Khảo sát quy trình miễn dịch kháng huyết thanh uốn ván sử dụng tá chất montanide isa 50v2

  • Số trang: 54 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 29 |
  • Lượt tải: 0
nhattuvisu

Đã đăng 26946 tài liệu

Mô tả:

1 MỞ ĐẦU Ngày nay bệnh uốn ván vẫn còn là bệnh gây tử vong không ít đối với các nước kém phát triển, các n ước đang phát triển trong đó có Việt Nam. Tr ên thế giới, tỷ lệ mắc bệnh uốn ván dẫn đến tử vong c òn cao. Trong những năm gần đây nhờ những công trình nghiên cứu phòng và điều trị uốn ván, nhất là chương trình tiêm phòng uốn ván cho trẻ em và phụ nữ mang thai được tổ chức y tế thế giới phát động đã làm giảm tỷ lệ tử vong bệnh uốn ván xuống 30 – 48% [3]. Tuy nhiên các đối tượng khác như người già, người trung niên chưa được tiêm phòng uốn ván, hay có tiêm phòng nhưng chưa tiêm nhắc lại rất lớn, đã làm cho hiệu quả của việc miễn dịch chủ động bằng cách ti êm phòng vacxin uốn ván còn hạn chế. Hơn nữa tình trạng tai nạn giao thông hiện nay tăng l ên rất nhiều so với các năm trước nên số lượng người có nguy cơ mắc uốn ván cũng tăng theo. V ì vậy tiêm huyết thanh kháng độc tố uốn ván (SAT) vẫn l à cách điều trị dự phòng hữu hiệu. Từ lâu huyết thanh điều trị l à biện pháp miễn dịch thụ động đ ược dùng để trung hoà lại độc tố của vi khuẩn uốn ván. Tuy nhi ên ngày nay nhu cầu về huyết thanh uốn ván tăng lên do số người có nguy cơ mắc bệnh cao. Vì vậy nghiên cứu ra quy trình gây miễn dịch sản xuất huyết thanh có hiệu giá cao l à mục tiêu đặt ra hàng đầu. Viện Vacxin hiện đang từng bước áp dụng qui trình miễn dịch ngựa để cải tiến phương pháp sản xuất huyết thanh kháng uốn ván tiến tới nâng cao chất l ượng và số lượng đồng thời giảm giá th ành, vì vậy chúng tôi thực hiện đề t ài: “Khảo sát quy trình miễn dịch kháng huyết thanh uốn ván sử dụng tá chất Montanide ISA 50V2”. Mục tiêu của đề tài: 1. So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch ngựa đối với hai loại tá chất d ùng để pha kháng nguyên: Nhôm phosphate (AlPO 4) và Montanide ISA 50V2. 2. Đề xuất quy trình gây miễn dịch ngựa bằng kháng nguy ên giải độc tố uốn ván tinh chế với loại tá chất cho hiệu giá kháng thể cao. 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Bệnh uốn ván. 1.1.1. Lịch sử phát hiện nguyên nhân gây bệnh uốn ván [8], [10].  Bệnh uốn ván được mô tả lần đầu tiên từ thời Hypocrate. Năm 1854 Simpon đã mô tả được triệu chứng uốn ván giống nh ư bị ngộ độc Strychnin…  Năm 1884 Carle và Rottone đ ã chứng minh tính chất nhiễm khuẩn uốn ván và mô tả bệnh uốn ván điển hình ở thỏ bằng cách tiêm dịch nghiền của vết thương tấy mủ của người mắc bệnh cho thỏ.  Năm 1885 Nicholaire đã tìm thấy loại trực khuẩn uốn ván nh ưng không phân lập được chủng thuần khiết. Ông cho rằng nguy ên nhân gây ra bệnh uốn ván là do chất độc từ trực khuẩn này tiết ra giống như Strychnin.  Năm 1886 Rosebach tìm thấy nha bào của vi khuẩn uốn ván.  Năm 1989 Kitazazo đ ã phân lập được trực khuẩn uốn ván từ một vết thương tấy mủ, thuần khiết được trực khuẩn này trong môi trường nuôi cấy nhân tạo và nhận thấy có chứa một độc tố ho à tan, độc tố này gây nên triệu chứng uốn ván. 1.1.2. Vi khuẩn uốn ván [8], [ 10]. Vi khuẩn uốn ván có tên khoa học là Clostridium tetani, là trực khuẩn Gram (+), có kích thước rộng 0.3 – 0,5 µm, dài 2,0 – 2,5 µm di động, có khả năng hình thành nha bào, mọc tốt trong môi trường yếm khí. Nha bào uốn ván có sức chịu đựng rất tốt, tồn tại