Tài liệu Khảo sát tác dụng bảo vệ vi khuẩn của Alginat trong quá trình tạo nguyên liệu Probiotic chứa Lactobacilus acidophilus

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HOA KHẢO SÁT TÁC DỤNG BẢO VỆ VI KHUẨN CỦA ALGINAT TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC CHỨA Lactobacilus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HOA KHẢO SÁT TÁC DỤNG BẢO VỆ VI KHUẨN CỦA ALGINAT TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC CHỨA L. acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Đàm Thanh Xuân 2. DS. Ninh Thị Kim Thu Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Công nghiệp dược HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Với sự kính trọng và long biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Đàm Thanh Xuân và DS. Ninh Thị Kim Thu, DS. Lê Ngọc Khánh những người thầy đã tận tình hướng dẫn và ch ỉ bảo cho tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thiện khóa luận này. Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Công Nghiệp Dược đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, chỉ bảo tôi trong thời gian làm thực nghiệm. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường. Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình , người thân và bạn bè đã động viên , giúp đỡ tôi trong suốt quá trình h ọc tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót . Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô , bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày , tháng 5, năm 2013. Sinh viên NGUYỄN THỊ HOA MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Đại cương về probiotic 2 1.1.1. Khái niệm 2 1.1.2. Vai trò 2 1.1.3. Cơ chế tác dụng 4 1.1.4. Một số dạng chế phẩm trên thị trường 5 1.2. Phương pháp đông khô 7 1.2.1. Khái niệm 7 1.2.2. Các giai đoạn của phương pháp đông khô 7 1.2.3. Ưu điểm của phương pháp đông khô 8 1.2.4. Ứng dụng 8 1.2.5. Các tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật. 8 1.3. Alginat 10 1.3.1. Sơ lược về alginat 10 1.3.2. Một số tính chất của natri alginat 10 1.3.3. Ứng dụng 11 1.3.4. Một số hướng nghiên cứu sử dụng alginat trong sản xuất chế phẩm 12 probiotic thời gian gần đây. Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN 13 CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị. 13 2.1.1. Nguyên vật liệu sử dụng 13 2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 13 2.1.3. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu 13 2.1.4. Thiết bị 14 2.2. Nội dung nghiên cứu 14 2.2.1. Khảo sát khả năng sử dụng alginat làm tá dược bảo vệ trong quá 14 trình đông khô tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus. 2.2.2. Khảo sát khả năng bảo vệ vi sinh vật của alginat khi sử dụng làm tá 15 dược độn 2.3. Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1. Phương pháp nhân giống. 15 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu sinh khối. 15 2.3.3. Phương pháp đông khô. 15 2.3.4. Phương pháp xác định hàm ẩm. 16 2.3.5. Phương pháp xác định số lượng VSV bằng phương pháp pha loãng 16 liên tục. 2.3.6. Phương pháp tiệt khuẩn Tyndall 18 Chương 3: Kết quả và bàn luận 19 3.1. Khảo sát khả năng sử dụng alginat làm tá dược bảo vệ trong quá trình 19 đông khô tạo nguyên liệu probiotic chứa L. acidophilus ATCC 4653 3.1.1. Đánh giá thể chất của các nguyên liệu chứa vi sinh vật tạo 19 thành sau khi đông khô 3.1.2. Đánh giá hàm ẩm và tốc độ hút ẩm của các mẫu đông khô vi sinh 22 vật với tá dược bảo vệ là sữa gầy và alginat. 