Tài liệu Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của bần trắng (sonneratia alba) và bần ổi (sonneratia ovata), họ bần (sonneratiaceae), mọc ở rừng ngập mặn cần giờ, tp hcm - ncs. nguyễn thị hoài thu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  NGUYỄN THỊ HOÀI THU KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA BẦN TRẮNG (SONNERATIA ALBA) VÀ BẦN ỔI (SONNERATIA OVATA), HỌ BẦN (SONNERATIACEAE), MỌC Ở RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ - TP HCM Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 62 44 27 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC TP Hồ Chí Minh – 2015 Công trình được hoàn thành tại Đại học Khoa Học Tự Nhiên Đại học Quốc Gia TP HCM Người hướng dẫn khoa học: GS. TS. Nguyễn Kim Phi Phụng (Việt Nam) GS. TS. Poul Erik Hansen (Đan Mạch) Phản biện 1: Phản biện 2: PGS.TS. Trần Hùng PGS.TS. Trần Công Luận Phản biện 3: Phản biện độc lập 1: Phản biện độc lập 2: PGS.TS. Phạm Đình Hùng PGS.TS. Phan Minh Giang TS. Trần Thị Phương Thảo Luận án sẽ được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án cấp cơ sở đào tạo, họp tại Đại học Khoa Học Tự Nhiên. Vào hồi giờ ngày tháng năm 2015 Có thể tìm hiểu luận án tại Thư viện Tổng hợp và Thư viện Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Quốc Gia TP HCM. DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Nguyen Thi Hoai Thu, Lam Phuc Khanh, Nguyen The Duy, 2. 3. 4. 5. 6. Nguyen Thi Kim Chanh, Nguyen Kim Phi Phung, Poul Erik Hansen (2011), Chemical constituents from leaves of Sonneratia alba J. E. Smith (Sonneratiaceae), Tạp chí Phát Triển Khoa học và Công Nghệ, 14(6), 11–17. Nguyen Thi Hoai Thu, Lam Phuc Khanh, Poul Erik Hansen, Nguyen Kim Phi Phung (2011), Some triterpenoid and phenolic compounds from leaves of Sonneratia alba J.E. Smith and their acetylcholinesterase inhibitions, Tạp chí Khoa học và Công Nghệ, 49(5B), 715–721. Nguyen Thi Hoai Thu, Poul Erik Hansen, Nguyen Kim Phi Phung (2014), Thành phần hóa học của cao ethyl acetate của Bần ổi Sonneratia ovata, mọc ở rừng ngập mặn Cần Giờ Tp HCM, Tạp chí Y học TP HCM, 18(1), 217–221. Thi Hoai Thu Nguyen, Nguyen Kim Tuyen Pham, Khanitha Pubhom, Poul Erik Hansen, Kim Phi Phung Nguyen (2014), Structure elucidation of four new megastigmanes from Sonneratia ovata Backer, Magnetic Resonance in Chemistry, 52, 795–802. Nguyen Thi Hoai Thu, Poul Erik Hansen, Nguyen Kim Phi Phung (2015), Cô lập và xác định cấu trúc của luteolin và dẫn xuất của nó từ lá Bần ổi Sonneratia ovata, Tạp chí Y học TP HCM, 19(1), 275–279. Thi Hoai Thu Nguyen, Huu Viet Thong Pham, Nguyen Kim Tuyen Pham, Ngo Diem Phuong Quach, Khanitha Pubhom, Poul Erik Hansen, Kim Phi Phung Nguyen, Chemical constituents from Sonneratia ovata Backer and their in vitro cytotoxicity and acetylcholinesterase inhibitory activities, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, (Available online 11 April 2015). DOI information: 10.1016/j.bmcl.2015.04.017. MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới, nóng ẩm, gió mùa, nên có thảm thực vật rất phong phú đa dạng và là kho tàng dược liệu quý giá. Rừng ngập mặn với các loài động, thực vật đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái ven biển Việt Nam. Tuy nhiên, các hiểu biết về thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học của các loài cây ngập mặn còn rất hạn chế. Vì vậy, luận án đặt vấn đề nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài cây Sonneratia alba J.E. Smith và cây Sonneratia ovata Backer, mọc ở rừng ngập mặn Cần Giờ TP HCM, là những cây ít được nghiên cứu về mặt hóa học và hoạt tính sinh học, đặc biệt chưa được nghiên cứu ở Việt Nam. Nội dung chính được thực hiện trong luận án này là khảo sát thành phần hóa học của lá hai loài cây Bần trắng Sonneratia alba J.E. Smith và Bần ổi Sonneratia ovata Backer, thử nghiệm in vitro hoạt tính