Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn escherichia coli sinh beta-lactamases phổ rộng trên gà khỏe tại huyện long hồ tỉnh vĩnh long

  • Số trang: 43 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 11 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y NGUYỄN HUỲNH ĐẢM KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI SINH BETA-LACTAMASES PHỔ RỘNG TRÊN GÀ KHỎE TẠI HUYỆN LONG HỒ TỈNH VĨNH LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y Cần Thơ, 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI SINH BETA-LACTAMASES PHỔ RỘNG TRÊN GÀ KHỎE TẠI HUYỆN LONG HỒ TỈNH VĨNH LONG Giảng viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện ThS. BÙI THỊ LÊ MINH NGUYỄN HUỲNH ĐẢM MSSV: 3103014 Lớp: CN10Y4A1 – Khóa 36 Cần Thơ, 2014 i TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y Đề tài “Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn Escherichia coli sinh beta – lactamases phổ rộng trên gà khỏe tại huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long” do sinh viên Nguyễn Huỳnh Đảm thực hiện tại Bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại Học Cần Thơ từ tháng 8 năm 2014 đến tháng 12 năm 2014. Cần Thơ, ngày….tháng…..năm 2014 Cần Thơ, ngày….tháng…..năm 2014 Duyệt Bộ Môn Giảng viên hƣớng dẫn ThS. Bùi Thị Lê Minh Cần Thơ, ngày….tháng…..năm 2014 Duyệt Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng ii LỜI CẢM ƠN Trải qua những năm tháng học tập tại trƣờng và những ngày tháng làm luận văn tốt nghiệp, tôi xin: Thành kính biết ơn! Sự dạy dỗ, động viên và lo lắng của cha mẹ và những ngƣời thân trong gia đình chính là nguồn động lực thúc đẩy tôi nổ lực và phấn đấu. Trong tận đáy lòng tôi xin chân thành cám ơn những ngƣời thân yêu và kính dâng lên cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc, ngƣời đã dành cả cuộc đời mình cho tôi cất bƣớc đến trƣờng. Xin chân thành biết ơn! Cô Bùi Thị Lê Minh đã dành thời gian quý báo, hết lòng chỉ bảo, giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Cô Châu Thị Huyền Trang, cố vấn học tập đã luôn nhắc nhở và động viên tôi trong suốt thời gian học tập ở trƣờng. Quý Thầy, Cô Bộ môn Thú y và Bộ môn Chăn nuôi đã tận tình truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm vô cùng quý báu với tôi trong suốt thời gian qua. Chân thành cám ơn! Xin cám ơn các anh chị Cao học Thú Y khóa 19, các bạn Dƣợc Thú Y khóa 36 và các em sinh viên Dƣợc Thú Y khóa 37 học việc tại phòng thí nghiệm đã động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. iii TÓM LƢỢC Đề tài được thực hiện từ tháng 8 năm 2014 đến tháng 12 năm 2014 nhằm mục tiêu xác định tỷ lệ hiện diện E. coli sinh beta - lactamases trên gà khỏe xuất thịt từ một số trại gà công nghiệp ở huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long bằng phương pháp đĩa kết hợp. Qua khảo sát 440 mẫu gồm 110 mẫu phân, 110 mẫu gan, 110 mẫu phổi và 110 mẫu thịt của 110 con gà khỏe gồm 55 gà thịt và 55 gà đẻ từ 20 trại gà công nghiệp, kết quả cho thấy tỷ lệ hiện diện E. coli ESBL trên gà là 62,7% trong đó gà thịt có tỷ lệ hiện diện E. coli ESBL (85,5%) cao hơn ở gà đẻ (40%). Sự hiện diện của E. coli ESBL trên mẫu thịt, gan, phổi và phân lần lượt là 13,6%; 7,3%; 19,1% và 62,7%. iv MỤC LỤC TRANG TỰA .............................................................................................................. i TRANG DUYỆT ........................................................................................................ ii LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ iii TÓM LƢỢC .............................................................................................................. iv MỤC LỤC .................................................................................................................. v DANH MỤC VIẾT TẮT.......................................................................................... vii DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. ix CHƢƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................... 