêm hạch: lá tươi cả cuống, rửa sạch, thêm muối (8 – 10g muối cho 100g lá), giã nát, đắp lên chỗ sưng, băng lại, sau 10 – 12 giờ tháo ra, thay thuốc khác, làm 2 – 3 lần. Nên đắp cách đêm, từ tối hôm trước đến sáng hôm sau. Trong khi chữa không phải tiêm hay uống thuốc kháng sinh [4], [8]. Ở Ấn Độ, hoa được dùng làm thuốc chữa bệnh về đường hô hấp. Người dân ta còn dùng Lục bình làm thuốc chữa các vết thương trên cơ thể bị nhiễm chất độc hóa học. Ở Trung Quốc, người ta dùng toàn cây làm thuốc trị cảm mạo phát nhiệt, tiểu tiện đỏ đau, mụn nhọt sưng đỏ [4], [8]. 5 1.2. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CÂY LỤC BÌNH 1.2.1. Một số nghiên cứu trên thế giới về hoạt tính kháng vi sinh vật của Lục bình Bikash Baral và Bijaya Laxmi Maharjan (2011) khi khảo sát năm loài thực vật ngoại lai ở Nepal đã phát hiện khả năng kháng khuẩn của chúng, trong đó có Lục bình. Dịch chiết methanol và dịch chiết nước của Lục bình được thử tác dụng trên mười loài vi khuẩn và chín loài nấm. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng vi sinh vật của các dịch chiết thay đổi tùy thuộc vào loại dung môi sử dụng, phương pháp chiết xuất và chủng vi sinh vật [13]. Một nghiên cứu khác của Bikash Baral và cộng sự (2011) đã cho thấy hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của Lục bình khi sử dụng chloroform và ethanol để chiết xuất. Dịch chiết nóng với chloroform cho thấy vùng ức chế vi khuẩn tăng trưởng có đường kính < 13 mm, ở nấm có đường kính vòng kháng < 12 mm; trong khi dịch chiết lạnh có khả năng kháng nấm với đường kính vòng kháng < 13 mm nhưng lại không có hoạt tính kháng khuẩn. Tương tự, dịch chiết nóng với ethanol có đường kính vùng ức chế vi khuẩn tăng trưởng < 19 mm, ở nấm có đường kính vòng kháng < 20 mm, trong khi dịch chiết lạnh cho kết quả đường kính vòng kháng khuẩn < 10 mm và khả năng kháng nấm với vùng ức chế nấm tăng trưởng có đường kính < 14 mm. Nghiên cứu cho thấy phương pháp chiết nóng dùng để chiết xuất các hợp chất kháng vi sinh vật ở cây Lục bình có kết quả tốt hơn so với phương pháp chiết lạnh [14]. P. Lalitha và cộng sự (2012) nghiên cứu dịch chiết từ lá Lục bình tươi với các dung môi khác nhau, tất cả đều có hoạt tính kháng vi sinh vật đáng kể khi thử trên một số chủng vi khuẩn và vi nấm (Rhodospirillum rubrum, Aspergillus fumigates, Micrococcus luteus, Monoscus ruber). Trong số các dung môi thử nghiệm thì dịch chiết Lục bình với etyl acetate có khả năng kháng khuẩn tốt nhất [16]. Sanaa Shanab và cộng sự (2012) nghiên cứu hoạt tính sinh học và khả năng chống oxy hóa của Lục bình. Dịch chiết methanol cho thấy cây chứa các hợp chất có 6 tính kháng khuẩn và kháng nấm, trong đó hoạt tính kháng khuẩn cao đối với S. faecalis với đường kính vòng kháng khuẩn khoảng 14 ± 0,2 mm [21]. Hiba Hazim Hamid và cộng sự (2013) nghiên cứu khả năng chống oxi hóa và kháng khuẩn của một số chiết xuất từ lá Lục bình. Dịch chiết với ethanol có hoạt tính kháng khuẩn rõ ràng đối với tất cả các chủng vi khuẩn thử nghiệm, ức chế tốt nhất S. aureus (đường kính vùng ức chế 20 mm). Dịch chiết với nước thể hiện hoạt tính kháng khuẩn rất yếu, trong khi chiết xuất với chloroform cho hoạt tính kháng khuẩn tốt đối với S. faecalis với vùng ức chế là 16 mm [17]. P. Lalitha và cộng sự (2013) nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của