gây độc tế bào và ức chế acetylcholinesterase của các cao chiết và hợp chất cô lập được. Kết quả đạt được của luận án góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học của chi Sonneratia. Bên cạnh đó, những thử nghiệm hoạt tính sinh học cũng được thực hiện trên các hợp chất tinh khiết cô lập được, góp phần nâng cao giá trị ứng dụng của 2 loài cây này. Chúng tôi chọn thử nghiệm hoạt tính ức chế acetylcholinesterase và hoạt tính gây độc trên ba dòng tế bào ung thư cổ tử cung (HeLa), ung thư phổi (NCI–H460) và ung thư vú (MCF–7). Một số hợp chất có hoạt tính được tiến hành thử nghiệm xác định IC50 và khả năng gây độc trên tế bào lành (tế bào nguyên sợi của người). ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Trong phần cô lập các hợp chất tinh khiết từ hai loài thuộc chi Sonneratia, chúng tôi đã cô lập được 58 hợp chất, trong đó có 7 hợp chất mới và một hỗn hợp của 2 hợp chất mới, 44 chất lần đầu tiên được biết đến 1 trong chi Sonneratia, 21 chất lần đầu tiên được báo cáo trong Sonneratia alba và 38 chất lần đầu tiên được báo cáo trong Sonneratia ovata. Kết quả thử hoạt tính ức chế acetylcholinesterase cho thấy các cao trích của hai loài này có hoạt tính yếu hoặc không có hoạt tính. Trong số các hợp chất cô lập, có 3 hợp chất phenol có tiềm năng ức chế acetylcholinesterase. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư (Hela, NCI-H460, MCF-7) cho thấy một số hợp chất, gồm 6 hợp chất phenol, 2 lignan và 1 triterpen có hoạt tính trên 1, 2 hoặc 3 dòng tế bào này. Trong đó, hai hợp chất (67, 94) gây độc dòng tế bào MCF-7 với IC50 lần lượt là 49.75 và 41.30 g/mL, nhưng không gây độc trên tế bào nguyên sợi của người (tế bào thường) ở nồng độ 100 µg/mL. BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN Luận án gồm 255 trang, với phần nội dung chính 143 trang được phân ra thành các phần như sau: Giới thiệu (1 trang), Chương 1: Tổng quan (9 trang), Chương 2: Thực nghiệm (13 trang), Chương 3: Kết quả và bàn luận (102 trang), Chương 4: Kết luận và kiến nghị (2 trang), Công trình công bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (15 trang, với 133 tài liệu tham khảo). Riêng phần Phụ lục có 112 trang gồm 215 phổ IR, 1D và 2DNMR, phổ MS. Toàn bộ luận án có 23 bảng, 10 hình ảnh và 2 sơ đồ. Danh mục công trình với một quyển riêng, gồm 02 bài báo đã đăng hoặc nhận đăng trong tạp chí quốc tế (Magnetic Resonance in Chemistry, Bioorganic Medicinal Chemistry Letters), 04 bài báo đăng trong tạp chí chuyên ngành trong nước (Tạp chí Khoa Học và Công Nghệ, Tạp chí Phát Triển Khoa Học và Công Nghệ, Tạp chí Y Học TP HCM). NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Tổng hợp các tài liệu nghiên cứu về trước của các tác giả trong và ngoài nước, trên các nội dung: mô tả thực vật, những nghiên cứu về dược học và những nghiên cứu về hóa học. 2 Các tài liệu tham khảo cho thấy trên thế giới, chi Sonneratia có 20 loài, ở Việt Nam có 5 loài, trong đó loài Sonneratia caseolaris (L.) Engl. được khảo sát nhiều nhất về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM Chương 2 liệt kê các hóa chất, thiết bị thí nghiệm, nguyên tắc thử nghiệm hoạt tính sinh học, cùng với cơ quan đo phổ nghiệm cũng như thực hiện các thử nghiệm hoạt tính sinh học. 2.1. Trích ly và cô lập các hợp chất Hình 2.1. Sonneratia alba J.E. Smith Hình 2.2. Sonneratia ovata Backer 2.1.1. Điều chế các loại cao Lá cây Bần trắng Sonneratia alba J.E. Smith và cây Bần ổi Sonneratia ovata Backer được thu hái ở rừng ngập mặn Cần Giờ TP HCM và được định danh bởi TS. Võ Văn Chi và cố Dược sỹ Phan Đức Bình. Mẫu tiêu bản thực vật được lưu trữ tại Bộ môn Hoá hữu cơ, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, ký hiệu mẫu US-B005 (Bần trắng) và US-B006 (Bần ổi). Mẫu được cắt nhỏ, sấy khô, xay nhuyễn và trích bằng phương pháp ngâm dầm trong methanol ở nhiệt độ phòng, dung dịch được