3.1.3. Khảo sát số lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sống sót sau 24 đông khô 3.1.4. So sánh khả năng sống sót của vi sinh vật trong nguyên liệu đông 28 khô có và không có kết hợp alginat và sữa gầy 3.2. Khảo sát khả năng bảo vệ vi sinh vật của alginat khi sử dụng làm tá 31 dược độn 3.2.1. Khảo sát khả năng bảo vệ vi sinh vật của bột nguyên liệu probiotic 31 có alginat trong môi trường acid dạ dày KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT B. subtilis : Bacillus subtilis Cfu (Colony- Forming Units) : Số đơn vị khuẩn lạc FAO (Food and Agriculture Organization) : Tổ chức nông lương thế giới Glass : một trạng thái nhiệt động quá bão hòa không bền với độ nhớt cao HDL (High density lipoprotein) : Lipoprotein tỉ trọng cao HDSK : Hỗn dịch sinh khối IDF (Internation Dairy Federation) : Liên đoàn bơ sữa thế giới Kl/kl : Khối lượng/khối lượng Kl/tt : Khối lượng/thể tích L. acidophilus : Lactobacillus acidophilus LAB (Lactic acid bacteria) : Nhóm vi khuẩn lactic LDL (Low density lipoprotein) : Lipoprotein tỉ trọng thấp MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn MT : Môi trường PPI (Proton Pump Inhibitor) : Ức chế bơm proton S. boulardii : Saccharomyces boulardii Tt/kl : Thể tích/khối lượng VSV : Vi sinh vật WHO (World Health Organization) : Tổ chức Y tế thế giới DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 2.1 Bảng các hóa chất dùng trong nghiên cứu. 13 Bảng 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 14 Bảng 3.1 Thể chất của các mẫu đông khô L. acidophilus với các tá 20 dược bảo vệ tại thời điểm ngay sau khi đông khô Bảng 3.2 Kết quả đo hàm ẩm (%) của một số mẫu đông khô L. 23 acidophilus với tá dược bảo vệ khác nhau theo thời gian Bảng 3.3 Số lượng vi khuẩn sống sót trong 4 mẫu sau đông khô Bảng 3.4 Kết quả đo hàm ẩm của các mẫu đông khô với tá dược bảo vệ 29 26 là hỗn hợp sữa gầy với alginat các nồng độ Bảng 3.5 Số lượng vi sinh vật sống sót tính trên 1g bột sau đông khô 30 trong các mẫu đông khô sử dụng kêt hợp alginat và sữa gầy. Bảng 3.6 Số lượng vi sinh vật sống sót tính trên 1g bột đông khô sau 33 thời gian được ngâm trong môi trường acid HCl pH 1,2. DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 1.1 Chế phẩm probiotic cốm 6 Hình 1.2 Chế phẩm probiotic dạng viên nang 6 Hình 1.3 Chế phẩm dạng lỏng 6 Hình 1.4 Công thức cấu tạo của acid α- L- guluronic và acid β- D- 10 mannuronic Hình 3.1 Hình ảnh mẫu đông khô với nước cất. Hình 3.2 Đồ thị biểu thị hàm ẩm của 3 mẫu ngay sau đông khô và sau 23 21 thời gian bảo quản. Hình 3.3 Hình ảnh mẫu đông khô với alginat ngay sau khi tháo khỏi 24 máy và sau 3 phút trong điều kiện không được bảo quản. Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn tỉ lệ vi khuẩnL. acidophilus sống sót trong các 27 mẫu sau đông khô Hình 3.5 Biểu đồ thể hiện số lượng vi sinh vật sống sót sau khi thử trong 33 môi trường acid HCl pH 1,2 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn probiotic được biết đến như một nhóm vi sinh vật manglại rất nhiều lợi ích cho con người như: chống nhiễm trùng đường tiêu hóa, cải thiện khả năng dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch…[20]. Tuy nhiên hầu hết cácvi sinh vật này có một nhược điểm lớn là độ ổn định. Chúng dễ bị ảnh hưởng bởi các điều kiện của môi trường như: pH, nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm [35]. Khi sử dụng theo đường uống pH acid, enzym tiêu hóa, acid mật... là các yếu tố làm suy giảm số lượng sống sót ngăn cản việc thiết lập hệ vi sinh vật ở niêm mạc ruột. Ngoài ra các thông số liên quan trong quá trình sản xuất cũng làm ảnh hưởng đến khả năng sống sót của vi khuẩn probiotic [29]. Do đó muốn đem lại tác dụng cho vật chủ cần phải tìm những phương pháp gia tăng tỉ lệ sống sót và khả năng chống chịu của vi khuẩn probiotic trước các điều kiện bất lợi trong sản xuất, bảo quản và sử dụng. Chính vì vậy mà đã có nhiều nghiên cứu nhằm tìm các chất có tác dụng bảo vệ vi sinh vật probiotic và một trong các hướng nghiên cứu đáng chú ý trong thời gian gần đây là sử dụng alginat như một tác nhân bảo vệ nhằm gia tăng tỉ lệ sống sót của các vi khuẩn probiotic. Từ các lí do trên chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát tác dụng bảo vệ vi khuẩn của alginat trong quá trình tạo nguyên liệu probiotic chứa L. acidophilus” nhằm 2 mục tiêu sau: 1. Khảo sát khả năng sử dụng alginat làm tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô Lactobacillus acidophilus. 2. Khảo sát khả năng bảo vệ vi sinh vật của alginat khi sử dụng làm tá dược độn cho dạng thuốc rắn. 2 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Đại cương về probiotic 1.1.1. Khái niệm Thuật ngữ probiotic có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, trong đó “biotic” nghĩa là “sự sống” và “probiotic”là “dành cho sự sống”. Probiotic là những vi khuẩn sống có thể cạnh tranh với các tác nhân gây bệnh và giúp cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật đường tiêu hóa [20], [28]. Trong lịch sử probiotic được định nghĩa theo nhiều cách khác nhau, tùy thuộc vào cách hiểu của chúng ta về cơ chế tác động và ảnh hưởng của chúng tới sức khỏe và sức sống của con người. Một trong những định nghĩa được sử dụng nhiều nhất là định nghĩa của Fuller: “Probiotic là thực phẩm bổ sung các vi sinh vật sống tạo ra các tác động có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột” [29]. Năm 2001, tổ chức Nông Lương Thế Giới (FAO) đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và đầy đủ: “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác dụng có lợi cho sức khỏe của vật chủ”. Theo FAO để có được hiệu quả thực sự, thì vi sinh vật trong các chế phẩm probiotic cần phải đến được vị trí tác dụng của nó trong đường tiêu hóa. Do trong quá trình sử dụng vi khuẩn probiotic phải đối mặt với nhiều điều kiện bất lợi của đường tiêu hóa nên để đem lại tác dụngbất cứ sản phẩm chứa probiotic nào cũng phải chứa ít nhất 106 cfu/ml tế bào vi sinh vật sống cho đến ngày hết hạn sử dụng vì liều điều trị tối thiểu mỗi ngày được đề xuất là từ 108÷ 109 tế bào [20]. 