Tài liệu Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn escherichia coli sinh men beta-lactamases phổ rộng trên gà khỏe tại một số nông hộ thuộc huyện long hồ tỉnh vĩnh long

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y NGUYỄN HẢI YẾN KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI SINH MEN BETA-LACTAMASES PHỔ RỘNG TRÊN GÀ KHỎE TẠI MỘT SỐ NÔNG HỘ THUỘC HUYỆN LONG HỒ TỈNH VĨNH LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y Cần Thơ, 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI SINH MEN BETA-LACTAMASES PHỔ RỘNG TRÊN GÀ KHỎE TẠI MỘT SỐ NÔNG HỘ THUỘC HUYỆN LONG HỒ TỈNH VĨNH LONG Giảng viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện ThS. BÙI THỊ LÊ MINH NGUYỄN HẢI YẾN MSSV: 3103077 Lớp: CN10Y4A1 – K36 Cần Thơ, 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y Đề tài “Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn Escherichia coli sinh men beta-lactamases phổ rộng trên gà khỏe tại một số nông hộ thuộc huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long” do sinh viên Nguyễn Hải Yến thực hiện tại Bộ môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trƣờng Đại Học Cần Thơ từ tháng 8 năm 2014 đến tháng 12 năm 2014. Cần Thơ, ngày….tháng…..năm….. Cần Thơ, ngày….tháng…..năm…. Giáo viên hướng dẫn Duyệt Bộ Môn Bùi Thị Lê Minh Cần Thơ, ngày….tháng…..năm…. Duyệt Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng i LỜI CẢM ƠN Qua thời gian học tập và phấn đấu của bản thân, tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Trong quá trình đó tôi đã nhận đƣợc những sự giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và bạn bè. Giây phút này đây tôi không biết nói gì hơn ngoài lời cảm ơn chân thành đến những ngƣời đã quan tâm, ủng hộ tôi trong suốt thời gian vừa qua. Xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cha mẹ tôi – ngƣời đã nuôi dạy và luôn bên cạnh động viên tôi những lúc khó khăn nhất. Xin chân thành cảm ơn Cô Bùi Thị Lê Minh - ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Quý thầy cô trong Bộ môn Thú y, Bộ môn Chăn nuôi đã truyền đạt những kiến thức quý báo cho tôi trong suốt quá trình học tập và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn. Các anh chị và các bạn trong phòng thí nghiệm, cũng nhƣ những ngƣời bạn trong lớp Dƣợc thú y khóa 36 đã động viên và giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Cuối cùng tôi xin chúc tất cả quý thầy cô, anh chị và các bạn dồi dào sức khỏe, thành công trong cuộc sống. Chân thành cảm ơn. Nguyễn Hải Yến ii TÓM LƯỢC Qua tiến hành phân lập vi khuẩn E. coli ESBL từ 48 gà khỏe tại một số nông hộ thuộc huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long bằng phương pháp đĩa kết hợp cho thấy tỉ lệ hiện diện của vi khuẩn E. coli ESBL ở gà khỏe là 31,25%, trong đó ở gà thịt là 12,5% và gà đẻ là 50%. Bằng phương pháp khuếch tán trên thạch của Kirby Bauer, 41 chủng vi khuẩn E. coli ESBL được kiểm tra tính nhạy cảm đối với 13 loại kháng sinh, kết quả cho thấy các chủng E. coli ESBL phân lập được có tỉ lệ đề kháng cao với cefaclor (97,56%), ampicilline (90,24%), cefuroxime (82,93%) và còn nhạy cảm với các kháng sinh amikacin (100%), doxycycline (85,37%) fosfomycin (82,93%). Ngoài ra, vi khuẩn E. coli ESBL đa kháng với từ 2 đến 10 loại kháng sinh với 24 kiểu đa kháng, trong đó kháng với 7 loại kháng sinh là phổ biến nhất với tỉ lệ 29,27%. iii MỤC LỤC Trang duyệt ..................................................................................................................... i Lời cảm ơn ..................................................................................................................... ii Tóm lƣợc ....................................................................................................................... iii Mục lục.......................................................................................................................... iv Danh mục chữ viết tắt ................................................................................................... vi Danh mục hình ............................................................................................................. vii Danh mục bảng ........................................................................................................... viii CHƢƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................... 