lọc qua giấy lọc và thu hồi dung môi ở áp suất thấp, thu được cao thô metanol. Phần cao thô methanol tiếp tục được hòa tan vào nước sau đó được chiết lỏng–lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần, thu hồi dung môi dưới áp suất thấp có được các cao tương ứng. 3 2.1.2. Trích ly, cô lập các hợp chất từ hai loài thuộc chi Sonneratia Việc trích ly và cô lập được thực hiện bằng sắc ký cột cổ điển với silica gel pha thường hoặc pha đảo RP-18 kết hợp với sắc ký bản mỏng. 2.2. Thử nghiệm hoạt tính sinh học 2.2.1. Thử nghiệm hoạt tính ức chế acetylcholinesterase in vitro Hoạt tính ức chế acetylcholinesterase của các cao chiết cũng như các hợp chất cô lập được thực hiện theo phương pháp Ellman, 1961 và chất chứng dương là galanthamine. Mẫu được gửi thử nghiệm tại Khoa Dược, Đại học Y Dược TP HCM, hoặc tại Khoa Sinh, Đại học Khoa Học Tự Nhiên – TP HCM. 2.2.2. Thử nghiệm hoạt tính ức chế in vitro trên ba dòng tế bào ung thư người và tế bào nguyên sợi của người của các hợp chất cô lập được Hoạt tính gây độc tế bào kháng lại 3 dòng tế bào ung thư (Hela, NCIH460 và MCF-7) của các hợp chất cô lập được thực hiện ở nồng độ 100 g/mL, sử dụng chất nhuộm Sulforhodamine B (SRB) và chất chứng dương là camptothecin. Các mẫu có hoạt tính được tiến hành thử nghiệm xác định liều IC50 và khả năng gây độc trên tế bào nguyên sợi của người. Mẫu được gửi thử nghiệm tại Khoa Sinh, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – TP HCM. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả khảo sát cấu trúc hóa học Từ lá của hai loài cây Bần trắng và Bần ổi, chúng tôi đã cô lập được 58 hợp chất, trong đó có 7 hợp chất mới, một hỗn hợp của 2 hợp chất mới. Cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được xác định bằng cách phân tích các dữ liệu phổ nghiệm MS, 1D và 2D–NMR, đo năng lực triền quang và nhiệt độ nóng chảy, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo, đã được trình bày chi tiết trong quyển luận án. Các hợp chất được phân loại theo 7 nhóm, như sau: Nhóm A: Steroid (3 hợp chất đã biết) 4 Nhóm B: Triterpenoid (8 hợp chất đã biết) Nhóm C: Flavonoid (8 hợp chất đã biết) Nhóm D: Lignan (10 hợp chất đã biết) Nhóm E: Megastigmane (12 hợp chất: 2 mới, một hỗn hợp 2 chất mới và 9 đã biết) Nhóm F: Hợp chất phenolic (13 hợp chất: 4 mới và 9 đã biết) Nhóm G: Hợp chất khác (4 hợp chất: 1 mới và 3 đã biết) Quyển tóm tắt luận án chỉ trình bày khảo sát cấu trúc hóa học của một vài hợp chất mới. 3.1.1. Khảo sát cấu trúc hoá học của sonnerstigmane A (74a) và sonnerstigmane B (74b) Hợp chất 74a và 74b được cô lập từ phân đoạn A2 của loài S. ovata  Khối phổ: HR-ESI-MS (ghi nhận ion dương): m/z 261.1479 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho C14H22O3+Na, 261.1467).  Phổ 1H, 13C–NMR: Trình bày trong Bảng 3.1 Phổ 1H và 13C–NMR của 74 cho thấy các cặp tín hiệu hiện diện với tỉ lệ khoảng 1.2:1.0; vì vậy nó được đề nghị là một hỗn hợp của hai xuyên lập thể phân 74a và 74b. Phổ proton của 74 cho thấy một tín hiệu mũi đôi tại δH 1.30 (3H, d, 6.5 Hz, H–10) của một nhóm methyl gắn kề với một nhóm methine. Điều này cũng phù hợp với tương quan COSY của proton H–10 với tín hiệu proton tại δH 3.80 (1H, quint–like, H–9). Hơn thế nữa, phổ COSY cũng cho thấy các tín hiệu tương quan của proton H–9 với proton olefin tại δH 5.72 (1H, dd, 15.6, 5.1 Hz, H–8), của proton H-8 với một proton olefin khác tại δH 5.73 (1H, d, 15.6 Hz, H–7). Vì vậy, 74 được đề nghị có mảnh >C–CH=CH–CH(OR)CH3 trong công thức. Hằng số ghép lớn 15.6 Hz đề nghị cấu hình E của nối đôi tại C–7. Phổ proton cũng cho thấy một tín hiệu mũi đơn proton olefin tại δH 5.89 (H–4), và tín hiệu này có tương quan COSY với tín hiệu proton methyl bị giảm chắn tại δH 1.90 (3H, s, H–13). Điều này cho thấy nhóm methyl này 5 gắn trực tiếp vào nối đôi. Bên cạnh đó, phổ HMBC cho thấy tương quan của H–13 với các tín hiệu carbon tại δC 127.0 (=CH–, C–4), 162.8 (>C=, C–5), và 79.2 (>C(OH)–, C–6), vì vậy 74 có mảnh – CH=C(CH3)–C(OH)< trong công thức. Ở vùng từ trường cao, phổ proton của 74 còn cho thấy cặp tín hiệu proton mũi đơn của hai nhóm gem–methyl tại δH 1.07 (H–11) và 0.99 (H– 12) của nhóm >C(CH3)2, cặp tín hiệu proton mũi đôi với hằng số ghép lớn 16.8 Hz tại δH 2.41 và 2.26 mà cùng có tương quan HSQC với carbon tại δC 49.9 (C–2). Hơn nữa, phổ HMBC cho thấy tương quan của H–11 và H–12 với các carbon C–1 (δC 41.3, >C<), C–2, và C–6, của cả hai proton methylene H–2a và H–2b với các carbon C–1, C–3 (δC 198.0), C–4, C–6, C–11, và C–12. Vì vậy, 74a và 74b được đề nghị với khung 6,9dihydroxymegastigmane-4,7-diene-3-one. Bên cạnh đó, mỗi hợp chất còn có một nhóm methoxy. Tín hiệu của hai nhóm methoxy này cộng hưởng tại δH 3.24 (3H, s, –OCH3) và δC 56.3 (– OCH3), và tại δH 3.26 (3H, s, –OCH3) và δC 56.3 (–OCH3). Nhóm methoxy gắn vào khung megastigmane tại C–9 được xác định dựa trên tương quan HMBC của proton methoxy với carbon C–9. Theo tác giả Yamano và Ito, hai đồng phân (6S,9R) và (6S,9S) của vomifoliol hữu triền có giá trị lần lượt là +214.1 và +197.8, và hai đồng phân (6R,9S) và (6R,9R) tả triền có giá trị lần lượt là –195.8 và –205.2. Hợp chất 74 chỉ khác vomifoliol ở chỗ có thêm một có nhóm methoxy tại C–9 và có năng lực triền quang là [α] +158.3 (c 1.2, MeOH). Vì vậy, 74 được đề nghị là hỗn hợp của hai xuyên lập thể phân (6S,9R) và (6S,9S) với tỉ lệ khoảng 1.2:1.0 (74a và 74b). Khối phổ phân giải cao HR–ESI–MS cho mũi ion phân tử giả tại m/z 261.1479 [M+Na]+, tương ứng với công thức phân tử C14H22O3 (tính toán lý thuyết của C14H22O3+Na là 261.1467). Tất cả những dữ kiện trên đề nghị cấu trúc của 74 là hỗn hợp với tỉ lệ (1.2:1.0) của sonnerstigmane A 6 [(6S,7E,9R)-6-hydroxy-9-methoxymegastigmane-4,7-diene-3-one (74a)] và sonnerstigmane B [(6S,7E,9S)-6-hydroxy-9-methoxymegastigmane-4,7diene-3-one (74b)]. Bảng 3.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 74a, 74b và 79 STT 74ac* δH, J (Hz) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 74bc* δC 41.3 2.41 d (16.8) 2.26 d (16.8) 49.9 198.0 5.89 s 127.0 162.8 79.2 5.73 d (15.6) 131.3 5.72 dd (15.6, 5.2) 133.8 3.80 quint-like (6.0) 77.5 1.25 d (6.0) 21.5 1.07 s 23.0 0.99 s 24.2 1.90 s 19.0 δH, J (Hz) 2.41 d (16.8) 2.26 d (16.8) 79m δC 41.2 49.9 198.0 5.89 s 127.1 162.7 79.3 5.73 d (15.6) 131.2 5.70 dd (15.6, 5.2) 133.9 3.80 quint-like (6.0) 77.4 1.23 d (6.0) 21.5 1.07 s 23.0 1.01 s 24.3 1.88 s 19.0 6’ -OMe 3.24 s δH, J (Hz) 2.40 d (16.0) 2.37 d (16.0) 5.98 s 6.09 d (10.0) 4.75 dd (10.0, 5.0) 3.83 m 1.30 d (6.5) 1.39 s 1.33 s 2.15 s 4.46 d (7.5) 3.26 dd (8.5, 8.5) 3.37 dd (8.5, 8.5) 3.29 m 3.27 m 3.88 m 3.68 dd (12.0, 5.0) δC 39.9 54.3 202.0 127.3 158.9 145.2 134.7 72.3 82.1 19.3 29.8 29.9 22.8 105.7 75.5 78.0 71.5 77.9 62.7 56.3 3.26 s 56.3 Ghi chú: c: Chloroform–d m: Methanol–d4 *: Bộ tín hiệu phổ của 74a và 74b có thể trao đổi cho nhau 3.1.2. Khảo sát cấu trúc hóa học của sonnerstigmane D (79) Hợp chất 79 thu được từ phân đoạn A8 của sơ đồ 2 của loài S. ovata.  Dạng   [α] dầu không màu. +2.3 (c 0.48, MeOH). Khối phổ phân giải cao: HR-ESI-MS (ghi nhận ion dương): m/z 409.1858 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết của C19H30O8+Na, 409.1838).  