1.1.2. Vai trò Các tác dụng chính có thể kể đến của probiotic là: • Ngăn chặncác bệnh nhiễm trùng đường ruột Lactobacillus acidophilus và bifidobacterialà 2 vi khuẩn được sử dụng nhiều nhất trong các chế phẩm probiotic, có khả năng ngăn chặn sự phát triển của cácnhân gây bệnh như:Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Yersiniaenterocolitica và Clostridium perfringens nhờ cạnh tranh vị trí bám trên 3 niêm mạc ruột và sinh ra các chất có tác dụng kháng khuẩn làm cho vi khuẩn có hại không phát triển được như: các barteriocine (như: nisin, lactobrevin, acidophilin, acidolin, lactobacillin,lactocidin và lactolin), acid lactic, acid acetic, hydrogen peroxid, carbon dioxid, diacetyl… [8], [20], [27]. • Tăng cường miễn dịch. Một số nghiên cứu cho thấy vi khuẩn lactic làm tăng cả 2 loại đáp ứng miễn dịch: miễn dịch đặc hiệu (ví dụ: sản xuất kháng thể, cytokinase, tăng sinh tế bào lympho) và miễn dịch không đặc hiệu- miễn dịch tự nhiên (tăng cường chức năng của đại thực bào, hoạt động của tế bào diệt tự nhiên). Sự bám dính của các vi khuẩn probiotic và các sản phẩm của chúng trên các mô lympho tại ruột sẽ kích hoạt tác động bảo vệ của hệ miễn dịch [8], [20], [28]. • Ngăn chặn bệnh tiêu chảy. Đánh giá các bằng chứng khi sử dụng chế phẩm probiotic trong các trường hợp tiêu chảy cho thấy giảm đáng kể các trường hợp tiêu chảy liên quan đến kháng sinh 52%, tiêu chảy cấp do nguyên nhân khác nhau 34% trong đó giảm 57% nguy cơ liên quan tiêu chảy cấp ở trẻ em, và 26% ở người lớn. Hiệu quả bảo vệ không khác nhau đáng kể giữa các chế phẩm chứa các chủng vi khuẩn probiotic khác nhau như:Saccharomyces boulardii, Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus và các chế phẩm khác sử dụng một mình hoặc kết hợp của hai hay nhiều chủng[20],[33]. • Chống lại tác nhân gây ung thư Những thử nghiệmin-vitro và in-vivo gần đây đã chỉ ra rằng vi khuẩn probiotic có thể làm giảm nguy cơ, tỷ lệ và số lượng các khối u đại tràng, gan và bàng quang. Hiệu quả bảo vệ chống lại sự phát triển ung thư có thể do liên kết của chất gây đột biến với vi khuẩn đường ruột, hoặc do khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn chuyển đổi procarcinogens thành chất gây ung thư, do đó làm giảm lượng chất gây ung thư trong ruột, hoặc chỉ đơn thuần là ức chế sự phát triển của các khối u bằng cách tăng cường hệ thống miễn dịch của vật chủ…[8], [20],[26]. 4 • Ngăn ngừa chứng tăng cholesterol máu. (ngăn cản hấp thu cholesterol và tái hấp thu acid mật) Các nghiên cứu sử dùng kết hợp các chế phẩm probiotic và chế độ ăn giàu cholesterol trên chuột đã cho thấy nhóm chuột trong chế độ ăn có bổ sung VSV probiotic có nồng độ cholesterol huyết tương, LDL thấp hơn đáng kể so với nhóm không dùng, trong khi đó nồng độ triglycerid, HDL-cholesterol huyết tương giữa 2 nhóm không có sự khác biệt đáng kể [10], [36], [37]. Ngoài ra một số nghiên cứu còn cho thấy sử dụng probiotic hằng ngày giúp cải thiện tình trạng gan nhiễm mỡ ở người nghiện rượu và bình thường người thường. • Tác dụng trên H. pylori Helicobacter pylori đóng vai trong chủ yếu trong nguyên nhân và bệnh