Khảo sát sự lƣu hành của vi khuẩn e. coli sinh beta lactamase phổ rộng trên gà khỏe tại một số trại gà thuộc huyện mỹ tú tỉnh sóc trăng

  • Số trang: 39 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 20 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y HUỲNH NGỌC HUYỀN KHẢO SÁT SỰ LƢU HÀNH CỦA VI KHUẨN E. coli SINH BETA LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN GÀ KHỎE TẠI MỘT SỐ TRẠI GÀ THUỘC HUYỆN MỸ TÚ TỈNH SÓC TRĂNG Luận văn tốt nghiệp Ngành: BÁC SĨ THÚ Y Cần Thơ, 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y Luận văn tốt nghiệp Ngành BÁC SĨ THÚ Y Tên đề tài KHẢO SÁT SỰ LƢU HÀNH CỦA VI KHUẨN E. coli SINH BETA LACTAMASE PHỔ RỘNG TRÊN GÀ KHỎE TẠI MỘT SỐ TRẠI GÀ THUỘC HUYỆN MỸ TÚ TỈNH SÓC TRĂNG Giảng viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện HUỲNH NGỌC TRANG HUỲNH NGỌC HUYỀN MSSV: 3103025 Lớp: CN10Y4A1 – K36 Cần Thơ, 2014 i TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y Đề tài: “Khảo sát sự lƣu hành của vi khuẩn E. coli sinh beta lactamase phổ rộng trên gà khỏe một số trại gà thuộc huyện Mỹ Tú tỉnh Sóc Trăng”, do sinh viên Huỳnh Ngọc Huyền thực hiện tại Bộ môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trƣờng Đại Học Cần Thơ. Từ tháng 8/2014 đến tháng 12/2014. Cần Thơ, ngày….tháng…..năm 2014 Cần Thơ, ngày….tháng…..năm 2014 Giảng viên hƣớng dẫn Duyệt Bộ Môn Huỳnh Ngọc Trang Cần Thơ, ngày….tháng…..năm 2014 Duyệt Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn trƣờng Đại học Cần Thơ, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Bộ môn Thú y cùng tất cả thầy cô đã tận tâm dạy dỗ truyền đạt những tri thức khoa học và kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình rèn luyện và học tập tại trƣờng. Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô Bùi Thị Lê Minh và cô Huỳnh Ngọc Trang đã tạo điều kiện tốt nhất, tận tình giúp đỡ và hƣớng dẫn để tôi hoàn thành luận văn. Cảm ơn các anh chị cao học đã nhiệt tình hỗ trợ giúp đỡ tôi trong học tập cũng nhƣ trong suốt quá trình làm bài. Xin cảm ơn gia đình, bạn bè tất cả những ngƣời đã luôn bên tôi, giúp đỡ tôi hết mình những lúc khó khăn để tôi hoàn thành tốt. Một lần nữa xin chân thành cảm ơn tất cả mọi ngƣời. iii TÓM LƢỢC Đề tài thực hiện nhằm khảo sát sự lưu hành của vi khuẩn Escherichia coli ESBL tại huyện Mỹ Tú trên 4 loại mẫu của gà khỏe. Qua khảo sát trên 22 con gà khỏe gồm 11 gà thịt khỏe và 11 gà đẻ loại, mỗi gà phân tích 4 mẫu: phân, gan, thịt, phổi. Phân lập Escherichia coli ESBL bằng phương pháp đĩa kết hợp và thử nghiệm kháng sinh đồ. Kết quả: Tỉ lệ nhiễm Escherichia coli sinh ESBL trên gà khỏe khá cao 68,18%. Trong đó Escherichia coli sinh ESBL trên gà thịt 81,82% và gà đẻ 36,36%. Tỉ lệ Escherichia coli sinh ESBL trên các cơ quan phân, gan, phổi lần lượt là 59,1%, 9,1% và 13,64%, không phát hiện Escherichia coli sinh ESBL trên thịt. Thử nghiệm kháng sinh đồ 46 chủng Escherichia coli sinh ESBL nhạy cảm với amikacin 100%, fosfomycin 95,65% và doxycylin 84,78%. Đề kháng cao với ampicillin 100%, cefuroxime 95,65%, cefaclor, gentamycin, streptomycin, trimethoprim-sulfamethoxazole 97,83%, kanamycin 78,26%, ofloxacin 93,48%, norfloxacin 91,3%. Các chủng Escherichia coli ESBL cùng lúc đề kháng từ 3 đến 11 loại kháng sinh là 100% (46/46) với 11 kiểu hình đa kháng. Trong đó kháng cùng lúc 3 loại kháng sinh chiếm 2,17%, kháng 7 loại chiếm 6,52%, kháng 8 loại 17,39%, kháng 9 loại 30,44%, kháng 10 loại 32,61%, kháng 11 loại 10,87%. iv MỤC LỤC TRANG TỰA ........................................................................................................... ...i TRANG DUYỆT .................................................................................................... …ii LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ iii TÓM LƢỢC .............................................................................................................. iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................ vii DANH SÁCH BẢNG .............................................................................................. viii DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. ix CHƢƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................... 1 CHƢƠNG 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN ................................................................................ 2 2.1. Vi khuẩn Escherichia coli ................................................................................ 