1 CHƢƠNG 2: CƠ SỞ LÝ LUẬN ................................................................................... 2 2.1 Giới thiệu về vi khuẩn E. coli ............................................................................... 2 2.1.1 Đặc điểm hình thái và nuôi cấy ...................................................................... 2 2.1.2 Đặc tính sinh hóa ............................................................................................ 3 2.1.3 Tính gây bệnh và nguồn lây nhiễm ................................................................ 4 2.2 Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn ........................................... 6 2.2.1 Kháng sinh nhóm beta-lactam ........................................................................ 8 2.2.2 Kháng sinh nhóm aminoglycoside.. ............................................................... 9 2.2.3 Kháng sinh nhóm tetracycline ........................................................................ 9 2.2.4 Kháng sinh nhóm quinolone ........................................................................ 10 2.3 Giới thiệu men beta-lactamases phổ rộng .......................................................... 10 2.3.1 Lịch sử và đặc điểm...................................................................................... 10 2.3.2 Các kỹ thuật phát hiện ESBL ....................................................................... 11 2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn E. coli ESBL trong và ngoài nƣớc ................... 13 CHƢƠNG 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 16 3.1 Phƣơng tiện thí nghiệm....................................................................................... 16 3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tƣợng nghiên cứu .................................................. 16 3.1.2 Hóa chất và môi trƣờng ................................................................................ 16 3.1.3 Thiết bị và dụng cụ ....................................................................................... 16 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 16 iv 3.2.1 Phƣơng pháp thu thập mẫu ........................................................................... 16 3.2.2 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn E. coli ESBL ............................................. 17 3.2.3 Phƣơng pháp kiểm tra tính nhạy cảm của vi khuẩn E. coli ESBL phân lập đƣợc ....................................................................................................................... 19 3.2.4 Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................................ 20 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 21 4.1 Kết quả sự hiện diện của vi khuẩn E. coli ESBL trên gà khỏe phân lập tại huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long................................................................................ 21 4.2 Kết quả sự hiện diện của vi khuẩn E. coli ESBL trên gà thịt khỏe phân lập tại huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long................................................................................ 22 4.3 Kết quả thử độ nhạy của vi khuẩn E. coli ESBL phân lập đƣợc đối với một số loại kháng sinh .......................................................................................................... 23 4.4 Khảo sát tính đa kháng của vi khuẩn E. coli ESBL phân lập đƣợc đối với một số loại kháng sinh ..................................................................................................... 25 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 29 5.1 Kết luận ............................................................................................................... 29 5.2 Đề nghị................................................................................................................ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 30 PHỤ CHƢƠNG ........................................................................................................... 34 v DANH MỤC VIẾT TẮT Chữ viết tắt APEC CFU ctv. CLSI E. coli EMB ESBL EPEC ETEC EIEC EAEC EHEC et al. HUS MC MHA MLST MR NA PBP VP Chữ viết đầy đủ Avian Pathogenic E. coli Colony Forming Unit Cộng tác viên Clinical and Laboratory Standards Institute Escherichia coli Eosin Methyl Blue Extended-spectrum beta-lactamases Enteropathogenic E. coli Enterotoxigenic E. coli Enteroinvasive E. coli Enteroaggregative E. coli Enterohaemorrhagic E. coli et alii Hemolytic uremic syndrome MacConkey Agar Mueller Hinton Agar Multilocus sequence typing Methyl Red Nutrient Agar Penicillin binding protein Voges Proskauer vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Khuẩn lạc E. coli trên môi trƣờng MC ...................................................... 3 Hình 2.2. Phƣơng pháp đĩa kết hợp ......................................................................... 13 Hình 3.1. Quy trình phân lập vi khuẩn E. coli ESBL .............................................. 18 Hình 3.2. Thử nghiệm kháng sinh đồ....................................................................... 20 Hình 4.1. Kết quả kiểm tra tính nhạy cảm của vi khuẩn E. coli ESBL với một số loại kháng sinh ......................................................................................................... 24 Hình 4.2. Tính đa kháng của các chủng E. coli ESBL phân lập đƣợc ..................... 27 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli .................................................... 17 Bảng 3.2. Tiêu chuẩn đƣờng kính vòng kháng khuẩn của vi khuẩn họ Enterobacteriaceae với một số loại kháng sinh (CLSI, 2014) ................................ 20 Bảng 4.1. Tỉ lệ vi khuẩn E. coli ESBL dƣơng tính trên gà thịt và gà đẻ khỏe......... 21 Bảng 4.2. Tỉ lệ vi khuẩn E. coli ESBL dƣơng tính trên gà thịt khỏe ở 2 lứa tuổi ... 22 Bảng 4.3. Kết quả kháng sinh đồ của các chủng E. coli ESBL phân lập đƣợc với một số loại kháng sinh.............................................................................................. 24 Bảng 4.4. Kết quả kiểm tra tính đa kháng của vi khuẩn E. coli ESBL phân lập đƣợc với một số loại kháng sinh .............................................................................. 26 viii CHƢƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Chăn nuôi gà là một nghề không chỉ cung cấp thực phẩm cho bữa ăn hàng ngày của mỗi gia đình mà còn đem lại nguồn thu nhập đáng kể cho người chăn nuôi nên những năm gần đây ngành chăn nuôi gà ở tỉnh Vĩnh Long phát triển rất mạnh. Theo báo cáo sơ kết 6 tháng đầu năm 2014 của Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Vĩnh Long, tổng đàn gà của toàn tỉnh trên 3 triệu con, tăng 24,7% so với cùng kỳ năm 2013 (Chi cục Thú y tỉnh Vĩnh Long, 2014). Tuy nhiên hiện tại phần lớn người dân vẫn còn chăn nuôi theo hình thức nhỏ lẻ, tự phát nên dễ phát sinh các dịch bệnh gây thiệt hại về kinh tế. Để hạn chế rủi ro trong chăn nuôi, người dân có thói quen dùng nhiều loại kháng sinh nhằm kích thích tăng trưởng hoặc phòng và điều trị bệnh cho vật nuôi (Phạm Kim Đăng và ctv., 2012). Việc sử dụng kháng sinh không hợp lý không những tạo áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn gây bệnh mà còn ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa, khiến cho vi khuẩn trở nên đề kháng với kháng sinh. Hiện nay đã xuất hiện các chủng vi khuẩn gram âm sinh men beta-lactamase phổ rộng (ESBL) có khả năng đề kháng với các kháng sinh nhóm beta-lactam bao gồm cả các kháng sinh phổ rộng như cephalosporin thế hệ 3 và 4. Trên thế giới đã có rất nhiều báo cáo về E. coli ESBL trên gà được công bố, theo nghiên cứu của Ilse Overdevest et al. (2011), tại Hà Lan có 79,8% (68/89) mẫu thịt gà thu thập được có sự hiện diện của E. coli ESBL; tại Bỉ có 27,2% (133/489) mẫu phân gà khỏe thu thập được có sự hiện diện của E. coli ESBL (Annemieke Smet et al., 2008). Tuy nhiên tại Việt Nam các nghiên cứu về vấn đề