sinh loét dạ dày tá tràng và là yếu tố nguy cơ của một số bệnh lí dạ dày ác tính khác như: ung thư hay u dạ dày. Đây là một xoắn khuẩn Gram âm, sống ở lớp niêm mạc và dưới niêm mạc dạ dày- tá tràng, chúng làm tổn thương niêm mạc tại chỗ [5].Các nghiên cứu dùng kết hợp phương pháp điều trị bằng PPI và kháng sinh với chế phẩm probiotic đã cho thấy phương pháp này làm giảm đáng kể tác dụng không mong muốn của kháng sinh đến hệ vi sinh vật đường tiêu hóa. Do vậy sử dụng probiotic để phòng ngừa các bệnh lí liên quan viêm loét dạ dày tá tràng là 1 hướng điều trị viêm loét dạ dày được chú ý trong những năm gần đây [12], [15],[19],[35], [36]. Ngoài những tác dụng kể trên, probiotic còn được biết đến với khả năng “cải thiện dung nạp lactose”, “ổn định hàng rào niêm mạc ruột”, “giảm các triệu chứng dị ứng thực phẩm”… Viên đặt probiotic có tác dụng tốt trong phòng ngừa và điều trị nấm âm đạo, nhiễm trùng tiết niệu, nhiễm trùng âm đạo do vi khuẩn [20], [36]. 1.1.3. Cơ chế tác dụng • Cạnh tranh năng lượng, vị trí bám. Khả năng bám vào bề mặt đường tiêu hóa tạo nên mối tương tác giữa probiotic và bề mặt niêm mạc ruột nơi có chứa nhiều tế bào lympho, việc này sẽ làm kích 5 thích miễn dịch tại chỗ và toàn bộ cơ thể. Sự bám dính của probiotic cũng tạo nên khả năng cạnh tranh gắn vào biểu mô giữa những vi khuẩn gây bệnh và probiotic [5], [8]. Một số nghiên cứu invitro cho thấy rằng cả 2 dạng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus còn sống hoặc đã bị chết do nhiệt đều có khả năng ức chế sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh [8]. Mặt khác khi các vi khuẩn probiotic phát triển trong đường tiêu hóa sẽ cạnh tranh năng lượng với các vi khuẩn gây hại từ đó hạn chế sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Ngoài ra một số cơ chế khác có thể kể đến như: “Tăng cường khả năng chống đỡ của niêm mạc ruột”, “Sản sinh ra chất có tác dụng kháng khuẩn”, “Kích thích đáp ứng miễn dịch”, “Tăng cường chức năng của hệ tiêu hóa”[8], [20], [36]. 1.1.4. Một số sản phẩm chứa probiotic trên thị trường Các chế phẩm probiotics trên thi trường hiện nay chủ yếu là dạng khô (bột, cốm, viên nén, viên nang…) mà ít thấy các chế phẩm probiotic dạng lỏng. Nguyên nhân là do ưu điểm độ ổn định, tiện sử dụng, vận chuyển của dạng thuốc rắnso với dạng thuốc lỏng. Các chế phẩm probiotic dạng lỏng hiện có trên thị trường hiện nay đều có thành phần là dạng bào tử của vi khuẩn do dạng này có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi và tồn tại trong môi trường lâu hơn. Trong khi đó hầu hết các vi khuẩn probiotic đều thuộc nhóm không có khả năng sing bào tử ngoại trừ chi Bacillus. Về nguyên liệu để sản xuất dạng thuốc rắn thì hầu hết trên thị trường hiện giờ đều là bột đông khô do khả năng duy trì số lượng VSV sống ngay cả trong quá trình bảo quản thời gian dài. Ngoài ra bột đông khô còn là dạng nguyên liệu tốt nhất để sản xuất chế phẩm probiotic dạng rắn như bột, cốm hoặc viên nén và viên nang [3]. 