Phổ 1H, 13C-NMR: Trình bày trong Bảng 3.1 7 Khối phổ phân giải cao HR–ESI–MS cho mũi ion phân tử giả tại m/z 409.1858 [M+Na]+, tương ứng với công thức phân tử C19H30O8 (tính toán lý thuyết của C19H30O8+Na là 409.1838). Phổ 1H và 13C–NMR của 79 cho thấy những tín hiệu của khung megastigmane giống như 74a và 74b. Tuy nhiên, hợp chất 79 khác với 74a và 74b ở vị trí của nối đôi tại C–6 và sự hiện diện thêm một proton methine gắn oxygen tại δH 4.75 (1H, dd, 10.0, 5.0 Hz, H–8) và bớt một tín hiệu proton olefin. Điều này cũng phù hợp với phổ 13C-NMR của 79 cho thấy sự hiện diện thêm một carbon methine gắn với oxygen tại δC 72.3 (C–8) thay vì một tín hiệu carbon tứ cấp gắn oxygen tại 80 ppm của C–6 trong hợp chất 74a và 74b. Quan sát này cũng được xác định dựa vào tương quan COSY của proton olefin H–7 tại δH 6.09 (1H, d, 10.0 Hz) với proton carbinol H–8 tại δH 4.75 (1H, dd, 10.0, 5.0 Hz), của H–8 với proton carbinol H–9 tại δH 3.83 (1H, m), và của H–9 với proton methyl tại δH 1.30 (3H, d, 6.5 Hz, H–10) (Hình 3.1). Hơn nữa, phổ HMBC cho thấy tín hiệu tương quan của proton H–10 với hai carbon gắn oxygen tại δC 72.3 (C–8) và 82.1 (C–9), của H–13 tại δH 2.15 (3H, s) với các carbon olefin tại δC 127.3 (C–4), 158.9 (C–5), và 145.2 (C–6) (Hình 3.1). Phổ 1H–NMR của 79 cũng cho thấy một tín hiệu proton anomer tại δH 4.46 (1H, d, 7.5 Hz, H–1’) và những tín hiệu proton carbinol cộng hưởng từ 3.26–3.86 ppm của một đơn vị đường β–D–glucose. Điều này phù hợp với sự hiện diện của một tín hiệu carbon anomer tại δC 105.7 và năm tín hiệu carbon carbinol cộng hưởng từ 62.7 đến 78.0 ppm. Nhóm glucose gắn vào phần aglycone tại C–9 được xác định bởi tương quan HMBC của proton anomer H–1’ với carbon C–9. Phổ NOESY (Hình 3.1) cho thấy tương quan của proton olefin H–7 và proton methyl H–13, vì vậy, nối đôi tại C–6 có cấu hình E. Đơn vị đường glucose được xác định là đường β- dựa trên hằng số ghép cặp lớn 7.5 Hz của tín hiệu proton anomer tại δH 4.46. Phổ HMBC cho thấy tín hiệu tương quan với cường độ mạnh của proton H–1´ và C–9, 8 Hình 3.1. Một số tương quan COSY, HMBC và NOESY của 79 và 80 Hình 3.2. Cấu trạng của hai hợp chất 79 và 80 (Cấu trúc của 80 là thay nhóm O-glucopyranosyl bằng nhóm hydroxyl và cấu trạng của 80 tương ứng lần lượt là A’, B’, C’, D’, E’, F’, G’, H’, I’, J’ và K’). 9 của proton H–9 và C–1´, và phổ NOESY cũng cho thấy tín hiệu tương quan mạnh của proton H–9 và proton H–1´ (Hình 3.1). Điều này đề nghị hai proton H–9 và proton H–1´ gần nhau trong không gian. Hơn nữa, tín hiệu tương quan NOESY mạnh của H–8 với cả proton methyl H–11 và H–12 cho thấy proton H–8 hướng về phía gần những proton methyl này. Từ những thông tin trên, 12 cấu trạng của hợp chất 79 được đề nghị như trong Hình 3.2. Cấu hình tuyệt đối của hai carbon gắn oxygen C–8 và C–9 được xác định dựa trên sự ghép cặp H-H, cường độ của tín hiệu tương quan NOESY, giá trị tính toán lý thuyết mức độ che chắn hạt nhân 13C và năng lượng của các cấu trạng của hợp chất 79. Việc tính toán theo thuyết hàm mật độ (density functional theory: DFT) dựa trên phần mềm Gaussian 09, các cấu trạng được tối ưu hóa hoàn toàn sử dụng các biến B3LYP của thuyết hàm mật độ. Trong tất cả các cấu trạng của 79, mức độ che chắn hạt nhân của các carbon C–7, C–8, C–9, C–10, C–1´, CH3–11 và CH3–12 được tính toán vì những carbon này bị ảnh hưởng nhiều nhất bởi cấu trạng và cấu hình khác nhau. Kết quả được trình bày trong Hình 3.2. Phổ NOESY cho thấy tương quan với cường độ mạnh của proton H–8 và proton H–10, nên bốn cấu trạng A, D, I và L là không phù hợp. Tương quan NOESY rất yếu của H–8 and H–9 cho thấy hai proton này xa nhau không gian, vì vậy các cấu trạng B, E, H, và K cũng không phù hợp. Từ những thông tin này, chỉ còn bốn cấu trạng C, F, G, và J là phù hợp với các tương quan NOESY. Tiếp theo, G và J bị loại bởi vì hai cấu trạng này có hệ số tương quan (R2) giữa mức độ che chắn hạt nhân theo tính toán và độ dịch chuyển hóa học của các carbon tương ứng thấp hơn hai cấu trạng còn lại F và C (Hình 3.2). Việc phân biệt hai cấu trạng này dựa trên các giá trị năng lượng theo tính toán lý thuyết. Cấu trạng E đã bị loại, mà năng lượng tính toán của cấu trạng F lại cao hơn E là 23 KJ, vì vậy cấu trạng F kém ưu đãi hơn E, vì thế F bị loại. Ngược lại, cấu trạng C thì ưu đãi hơn cấu trạng 10 B là 21 KJ. Cấu trạng C được lựa chọn vì phù hợp nhất, trong đó hai nhóm cồng kềnh glucose và quinone trong cấu trạng C xa nhau trong không gian. Từ những thông tin trên, hợp chất 79 được đề nghị là (7E,8R,9R)-8,9dihydroxymegastigmane-4,6-diene-3-one 9-O-β-D-glucopyranoside và được đặt tên là sonnerstigmane D. 3.1.3. Khảo sát cấu trúc hóa học của sonnerphenolic B (86) Hợp chất 86 thu được từ phân đoạn A3 của sơ đồ 2 của loài S. ovata.  