các dịch chiết từ Lục bình. Kết quả thể hiện khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của cây đối với chủng thử nghiệm, trong đó khả năng kháng khuẩn tốt hơn so với khả năng kháng nấm. Dịch chiết acetone của Lục bình thể hiện hoạt tính cao hơn so với các dung môi khác [19]. Từ các công trình trên cho thấy, dịch chiết từ cây Lục bình có chứa các chất kháng khuẩn và kháng nấm. Tuy nhiên, mức độ kháng vi sinh vật lại phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: dung môi chiết xuất, phương pháp chiết xuất và loại vi sinh vật thử nghiệm. 1.2.2. Nghiên cứu ở Việt Nam về hoạt tính kháng vi sinh vật của Lục bình Các nghiên cứu về khả năng kháng vi sinh vật của Lục bình ở Việt Nam ít được quan tâm. Chỉ có một nghiên cứu của Trần Đình Bình và cộng sự (2012) khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của một số loài cây thuốc ở Huế, tác giả đã tìm thấy 18 cây thuốc thường dùng trong dân gian, trong đó Lục bình có hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn khác nhau. Kết quả cho thấy dịch chiết của các cây thuốc ở nồng độ 0,05 - 0,1 g/ml có tác dụng kháng P. aeruginosa, S. aureus, E. coli [1]. Theo nghiên cứu của các nhà khoa học trong và ngoài nước cho thấy Lục bình mang lại nhiều tác dụng tốt nhờ thành phần hóa học đa dạng với các hợp chất có khả năng kháng được nhiều chủng vi sinh vật gây bệnh ở người. Trong đời sống, từ lâu người dân đã biết dùng Lục bình để chữa trị những vết thương ngoài da. Tuy nhiên, Việt Nam lại chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng 7 kháng vi sinh vật của cây Lục bình. Dù Lục bình du nhập vào Việt Nam khá lâu nhưng đến nay các nghiên cứu vẫn thường tập trung vào khả năng xử lí môi trường hoặc làm thức ăn cho vật nuôi. Vì vậy, đánh giá khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của Lục bình cần được thực hiện để có thể khai thác một cách hiệu quả loài cây này như một ứng viên dược phẩm tiềm năng. Dược liệu có nguồn gốc từ thực vật được sử dụng bằng nhiều cách khác nhau như sao thuốc, sắc thuốc, chưng thuốc, hãm thuốc, ngâm thuốc, xông thuốc,… trong đó chiết xuất hoạt chất từ dược liệu là một trong những phương pháp được dùng khá phổ biến. 1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT HOẠT CHẤT TỪ DƯỢC LIỆU Chiết là phương pháp sử dụng dung môi để tách các chất tan ra khỏi một hỗn hợp các chất [6]. Trong quá trình chiết các chất từ các tổ chức sống, chất tan có thể nằm bên trong tế bào, cách biệt với môi trường bên ngoài bởi vách tế bào. Vì vậy, các chất sau khi hòa tan phải vượt qua vách tế bào để đi vào dịch chiết. Do vậy, quá trình chiết chất tan từ các tổ chức sinh học thường được gọi là quá trình “chiết xuất” [6]. 1.3.1. Các quá trình xảy ra trong chiết xuất Trong chiết xuất có ba quá trình quan trọng đồng thời xảy ra là: sự hòa tan, sự khuếch tán và sự thẩm thấu qua vách tế bào [6], [7]. 1.3.1.1. Sự hòa tan Khi cho dược liệu tiếp xúc với dung môi, dung môi sẽ thấm vào tế bào dược liệu. Các chất tan sẽ hoà tan vào dung môi xung quanh nó tạo thành dung dịch. Sự hoà tan chủ yếu là quá trình vật lý trong đó chất tan được solvat hóa và kéo vào dung môi. Tuy nhiên, quá trình hóa học đôi khi cũng xảy ra như khi hoà tan các chất kiềm trong dung môi có tính acid hay ngược lại [6], [7]. Quá trình hoà tan xảy ra nhanh hay chậm phụ thuộc vào khả năng hoà tan của chất tan trong dung môi, diện tích bề mặt tiếp xúc của chất tan với dung môi, nhiệt độ và sự khuếch tán của chất tan trong dung môi [6], [7]. 