6  Một số hình ảnh các chế phẩm probiotic trên thị trường: Cốm vi sinh Bio King Thành phần: Lactobacilus acidophilus: 108 Cfu 108 Bifidobacterium: Cfu Streptococcus thermophilus TH: 108Cfu Một số vitamin B1, B2, B5, B6, B9. tá dược vđ: 3g Hình 1.1. Chế phẩm probiotic dạng cốm Dạng viên nang: Biolac 500mg (Hộp 10 vỉ x 10 viên) Thành phần: Lactobacillus acidophilus 106 -107 cfu Hình 1.2. Chế phẩm probiotic dạng viên nang Dạng thuốc lỏng Lactobacillus sporogenes 106 – 107 cfu Lactobacillus kefir 106 – 107cfu Enterogermina(hộp 20 ống hỗn dịch. Mỗi ống 5ml.) Thành phần: bào tửBacillus clausiiđa kháng kháng sinh Hình 1.3. Chế phẩm dạng lỏng 7 1.2. Phương pháp đông khô Đông khô từ nhiều năm nay đã được sử dụng để ổn định khả năng sống sót của vi sinh vậttrong thời gian bảo quản. Trong ngành công nghiệp sinh học, đông khô làm cho tế bào vi sinh vật được bảo vệ trong hàng thập kỉ mà không suy giảm số lượng sống sót. Ưu điểm lớn nhất của đông khô vi sinh vật là ổn định khả năng sống sót của vi sinh vật và làm quá trình vận chuyển, bảo quản trở nên thuận tiện và dễ dàng hơn [13], [25]. 1.2.1. Khái niệm Đông khô đươc định nghĩa như là một quy trình tạo sự ổn định mà trong đó vật cần đông khô được làm đông lạnh trước, tiếp theo lượng dung môi có trong vật (dung môi thường là nước) được loại đi nhờ quá trình thăng hoa, sau đó là quá trình khử ẩm liên kết còn lại đến giá trị mà sẽ không thể khiến VSV phát triển hoặc xúc tác các phản ứng hóa học [13], [24]. 1.2.2. Các giai đoạn của quá trình đông khô  Giai đoạn lạnh đông. Có thể làm lạnh đông ngay trong buồng sấy hoặc có trong buồng lạnh đông riêng bên ngoài buồng sấy.Mục đích của giai đoạn này là làm ẩm trong chế phẩm, nguyên liệu chuyển trạng thái từ lỏng sang rắn, đồng thời làm giảm nhiệt độ xuống dưới nhiệt độ của điểm ba nhiệt độ đóng băng tb của ẩm [13], [9].  Giai đoạn thăng hoa Ở giai đoạn này vật được đặt trong buồng sấy, tiến hành hút chân không. Ẩm trong vật chuyển trực tiếp từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi mà không qua giai đoạn lỏng. Trong giai đoạn này nhiệt độ và áp bên trong buồng sấy được duy trì ở mức dưới nhiệt độ đóng băng [13], [9].  Giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại. Ở giai đoạn này nhiệt độ tăng nhanh, ẩm trong vật là ẩm liên kết và ở trạng thái lỏng. Quá trình sấy trong giai đoạn này giống như quá trình sấy trong các thiết bị sấy chân không bình thường. Nhiệt độ môi chất trong buồng sấy lúc này cũng cao hơn nhiệt độ ở giai đoạn thăng hoa [9]. 8 1.2.3. Ưu nhược điểm của phương pháp đông khô  Ưu điểm Do quá trình sấy được thực hiện ở nhiệt độ thấp, nước chuyển trực tiếp từ dạng rắn sang dạng hơi nên đông khô có rất nhiều ưu điểm so với các phương pháp sấy khác như: Giữ nguyên màu sắc, cấu trúc, hương vị; Giữ được hoạt tính sinh học; Bảo vệ nguyên vẹn các vitamin như lúc còn tươi, không làm biến chất albumin… Giữ nguyên được thể tích ban đầu của vật sấy nhưng có cấu trúc xốp nên dễ hấp thụ nước để trở lại trạng thái ban đầu [9].  Nhược điểm Tuy có khá nhiều ưu điểm so với các phương pháp sấy khác nhưng đông khô cũng có những nhược điểm riêng khiến nó hiện chưa được sử dụng rộng rãi: Giá thành thiết bị cao; Vận hành phức tạp, đòi hỏi người thao tác phải có trình độ kĩ thuật cao. Tiêu hao điện năng lớn làm giá thành sản phẩm tăng cao [9]. 