1 CHƢƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN ................................................................................. 2 2.1 Giới thiệu vi khuẩn E. coli ................................................................................ 2 2.1.1 Đặc điểm hình thái E. coli .......................................................................... 3 2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy E. coli ........................................................................... 3 2.1.3 Đặc tính sinh hóa ........................................................................................ 4 2.1.4 Cấu trúc kháng nguyên ............................................................................... 5 2.1.5 Sức đề kháng ............................................................................................... 6 2.1.6 Độc tố vi khuẩn ........................................................................................... 6 2.1.7 Tính gây bệnh ............................................................................................. 7 2.2 Giới thiệu về vi khuẩn sinh ESBL .................................................................... 7 2.3 Giới thiệu một số phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL ....................... 9 2.3.1 Phƣơng pháp ChromID ESBL agar ............................................................ 9 2.3.2 Phƣơng pháp đĩa đôi ................................................................................... 9 2.3.3 Băng giấy E-test ESBL ............................................................................... 9 2.3.4 Phƣơng pháp đĩa kết hợp .......................................................................... 10 v CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 11 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu .................................................................................. 11 3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tƣợng nghiên cứu .............................................. 11 3.1.2 Hóa chất .................................................................................................... 11 3.1.3 Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 11 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................. 11 3.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu ............................................................................... 11 3.2.2 Phƣơng pháp phân lập E. coli ESBL ....................................................... 12 3.2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu ........................................................................ 14 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 15 4.1 Kết quả khảo sát sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà thịt khỏe ................. 15 4.2 Kết quả khảo sát sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà đẻ khỏe ................... 16 4.3 Kết quả khảo sát sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà công nghiệp ............ 18 CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 21 5.1. Kết luận .......................................................................................................... 21 5.2. Đề nghị ........................................................................................................... 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 22 PHỤ CHƢƠNG ........................................................................................................ 24 1. Một số hình ảnh thu thập đƣợc trong thời gian nghiên cứu ........................... 24 2. Kết quả xử lí thống kê .................................................................................... 26 vi DANH MỤC VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ APEC Avian Pathogenic E. coli CFU Colony Forming Unit CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute E. coli Escherichia coli EMB Eosin Methyl Blue ESBL Extended-spectrum beta-lactamases EPEC Enteropathogenic E. coli ETEC Enterotoxigenic E. coli EIEC Enteroinvasive E. coli EAEC Enteroaggregative E. coli EHEC Enterohaemorrhagic E. coli MC MacConkey Agar MHA Mueller Hinton Agar MR Methyl Red NA Nutrient Agar VP Voges Proskauer vii DANH MỤC BẢNG Bảng Tựa bảng 2.1 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli 5 3.1 Dung lƣợng mẫu khảo sát 12 4.1 Tỷ lệ E. coli ESBL dƣơng tính trên gà thịt 15 4.2 Tỷ lệ E. coli ESBL dƣơng tính trên gà đẻ 16 4.3 Tỷ lệ sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà thịt và gà đẻ 18 viii Trang DANH MỤC HÌNH Hình Tựa hình 2.1 Khuẩn lạc E. coli trên môi trƣờng MC 4 3.1 Quy trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn E. coli ESBL 13 4.1 So sánh sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà thịt 15 4.2 So sánh sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà đẻ 17 4.3 So sánh sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà thịt và gà đẻ 18 ix Trang CHƢƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi gà đang phát triển mạnh mẽ với quy mô lớn, việc phát triển đàn một cách nhanh chóng đã làm tăng nguy cơ lây lan dịch bệnh, thậm chí phát sinh nhiều bệnh nguy hiểm gây thiệt hại lớn cho nhà chăn nuôi, trong đó phải kể đến Colibacillosis do vi khuẩn Escherichia coli trên gà. Vi khuẩn E. coli là nguyên nhân gây viêm rốn, viêm túi lòng đỏ ở gà con, viêm túi khí, nhiễm trùng huyết và thƣờng kết hợp với Mycoplasma gallisepticum gây viêm khớp, sƣng phù đầu, viêm màng bụng (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền, 2012). Vĩnh Long là một tỉnh có vị thế phát triển mạnh về chăn nuôi đặc biệt là chăn nuôi gà theo mô hình công nghiệp, do đó sự ảnh hƣởng của E. coli trên đàn gà là không thể tránh khỏi. Trong những năm gần đây, một số nghiên cứu cho thấy vi khuẩn E. coli sinh men beta – lactamases phổ rộng là một trong những nguyên nhân gây thất bại trong việc điều trị bệnh nhiễm khuẩn bằng kháng sinh do vi khuẩn tiết ra men beta - lactamases phổ rộng làm bất hoạt kháng sinh nhóm beta – lactam và một số nhóm kháng sinh khác. Vì vậy, việc nghiên cứu về vi khuẩn E. coli sinh men beta – lactamases là rất cần thiết nên đề tài “Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn Echerichia coli sinh beta – lactamases phổ rộng trên gà khỏe tại huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long” đƣợc thực hiện nhằm mục tiêu xác định tỷ lệ vi khuẩn E. coli sinh men beta – lactamases dƣơng tính trên gà khỏe nuôi công nghiệp. 