2 2.1.1 Đặc điểm hình thái ...................................................................................... 2 2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy ...................................................................................... 2 2.1.3 Đặc tính sinh hóa ........................................................................................ 3 2.1.4 Sức đề kháng và tính gây bệnh ................................................................... 4 2.2 Kháng sinh nhóm beta- lactam.......................................................................... 5 2.2.1 Phân loại kháng sinh nhóm beta-lactam ..................................................... 5 2.2.2 Cơ chế tác động của kháng sinh nhóm beta- lactam .................................. 5 2.2.3 Cơ chế đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh ........................................... 5 2.3 Men beta- lactamase phổ rộng .......................................................................... 6 2.3.1 Đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli sinh ESBL ............................... 6 2.3.2 Phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn E. coli sinh ESBL .................................. 6 2.4. Những nghiên cứu vi khuẩn E. coli sinh ESBL trên thế giới .......................... 8 CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ....................................................... 11 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu .................................................................................. 11 3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tƣợng nghiên cứu ............................................. 11 3.1.2 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm ................................................................... 11 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................. 11 3.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu ............................................................................... 11 3.2.2 Phân lập vi khuẩn E. coli sinh ESBL ........................................................ 12 3.2.3 Phƣơng pháp làm kháng sinh đồ............................................................... 14 v 3.2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu ........................................................................ 15 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 16 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn E. coli sinh ESBL trên gà ở huyện Mỹ Tú tỉnh Sóc Trăng. .................................................................................................................... 16 4.2 Kết quả sự hiện diện E.coli sinh ESBL trên cơ quan phủ tạng và phân ......... 17 4.3. Kết quả khảo sát tính nhạy cảm của vi khuẩn E. coli đối với một số loại kháng sinh ............................................................................................................. 19 4.4 Kết quả đa kháng của vi khuẩn E. coli sinh ESBL đối với một số loại kháng sinh ........................................................................................................................ 21 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 23 5.1 Kết luận ........................................................................................................... 23 5.2 Đề nghị ............................................................................................................ 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 24 PHỤ CHƢƠNG ........................................................................................................ 27 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ CSLI Clinical and Laboratory Standards Institute E. coli Escherichia coli ESBL Extended spectrum beta lactamase EMB Eosin Methylene Blue IMViC Indole, Methy Red, Voges prokauer, Citrate LT Heat Labile MC MacConkey Agar MHA Mueller – Hinton Agar MR Methyl Red NA Nutrient Agar PBP Penicillin – binding protein ST Heat Stable VP Voges ProsKauer vii DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli 12 3.2 Tiêu chuẩn phân tích kết quả đƣờng kính vô khuẩn của kháng sinh (CLSI, 2014) 15 4.1 Tỉ lệ vi khuẩn E. coli ESBL trên gà khỏe ở huyện Mỹ Tú 16 4.2 Tỉ lệ dƣơng tính E. coli ESBL trên cơ quan gan, thịt, phổi và mẫu phân 17 4.3 Tỉ lệ kháng của vi khuẩn E. coli ESBL 19 4.4 Tỉ lệ đa kháng và kiều kháng của vi khuẩn E. coli ESBL với kháng sinh của vi khuẩn E. coli ESBL 21 viii DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang 1 Vi khuẩn E. coli dƣới kính hiển vi (X=10µm) 2 2 Vi khuẩn E. coli trên môi trƣờng MC 12 3 Sinh hóa xác định E. coli 12 4 Quy trình phân lập vi khuẩn E. coli ESBL 13 ix CHƢƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi nói chung và ngành chăn nuôi gà công nghiệp nói riêng đang khẳng định vai trò hết sức quan trọng vào sự tăng trƣởng chung của đất nƣớc, chiếm tỷ trọng cao trong cơ cấu kinh tế nông nghiệp. Chăn nuôi gà công nghiệp không chỉ dừng lại ở tập quán sản xuất đơn thuần, mà ngày càng đƣợc ngƣời chăn nuôi chú ý đầu tƣ, áp dụng tiến bộ khoa học vào sản xuất để nâng cao năng suất, chất lƣợng. Sóc Trăng là tỉnh có nhiều tiềm năng lợi thế về điều kiện tự nhiên, kinh tế phù hợp để phát triển chăn nuôi gà công nghiệp. Theo kết quả điều tra chăn nuôi thời điểm 1/4/2013 toàn tỉnh có 4,06 triệu con gia cầm, trong đó, đàn gà hiện có 2,7 triệu con, chiếm 68,28% tổng đàn gia cầm, tăng 6,66% so với cùng thời điểm năm trƣớc (Hoàng Thọ, 2013). Tuy nhiên, việc phát triển nhanh chóng đồng thời cũng làm tăng nguy cơ lây lan dịch bệnh, ảnh hƣởng không nhỏ tới năng suất và hiệu quả chăn nuôi. Theo Hồ Thị Việt Thu (2012), hầu hết các loài gia cầm ở mọi lứa tuổi đều mẫn cảm với vi khuẩn E. coli . Trong các bệnh nhiễm trùng trên gà thì E.coli là bệnh phổ biến nhất, xảy ra ở mức độ ngày càng tăng và có thể trở thành một vấn nạn trong ngành công nghiệp chăn nuôi gia cầm (Võ Thị Trà An, 2012). Để đối phó với dịch bệnh do E. coli gây ra thì kháng sinh là lựa chọn hàng đầu và đã đem lại nhiều thành công trong điều trị. Tuy nhiên, việc sử dụng rộng rãi kháng sinh đã vô tình tạo ra áp lực chọn lọc để vi khuẩn E. coli có khả năng kháng lại một số loại kháng sinh bằng cách sinh men beta- lactam. Những đối tƣợng vật nuôi có áp lực sử dụng kháng sinh nhiều nhƣ gà thì vi khuẩn gây bệnh hiện diện trên gà càng có khả năng kháng với kháng sinh cao hơn vi khuẩn hiện diện trên các loại vật nuôi khác. Vi khuẩn đề kháng kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị nhiễm trùng, lây truyền qua nhiều thế hệ, hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn không gây bệnh nhƣng đề kháng kháng sinh hay đa đề kháng còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để truyền cho những vi khuẩn gây bệnh khác (Võ Thị Trà An, 2007). Hiện tƣợng kháng thuốc của E. coli ở gia cầm là do kháng sinh đƣợc bổ sung thƣờng xuyên vào thức ăn và nƣớc uống để phòng trị bệnh, cũng nhƣ việc sử dụng kháng sinh không hợp lí trong chăn nuôi không theo khuyến cáo (Đỗ Võ Anh Khoa và Lƣu Hữu Mãnh, 2012). Mỹ Tú là một trong những huyện thuộc tỉnh Sóc Trăng tập trung nhiều cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp qui mô lớn. Tuy nhiên chƣa có những nghiên cứu về tỉ lệ E. coli sinh ESBL trên những trang trại gà của huyện, do đó “Khảo sát sự lƣu hành của vi khuẩn E. coli sinh beta- lactamase phổ rộng trên gà khỏe tại một số trại gà thuộc huyện Mỹ Tú tỉnh Sóc Trăng” đƣợc thực hiện. Mục tiêu đề tài: - Xác định tỉ lệ E.coli ESBL dƣơng tính trên đàn gà khỏe nuôi công nghiệp tại huyện Mỹ Tú tỉnh Sóc Trăng. Thử tính nhạy cảm vi khuẩn E. coli sinh ESBL với một số loại kháng sinh. 1 CHƢƠNG 2. CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1. Vi khuẩn Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) lần đầu tiên phân lập từ phân trẻ em bị tiêu chảy năm 1885 và đặt theo tên của bác sĩ nhi khoa Đức. Vi khuẩn E. coli thuộc chi Escherichia họ Anterobacteriaceae, họ vi khuẩn thƣờng trực ở trong ruột, chiếm tới 80% các vi khuẩn hiếu khí vừa là vi khuẩn cộng sinh thƣờng trực đƣờng tiêu hoá, vừa là vi khuẩn gây nhiều bệnh ở đƣờng ruột và ở các cơ quan khác (Lê Văn Tạo, 1997). Theo Hồ Thị Việt Thu (2012), E. coli đƣợc thải qua phân với số lƣợng lớn, hầu hết các loài gia cầm đều mẫn cảm với vi khuẩn E. coli. Theo P. J. Quinn et al. (1994), E. coli có nhiều trong ruột của động vật ăn thịt, ăn tạp hơn là động vật ăn cỏ, sống vài tuần đến vài tháng trong bụi, phân, nƣớc, ngoài tự nhiên. Các loài E. coli hiện diện rộng rãi trong môi trƣờng bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn tại rất lâu trong môi trƣờng. Gần đây ngƣời ta còn chứng minh đƣợc rằng E. coli cũng hiện diện ở những vùng nƣớc ấm, không bị ô nhiễm chất hữu cơ. Các dòng