này đa phần chỉ thực hiện trên người ở những bệnh viện lớn, có rất ít nghiên cứu về E. coli ESBL trên vật nuôi nói chung và trên gà nói riêng. Xuất phát từ tình hình đó, đề tài “Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn Escherichia coli sinh men beta-lactamase phổ rộng trên gà khỏe tại một số nông hộ thuộc huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long” được thực hiện với mục tiêu: - Xác định tỉ lệ hiện diện của vi khuẩn E. coli ESBL trên gà khỏe tại huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long. - Khảo sát tính nhạy cảm của vi khuẩn E. coli ESBL phân lập được đối với một số loại kháng sinh. 1 CHƢƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1 Giới thiệu về vi khuẩn E. coli Trong các vi khuẩn đường ruột, E. coli là vi khuẩn phổ biến nhất, chúng chiếm 80% vi khuẩn hiếu khí (Trần Cẩm Vân, 2001). Theo S Hudault et al. (2001), E. coli là một trong những vi khuẩn xuất hiện rất sớm ở đường ruột người và động vật sơ sinh, kể cả gà. Hầu hết E. coli là sinh vật sống cộng sinh, chúng sống trong đường ruột nhưng không có hại cho vật chủ. Khi các điều kiện nuôi dưỡng, khẩu phần thức ăn, vệ sinh thú y kém, sức chống đỡ bệnh tật của con vật yếu thì E. coli trở nên cường độc và có khả năng gây bệnh (Đào Trọng Đạt và ctv., 1999). Ở ruột, vi khuẩn E. coli sống đối kháng với một số vi khuẩn khác như Salmonella và Shigella nhờ có khả năng tạo ra một loại chất ức chế có tên là colicin (S Hudault et al., 2001). Chúng còn có khả năng tổng hợp một số vitamin thuộc nhóm B, E và K, vì thế khi không gây bệnh chúng có lợi cho đường ruột nhờ hạn chế một số vi khuẩn khác, giữ thế cân bằng sinh thái trong ruột và tổng hợp một số vitamin (Trần Cẩm Vân, 2001). Vi khuẩn E. coli hiện diện thường xuyên trong đường ruột gà và được thải qua phân với số lượng lớn (Hồ Thị Việt Thu, 2012). 2.1.1 Đặc điểm hình thái và nuôi cấy E. coli là một trực khuẩn gram âm, ngắn, kích thước 2 - 3x0,5µm, không sinh nha bào, rất ít chủng E. coli có vỏ nhưng hầu hết có lông, di động được. Trong cơ thể, E. coli có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành hình chuỗi ngắn. E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, là vi khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện. Nhiệt độ phát triển thích hợp là 370C (Lê Hồng Hinh, 2008). Trong môi trường thạch thường (NA): Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn E. coli hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt (dạng S), bóng láng, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính 2 - 3mm. Nếu nuôi lâu khuẩn lạc có màu nâu nhạt, mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng M và dạng R. Trên môi trường EMB (Eosin Methyl Blue): Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc màu tím đen có ánh kim (Nguyễn Ngọc Hải, 2012). 2 Trên môi trường MC (MacConkey Agar): Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, khuẩn lạc E. coli có dạng tròn, màu hồng đậm, nhám hoặc trơn đường kính 2 - 4 mm (TCVN 8400-16:2011). Hình 2.1. Khuẩn lạc E. coli trên môi trường MC (Nguồn: http://learn.chm.msu.edu/vibl/content/differential/) 2.1.2 Đặc tính sinh hóa Theo Nguyễn Ngọc Hải (2012) vi khuẩn E. coli được định danh bằng phản ứng IMViC qua các môi trường Trypton (thử nghiệm sinh indole), MR (Methyl Red), VP (Voges Proskauer), Simmons Citrate. Thử nghiệm sinh indole: Tryptophan là một axit amin có thể bị oxy hóa bởi các sinh vật có hệ men tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indole. Khi nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s nếu trong môi trường có sinh indole thì sẽ có vòng màu hồng cánh sen nổi lên trên. Vi khuẩn E. coli có phản ứng indole dương tính. Thử nghiệm MR (Methyl Red): Nhiều loài sinh vật nhất là nhóm vi khuẩn đường ruột có khả năng lên men glucose tạo sản phẩm acid bền làm cho pH của môi trường bị hạ thấp xuống dưới 4,5. Chất chỉ thị methyl red giúp phân biệt độ pH của môi trường sau khi vi khuẩn lên men glucose. Phản ứng dương tính môi trường chuyển sang màu đỏ, âm tính thì môi trường có màu vàng. Vi khuẩn E. coli có phản ứng MR dương tính. Thử nghiệm VP (Voges Proskauer): Đối