8 1.3.1.2. Sự khuếch tán Khi cho dung môi tiếp xúc với các tiểu phần dược liệu, ở những nơi dung môi tiếp xúc với chất tan, dung dịch có nồng độ cao hơn những nơi không hoặc ít tiếp xúc với chất tan, tạo nên sự chênh lệch nồng độ. Quá trình khuếch tán xảy ra nhằm cân bằng sự chênh lệch nồng độ này. Các phân tử chất tan sẽ di chuyển từ nơi có nồng độ cao tới nơi có nồng độ thấp hơn, nhờ vậy chất tan có mặt đồng đều trong dung dịch. Sự khuếch tán trong dung dịch xảy ra do chuyển động nhiệt của phân tử (chuyển động Brown) chất tan cũng như của dung môi. Sự khuếch tán thúc đẩy quá trình hoà tan và kéo chất tan từ các tế bào bị phá vỡ ra khỏi tế bào, đi vào dịch chiết [6], [7]. Các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình khuếch tán gồm: sự chênh lệch nồng độ, nhiệt độ và độ nhớt của dung môi [6], [7]. 1.3.1.3. Sự thẩm thấu Vách tế bào thực vật có cấu tạo cellulose và hemicellulose với những kênh bào tương (các ống trao đổi) nối giữa các tế bào. Khi khuếch tán qua các kênh bào tương, đường kính của các kênh sẽ quyết định kích thước và vận tốc của những phân tử có thể qua màng. Các chất có kích thước nhỏ hơn kênh bào tương đa số là các chất chuyển hóa thứ cấp sẽ đi qua dễ dàng trong khi các chất có phân tử lượng lớn như protein, polysaccharid,... sẽ khó qua hơn và được giữ lại trong tế bào. Như vậy, sự thẩm thấu qua vách tế bào làm cho quá trình hoà tan, chiết xuất có tính chọn lọc hơn. Quá trình hoà tan, chiết xuất giúp kéo chất tan ra khỏi các tế bào còn nguyên vẹn và đi vào dịch chiết. So với sự hoà tan đơn giản, sự hòa tan, chiết xuất xảy ra chậm hơn và chọn lọc hơn [6], [7]. Các yếu tố chính ảnh hưởng tới quá trình thẩm thấu gồm: sự chênh lệch nồng độ giữa bên trong và bên ngoài tế bào, cấu trúc của vách tế bào, kích thước dược liệu, kích thước chất tan, nhiệt độ, độ nhớt của dung môi [6], [7]. 1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất 1.3.2.1. Nguyên liệu Đặc điểm nguyên liệu: độ dày của vách tế bào hay chiều dài của các kênh bào tuơng càng lớn thì quá trình hoà tan chiết xuất xảy ra càng chậm. Nếu các nguyên liệu 9 là gỗ thì quá trình chiết sẽ chậm hơn các nguyên liệu là lá hay cánh hoa. Đường kính các kênh bào tương càng lớn, các chất đi qua vách tế bào càng dễ dàng. Quá trình chiết xuất càng xảy ra nhanh [6], [7]. Kích thước nguyên liệu: nguyên liệu càng được chia nhỏ thì quá trình hoà tan đơn giản càng tăng và thời gian khuếch tán chất tan vào dịch chiết sẽ giảm, thời gian thẩm thấu qua vách tế bào giảm sẽ giúp quá trình chiết nhanh hơn. Tuy nhiên, khi chia nhỏ nguyên liệu, tính chọn lọc của quá trình hòa tan, chiết xuất sẽ giảm, dịch chiết xuất hiện nhiều tạp chất. Vì vậy, lượng cao chiết tăng lên nhiều, đồng thời thành phần dịch chiết phức tạp và khó tách các chất thành phần [6], [7]. Chất tan: độ tan trong dung môi của chất tan càng lớn, quá trình chiết xảy ra càng nhanh. Kích thước phân tử chất tan càng lớn, tốc độ khuếch tán và khả năng qua vách tế bào càng giảm. Dạng thù hình của chất tan có ảnh hưởng nhiều đến tốc độ hoà tan. Các chất tồn tại dưới dạng vô định hình sẽ hoà tan nhanh hơn do bề mặt tiếp