E. coli gây bệnh gây ra các triệu chứng rối loạn đƣờng tiêu hóa. (Trần Minh Tùng, 2010) 2.1.1 Đặc điểm hình thái E. coli là trực khuẩn ngắn, Gram âm, có hình dạng đồng nhất và không hình thành nha bào. Kích thƣớc trung bình từ 2 – 3µm x 0,6µm, phần lớn E. coli di động và có lông roi quanh thân (Hồ Thị Việt Thu, 2012). Vi khuẩn bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẩm ở hai đầu, khoảng giữa nhạt hơn. Nếu cố định bằng axit osmic rồi quan sát dƣới kính hiển vi thấy tế bào E. coli có nhân đó là một khối nằm trong nguyên chất màu sáng (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997). Hình 1 Vi khuẩn E. coli dƣới kính hiển vi (X=10µm) http://bacteriainphotos.com/ 2 2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy E. coli là trực khuẩn yếm khí và hiếu khí tùy tiện, có thể sống đƣợc ở nhiệt độ từ 5400C, nhiệt độ thích hợp là 370C, pH thích hợp là 7,2- 7,4 phát triển đƣợc ở pH 5,58,0 (Lƣu Hữu Mãnh, 2010). Theo Nguyễn Ngọc Hải, (2012) E. coli phát triển dễ dàng trên môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng ở 370C .Trên môi trƣờng MacConkey, Endo, EMB (Eosin Methylen Blue) E. coli hình thành nên khuẩn lạc điển hình có thể phân biệt với các vi khuẩn khác. Trên môi trƣờng MacConkey, vi khuẩn lên men đƣờng lactose và hình thành những khuẩn lạc màu đỏ hồng, tròn, bóng, không nhầy. Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ có ánh kim hoặc không có ánh kim trên môi trƣờng Endo, khuẩn lạc có màu đen tím trên môi trƣờng EMB (Lê Văn Việt Mẫn, 2006). Môi trƣờng Mueller-Hinton Agar là môi trƣờng trong, dùng cho thử nghiệm tính nhạy cảm của vi sinh vật với kháng sinh. Môi trƣờng cũng thƣờng đƣợc dùng để thử nghiệm sự thuỷ phân tinh bột. Môi trƣờng NA (Nutrient Agar) thƣờng đƣợc dùng làm môi trƣờng lƣu giữ chủng. sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn, ƣớt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đƣờng kính từ 2 – 3 mm. Nuôi lâu khuẩn lạc gần nâu nhạt và phát triển rộng ra. 2.1.3 Đặc tính sinh hóa E. coli có khả năng lên men đƣờng fructoz, glucose, levulo, galactoz, lactose, mantose, mannitol, xylose, glycerol, rhamnose, sorbitol và arabinose. Hầu hết các chủng vi khuẩn E. coli đều lên men đƣờng lactose nhanh và sinh hơi, đây là một đặc điểm quan trọng để phân biệt vi khuẩn E. coli và Sallmonella. E. coli không lên men dextrin, glycogen, inositol, salisin, ít khi lên men inulin, pectin. E. coli không sinh H2S, không tan chảy gellatin, không phân hủy đạm, hoàn nguyên nitrate thành nitrite (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997). Theo Nguyễn Ngọc Hải (2011) để khẳng định E. coli với vi khuẩn đƣờng ruột khác, ngƣời ta thƣờng sử dụng thử nghiệm IMViC với các phản ứng: Môi trƣờng Trypton Water dùng để kiểm tra tính sinh indole của vi khuẩn, môi trƣờng có tryptophan, E. coli nhờ có tryptophan sẽ ly giải tryptophan thành indole khi nhỏ thuốc thử Kowacs vào nếu trên bề mặt môi trƣờng xuất hiện vòng đỏ thì phản ứng dƣơng tính và ngƣợc lại nếu trên bề mặt môi trƣờng không xuất hiện vòng đỏ thì indole âm tính. Môi trƣờng VP dùng để kiểm tra tính di động và tính sinh aceton của vi khuẩn. Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trƣờng. Ngƣợc lại, vi khuẩn không có khả năng di động thì chỉ thấy vi khuẩn mọc theo đƣờng kim cấy, môi trƣờng xung quanh trong. Sau khi nhỏ thuốc thử VP1, VP2 vào nếu trên bề mặt môi trƣờng có vòng đỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh aceton. Ngƣợc lại, nếu trên bề mặt môi trƣờng không xuất hiện vòng đỏ thì vi khuẩn không có khả năng sinh aceton. Tùy loại enzyme vi khuẩn có đƣợc mà quá trình lên men glucose sẽ cho ra sản phẩm cuối cùng khác nhau, một trong số đó là aceton sẽ tạo phức hợp màu đỏ với naphthol và KOH. 3 Môi trƣờng MR dùng để kiểm tra tính sử dụng đƣờng của vi khuẩn. Nhỏ lên bề mặt môi trƣờng ít giọt thuốc thử Methel Red, phản ứng dƣơng tính sẽ có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trƣờng và ngƣợc lại. Môi trƣờng Simmon Citrat Agar dùng để kiểm tra khả năng sử dụng citrate thay nguồn cacbon của vi khuẩn. Trên môi trƣờng này, vi khuẩn cho kết quả dƣơng tính khi màu của môi trƣờng chuyển từ xanh lục sang xanh dƣơng và âm tính khi môi trƣờng vẫn giữ màu xanh lá cây. Trong môi trƣờng simmon nguồn cacbon duy nhất là citrate, vi khuẩn sử dụng citrate sẽ kiềm hóa môi trƣờng làm môi trƣờng đổi từ xanh lục sang xanh lơ. E .coli không có khả năng sử dụng citrate nhƣ nguồn carbon duy nhất, môi trƣờng không đổi màu. 2.1.4 Sức đề kháng và tính gây bệnh E. coli bị diệt ở 550C trong 1 giờ, 600C trong 15 - 30 phút, các chất sát trùng nhƣ acid phenic, formol có thể bị diệt trong 5 phút. Đề kháng với sự sấy khô, 95% E. coli bị diệt ở nhiệt độ đông lạnh trong 2 giờ (Lê Văn Tạo, 2006). Cấu trúc kháng nguyên của E. coli gồm kháng nguyên thân O (somatic), kháng nguyên lông H (flagellar), kháng nguyên vỏ K (capsular): Kháng nguyên O (kháng nguyên thân) đƣợc phân bố trong vách tế bào bao gồm hỗn hợp lipid – polysaccharide – protein, lipid xác định độc tính colitoxin, polysaccharid xác định tính đặc thù của huyết thanh và protein mang tính kháng nguyên (Đoàn Ngọc Tuấn, 2006). Kháng nguyên K (kháng nguyên vỏ bọc) kháng nguyên giáp mô K (capsular antigen) giúp E. coli bám vào tế bào biểu mô trƣớc khi xâm lấn đƣờng tiêu hóa hay đƣờng tiết niệu. Kháng nguyên H (kháng nguyên lông) cấu tạo bởi protein và có tính chất không chịu nhiệt khi kháng nguyên H gặp kháng thể tƣơng ứng sẽ xảy ra hiện tƣợng ngƣng kết H. Có ý nghĩa trong xác định giống loài vi khuẩn (Đoàn Ngọc Tuấn, 2006). Độc tố gồm có hai loại: nội độc tố và ngoại độc tố, ngoại độc tố gồm hai loại: loại chịu nhiệt Stabile toxin (ST) và loại không chịu nhiệt Labile toxin (LT). Nội độc tố: gồm 2 loại Enterotoxin LT: không bền với nhiệt độ, LT gây hoạt hoá adennylcylase trong tế bào biểu mô ruột, làm tăng lƣợng AMP (adenosine monophosphate) vòng, ức chế tái hấp thụ Na+, hậu quả cuối cùng là tiêu chảy mất nƣớc. Enterotoxin ST: bền với nhiệt gồm STa và STb không có tính kháng nguyên. ST tác động lên ruột bằng sự hoạt hoá emzyme guaylate cyclate làm tăng GMP (guanosine monophosphate) vòng dẫn đến kích thích bài tiết nƣớc muối gây tiêu chảy. Tính gây bệnh của E. coli đƣợc chia thành 2 loại: Trong đƣờng ruột và ngoài đƣờng ruột. Trong đƣờng ruột gồm có ETEC (Enterotoxigenic E. coli), EIEC (Enteroinvasive E. coli), EPEC (Enteropathogenic E. coli), EHEC (Enterohemorrhagic E. coli), EAEC (Enteroaggregative E. coli), DAEC (Diffusely adhering E. coli). Ngoài đƣờng ruột gồm MAEC (Meningitidis-associated E. coli), UPEC (Uropathogenic E. coli) 4 2.2 Kháng sinh nhóm beta- lactam Tất cả các kháng sinh nhóm beta- lactam đều có vòng beta- lactam trong cấu trúc phân tử. Vòng beta- lactam có cấu trúc không gian hóa học 4 cạnh gồm 3 nguyên tử C và một nguyên tử N. 2.2.1 Phân loại kháng sinh nhóm beta-lactam Theo Huỳnh Kim Diệu (2012) kháng sinh beta-lactam gồm các nhóm: penam, penem, cephem và monobactam và nhóm ức chế men beta-lactamase không có hoạt tính kháng khuẩn dùng phối hợp với các beta-lactams để có tác động trên betalactamase. Đặc điểm chung của nhóm này là có một vòng beta-lactam. Nhóm betalactams đƣợc sử dụng rộng rãi vì có phổ kháng khuẩn đa dạng và ít độc tính. Một số kháng sinh thuộc nhóm penicillin: benzyl penicillin, phenoxypenicillin, ampicillin, amoxicillin. Phân nhóm cephalosporins gồm có: Cephalosporin I: cefalotin, cefazolin, cefaclor, cephalexin. Cephalosporin II: cefamendol, cefuroxim, cefoxitin. Cephalosporin III: cefotaxim, cefixim, ceftriaxone, cefpodoxim, ceftiazidim. 2.2.2 Cơ chế tác động của kháng sinh nhóm beta- lactam Các kháng sinh nhóm beta- lactam ức chế sự tổng hợp thành tế bào vi khuẩn bằng cách can thiệp vào các enzyme transpeptidase có vai trò trong sự tạo các liên kết của chuỗi peptidoglycan. Các enzyme này liên kết với 1 nhóm protein gọi là PBP (penicillin – binding protein) nằm ở bên ngoài màng nguyên sinh chất. Nhƣ vậy, điểm tác động của kháng sinh nhóm beta- lactam chính là PBP. Mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một kháng sinh trong nhóm này tùy thuộc vào mức độ gắn kết với PBP, khả năng xâm nhập vào tế bào và khả năng kháng đƣợc các enzyme betalactam. Beta- lactam không chỉ ức chế những kết nối cuối cùng của peptidoglycan trong tiến trình tổng hợp thành vi khuẩn mà còn gây tiết lipoteichoic acid tạo phản ứng tự ly giải của vi khuẩn do sự hƣ hỏng peptidoglycan. Beta - lactam có tác động sát khuẩn phụ thuộc thời gian, nghĩa là phải đảm bảo rằng trong thời gian trị liệu nồng độ kháng sinh trong huyết tƣơng hoặc mô bào đạt trên MIC. Tuy nhiên, do beta- lactam chỉ tác động lên vi khuẩn trong giai đoạn tăng trƣởng (giai đoạn tổng hợp thành), ở nồng độ quá cao trên mức nồng độ sát khuẩn tốt nhất sẽ gây hiệu ứng Eagle (hiệu ứng ngƣợc), nghĩa là giảm khả năng sát khuẩn. Đây là một khái niệm quan trọng để tránh sử dụng quá liều kháng sinh nhóm này (Võ Thị Trà An, 2010). 