1 CHƢƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2.1 Giới thiệu vi khuẩn E. coli Vi khuẩn Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaeceae đƣợc bác sĩ ngƣời Đức là Theodor Escherich (1858 - 1911) phân lập đầu tiên và đƣa ra đặc điểm của vi khuẩn vào năm 1885. E. coli thƣờng xuất hiện rất sớm bên trong đƣờng ruột của ngƣời và động vật sơ sinh (sau đẻ 2 giờ), chúng thƣờng ở phần sau của ruột, ít khi xuất hiện ở dạ dày hay ruột non. Trong nhiều trƣờng hợp chúng đƣợc tìm thấy ở niêm mạc của nhiều bộ phận khác nhau trong cơ thể (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997). Trong các vi khuẩn đƣờng ruột loài Escherichia coli là loài phổ biến nhất, chúng sinh sống bình thƣờng trong đƣờng ruột của ngƣời và động vật. Khi các điều kiện nuôi dƣỡng, khẩu phần thức ăn, vệ sinh thú y kém, sức chống đỡ bệnh tật của con vật yếu, thì E. coli trở nên cƣờng độc và có khả năng gây bệnh (Đào Trọng Đạt, 1999). Theo Nataro and Kaper (1998) có 6 nhóm E. coli gây bệnh đƣợc biết đến đó là: Enteropathogenic E. coli (EPEC) mang yếu tố bám dính và có khả năng xâm nhiễm vào ruột non, phá hủy lớp tế bào biểu mô ruột, kèm theo biểu hiện sốt và tiêu chảy. Vi khuẩn thuộc nhóm này thƣờng gây bệnh ở ngƣời, thỏ, chó, mèo, heo và có thể ở ngựa. Enterotoxigenic E. coli (ETEC) vi khuẩn thuộc nhóm này thƣờng có khả năng mang yếu tố kháng nguyên bám dính và sinh độc tố đƣờng tiêu hóa. Vi khuẩn nhóm này thƣờng gây bệnh tiêu chảy trên ngƣời, heo, cừu, gà, bò, chó và ngựa. Enteroinvasive E. coli (EIEC) vi khuẩn xâm nhiễm vào biểu mô tế bào ruột, làm dung giải thể thực bào. Vi khuẩn thuộc nhóm này chủ yếu đƣợc phân lập ở ngƣời. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) phân lập đƣợc từ ngƣời và động vật nhai lại. Nhóm này thƣờng sản sinh yếu tố xâm nhiễm, độc tố Shiga (Stx). Quá trình xâm nhiễm và gây bệnh thƣờng gây nên những bệnh lý tế bào rất nặng. Enteroaggregative E. coli (EAEC) có khả năng sản sinh ra yếu tố bám dính và xâm nhập đƣợc xác định là yếu tố liên quan đến bệnh tiêu chảy của heo con sau cai sữa. Vi khuẩn nhóm này có thể tìm thấy ở ngƣời và ở heo, bò. Diffusely adhering E. coli (DAEC) có thể tìm thấy trong ruột non, đặc biệt là ở trẻ em từ 12 tháng tuổi trở lên. Trong một nghiên cứu trên những đứa trẻ ở bệnh viện giữa độ tuổi từ 1 tháng tuổi đến 14 tuổi, đa số những bệnh nhân nhiễm DAEC đều 2 bị ói mửa. Một vài nghiên cứu cho thấy DAEC là nguyên nhân của bệnh tiêu chảy. DAEC đƣợc xem là tác nhân gây bệnh trên những trẻ sơ sinh hơn là những đứa trẻ tập đi và biết đi. 2.1.1 Đặc điểm hình thái E. coli Escherichia coli là một loại trực khuẩn hình gậy ngắn, gram âm, kích thƣớc 2 3µm x 0,6µm. Trực khuẩn có hình cầu, đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Phần lớn E. coli di động do có lông ở quanh thân, nhƣng một số không thấy di động. Vi khuẩn không sinh nha bào, có khả năng hình thành giáp mô khi gặp môi trƣờng tốt. Nếu cố định bằng axit osmic rồi quan sát dƣới kính hiển vi thấy tế bào E. coli có nhân đó là một khối tối nằm trong nguyên sinh chất màu sáng (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997). 2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy E. coli E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, một số còn phát triển ở môi trƣờng đơn giản. E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có thể sống đƣợc ở nhiệt độ từ 5 - 40°C, nhiệt độ thích hợp là 37°C, pH thích hợp là 7,2 – 7,4, phát triển đƣợc ở pH 5,5 – 8,0. Trên môi trƣờng EMB (Eosin Methyl Blue) khuẩn lạc E. coli to, tròn, hơi lồi, bóng, màu thẫm tím, có ánh kim (Lƣu Hữu Mãnh, 2010). Trên môi trƣờng NA (Nutrient Agar) và môi trƣờng TSA (Trypticase Soy Agar) sau 18 – 24 giờ ủ trong tủ ấm 37°C hình thành những khuẩn lạc tròn, màu trắng nhạt, mặt khuẩn lạc hơi lồi, đƣờng kính 2 – 3 mm (Đào Trọng Đạt, 2001). Môi trƣờng nƣớc thịt vi khuẩn phát triển tốt, môi trƣờng rất đục, có cặn màu tro nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màu xám nhạt trên mặt môi trƣờng, môi trƣờng có mùi phân thối. Trên môi trƣờng Meller Kauffman và môi trƣờng Malasit, E. coli không mọc, môi trƣờng Vinson Blai thì E. coli bị ức chế (Nguyễn Nhƣ Thanh và ctv., 1997). Trên môi trƣờng thạch máu: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37°C, vi khuẩn E. coli hình thành khuẩn lạc to, ƣớt, lồi, viền không gọn, màu sáng, kích thƣớc từ 1 – 2 mm, có thể có hoặc không có dung huyết tùy thuộc vào chủng. Trên môi trƣờng MC (MacConkey Agar) vi khuẩn E. coli hình thành khuẩn lạc tròn đều màu hồng nhạt, mặt khuẩn lạc hơi lồi, kích thƣớc 2 – 3 mm (Nguyễn Ngọc Hải, 2012). 