1.2.4. Ứng dụng Do những ưu nhược điểm ở trên nên đông khô chỉ được áp dụng trên các sản phẩm có yêu cầu chất lượng cao, đồng thời kém bền với nhiệt độ cao. Trong ngành Dược được ứng dụng để sản xuất các bột đông khô để pha tiêm (ví dụ: kháng sinh như penicillin, cephalexin…), làm khô các chế phẩm sinh học như albumin, vi sinh vật. Ngoài ra đông khô cũng được sử dụng như một phương pháp bảo quản trong ngành công nghiệp thực phẩm để bảo quản 1 số sản phẩm khác. 1.2.5. Các tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật Quá trình đông khô vi sinh vật tuy có nhiều ưu điểm nhưng nó cũng là 1 trong những nguyên nhân làm giảm số lượng vi sinh vật sống sót trong quá trình tạo nguyên liệu và chế phẩm probiotic. Đặc biệt giai đoạn tiền đông là nguyên nhân gây lên áp lực cho thành tế bào vi khuẩn. Đông lạnh làm cho lớp lipid màng tế bào dễ bị tổn thương. Một nghiên cứu khác lại cho rằng sự thay đổi hình thái tự nhiên của lipid màng và sự thay đổi cấu trúc của các protein nhạy cảm là nguyên nhân chính gây ra sự suy giảm số lượng tế bào trong quá trình đông khô [21]. Một số tài liệu lại cho rằng chính việc hình thành tinh thế đá nội phân tử có thể là nguyên nhân gây 9 phá vỡ màng tế bào. Các tá dược bảo vệ được thêm vào trong thành phần nguyên liệu đem đông khô nhằm: bảo vệ tế bào trong quá trình đông khô và đảm bảo sức chịu đựng của vi sinh vật trong quá trình làm khô [24]. Một trong những phương pháp được sử dụng để gia tăng sự sống sót của vi sinh vật trong quá trình này là bổ sung vào nguyên liệu đông khô các tác nhân bảo vệ. Các tác nhân này nhằm bảo vệ tế bào vi sinh vật trước các điều kiện bất lợi của quá trình cũng như trong thời gian bảo quản. Các tá dược được dùng để bảo vệ VSV như: Sữa gầy, nước sữa, trehalose, glycerol, betaine, adonitol, sucrose, glucose, lactose và các polymer như dextran, polyethylene glycol [13], [21], [25]. Các tác nhân bảo vệ có thể thêm vào trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật hoặc ngay trước khi làm khô.  Sữa gầy Sữa gầy hay còn gọi là “skim milk” là các sản phẩm sữa mà trong thành phần có chứa không quá 0,5 % chất béo (trong khi sữa nguyên chất chứa hàm lượng chất béo khoảng 3,5%, sữa tách bơ- butter milk chứa khoảng 1% chất béo). Sữa gầy có trong các chế phẩm đông khô probiotic vì nó có tác dụng bảo vệ tốt probiotic trong quá trình đông khô. Theo nhiều tổng kết nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước từ trước tới nay thì sữa gầy sử dụng ở nồng độ khoảng 10% cho tỉ lệ sống sót cao nhất. Tác dụng bảo vệ này có thể do nó chứa tỉ lệ dinh protein và carbohydrat- những chất mà có khả năng bảo vệ tế bào. Thành phần dinh dưỡng chính trong sữa gầy: 32- 35,7 % protein. 48,4- 54,1 % lactose. Thành phần lactose có trong sữa gầy cũng như một số disaccharid khác có thể thấm qua thành tế bào, sau đó chúng hình thành liên kết hydro giữa đường- protein. Các liên kết này giúp duy trì cấu trúc của protein màng khi nước bị loại đi. Protein giúp hình thành trạng thái glass xung quanh và bên trong tế bào tạo ra một môi trường đủ nhớt bên trong và ngoài tế bào giúp ngăn cản sự biến đổi của tế bào ở mức thấp nhất [13]. 