Dạng   [α] dầu màu vàng nhạt. –282.8 (c 0.18, MeOH). Khối phổ phân giải cao: HR-ESI-MS (ghi nhận ion dương): m/z 305.1160 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết của C18H18O3+Na, 305.1154).  Phổ 1H, 13C-NMR: Trình bày trong Bảng 3.2 Hợp chất 86 thu được ở dạng dầu màu vàng nhạt. Khối phổ phân giải cao cho mũi ion phân tử giả [M+Na]+ tại m/z 305.1160, phù hợp với công thức phân tử là C18H18O3 (tính toán lý thuyết của C18H18O3+Na là 305.1154). Phổ 1H–NMR cho thấy sự hiện diện của 7 tín hiệu proton vòng thơm, bao gồm bộ ba tín hiệu tại δH 6.90 (1H, brs, H–2’), 6.81 (1H, d, 8.0 Hz, H–5’) và 6.80 (1H, brd, 8.0 Hz, H–6’) của hệ ABX của vòng A– benzene và hai tín hiệu tại δH 7.09 (2H, d, 8.4 Hz, H–2’’, H–6’’) và 6.78 (2H, d, 8.4 Hz, H–3’’, H–5’’) của hệ AA'BB' của vòng B–benzene. Tại vùng từ trường cao hơn, phổ 1H và HSQC–NMR cũng cho thấy các tín hiệu của hai proton olefin methylene, ba proton olefin methine của hai nối đôi trong vùng từ 5.15 đến 6.50 ppm, một tín hiệu proton methine bão 11 hòa tại δH 4.54 (1H, dd, 9.6, 6.4 Hz, H–3) và một tín hiệu tại δH 3.89 (3H, s) của một nhóm methoxy. Điều này phù hợp với sự hiện diện của 16 tín hiệu carbon, trong đó có 2 tín hiệu xuất hiện với cường độ gấp đôi tại δC 129.0 và 115.6 của hệ AA'BB' trên phổ 13C–NMR. Hơn thế nữa, phổ COSY cho thấy tương quan của proton H–1 tại δH 6.49 (1H, d, 11.6 Hz, –CH=) với proton H–2 tại δH 5.67 (1H, dd, 10.8, 10.4 Hz, –CH=), của proton H–2 với proton H–3 tại δH 4.54 (1H, dd, 9.6, 6.4 Hz, –CH<), của proton H–3 với proton H–4 tại δH 6.01 (1H, ddd, 16.8, 10.0, 6.0 Hz, –CH=), của proton H– 4 với proton H–5a tại δH 5.17 (1H, d, 9.2 Hz, =CH2) và proton H–5b tại δH 5.20 (1H, d, 18.4 Hz, =CH2) (Hình 3.3). Những dữ kiện này xác định sự hiện diện của mảnh 1,3-diarylpenta-1,4-diene trong cấu trúc của 86. Hằng số ghép 11.6 Hz đề nghị nối đôi tại carbon C–1 có cấu hình cis. Tương quan HMBC của H–1 (δH 6.49) với ba carbon thơm tại δC 130.9 (C–1’), 115.0 (C–2’), 120.8 (C–6’) đề nghị 1 nhóm aryl gắn vào dây penta1,4-diene tại C–1. Phổ 1H–NMR cho thấy tín hiệu proton H–2’ tại H 6.90 là mũi đơn rộng và proton H–6’ tại H 6.80 là mũi đôi rộng với hằng số ghép là 8.0 Hz. Những tín hiệu này đề nghị hai proton này ghép meta với nhau. Hơn nữa, proton H–6’ có tương quan COSY với một tín hiệu proton mũi đôi tại δH 6.81 (1H, d, 8.0 Hz, H–5’). Điều này đề nghị vòng A– benzene có hai nhóm thế tại C–3’ and C–4’ và gắn vào dây penta-1,4-diene tại C–1. Tương quan HMBC của proton hydroxyl tại δH 5.59 (1H, s) với carbon C–2’ và C–3’, của proton methoxy tại δH 3.89 (3H, s) với carbon C– 4’ đề nghị nhóm hydroxyl và methoxy gắn vào vòng A–benzene lần lượt tại C–3’ và C–4’. Những báo cáo trước đây về loại hợp chất này cho thấy nếu vòng benzene có nhóm hydroxyl tại C–3 và nhóm methoxy tại C–4, thì giá trị δC của C–3 và C–4 là 0.5 ppm trong chloroform–d, ngược lại, nếu vòng benzene có nhóm hydroxyl tại C–4 và nhóm methoxy tại C–3, thì giá trị δC của C–3 và C–4 là 2.9 ppm trong methanol–d4 hoặc là 2.3 ppm trong acetone–d6. Đối với hợp chất 86, giá trị δC của C–3’ và C–4’ là 0.3 ppm 12 trong chloroform–d, vì vậy hợp chất 86 có nhóm một nhóm hydroxyl tại at C–3’ và một nhóm methoxy tại C–4. Cấu trúc này cũng phù hợp với các tương quan HMBC. Hình 3.3. Một số tương quan COSY và HMBC của hợp chất 86 Nhóm hydroxyl gắn tại C–4’’ của vòng B–benzene được xác định dựa trên tương quan HMBC của proton hydroxyl tại δH 4.80 (1H, s) với carbon C–3’’(C–5’’) và C–4’’. Vòng benzene này được xác định gắn