với môi trường VP tùy loại enzyme vi khuẩn có được mà quá trình lên men glucose sẽ cho sản phẩm cuối cùng khác nhau, một trong số đó là aceton sẽ tạo phức với thuốc thử α-naphthol và NaOH. Phản ứng dương tính khi môi trường có màu đỏ nhạt, phản ứng âm tính khi môi trường có màu vàng hoặc không đổi màu. E. coli có phản ứng VP âm tính. 3 Khả năng chuyển hóa citrate: Trong môi trường Simmons citrate, nếu vi khuẩn có khả năng sử dụng citrate (là nguồn cacbon duy nhất) thì sẽ kiềm hóa môi trường làm môi trường từ màu xanh lá cây chuyển sang màu xanh dương, kết quả âm tính khi môi trường giữ nguyên màu xanh lá cây. Vi khuẩn E. coli có phản ứng citrate âm tính. Ngoài ra vi khuẩn E. coli còn lên men sinh hơi các loại đường fructose, glucose, galactose, manitose, lactose. Tất cả các loại E. coli đều lên men đường lactose nhanh và sinh hơi, đó là một đặc điểm quan trọng mà người ta dựa vào đó để phân biệt E. coli và Salmonella. Các phản ứng khác: làm đông sữa sau 24 - 72 giờ, H2S âm tính, khử nitrate thành nitrite. 2.1.3 Tính gây bệnh và nguồn lây nhiễm Cấu trúc kháng nguyên Vi khuẩn E. coli được chia thành các serotype khác nhau dựa vào cấu trúc kháng nguyên. Cấu trúc kháng nguyên của E. coli gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên vỏ K và kháng nguyên lông H. Kháng nguyên O được coi như là một yếu tố độc lực có thể tìm thấy ở thành tế bào vi khuẩn và có liên hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch. Kháng nguyên H là thành phần lông của vi khuẩn, có bản chất protein, kém bền vững hơn so với kháng nguyên O. Kháng nguyên H không phải là yếu tố độc lực của vi khuẩn nhưng có khả năng tạo miễn dịch mạnh, phản ứng miễn dịch xảy ra nhanh hơn so với kháng nguyên O. Kháng nguyên H của vi khuẩn E. coli không có vai trò bám dính, không có tính độc và cũng không có ý nghĩa trong đáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít được nghiên cứu, nhưng nó có ý nghĩa rất lớn trong xác định giống loài của vi khuẩn. Kháng nguyên K còn được gọi là kháng nguyên bề mặt hoặc kháng nguyên vỏ bọc, gồm 3 loại kháng nguyên L, A, B. Kháng nguyên K có nhiệm vụ hỗ trợ phản ứng ngưng kết của kháng nguyên O nên thường ghi công thức serotype của vi khuẩn là Ox:Ky, ví dụ như O1:K1. Ngoài ra kháng nguyên K còn tạo ra hàng rào bảo vệ vi khuẩn chống lại các tác động ngoại cảnh và hiện tượng thực bào, yếu tố phòng vệ của vật chủ. Theo Ewers C (2003) hiện nay các serotype O1:K1, O2:K1 và O78:K80 được công nhận là phổ biến nhất trong các chủng E. coli gây bệnh trên gà. 4 Sức đề kháng E. coli là vi khuẩn không sinh nha bào nên không chịu được nhiệt độ cao, có thể bị vô hoạt ở nhiệt độ 600C sau 30 phút, ở 700C sau 2 phút, trong điều kiện đông khô vi khuẩn có thể sống lâu (Hồ Thị Việt Thu, 2012). Các chất sát trùng thông thường như axit phenic, formol, hydroperoxide 1% diệt được vi khuẩn trong vài phút. Tính gây bệnh E. coli có sẵn trong ruột của động vật nhưng chỉ tác động gây bệnh khi sức đề kháng của con vật giảm. Tùy từng loại mà cơ chế gây bệnh có khác nhau: EPEC (Enteropathogenic E. coli) gây viêm ruột non; ETEC (Enterotoxigenic E. coli) gây bệnh do sinh độc tố; EIEC (Enteroinvasive E. coli) gây bệnh do có khả năng xâm nhập vào niêm mạc ruột già, cơ chế giống vi khuẩn Shigella gây tiêu chảy có đờm lẫn máu; EAEC (Enteroaggregative E. coli) gây bệnh do bám vào niêm mạc và làm tổn thương chức năng ruột; EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli) gây bệnh làm tổn thương xuất huyết ruột (Lê Hồng Hinh, 2008). Các chủng EHEC là một mối đe dọa cho sức khỏe con người, đặc biệt là serotype O157:H7. Vi khuẩn được truyền sang người chủ yếu thông qua việc sử dụng các thực phẩm sống hoặc chưa nấu chín kỹ, ngoài ra vi khuẩn có thể bị vấy nhiễm vào thực phẩm thông qua môi trường xung quanh. Chỉ cần một lượng rất nhỏ vi khuẩn cũng đủ gây bệnh và EHEC thường dẫn đến hội chứng tán huyết - tăng urê máu (HUS) rất phổ biến ở trẻ em. EHEC thường được tìm thấy nhiều nhất ở động vật nhai lại, nhưng đôi khi chúng vẫn có thể hiện diện trên các động vật khác như heo, chó mèo hoặc gà (WHO, 2011). Vi khuẩn E. coli gây bệnh trên gia cầm thuộc