10 Theo một nghiên cứu khác thì protein trong sữa gầy có thể tạo thành lớp áo bảo vệ trên thành tế bào, đồng thời sữa gầy còn cung cấp những chất đệm tan trong nước (muối phosphat, muối citrat) giúp ổn định pH trong quá trình đông khô [24]. Nguyên liệu đông khô với sữa gầy vừa tạo cấu trúc xốp giúp quá trình bù nước dễ dàng, nhưng đồng thời cũng làm cho nguyên liệu đông khô hút ẩm khá nhanh nếu không được bảo quản tốt. 1.3. Alginat 1.3.1. Sơ lược về alginat Alginat có nguồn gốc chủ yếu là từ tảo nâu, rong mơ.Alginat là tên chỉ chung alginic và 1 số muối của nó như natri alginat, kali alginat,… Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng cấu tạo từ hai gốc uronic là acid α- L- guluronic (G) và acid β- D- mannuronic (M). Acid α – L – Guluronic Acid β – D – Mannuronic Hình 1.4. Công thức cấu tạo của acid α- L- guluronic và acid β- Dmannuronic Tùy theo nguồn gốc của alginat mà độ dài trung bình của mạch phân tử, độ dài của mỗi block, tỷ lệ và trình tự kết hợp của chúng với nhau có khác nhau. Điều này làm cho tính chất của alginat biến đổi trong một dải rộng. 1.3.2. Một số tính chất của Natri alginat Là muối natri của acid alginic, là một vật liệu hút ẩm, tuy nhiên khá ổn định nếu được bảo quản trong điều kiện mát mẻ và độ ẩm tương đối thấp. Dung dịch Natri alginat ổn định nhất ở pH 4÷10, ở pH < 3 acid alginic bị kết tủa lại. Hấp tiệt khuẩn có thể làm giảm độ nhớt của dung dịch [17], [31], [34]. 11  Độ tan: Thực tế không tan trong ethanol (95%), ether, chloroform, và hỗn hợp ethanol nước có chứa hơn 30% ethanol. Không tan trong các dung môi hữu cơ khác và trong dung dịch acid có pH<3. Tan chậm trong nước, tạo dung dịch keo nhớt [31], [14].  Độ nhớt: Các dung dịch natri alginat của các chế phẩm khác nhau cũng có giá trị tương đối khác nhau. Thông thường độ nhớt của dung dịch 1% (kl/tt) có độ nhớt khoảng 20-400 mPas, độ nhớt thay đổi theo nồng độ, nhiệt độ, pH và sự có mặt của các ion kim loại[31].  pH: 7,2 (dung dịch 1% trong nước) [31]. 1.3.3. Ứng dụng Trong công nghệ bào chế dược phẩm, alginat được sử dụng làm tá dược rã, tá dược dính trong viên nén, tá dược kiểm soát giải phóng trong bào chế viên giải phóng kéo dài.Natri alginat còn được sử dụng làm tá dược độn trong dạng viên nang,tá dược tăng độ nhớt, ổn định thể chất trong các chế phẩm dạng kem, gel, bột nhão dùng tại chỗ. Chất phân ổn định thể chất trong nhũ tương, hỗn dịch. Trong thời gian gần đây natri alginat được sử dụng để bào chế dạng vi nang và siêu vi nang chứa dược chất, hay được sử dụng trong một số dạng chế phẩm tác dụng tại chỗ khác như thuốc nhỏ mắt, nhỏ mũi [31].Trong công nghệ vi sinh, alginat được sử dụng trong kĩ thuật bất động tế bào và bất động enzym, ngoài ra hiện nay nó đang được nghiên cứu ứng dụng để tạo vi nang chứa vi sinh vật để tăng khả năng sống của chúng trong các điều kiện bất lợi[16], [23], [29]. Trong ngành y tế, loại vải sợi sản xuất từ natri và calci alginat được sử dụng để băng vết thương, cầm máu và làm vết thương mau lành hơn. Ngoài ra, do tính trương nở trong nước và khả năng bám dính của dạng gel trong nước, natrialginat được sử dụng trong một số thuốc dùng để ngăn cản trào ngược dạ dày- thực quản, giảm chứng ợ hơi… [31].