3 Hình 2.1: Khuẩn lạc E. coli trên môi trƣờng MC (http://www.impe-qn.org.vn) 2.1.3 Đặc tính sinh hóa Đặc tính lên men các loại đƣờng: Nhóm Escherichia coli gồm những trực khuẩn di động hoặc không di động, có khả năng lên men sinh hơi các loại đƣờng Glucoza, Fructoza, Galactoza, Lactoza, Maniton, Mannit, Levuloza, Xyloza. Lên men không chắc chắn với các loại đƣờng Dulciton, Sacaroza, Lactose trong khi đó vi khuẩn Salmonella thì không có đặc tính này, đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt vi khuẩn E. coli và Salmonella (Nguyễn Nhƣ Thanh và ctv., 1997). Vi khuẩn E. coli đƣợc định danh bằng các phản ứng sinh hóa qua các môi trƣờng KIA (Kliler Iron Agar), Simmons Citrate, VP (Voges – Proskauer), MR (Methyl Red), LIM (Lysine Indole Motility Medium) (Nguyễn Ngọc Hải, 2012). Môi trƣờng Trypton dùng để kiểm tra tính sinh Indole của vi khuẩn. Trên môi trƣờng này, sau khi nhỏ thuốc thử Kovac’s vào nếu trên bề mặt môi trƣờng xuất hiện vòng đỏ thì phản ứng dƣơng tính và ngƣợc lại nếu trên bề mặt môi trƣờng không xuất hiện vòng đỏ thì Indole âm tính. Môi trƣờng MR dùng để kiểm tra tính sử dụng đƣờng của vi khuẩn. Nhỏ lên bề mặt môi trƣờng vài giọt thuốc thử Methyl Red, phản ứng dƣơng tính sẽ có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trƣờng và ngƣợc lại. Môi trƣờng VP dùng để kiểm tra tính di động và tính sinh aceton của vi khuẩn. Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trƣờng. Ngƣợc lại, vi khuẩn không có khả năng di động thì chỉ thấy vi khuẩn mọc theo đƣờng que cấy, môi trƣờng xung quanh trong. Trên môi trƣờng VP, sau khi cho thuốc thử VP1 (α-napthol), VP2 (KOH) vào nếu trên bề mặt môi trƣờng có vòng đỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh aceton. Ngƣợc lại, nếu trên bề mặt môi trƣờng không xuất hiện vòng đỏ thì vi khuẩn không có khả năng sinh aceton. 4 Môi trƣờng Simmons citrate dùng để kiểm tra khả năng sử dụng citrate thay nguồn carbon của vi khuẩn. Trên môi trƣờng này, vi khuẩn cho kết quả dƣơng tính khi màu của môi trƣờng chuyển từ xanh lá cây sang xanh dƣơng. Cho phản ứng âm tính khi môi trƣờng vẫn giữ nguyên màu xanh lá. Bảng 2.1: Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli (Nguyễn Ngọc Hải, 2012) Phản ứng sinh hóa Kết quả Di động Dƣơng tính Glucose Dƣơng tính Lactose Dƣơng tính H2 S Âm tính Indole Dƣơng tính Methyl red Dƣơng tính Voges Proskauer Âm tính Citrate Âm tính 2.1.4 Cấu trúc kháng nguyên Cấu trúc kháng nguyên của E. coli rất phức tạp, có 3 loại kháng nguyên: kháng nguyên thân O (Somatic), kháng nguyên H (Flagellar) và kháng nguyên vỏ K (Capsular). Cho đến nay ngƣời ta đã xác định đƣợc 175 type kháng nguyên O, 80 type kháng nguyên K và 56 type kháng nguyên H. Kháng nguyên O (Somatic – kháng nguyên thân) Đây là thành phần chính của vi khuẩn và cũng đƣợc coi là yếu tố độc lực của vi khuẩn. Kháng nguyên O đƣợc coi là ngoại độc tố, đƣợc tìm thấy màng ngoài vỏ vi khuẩn và thƣờng xuyên phóng thích vào môi trƣờng nuôi cấy. Tất cả kháng nguyên O đều cƣ trú bề mặt, do vậy có thể liên kết trực tiếp với hệ thống miễn dịch. Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tƣơng ứng sẽ xãy ra phản ứng ngƣng kết gọi là “hiện tƣợng ngƣng kết O” thân vi khuẩn ngƣng kết với nhau dƣới dạng những hạt khô, rất khó tan khi lắc. Kháng nguyên O chịu nhiệt, khi đun ở 100°C trong vòng 2 giờ 30 phút vẫn giữ đƣợc tính kháng nguyên, giữ đƣợc khả năng ngƣng kết và kết tủa. Không bị cồn phá hủy, có tính chất của một lipopolysaccharide. Đặc tính của kháng nguyên O và kháng nguyên H giống các trực khuẩn đƣờng ruột khác. Kháng nguyên O là thành phần gây đáp ứng miễn dịch đối với vật chủ. Ngƣời ta có thể tách chiết kháng nguyên O của vi khuẩn E. coli bằng các loại dung môi hữu cơ hoặc bằng phƣơng pháp tổ hợp gene để sản 5 xuất vaccine phòng bệnh hoặc gây miễn dịch để chế kháng huyết thanh chẩn đoán (Nguyễn Vĩnh Phƣớc, 1970). Kháng nguyên H (Flagelar – kháng nguyên lông) Kháng nguyên H là kháng nguyên kém chịu nhiệt, đƣợc cấu tạo bởi protein. Ở 100°C trong vòng 2 giờ 30 phút tính kháng nguyên, khả năng ngƣng kết của kháng nguyên đều bị hủy (Đào Trọng Đạt và ctv., 1999). Kháng nguyên H của vi khuẩn E. coli không có vai trò về bám dính, đồng thời không có vai trò đáp ứng miễn dịch nên ít đƣợc quan tâm nghiên cứu, nhƣng nó có ý nghĩa lớn trong việc xác định giống, loài của vi khuẩn và bảo vệ vi khuẩn khỏi bị tiêu diệt trong tế bào đại thực bào, giúp vi khuẩn sống lâu và tồn tại trong đại thực bào. Kháng nguyên K (Capsular – kháng nguyên bề mặt) Kháng nguyên K còn đƣợc gọi là kháng nguyên vỏ, kháng nguyên màng tế bào. Đƣợc cấu tạo bởi polysaccharide hoặc protein. Loại này chỉ có ở một số loại vi khuẩn đƣờng ruột. Những chủng có kháng nguyên L và B thƣờng không chịu nhiệt và không tìm thấy giáp mô (Nguyễn Nhƣ Thanh và ctv., 1997). 2.1.5 Sức đề kháng Vi khuẩn có thể bị vô hoạt ở nhiệt độ 60°C trong 30 phút, ở 70°C vi khuẩn bị vô hoạt trong 2 phút, trong điều kiện đông khô vi khuẩn có thể sống lâu. Vi khuẩn có khả năng đề kháng với nhiều loại kim loại nặng nhƣ: arsenic, đồng, kẽm, thủy ngân và các chất sát trùng nhƣ hỗn hợp amonium, oxy già, formadehyde và chlorhexidine (Hồ Thị Việt Thu và ctv., 2012). Các chất tiêu độc bình thƣờng nhƣ phenol, formol, vôi ở nồng độ thông thƣờng cũng làm E. coli chết rất nhanh. Tuy nhiên, ở môi trƣờng bên ngoài các chủng E. coli độc có thể tồn tại đến 4 tháng (Nguyễn Nhƣ Thanh và ctv., 1997). 2.1.6 Độc tố vi khuẩn E. coli là trực khuẩn thƣờng trú ở đƣờng ruột của ngƣời và loài động vật máu nóng, hầu hết các chủng E. coli đều vô hại. Tuy nhiên do sự suy giảm miễn dịch hoặc có sự tổn thƣơng niêm mạc ở đƣờng tiêu hóa mà ngay cả chủng E. coli thông thƣờng cũng có thể gây bệnh. Vi khuẩn E. coli tạo ra 2 loại độc tố là: nội độc tố và ngoại độc tố (Lê Văn Tạo và ctv., 2006). Nội độc tố (Endotoxin): thành phần chính Lypopolysacharid (LSP) và Lipid A cấu tạo nên thành phần tế bào vi khuẩn, khi tế bào vỡ ra thì các chất này đƣợc giải phóng và gây độc cho tế bào vật chủ, là độc tố chủ yếu của trực khuẩn đƣờng ruột. Nội độc tố có thể chiết xuất bằng nhiều phƣơng pháp phá vỡ tế bào bằng cơ học, chiết xuất bằng axit trichloaxetic hoặc phenol dƣới tác dụng của enzyme. Nội độc 6 tố có cấu trúc polysaccharide thuộc về kháng nguyên hoàn toàn và có tính đặc hiệu cao đối với các chủng của mỗi serotype. Ngoại độc tố (Exotoxin): do chính tế bào vi khuẩn tiết ra môi trƣờng xung quanh vi khuẩn trong quá trình sinh trƣởng phát triển của chúng. Loại độc tố này chỉ có ở vi khuẩn có độc lực, có khả năng gây bệnh. Ngoại độc tố là một chất không chịu nhiệt, dễ bị phá hủy ở 56°C trong vòng 15 – 30 phút. Dƣới tác động của formol và nhiệt độ, ngoại độc tố thành giải độc tố. Ngoại độc tố có hƣớng ngoại thần kinh và gây hoại tử. Hiện nay việc chiết xuất ngoại độc tố chƣa thành công mà chỉ có thể phát hiện trong canh trùng của những