nhóm APEC (Avian Pathogenic E. coli), chúng gây ra bệnh Colibacillosis (nhiễm khuẩn E. coli) trên gà, đây là một bệnh cấp tính, dẫn đến thiệt hại kinh tế đáng kể trong ngành công nghiệp chăn nuôi gà trên toàn thế giới (Ewers C, 2003). Tỉ lệ nhiễm trong đàn thường trên 10%, tỉ lệ chết thường thấp hơn 5% nhưng đôi khi có thể lên đến 20% (Hồ Thị Việt Thu, 2012). Gà mắc bệnh do E. coli có biểu hiện đờ đẩn, giảm tăng trọng, có triệu chứng hô hấp. Sau đó gà bị nhiễm trùng huyết, nhiệt độ tăng cao 42 – 43,50C. Lông xù có bết phân, sau đó gà chết. Một số gia cầm mắc bệnh có triệu chứng què từ mức độ nhẹ cho đến nặng, đi đứng khó khăn. Nguồn lây nhiễm Theo Đỗ Võ Anh Khoa và Lưu Hữu Mãnh (2012) E. coli là vi khuẩn luôn hiện diện trong đàn gia cầm nên việc nhiễm E. coli không hẳn biểu hiện ra triệu chứng lâm 5 sàng, vì thế việc bài tiết phân ra môi trường bên ngoài có thể gây nhiễm cho những con gà xung quanh. Ngoài ra E. coli có thể truyền qua trứng do cơ thể gà mẹ bị nhiễm bệnh; truyền lây qua đường hô hấp do niêm mạc phế quản bị tổn thương, vi khuẩn từ môi trường xâm nhập qua vết thương vào cơ thể; truyền qua vỏ trứng do bị nhiễm bẩn từ phân hoặc môi trường ở chuồng trại bị nhiễm trùng; lây qua thức ăn và nước uống bị nhiễm trùng (Nguyễn Xuân Bình và ctv., 2005). Vệ sinh phòng bệnh Bệnh lây truyền trên gà con chủ yếu do trứng gia cầm bị lây nhiễm từ phân, do đó cần thu nhặt trứng thường xuyên, giữ cho ổ đẻ sạch sẽ, loại bỏ những trứng dính phân hoặc trứng bị nứt, cần sát trùng vệ sinh trứng trong vòng 2 giờ sau khi đẻ, đảm bảo nhiệt độ úm cho gà con và bổ sung đầy đủ chất dinh dưỡng (Hồ Thị Việt Thu, 2012). 2.2 Kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hoá học bán tổng hợp, tổng hợp, với nồng độ rất thấp, có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc diệt được vi khuẩn (Bùi Thị Tho và Nghiêm Thị Anh Đào, 2005). Về nguyên lý, kháng sinh là chất ức chế sự phát triển của vi khuẩn, nhưng nếu trong môi trường kháng sinh ở nồng độ thường dùng mà vi khuẩn vẫn phát triển được gọi là hiện tượng đề kháng kháng sinh. Trong tự nhiên phần lớn các vi khuẩn đều sở hữu riêng các gen kháng kháng sinh. Dưới áp lực chọn lọc tự nhiên và sự đấu tranh sinh tồn đã giúp các loài vi khuẩn có khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh, do vậy sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn thường xuất hiện rất nhanh ngay sau khi kháng sinh được đưa vào sử dụng, ví dụ streptomycin được đưa vào sử dụng năm 1943 thì đến năm 1959 vi khuẩn đã đề kháng với kháng sinh này (Trần Huy Hoàng, 2013). Phân loại đề kháng Tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn có nguồn gốc ở gen. Các gen kháng thuốc hiện diện ở trong nhiễm sắc thể, hoặc trong yếu tố di động như các plasmid. Sự đề kháng có thể tự nhiên hoặc mắc phải. Đề kháng tự nhiên là do cấu trúc di truyền của một số loài vi khuẩn nên chúng đã có tính đề kháng từ trước khi tiếp xúc với kháng sinh, ví dụ như: vi khuẩn sinh men beta-lactamase, cấu trúc của thành vi khuẩn không thấm với kháng sinh. 6 Đề kháng mắc phải là vi khuẩn đang nhạy cảm với kháng sinh nhưng sau một thời gian tiếp xúc trở nên không nhạy cảm nữa. Nguyên nhân là do: đột biến hoặc kháng qua nhiễm sắc thể dẫn đến thay đổi đích tác động của kháng sinh; kháng qua plasmid, thường là sản xuất các enzyme làm bất hoạt kháng sinh; hoặc giảm ái lực của kháng sinh với đích tác động, hoặc thay đổi đường chuyển hóa. Plasmid là những đoạn DNA nhỏ có dạng vòng tròn, nằm ngoài DNA nhiễm sắc thể. Điểm thuận lợi của plasmid là chúng có thể di chuyển dễ dàng qua các màng tế bào và chúng có thể trao đổi các đoạn DNA với nhau giữa các vi khuẩn (Trang Quan Sen, 2005). Plasmid được tìm thấy trong hầu hết các loại vi khuẩn, có khả năng tồn tại một cách độc lập với bộ gen của vi khuẩn. Các plasmid kháng thuốc (R-plasmid) mang các gen mã hóa các enzyme làm bất hoạt kháng sinh và thay đổi hệ thống vận chuyển qua màng tế bào (Bùi Văn Nghĩa, 2012). Đáng chú ý là có nhiều gen kháng thuốc có thể cùng nằm trên một plasmid duy nhất, do đó tính đa kháng có thể được lan truyền giữa các chủng vi khuẩn khác nhau (Hiroshi