vào carbon C–3 của dây penta-1,4-diene dựa trên tương quan HMBC của H–2, H–3, và H–4 với C–1’’, và tương quan HMBC của proton thơm của vòng B– benzene tại H 7.09 (2H, d, 8.4 Hz, H–2’’, H–6’’) với carbon C–3. Cấu hình tuyệt đối của C–3 chưa được xác định. Tuy nhiên, hợp chất 86 tả triền với năng lực triền quang [α] được đề nghị là –282.8 (c 0.18, MeOH). Vì vậy 86 (–)-(Z)-1-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-3-(4- hydroxyphenyl) penta-1,4-diene và đặt tên là sonnerphenolic B. 3.1.4. Khảo sát cấu trúc hóa học của Sonnerphenolic A (88) Hợp chất 88 thu được từ phân đoạn A2.2 của sơ đồ 1 của loài S. alba và từ phân đoạn A5 của sơ đồ 2 của loài S. ovata.  Dạng   [α] sáp không màu. +3.8 (c 0.37, MeOH). Khối phổ phân giải cao: HR-ESI-MS (ghi nhận ion dương): m/z 309.1117 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết của C17H18O4+Na, 309.1097).  Phổ 1H, 13C–NMR: Trình bày trong Bảng 3.2 13 Công thức phân tử của hợp chất 88 được xác định là C17H18O4 dựa trên khối phổ phân giải cao HR–ESI–MS cho mũi ion phân tử giả tại m/z 309.1117 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết của C17H18O4+Na là 309.1097). Phổ 13 C–NMR của 88 cho thấy có 13 tín hiệu carbon, trong đó có bốn tín hiệu tại δC 131.5, 129.9, 116.1, và 115.8 xuất hiện với cường độ gấp đôi. Hơn thế nữa, phổ 1H-NMR của 88 cho thấy có sự hiện diện của bốn tín hiệu proton của tám proton vòng thơm ở dạng mũi đôi, hằng số ghép lớn tại δH 7.07 (2H, d, 8.5 Hz, H–2’’, H–6’’), 7.03 (2H, d, 9.0 Hz, H–2’, H–6’), 6.65 (2H, d, 9.0 Hz, H–3’, H–5’) và 6.62 (2H, d, 8.5 Hz, H–3’’, H–5’’). Những dữ liệu trên đề nghị sự hiện của hai vòng benzene mang hai nhóm thế ở vị trí para trong cấu trúc của hợp chất 88. Tại vùng từ trường cao từ 1.70 đến 4.30 ppm, phổ 1H–NMR cho thấy có 2 proton methine gắn với oxygen, hai proton methine bão hòa và hai proton methylene, phù hợp với sự hiện diện của năm tín hiệu carbon từ 44.0 đến 79.6 ppm trên phổ 13C–NMR. Những proton và carbon này là của một vòng cyclopentane, và được xác định dựa trên tương quan COSY của H–1/H– 2/H–3/H–4/H–5/H–1 (Hình 3.4) cũng như tương quan HSQC của các carbon và proton liền kề. Tương quan HMBC của H–2 với C–1’, C–2’, C– 6’, của H–2’ với C–2, của H–3 với C–2’’, C–6’’ và của H–2’’ với C–3 giúp đề nghị hai nhóm 4–hydroxyphenyl gắn vào vòng cyclopentane lần lượt tại C–2 and C–3. Từ những dữ liệu trên, cấu trúc phẳng của 88 được xác định là 1,4-dihydroxy-2,3-di-(4-hydroxyphenyl)cyclopentane. Hình 3.4. Một số tương quan COSY, HMBC và NOESY của hợp chất 88 Cấu hình tương đối của 88 được đề nghị dựa vào phổ NOESY. Phổ NOESY cho thấy có tương quan của H–3 với H–4, của H–4 với H–5b, của 14 H–5b với H–1, của H–1 với H–3 (Hình. 3.4), vì vậy bốn proton này được đề nghị là ở cùng một bên so với vòng cyclopentane. Tương quan NOESY của H–5a với H–2 đề nghị hai proton này cùng một phía với nhau và khác phía so với H–1, H–3, H–4 và H–5b. Từ những dữ liệu trên, cấu trúc hóa học của 88 được đề nghị là (1β,2α,3β,4β)-1,4-dihydroxy-2,3-di-(4hydroxyphenyl)cyclopentane và được đặt tên là sonnerphenolic A. Bảng 3.2. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 86 và 88 STT 1 2 3 4 5 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 1’’ 2’’ 3’’ 4’’ 5’’ 6’’ –OMe 3’–OH 4’’–OH 86c δH, J (Hz) 6.49 d (11.6) 5.67 dd (10.8, 10.4) 4.54 dd (9.6, 6.4) 6.01 ddd (16.8, 10.4, 6.0) 5.20 brd (18.4) 5.17 brd (9.2) 6.90 brs 6.81 d (8.0) 6.80 brd (8.0) 7.09 d (8.4) 6.78 d (8.4) 6.78 d (8.4) 7.09 d (8.4) 3.89 s 5.59 s 4.80 s Ghi chú: δC 128.8 132.3 47.0 140.8 115.2 130.9 115.0 145.5 145.8 110.6 120.8 135.8 129.0 115.6 154.2 115.6 129.0 56.1 c: Chloroform–d 15 88 m δH, J (Hz) 4.10 ddd (8.5, 8.5, 6.0) 3.34 dd (13.0, 8.5) 3.14 dd (13.0, 4.5) 4.21 ddd (6.5, 4.5, 2.0) 1.74 ddd (14.5, 6.0, 2.0) 2.63 ddd (14.5, 8.5, 6.0) 7.03 d (9.0) 6.65 d (9.0) 6.65 d (9.0) 7.03 d (9.0) 