xúc với dung môi lớn, lực liên kết giữa các phân tử trong pha rắn nhỏ, dễ bị phá vỡ. Đa số các chất tan trong tế bào dược liệu khô tồn tại dưới dạng vô định hình, trong một hỗn hợp gồm nhiều chất nên sự hoà tan xảy ra nhanh hơn so với dạng tinh thể hay đơn chất. Tuy nhiên, cũng có trường hợp các chất khác làm cản trở sự hoà tan do tạo phức hợp khó tan với chất tan như trường hợp tannat alkaloid hay ngăn cản sự tiếp xúc của dung môi với chất tan như khi chiết dược liệu nhiều chất béo với dung môi phân cực; chất nhầy, protein khi chiết dược liệu với dung môi không phân cực [6], [7]. 1.3.2.2. Dung môi Khả năng hoà tan của dung môi: khả năng hoà tan của dung môi với chất tan càng lớn, quá trình hoà tan càng nhanh, làm cho quá trình chiết xảy ra nhanh hơn. Khả năng hoà tan các chất trong các dung môi khác nhau thì khác nhau, phụ thuộc nhiều vào bản chất của chất tan và của dung môi. Khả năng hoà tan chất tan của dung môi có thể dự đoán được dựa vào độ phân cực của dung môi, theo nguyên tắc: dung môi phân cực hoà tan các chất phân cực, dung môi kém phân cực hoà tan các chất kém phân cực. Độ phân cực của dung môi được đánh giá bằng hằng số điện môi. Hằng số điện môi càng lớn, dung môi càng phân cực [6], [7]. 10 Độ nhớt của dung môi: độ nhớt của dung môi càng thấp, khả năng thấm vào tế bào, sự khuếch tán của chất tan và dung môi xảy ra càng dễ dàng, quá trình chiết xảy ra càng nhanh và ngược lại [6], [7]. Sự thấm dung môi qua vách tế bào: vách tế bào thực vật cấu tạo bởi cellulose. Ở trạng thái tươi, nước trên vách cũng như trong tế bào ngăn cản không cho dung môi kém phân cực, ít tan trong nước, thấm vào tế bào hay tiếp xúc với chất tan, làm quá trình chiết với dung môi này khó khăn hơn. Ở tế bào khô, lớp nước ngăn cách này đã bị bay hơi mất nên quá trình chiết sẽ dễ dàng hơn với dung môi kém phân cực [6], [7]. 1.3.2.3. Kĩ thuật chiết Sự khuấy trộn: sự khuấy trộn làm tăng quá trình cân bằng nồng độ của dung dịch bên ngoài các tiểu phần dược liệu, giúp “giải toả” lớp dịch chiết đậm đặc ngay sát tiểu phần dược liệu bằng phương pháp cơ học. Sự chênh lệch nồng độ giữa trong và ngoài tế bào tăng lên nên quá trình thẩm thấu xảy ra nhanh hơn [6], [7]. Nhiệt độ: tăng nhiệt độ làm tăng khả năng hoà tan của chất tan vào dung môi và đẩy nhanh quá trình chiết xuất do làm tăng chuyển động nhiệt của phân tử và giảm độ nhớt của dung môi, dẫn tới tăng khả năng và tốc độ hoà tan, tăng quá trình khuếch tán, làm cân bằng nồng độ [6], [7]. Áp suất: tăng áp suất sẽ làm tăng tốc độ thấm dung môi vào nguyên liệu. Tăng áp suất thường đi kèm với tăng nồng độ dung dịch [6], [7]. 1.3.3. Phương pháp chiết xuất dược liệu Phương pháp chiết xuất thường chỉ tác động đến các yếu tố bên ngoài, nhằm đạt được hiệu quả chiết xuất cao trong thời gian ngắn đối với từng loại nguyên liệu. Tùy theo đặc điểm của từng loại dược liệu để chọn phương pháp chiết xuất thích hợp. Một số phương pháp chiết thường gặp: phương pháp ngâm, phương pháp ngấm kiệt, phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng… [6] 1.3.3.1. Phương pháp ngâm Phương pháp ngâm: là một phương pháp chiết gián đoạn, trong đó dung môi tiếp xúc đồng thời với toàn bộ lượng dược liệu trong những dụng cụ thích hợp. Quá trình chiết xuất xảy ra ở mọi điểm trong thiết bị chiết là như nhau và dịch chiết được rút ra