Nikaido, 2009). Vi khuẩn kháng kháng sinh có thể phát triển sự kháng chéo với các kháng sinh trong cùng họ. Các tính chất di truyền cũng như tính đề kháng từ một nhóm vi khuẩn này có thể truyền sang một nhóm hoặc loài vi khuẩn khác trong môi trường, đặc biệt là giữa các vi khuẩn đường ruột gram âm (Enterobacteriaceae), do vậy có những vi khuẩn chưa bao giờ tiếp xúc với kháng sinh nhưng đã mang trong mình tính đề kháng do một vi khuẩn khác truyền sang (Võ Văn Ninh, 2001). Có rất nhiều cơ chế tham gia vào tình trạng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn. Những cơ chế này có thể thay đổi đích tác động, tạo ra các enzyme, ngăn cản khả năng gắn vào tế bào vi khuẩn và làm thay đổi đường chuyển hóa (tạo ra các isoenzyme). Làm thay đổi đích tác động Mỗi kháng sinh có đích tác động và điểm gắn kết đối với vi khuẩn khác nhau. Các đích tác động có thể bị thay đổi hoặc được bảo vệ bởi sự gắn kết của một protein, do đó thuốc không thể gắn vào và tác động đến vi khuẩn. Cơ chế đề kháng này xảy ra với hầu hết kháng sinh. Hiện tượng này do nguồn gốc từ nhiễm sắc thể hoặc plasmid, theo cơ chế làm giảm độ ái lực của kháng sinh tại vị trí tác dụng. Tạo ra các enzyme Enzyme được tạo ra làm biến đổi hoặc phá hủy cấu trúc phân tử của kháng sinh. Ví dụ vi khuẩn sinh ra men beta-lactamase bao gồm penicillinase và cephalosporinase có khả năng thủy phân các kháng sinh nhóm penicillin và cephalosporin. Tuy nhiên 7 các men này bị bất hoạt bởi các chất ức chế beta-lactamase là clavulanic acid và sulbactam. Do đó khi phối hợp penicillin hoặc cephalosporin với các chất ức chế beta-lactam này sẽ chống được sự đề kháng của các vi khuẩn sinh beta-lactamase (Bùi Văn Nghĩa, 2012). Làm giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất Vi khuẩn là các vi sinh vật đơn bào, có màng tế bào chất phân cách tế bào chất với môi trường bên ngoài. Các vi khuẩn gram âm còn được trang bị thêm một vỏ bên ngoài, gọi là thành ngoài. Chất dinh dưỡng và kháng sinh phải đi ngang qua lớp vỏ này để thấm vào bên trong vi khuẩn theo cách thức khuyến tán thụ động ngang qua các kênh. Sự giảm tính thấm của màng làm giảm lượng kháng sinh đi vào bên trong đến đích tác dụng, nguyên nhân do biến đổi tính thấm lớp màng bên trong hoặc bên ngoài vi khuẩn. Phương pháp chủ yếu để xác định vi khuẩn có đề kháng thuốc kháng sinh hay không là căn cứ vào kết quả thử nghiệm tính nhạy cảm của vi khuẩn đó với các loại kháng sinh thử nghiệm trong phòng thí nghiệm theo hướng dẫn của CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute – Viện tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm). Vi khuẩn xếp vào loại đa đề kháng nếu như kết quả thử nghiệm cho thấy nó kháng từ hai loại kháng sinh trở lên. Sự đa kháng của vi khuẩn có thể được tạo ra bởi cơ chế bơm đẩy (efflux pump) làm đẩy ngược các kháng sinh ra khỏi tế bào vi khuẩn, với các bơm đẩy được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid (Hiroshi Nikaido, 2009). 2.2.1 Kháng sinh nhóm beta-lactam Các kháng sinh nhóm beta-lactam có chung một cấu trúc là vòng beta-lactam, gồm các penicillin, cephalosporin (thế hệ 1, 2, 3 và 4), carbapenem, monobactam và các chất ức chế beta-lactamase như clavulanic acid. Chúng được sử dụng phổ biến trên người và động vật, có tác dụng với các vi khuẩn gram âm và gram dương (Cindy Maria Dierikx, 2013). Beta-lactam là nhóm kháng sinh có tác động sát khuẩn phụ thuộc thời gian, nghĩa là phải đảm bào rằng trong thời gian trị liệu nồng độ kháng sinh trong huyết tương hoặc mô bào đạt trên MIC (Võ Thị Trà An, 2010). Cơ chế tác dụng của kháng sinh nhóm beta-lactam Kháng sinh nhóm beta-lactam có tác dụng diệt khuẩn bằng cách tác động vào peptidoglycan thông qua việc tạo phức bền vững với transpeptidase (enzyme này 8 liên kết với PBP - penicillin binding protein) dẫn đến ức chế sự tổng hợp vách tế bào vi khuẩn. Mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh nhóm beta-lactam tùy thuộc vào mức độ gắn kết với PBP, khả năng xâm nhập vào tế bào và khả năng kháng được các enzyme beta-lactamase. Cơ chế đề kháng của vi khuẩn đối với kháng sinh nhóm beta-lactam Có bốn cơ chế chủ yếu mà vi khuẩn có thể đề kháng với kháng sinh nhóm beta-lactam là: sinh men beta-lactamase làm thủy phân vòng beta-lactam và phá vỡ cấu trúc của kháng sinh, thay đổi vị trí hoạt động của PBP làm thuốc không thể gắn vào đích tác động, làm giảm tính thấm của màng nguyên sinh chất ngăn kháng sinh thấm vào màng, bơm thuốc ra ngoài (Sarah M. Drawz and Robert A. Bonomo, 2010). Theo Greenwood (2000) cơ chế kháng thuốc phổ biến nhất của Enterobacteriacea với các kháng sinh nhóm beta-lactam là sinh men beta-lactamase (Trích dẫn bởi Christa Ewers et al., 2011). 