chủng mới phân lập đƣợc. 2.1.7 Tính gây bệnh Vi khuẩn E. coli gây bệnh trên gia cầm là nhóm APEC (Avian Pathogenic E. coli) thuộc serotype O1, O2, O78 gây bệnh đƣờng ruột là do kết hợp với nhiều yếu tố ngoại cảnh và nhân tố mở đƣờng (Lê Hồng Mận, 1999). Bệnh tiêu chảy do E. coli thƣờng xảy ra ở gà 1 – 10 ngày tuổi, kéo dài đến 9 tuần tuổi. Trong tự nhiên vi khuẩn tồn tại khắp nơi nền chuồng, máng ăn, nƣớc uống, chuồng trại ẩm thấp chật chội, mật độ nuôi cao, biên độ nhiệt thƣờng xuyên thay đổi, stress có thể là những điều kiện phát sinh mầm bệnh. Nguồn lây bệnh chủ yếu là từ gà bệnh và gà khỏe mang trùng bài xuất mầm bệnh ra môi trƣờng nuôi nhốt, ngoài ra nguồn bệnh có thể do các loài gặm nhấm lây truyền sang hoặc có thể từ công nhân mang mầm bệnh từ môi trƣờng ngoài vào (Nguyễn Xuân Bình, 2005). Vi khuẩn E. coli có thể lây qua đƣờng tiêu hóa, qua vết thƣơng ngoài da, qua niêm mạc đƣờng hô hấp bị tổn thƣơng, ngoài ra trứng có thể nhiễm E. coli từ buồng trứng hoặc ống dẫn trứng của gà mẹ, có khoảng 26,5% trứng nhiễm E. coli từ gà mẹ bị nhiễm E. coli (Hồ Thị Việt Thu và ctv., 2012). Triệu chứng: ủ rũ, mệt mỏi, tụm lại từng đám, xù lông, tiêu chảy phân có màu vàng nhạt, hậu môn dính bết phân. Bệnh tích: viêm màng bao tim, viêm cơ tim, bao tim dầy đục do tích tụ của dịch tiết có fibrin, trƣờng hợp kéo dài màng bao tim dính vào cơ tim. Viêm màng gan, gan sƣng, sậm, có màu xanh của mật. Viêm xoang vùng đầu, làm cho vùng đầu sƣng. Viêm ruột có nhiều hạt ở manh tràng, tá tràng, màng treo ruột, gan và không có sự hiện diện ở lách (Hồ Thị Việt Thu và ctv., 2012). 2.2 Giới thiệu về vi khuẩn sinh ESBL ESBL là viết tắt của từ Extended Spectrum Beta - lactamase, một loại enzyme đƣợc sản xuất bởi một số vi khuẩn. Men beta - lactamse phổ rộng (ESBL) đƣợc tìm thấy lần đầu tiên năm 1983 tại Đức, thƣờng gặp trong các chủng vi khuẩn đƣờng ruột đặc biệt là Klebsiella sp., E. coli… khi các chủng vi khuẩn sinh ESBL 7 thì đồng nghĩa với việc chúng kháng lại rất nhiều kháng sinh, đặc biệt là nhóm cephaslosporin. Đây là gánh nặng thực sự trong trong điều trị nhiễm trùng trực khuẩn gram âm. Những vi khuẩn sinh ESBL có thể mắc do lây truyền từ ngƣời này sang ngƣời khác, hoặc do sự chọn lọc do việc dùng kháng sinh (Paterson, 2005). Một số nghiên cứu E. coli ESBL trên gà ở nƣớc ngoài cho thấy: Theo Li Yuan et al. (2009), khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E. coli ESBL trên 51 mẫu gan gà thịt bệnh tại 14 trại gà ở tỉnh Hà Nam, Trung Quốc với tỷ lệ dƣơng tính là 60,8%. Kết quả nghiên cứu của Sunday Akidarju Mamza et al. (2010), khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E. coli ESBL tại Nigeria ở 400 con gà trên các cơ quan phổi, lách, ổ nhớp, ruột chiếm tỷ lệ lần lƣợt phổi 16,9%, lách 15,5%, ổ nhớp 4,9% và ruột 9,7%. Theo Leverstein - Van Hall et al. (2011), kiểm tra tỷ lệ dƣơng tính E. coli ESBL trên 98 mẫu thịt gà bán lẻ tại 12 cửa hàng ở Utrecht, Hà Lan là 94%. Trong đó phát hiện có 39% kiểu gen thuộc các kiểu gen đƣợc tìm thấy ở ngƣời. Nghiên cứu này cũng cho thấy các gen E. coli sinh ESBL có thể truyền từ gia cầm sang ngƣời thông qua các thức ăn bị nhiễm E. coli ESBL. Kết quả của Ilse Overdevest et al. (2011), phân tích 262 mẫu thịt gà ở Hà Lan cho thấy có 209 mẫu E. coli ESBL dƣơng tính, chiếm tỷ lệ là 79,8%. Theo Valeria Bortolaia et al. (2010), E. coli ESBL đƣợc sinh ra trên các yếu tố di truyền di động do đó có thể truyền qua cả chiều dọc và chiều ngang giữa các dòng vi khuẩn khác nhau. Theo kết quả nghiên cứu của Annemieke Smet (2008), phân tích 498 mẫu phân từ 5 trại gà thịt công nghiệp ở Bỉ, phát hiện 133 mẫu E. coli ESBL dƣơng tính, chiếm tỷ lệ 26,7%. Trong