2.2.3 Cơ chế đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh Theo Võ Thị Trà An, (2010) vi khuẩn kháng kháng sinh nhờ vào các cơ chế chủ yếu sau: sản xuất enzym làm vô hoạt kháng sinh; tạo ra enzym thay thế enzym mà kháng sinh tác động vào; đột biến hoặc sửa đổi ở điểm tiếp nhận làm giảm gắn kết của kháng sinh với điểm tiếp nhận; giảm hấp thu kháng sinh vào tế bào vi khuẩn, đẩy kháng sinh ra ngoài bằng bơm thoát dòng làm nồng độ kháng sinh trong tế bào 5 giảm. Khi gen kháng thuốc của vi khuẩn nằm trên nhiễm sắc thể thì sẽ có khả năng bảo tồn sự đề kháng. Ngƣợc lại khi yếu tố di truyền nằm trên plasmid nhất là plasmid tiếp hợp, vi khuẩn sẽ có khả năng truyền sự đề kháng này cho vi khuẩn khác của cùng loài hay khác loài. Từ đó sự kháng kháng sinh tăng dần lên trong quần thể vi khuẩn. 2.3 Men beta- lactamase phổ rộng Men beta- lactamase phổ rộng (ESBL) đƣợc tìm thấy lần đầu tiên năm 1983 tại Đức, thƣờng gặp trong các chủng vi khuẩn đƣờng ruột đặc biệt là E. coli, khi các chủng vi khuẩn sinh ESBL thì đồng nghĩa với việc chúng kháng lại rất nhiều các kháng sinh, đặc biệt là nhóm cephaslosporin. Đây là trở ngại thực sự trong điều trị nhiễm trùng trực khuẩn Gram âm (Nguyễn Tuấn Minh, 2008). Men beta- lactamase có thể đƣợc phân loại dựa vào khả năng thủy phân các cơ chất thuộc kháng sinh beta- lactam và mức độ bị ức chế bởi acid clavulanic, nhƣng các đột biến đơn giản có thể làm thay đổi sự phân loại này. Ví dụ TEM -1 là một penicillinase đơn giản và hoạt động của chúng có thể bị ức chế bởi acid clavulanic và tazobactam. Tuy nhiên, do đột biến điểm các enzyme TEM có phổ hoạt động rộng hơn dẫn đến sự đề kháng với cephalosporin thế hệ thứ 3. Sự bất hoạt của aztreonam, ceftazidime, cefotaxime hoặc ceftriaxone đƣợc xem là chỉ thị cho sự hiện diện của các men beta-lactamase có phổ rộng (Võ Thị Trà An, 2010). 2.3.1 Đề kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli sinh ESBL Theo Nguyễn Sâm (2012) các vi khuẩn sinh ESBL thƣờng đề kháng cao với nhiều nhóm kháng sinh, các nguyên nhân chính đang đƣợc ghi nhận đó là : Các ESBL thƣờng đƣợc mã hóa qua trung gian plasmide các gen đề kháng kháng sinh thƣờng liên kết theo nhóm, dẫn đến gen đề kháng cùng bị đột biến với các kháng sinh nhóm khác. Khi đã đề kháng kháng sinh do ESBL sẽ có sự thay thế kháng sinh điều trị mới dẫn tới tăng đột biến cảm ứng tạo gen đề kháng kháng sinh các nhóm kháng sinh thay thế nhiều hơn các vi khuẩn thông thƣờng. Vi khuẩn sinh ESBL còn có khả năng đề kháng chéo với các nhóm kháng sinh khác. Nhƣ vậy, nhìn từ lịch sử phát hiện cũng nhƣ các đặc điểm phân loại và cơ chế đề kháng kháng sinh thì bản chất của vi khuẩn sinh ESBL sẽ có những đặc điểm sau. Gen mã hóa ESBL nằm trên plasmide do đột biến từ các gen beta- lactam cổ điển nhƣ TEM-1, SHV-1. ESBL sinh ra do đột biến cảm ứng từ việc sử dụng các cephalosporin phổ rộng thế hệ thứ 3. Vi khuẩn sinh ESBL kháng hầu hết kháng sinh beta- lactam kể cả cephalosporin thế hệ 3, 4 và aztreonam. Kháng chéo kèm với các kháng sinh nhóm aminoglycosides, fluoroquinolones và nhiều kháng sinh khác. Tuy nhiên, còn nhạy cảm với các beta- lactam kết hợp chất ức chế, nhạy cảm carbapenem, cephamicins, temocillin các nhóm kháng sinh có cấu trúc tƣơng tự nhau. 2.3.2 Phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn E. coli sinh ESBL Theo Phạm Hùng Vân (2009), Tạ Văn Ngọc Đức (2007) đƣợc trích dẫn bởi Hà Vũ Minh Trang (2012), nguyên tắc chung để phát hiện vi khuẩn sinh men beta- 6 lactamase dựa trên chất ức chế men beta lactamase. Một acid clavulanic kết hợp với một oxymino- cephalosphorin nhƣ ceftazidime, cefotaxim. Phương pháp xét nghiệm đĩa kết hợp (Combination Disk Test- CDT) Phƣơng pháp này dựa trên sự so sánh đƣờng kính vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh oxymino- cephalosphorin khi không có và có kết hợp với acid clavulanic. Hội đồng quốc gia về các tiêu chuẩn cận lâm sàng đề nghị dùng cả 2 loại kháng sinh cefotazim và ceftazidime cho xét nghiệm này. Thêm 10µg acid clavulanic vào đĩa kháng sinh oxymino- cephalosphorin, nếu có sự gia tăng lớn hơn 5mm đƣờng kính vòng vô khuẩn so với đĩa kháng sinh oxymino-cephalosphorin không có acid clavulanic thì xét nghiệm dƣơng tính, xác nhận có sự sinh men ESBL của vi khuẩn. Ngoài ra theo Nguyễn Sâm (2009), một số phƣơng pháp khác nhƣ phƣơng pháp ChromID ESBL agar, phƣơng pháp E – test, phƣơng pháp Vitek ESBL test, phƣơng pháp Micro scan panels . ChromID ESBL agar Môi trƣờng chứa kháng sinh cefpodoxime và chất màu. Chất màu đƣợc thêm vào để dễ dàng phát hiện các phản ứng do enzyme của vi khuẩn nếu có trong môi trƣờng. Vì vậy có thể đồng thời vừa định danh vi khuẩn vừa phát hiện vi khuẩn đề kháng. Nếu vi khuẩn sinh ESBL sẽ kháng với cefpodoxime và có khả năng phát triển trên môi trƣờng ChromID ESBL tạo thành các khuẩn lạc có màu sắc khác nhau, đặc trƣng cho một số loài vi khuẩn. Ƣu điểm: dễ dàng tiến hành, giá thành rẻ dễ triển khai ở tất cả các cơ sở vi sinh lâm sàng có nuôi cấy vi khuẩn đặc biệt nhanh chóng sàng lọc các vi khuẩn đƣờng ruột sinh ESBL đồng thời định danh sơ bộ đƣợc một số loài vi khuẩn nhƣ E. coli và K. pneumoniae. Hạn chế: một số vi khuẩn kháng kháng sinh cefpodoxime không phải do sinh ESBL mà theo cơ chế khác hoặc sinh cephalosporinase, penicillinase... có thể mọc trên môi trƣờng này. Một số vi khuẩn màu sắc khuẩn lạc không điển hình, không màu hoặc nhiều loài vi khuẩn có thể có màu sắc khuẩn lạc giống nhau. Vi khuẩn sinh ESBL chậm hoặc yếu có thể không mọc trên môi truờng này sau 18 - 48h nuôi cấy. Phương pháp đĩa đôi (double disk diffusion test) Các ESBL có khả năng phân hủy các cephalosporin phổ rộng nhƣng bị ức chế bởi acid clavulanic, dẫn đến xuất hiện vùng ức chế vi khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh AMC và mở rộng vùng ức chế giao thoa giữa AMC với CAZ và CTX . Ƣu điểm: phƣơng pháp dễ thực hiện, rẻ tiền, độ nhạy và đặc hiệu cao > 95% . Nhƣợc điểm: khó lựa chọn đƣợc khoảng cách tối ƣu giữa 2 khoanh giấy ở từng vi khuẩn, âm tính giả với các ESBL hoạt tính thấp, không phát hiện đƣợc các vi khuẩn P.aeruginosa và một số vi khuẩn có ESBL giảm ức chế acid clavulanic thƣờng gặp nhƣ ESBL type OXA-. 7 Băng giấy E- test ESBL ESBL bị ức chế bởi acid clavulanic nên E. coli sinh ESBL sẽ có vùng ức chế vi khuẩn ở phần chứa kháng sinh kết hợp acid clavulanic, phần còn lại không có chất ức chế dẫn đến kháng sinh bị ESBL phân hủy nên vùng ức chế vi khuẩn nhỏ hơn hoặc không có vùng ức chế do vi khuẩn không bị kháng sinh ức chế hoặc chỉ bị ức chế ở nồng độ kháng sinh cao. Vi khuẩn sinh ESBL (+) sẽ có vùng ức chế hình ellip, hoặc phần kết thúc nồng độ MIC biến mất tạo thành bóng ellip hoặc vòng bị biến dạng của hình ellip và nồng độ MIC phía kháng sinh không kết hợp clavulanic acid tăng gấp ≥ 8 lần phần còn lại . Ƣu điểm: dễ tiến hành, có độ nhạy và đặc hiệu cao tới 100%, đây cũng là phƣơng pháp chính xác nhất hiện nay đƣợc dùng để khẳng định ESBL (+). Nhƣợc điểm: giá thành cao nên khó tiến hành rộng rãi. Trong một số trƣờng hợp phƣơng pháp này cho kết quả không xác định do các trƣờng hợp IRT enzyme (inhibitor resistant TEM) hoặc AmpC enzymes hoặc vi khuẩn kháng beta-lactam theo cơ chế khác. Vitek ESBL Card Phƣơng pháp này dùng card MIC có chứa cephalosporin nồng độ bắt đầu từ 0,5µg/ml trộn với acid clavulanic nồng độ 4µg/ml. Kết quả nếu vi khuẩn có ESBL sẽ cho MIC cephalosporin ≥ 8µg/ml, phƣơng pháp này có độ nhạy và đặc hiệu không cao lắm (khoảng 90%). Micro scan panels Tấm panel nhựa có 4 giếng chứa môi trƣờng kháng sinh cephalosporin và cephalosporin/acid clavulanic, cấy vi khuẩn vào các giếng để tủ ấm 18-24h đọc kết quả, nếu ESBL (+) vi khuẩn sẽ không mọc ở giếng có cephalosporin kết hợp clavulanic acid. 2.4. Những nghiên cứu vi khuẩn E. coli sinh ESBL trên thế giới Một nghiên cứu của Duru Carissa et al, 2013 đƣợc thực hiện tại Owerri, Nigeria, nhằm xác định sự hiện diện của E. coli sinh ESBL từ các trang trại chăn nuôi gia cầm bằng phƣơng pháp đĩa kết hợp và thử nghiệm tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh. Kết quả có 22,2% E. coli ESBL từ 45 E. coli dƣơng tính phân lập từ 159 mẫu phân của gà tây, gà giò và gà địa phƣơng. Các E. coli ESBL phân lập từ E. coli hoàn toàn nhạy cảm với imipenem, nhƣng kháng với cefepime, ceftriaxone, nalidixic acid, cefotaxime, ceftazidime, ampicillin, sulphamethoxazoletrimethoprim và ticarcillin. Annemieke Smet et al, 2008, nghiên cứu sự đa dạng của ESBL và Class C betalactame phân lập trên ổ nhớp gà từ các trại gà thịt tại Belgian. Trong 489 mẫu có 295 mẫu dƣơng tính với E. coli, trong đó có 45% (133/295) E. coli ESBL. Ngoài ra, kết quả còn cho thấy các chủng vi khuẩn E. coli ESBL kháng với: gentamycine 7,5%, kanamycine 4%, streptomycine 30,2%, trimethoprim 64,4%, tetracyline 48,1%. Kiểm tra sự đa kháng: 