2.2.2 Kháng sinh nhóm aminoglycoside Nhóm aminoglycoside là một nhóm kháng sinh sát khuẩn phụ thuộc nồng độ. Gồm nhiều loại như: streptomycin, kanamycin, gentamicin, amikacin. Đây là những thuốc diệt khuẩn được sử dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Cơ chế tác dụng: Các aminoglycoside gắn vào ribosome 30S làm ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn (Bùi Thị Tho và Nghiêm Thị Anh Đào, 2005). Vi khuẩn kháng aminoglycoside nhờ ba cơ chế: vô hoạt kháng sinh bởi các enzyme; đột biến chromosome, ví dụ như đột biến gen mã hóa protein đích ở tiểu thể 30S của ribosome vi khuẩn; giảm tính thấm của thành tế bào vi khuẩn đối với thuốc. Trong đó vô hoa ̣t kháng sinh bở i các enzyme giữ vai trò quan trọng nhất . Vi khuẩ n mang các yế u tố đề kháng này có thể đề kháng với mô ̣t hoă ̣c mô ̣t vài kháng sinh nhóm aminoglycoside (Võ Thị Trà An, 2010). 2.2.3 Kháng sinh nhóm tetracycline Các kháng sinh nhóm tetracycline có phổ kháng khuẩn rất mạnh, ức chế vi khuẩn ở nồng độ thấp và diệt khuẩn ở nồng độ cao. Gồm các kháng sinh như tetracycline, doxycycline. Cơ chế tác dụng: Sau khi khuyếch tán tích cực qua kênh porin ở màng vi khuẩn, các kháng sinh tetracycline ức chế sự tổng hợp protein vi khuẩn bằng cách gắn vào 9 ribosome 30S, ngăn cản sự tạo chuỗi polypeptide (Bùi Thị Tho và Nghiêm Thị Anh Đào, 2005). Cơ chế đề kháng của vi khuẩn đối với kháng sinh nhóm tetracycline: giảm khả năng tiếp nhận thuốc vào vi khuẩn bằng cách tác động vào các protein có khả năng bảo vệ ribosome hoặc thông qua hê ̣ thố ng bơm thoát dòng đẩ y kháng sinh từ trong tế bào ra ngoài , làm giảm nồng độ kháng sinh bên tron g tế bào chấ t của vi khuẩn . Cả hai cơ chế trên đề u đươ ̣c phát hiê ̣n ở cả vi khuẩ n gram dương và gram âm , các nhân tố này hiê ̣n diê ̣n ở cả chromosome và plasmid của vi khuẩ n (Võ Thị Trà An, 2010). 2.2.4 Kháng sinh nhóm quinolone Các kháng sinh nhóm này có tác dụng rất tốt trên vi khuẩn đường ruột gram âm, là nhóm kháng sinh sát khuẩn phụ thuộc nồng độ. Loại kinh điển có acid nalidixic là tiêu biểu, loại mới do gắn thêm fluor vào nên được gọi là fluoroquinolone. Gồm các kháng sinh như: norfloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin. Cơ chế tác dụng: Các quinolone đều ức chế DNA gyrase, là enzyme mở vòng xoắn DNA, giúp cho sự sao chép và phiên mã; vì vậy ngăn cản sự tổng hợp DNA của vi khuẩn (Võ Thị Trà An, 2010). Cơ chế đề kháng của vi khuẩn đối với các kháng sinh nhóm quinolone: Vi khuẩn kháng thuốc là do đột biến ở chromosome làm thay đổi DNA gyrase của vi khuẩn. Những thay đổi ở thành tế bào vi khuẩn gram âm làm giảm hấp thu kháng sinh vào trong tế bào cũng dẫn đến đề kháng với quinolone. Đề kháng quinolone qua bơm đẩy được ghi nhận ở E. coli được mã hóa bởi gen AcrAB (Võ Thị Trà An, 2010). 2.3 Giới thiệu men beta-lactamase phổ rộng 2.3.1 Lịch sử và đặc điểm Đầu những năm 1980 thì các kháng sinh beta-lactam phổ rộng như cephalosporin thế hệ thứ 2, thế hệ thứ 3 và monobactam được đưa vào điều trị các vi khuẩn kháng thuốc. Vào năm 1983, một chủng vi khuẩn Klebsiella ozaenae được phát hiện sinh enzyme beta-lactamase thủy phân cefotaxime và type này được đặt tên là SHV-2 (Nguyễn Sâm, 2009), đây là trường hợp sinh ESBL đầu tiên được ghi nhận. Đến năm 1986 tại Nhật, chủng vi khuẩn E. coli kháng cefotaxime được phát hiện ra không phải là TEM và SHV nên đặt tên là FEC-1, đây là type CTX- đầu tiên. Tại Đức vào đầu năm 1989, Bauernfeind et al. (1990) trích dẫn bởi R. Bonnet (2004) đã báo cáo về một chủng E. coli kháng cefotaxime không giống các type trước đây và 10