7.07 d (8.5) 6.62 d (8.5) 6.62 d (8.5) 7.07 d (8.5) m: Methanol–d4 δC 79.6 55.8 56.7 74.5 44.0 134.0 129.9 116.1* 156.6 116.1* 129.9 130.8 131.5 115.8* 156.6 115.8* 131.5 3.1.5. Nhận xét về hóa – thực vật của chi Bần Sonneratia Hai mươi bốn hợp chất từ lá Bần trắng Sonneratia alba và bốn mươi hợp chất từ lá Bần ổi Sonneratia ovata đã được cô lập và xác định cấu trúc hóc học. Các hợp chất này được phân loại 7 nhóm. Steroid: Trong các báo cáo trước đây, các hợp chất steroid cô lập được từ chi Bần đều có khung stigmastane và cholestane. Cả ba steroid cô lập và trình bày trong luận án đều thuộc khung stigmastane. Triterpenoid: Các hợp chất triterpenoid được cô lập trước đây từ chi Bần thuộc 1 trong 4 khung lupane, oleanane, ursane và lanostane. Luận án có 4 hợp chất lupane triterpenoid (20, 21, 25, 55) và hai oleanane triterpenoid (12, 14) được cô lập từ S. alba, trong khi, hai triterpenoid (56, 57) được cô lập từ S. ovata thuộc khung ursane. Hợp chất 55, 56 và 57 lần đầu tiên được cô lập từ chi Sonneratia. Flavonoid: Các nghiên cứu hóa học trước đây cho thấy, flavonoid cô lập được từ chi Bần thuộc dẫn xuất của luteolin, quercertin, và kaempferol. Trong nghiên cứu của chúng tôi, một luteolin O-glucoside (58) và một apigenin C-glucoside (62) được cô lập từ S. alba; luteolin (40), hai luteolin O-glucoside (41, 59), hai luteolin C-glucoside (60, 61) và hai apigenin Cglucoside (62, 63) được cô lập từ S. ovata. Tất cả các flavonoid này lần đầu tiên được báo cáo từ S. alba và S. ovata. Hợp chất 58–63 lần đầu tiên được cô lập từ chi Sonneratia. Nhóm flavonoid C-glucoside chưa được báo cáo trước đó từ chi Sonneratia. Lignan: Mười lignan cô lập được thuộc khung 2,6-diaryl-3,7dioxabicyclo[3.3.0]octane, 2-phenyl-5-benzofuranpropanol, và arylnaphthalene derivative. Từ S. alba, một dẫn xuất 2,6-diaryl-3,7dioxabicyclo[3.3.0]octane (66) và hai dẫn xuất arylnaphthalene (70, 71) được cô lập. Từ dioxabicyclo[3.3.0]octane S. ovata, (64, 65), hai dẫn ba dẫn xuất xuất 2,6-diaryl-3,72-phenyl-5- benzofuranpropanol (67, 68, 69) và bốn dẫn xuất arylnaphthalene (70, 71, 16 72, 73) được cô lập. Đây là lần đầu tiên, nhóm hợp chất lignan được báo cáo có hiện diện trong chi Sonneratia. Megastigmane: Mười một megastigmane và một hỗn hợp hai megastigmane được cô lập. Từ S. alba, ba hợp chất (83, 84, 85) được cô lập. Từ S. ovata, bốn hợp chất mới (74a, 74b, 78, 79) và sáu hợp chất đã biết (75, 76, 77, 80, 81, 82) được cô lập. Đây là lần đầu tiên, nhóm hợp chất này được báo cáo có hiện diện trong chi Sonneratia. Phenol: Trong các báo trước đây các hợp chất phenol cô lập từ chi Sonneratia thuộc dẫn xuất của diphenylpentane, gallic acid, ellagic acid và 6H-benzo[c]chromen-6-one. Trong kết quả của luận án, hai dẫn xuất diphenylpentane (87, 88), ba dẫn xuất gallic acid (30, 89, 93) và hai dẫn xuất của ellagic acid (33, 90) được cô lập từ S. alba. Ba dẫn xuất diphenylpentane (26, 86, 88), ba dẫn xuất gallic acid (91, 92, 93), và hai dẫn xuất 4-phenylbutane-2-ol (94, 95) được cô lập từ S. ovata. Các hợp chất 86, 87, 88, và 94 là hợp chất mới. Các hợp chất 89–93 và 95 lần đầu tiên được cô lập từ chi Sonneratia. Nhóm dẫn xuất 4-phenylbutane-2-ol lần đầu tiên được báo cáo có hiện diện trong chi Sonneratia. Nhóm hợp chất khác: Hai hợp chất (46, 97) được cô lập từ S. alba. Từ S. ovata, (46, 96, 98 (mới)) được cô lập. Hợp chất 96–98 lần đầu tiên được cô lập từ chi Sonneratia. Tóm tại, các hợp chất cô lập từ S. alba và S. ovata thuộc các nhóm hợp chất steroid, triterpenoid, flavonoid, phenolic tương tự các báo cáo trước đây về chi Sonneratia. Tuy nhiên, nhóm hợp chất flavonoid C-glucoside, lignan, megastigmane và 4-phenylbutane-2-ol phenolic lần đầu tiên được báo cáo có hiện diện trong chi Sonneratia. Trong số các chất cô lập được, sáu hợp chất (46, 62, 70, 71, 88, 93) được cô lập từ cả hai loài khảo sát. 17