4% kháng trên 8 loại kháng sinh, 76% kháng từ 1-2 kháng sinh và 5% kháng với 1 kháng sinh bổ sung. 8 Kola et al, 2012 nghiên cứu tỷ lệ beta-lactamase ở vi khuẩn đƣờng ruột trong thịt gà Đức. Nghiên cứu thực hiện trên 399 mẫu thịt gà lấy từ siêu thị, bốn cửa hàng thực phẩm và cửa hàng bán thịt ở Berlin và Greifswald. Kết quả tổng cộng có 185 chủng ESBL phân lập đƣợc từ 175 mẫu. Phần lớn các chủng E. coli sinh ESBL và 73,0% các E. coli ESBL kháng với tetracycline, 35,7% với trimoxazole và 7,6% với ciprofloxacin. Nghiên cứu của Felix Reich et al, 2010 tại Đức, nghiên cứu phân tích trên 70 mẫu thân thịt và 51 mẫu manh tràng gà cho kết quả tƣơng ứng 88,6% và 72,5% E. coli sinh ESBL. Nghiên cứu khác tại Bỉ của Garcia-Graells et al. (2013), thực hiện trên 396 mẫu thịt gia cầm để xác định tỉ lệ E. coli dƣơng tính với ESBL. Kết quả 94,2% (374/396) dƣơng tính với E. coli và 42% (156/374) đề kháng với cefotaxime. 273 chủng E. coli từ 156 mẫu thịt có E. coli dƣơng tính đƣợc xác định sự hiện diện E. coli sinh ESBL bằng phƣơng pháp đĩa đôi kết quả có 80,6% (220/273) dƣơng tính với ESBL, 18,3%(50/273) thuộc kiểu hình AmpC . Nghiên cứu của Ilse Overdevest et al, 2009 tại Hà Lan về gen E. coli ESBL trên ngƣời và gà. Khảo sát trên 262 mẫu thịt tƣơi bao gồm 3 nhóm thịt chính: gà, bò, lợn, trong đó có 89 mẫu thịt gà, 85 mẫu thịt bò, 57 mẫu thịt heo. Qua phân tích 89 mẫu thịt gà thì có 68 (76,8%) mẫu chứa E. coli ESBL. Kết quả giải trình tự gen mã hóa men beta- lactamase phổ rộng trên ngƣời và gà có sự tƣơng đồng. Nghiên cứu của Yuan et al, 2008 tại Hà Nam, Trung Quốc. Thực hiện trên 51 mẫu bệnh phẩm gan gà lấy từ 14 trang trại. Kết quả 60,8% (31/51) E. coli sinh ESBL. Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ kháng với các loại kháng sinh: gentamycine 87,1%, amikacin 80,6%. Nghiên cứu của Leverstein- van Hall et al, 2011 trên 98 mẫu thịt gà bán lẻ tại 12 cửa hàng ở Utrecht, Hà Lan năm 2010 và 516 mẫu bệnh phẩm ngƣời từ 31 phòng thí nghiệm thu thập đƣợc trong khoảng thời gian 3 tháng trong năm 2009. Kết quả có 94% mẫu thịt gà chứa E.coli ESBL và có 39% thuộc các kiểu gen đƣợc tìm thấy ở ngƣời. Những phát hiện này cho thấy việc truyền các gen E. coli sinh ESBL từ gia cầm sang ngƣời rất có thể thông qua chuổi thức ăn. Theo nghiên cứu của Gundogan et al, 2013, phân lập 75 mẫu từ thịt bê, đùi gà, sữa tƣơi, phô mai và kem mỗi loại 15 mẫu ở Thổ Nhĩ Kì. Kết quả 45 mẫu dƣơng tính với E. coli, trong đó 100% (15) mẫu đùi gà dƣơng tính với E. coli, 9 mẫu thịt bê, 7 mẫu sữa tƣơi, 11 mẫu phô mai và 3 mẫu kem nhiễm E. coli. Trong 45 mẫu E. coli phân lập có 20 (44,4%) dƣơng tính với E. coli ESBL . Trong số 20 E. coli ESBL có 10 (50%) là từ thịt đùi gà, 5 (25%) là từ thịt bê băm nhỏ, 2 (10%) từ phô mai, 2 (10%) từ sữa và 1 (5%) là từ các mẫu kem. Tỉ lệ E. coli ESBL phân lập trên đùi gà nói riêng là 66,67%(10/15). E. coli phân lập kháng với ampicillin (100%), tetracycline (77,8%), cefotaxime (33,3%), ciprofloxacin (31,1%), aztroenam (28,9%), ceftazidime (8,9%), ceftriaxone (8,9%), amoxcillin/acid clavulanic (6,7%), gentamicin (6,7%) và amikacin (4,4%). 9 Ba mƣơi (66,7%) E. coli phân lập kháng với một hoặc hai kháng sinh, và khả năng kháng ba đến mƣời bốn kháng sinh là 37,8% . Stefan Börjesson et al.(2013) 44% (44/100) các mẫu thịt gà ở thụy điển phát hiện E. coli ESBL ở Thụy Điển, gà hiếm khi điều trị bằng thuốc kháng sinh và không sử dụng các cephalosporin trong năm 2010 nhƣng đáng ngạc nhiên khi 34% gà Thụy Điển đã đƣợc xác định là mang E. coli ESBL năm 2010. E. coli phân lập từ thịt gà nhập khẩu từ Đan Mạch và Phần Lan là tƣơng đồng nhau và liên quan chặt chẽ đến phân lập từ Thụy Điển. Điều đó cho thấy sự xuất hiện của E. coli sinh ESBL trong gà Thụy Điển là do lây truyền dọc từ nhập khẩu con giống. Delphine Girlich et al. (2007), trong 112 mẫu manh tràng gia cầm khỏe mạnh tại cơ sở giết mổ của bảy huyện ở Pháp vào năm 2005, trong đó có 10,7% (12/112) mẫu dƣơng tính với E. coli ESBL. Cindy et al. (2013) đã nghiên cứu về sự hiện diện của E. coli ESBL/ AmpC trên gà thịt và thịt gà. Mẫu bệnh phẩm ổ nhớp gà 1 ngày tuổi, 18 và 31 tuần tuổi, gà thịt từ giống gà GPS và mẫu gạt môi trƣờng đƣợc kiểm tra. Kết quả tất cả các mẫu kiểm tra đều dƣơng tính với E. coli ESBL. Nghiên cứu đƣa ra đề nghị để giảm thiểu tỉ lệ E. coli sinh ESBL/ AmpC nên tập trung vào việc ngăn chặn truyền ngang và truyền dọc, đặc biệt là chuồng trại chăn nuôi. 10
- Xem thêm -