khoảng 10 năm trở lại đây, tại Việt Nam bắt đầu quan tâm đến các vi khuẩn gram âm sinh ESBL, tuy vậy vẫn chƣa có nhiều nghiên cứu về vấn đề này. Các nghiên cứu đa phần đƣợc thực hiện với đối tƣợng là ngƣời ở các bệnh viện lớn. Tỷ lệ vi khuẩn đƣờng ruột sinh ESBL dao động lớn tùy theo từng khu vực, cao nhất là ở bệnh viện Chợ Rẫy với 61% các chủng Klebsiella và 52,6% các chủng E. coli sinh ESBL. Ở bệnh viện Việt Đức nghiên cứu cho thấy tỷ lệ E. coli ESBL dƣơng tính là 34,2% (Nguyễn Thị Yến Chi, 2011). Theo kết quả nghiên cứu của Hồ Thị Kim Hoa và ctv. (2012) phát hiện sự hiện diện của một số vi khuẩn sinh ESBL ở trong chất thải chăn nuôi. Phân tích 45 mẫu bằng kỹ thuật PCR phát hiện có 37 mẫu chứa gen TEM, 4 mẫu chứa gen SHV và 8 không có mẫu nào chứa gen CTX-M. Từ các mẫu dƣơng tính, 357 chủng đƣợc kiểm tra kháng sinh đồ, kết quả có 40,9% chủng vi khuẩn kháng với ít nhất 1 kháng sinh và 52% chủng vi khuẩn kháng từ 2 kháng sinh trở lên. 2.3 Giới thiệu một số phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL 2.3.1 Phƣơng pháp ChromID ESBL agar Môi trƣờng ChromID ESBL do hãng Bio - Merieux (Pháp) sản xuất, đã đƣợc nhiều nƣớc trên thế giới sử dụng. Đây là môi trƣờng đƣợc khuyến cáo dùng để sàng lọc các vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae sinh ESBL. Việc xác định vi khuẩn sinh ESBL đặc biệt quan trọng trong việc phòng và giám sát dịch tể bệnh nhiễm khuẩn. Môi trƣờng chứa kháng sinh cefpodoxime và chất màu. Chất màu đƣợc thêm vào dễ dàng phát hiện các phản ứng do enzyme của vi khuẩn nếu có trong môi trƣờng. Vì vậy có thể đồng thời vừa định danh vi khuẩn vừa phát hiện vi khuẩn đề kháng. Nếu vi khuẩn sinh ESBL sẽ kháng với cefpodoxime và có khả năng phát triển trên môi trƣờng ChromID ESBL tạo thành các khuẩn lạc có màu sắc khác nhau, đặc trƣng cho một số loài vi khuẩn (Nguyễn Sâm, 2009). 2.3.2 Phƣơng pháp đĩa đôi Phƣơng pháp đĩa đôi đƣợc các nhà nghiên cứu ngƣời Pháp tiến hành cuối những năm 1980. Sau đó tác giả ngƣời Anh David M Livermore và các cộng sự đã tiếp tục nghiên cứu và đề xuất thêm một số tiêu chuẩn kỹ thuật cho thử nghiệm. Các ESBL có khả năng phân hủy các cephalosporin phổ rộng nhƣng bị ức chế bởi acid clavulanic và mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh cephalosporin khi đặt gần một đĩa kháng sinh chứa acid clavulanic (Livermore DM, 2002). 2.3.3 Băng giấy E-test ESBL Băng giấy E-test là khoanh plastic mỏng, kích thƣớc 5 × 60 mm, một mặt không thấm nƣớc, một mặt đƣợc tẩm kháng sinh với các nồng độ khác nhau. Băng giấy E-test ESBL là một loại băng E-test đặc biệt, có một phần chứa các nồng độ kháng sinh cephalosporin phổ rộng đƣợc pha loãng từ thấp đến cao, tính bằng µg/ml, phần còn lại chứa cephalosporin phổ rộng kết hợp clavulanic acid kết hợp. ESBL bị ức chế bởi clavulanic acid nên E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL sẽ có vùng ức chế vi khuẩn ở phần chứa kháng sinh kết hợp clavulanic acid, phần còn lại không có chất ức chế dẫn đến kháng sinh bị ESBL phân hủy nên vùng ức chế vi khuẩn nhỏ hơn hoặc không có vùng ức chế do vi khuẩn không bị kháng sinh ức chế hoặc chỉ bị ức chế ở nồng độ kháng sinh cao (Bradford PA, 1994). 9 2.3.4 Phƣơng pháp đĩa kết hợp Sử dụng một khoanh giấy kết hợp cephalosporin với acid clavulanic 30µg và một khoanh giấy cephalosporin 30µg. Nếu đƣờng kính ức chế ở khoanh kết hợp lớn hơn khoanh còn lại 5 mm thì kết luận vi khuẩn sinh ESBL. Tiêu chuẩn CLSI yêu cầu với phƣơng pháp này cần phải thực hiện đồng thời trên cả hai hệ thống là: ceftazidime 30µg, ceftazidime – acid clavulanic 10µg; cefotaxime 30µg, cefotaxime – acid clavulanic 10µg (Nguyễn Thị Yến Chi, 2011). 10
- Xem thêm -