nhiều năm trong đất b ùn, môi trường không có ánh sáng, chịu đựng được nhiệt độ sôi từ 1 – 3 giờ, có thể tồn tại 10 giờ trong dung dịch phenol 5% và 24 giờ trong dung dịch phenol 3%. Nhiệt độ 100 0C và các chất diệt khuẩn không diệt được nha bào, phải đun sôi kéo dài hay hấp ướt 1200C trong 30 phút thì mới có thể diệt trùng được nha bào uốn ván. Trực khuẩn uốn ván lên men đường glucose, sự hình thành nha bào sẽ tăng lên trong môi trường không có huyết thanh v à glucose. a. Khả năng gây bệnh [21]. Bệnh uốn ván là bệnh nhiễm độc thần kinh trung ương bởi độc tố của trực khuẩn Clostridium tetani. Vi khuẩn gây bệnh uốn ván ở khắp mọi nơi: trong đất, 3 bụi, phân người và súc vật... Bởi vậy, khả năng nhiễm bệnh đối với mọi ng ười đều rất lớn, nhất là ở thôn quê. Vết thương không cần sâu hay rộng, cũng vẫn có thể nhiễm trùng uốn ván. Phạm vi phân bố đã rộng mặt khác lại là vi khuẩn sinh nha bào nên khả năng tồn tại trong thiên nhiên rất lâu và vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo đường vết thương ở chân tay nên tỷ lệ mắc bệnh và chết do trực khuẩn uốn ván rất cao. Khi xâm nhập vào cơ thể chúng sinh ra độc tố mạnh , độc tố này xâm nhập vào các sợi thần kinh ngoại vi của hệ thần kinh trung ương. Tại đây, nó ức chế sự giải phóng các chất ức chế thần kinh nh ư glycin gây nên các triệu chứng co cơ, co giật do tăng trương lực cơ, liệt cứng và bệnh nhân có thể chết do suy hô hấp. Khi xâm nhập vào đường tiêu hóa, trực khuẩn bị phá hủy bởi acid dạ d ày do đó không gây bệnh theo đường tiêu hóa [26]. b. Tính chất sinh hóa của độc tố uốn ván. Tác nhân dẫn đến tử vong chính l à độc tố uốn ván. Độc tố này có tính độc rất mạnh, liều gây chết ở ng ười là 2,5 ng/kg cân nặng. Độc tố uốn ván được tổng hợp trong tế bào vi khuẩn uốn ván, trong các điều kiện nuôi cấy thí nghiệm độc tố được tách từ nước nổi của canh khuẩn. Độc tố n ày tan trong nước, bị phá hủy khi đun nóng ở nhiệt độ 70 0C [21]. Thành phần hoá học của độc tố uốn ván gồm ba phần: một phần có tác dụng gây tan máu, có tính đ ộc với tim, dễ bị ôxy hoá gọi l à tetanolysin; một phần gọi là tetanospasmin gây co giật các cơ, là triệu chứng cơ bản của bệnh uốn ván; phần c òn lại là neurotoxin không gây co th ắt, không có vai trò trong cơ chế gây bệnh uốn ván. Độc tố này tan trong nước, bắt đầu kết tủa trong dung dịch v à mất hoạt tính khi pH = 6 nhưng bền ở pH = 5 khi có mặt glycerin, c ơ chế việc sản sinh độc tố của trực khuẩn uốn ván đến nay còn nhiều điều chưa rõ. Độc tố có độc lực rất mạnh, có ái tính cao với tế bào thần kinh. Bản chất của độc tố uốn ván l à một protein chứa 15,7% nitơ; 0,062% phospho; 1,04% sulfur, không có cacbonhydrat e và lipide, điểm đẳng điện là 5 – 5,2 pI [8], [23]. Độc tố uốn ván có trọng l ượng phân tử 150.000 dalton, l à một chuỗi polypeptide đơn, gồm một chuỗi nhẹ có trọng l ượng phân tử 53.000 dalton v à một chuỗi nặng có trọng lượng phân tử 107.000 dalton nối với nhau bởi cầu nối disulfur. 4 Độc tố uốn ván và độc tố ngộ độc thịt (butolinum) thường gây bệnh nhiều nhất trong các loại độc tố do vi khuẩn tiết ra [10]. Trực khuẩn phát triển tại vết th ương và tiết ra độc tố làm tổn thương các nơron thần kinh trung ương gây nên co cứng cơ vân. Triệu chứng điển hình của bệnh uốn ván là những cơn co cơ và kèm theo đau, kh ởi đầu ở cơ vân, đến cơ cổ tiếp theo là khối cơ lưng [8]. Phần lớn các trường hợp chỉ vì giẫm phải một cái đinh rỉ, mắc chân vào một sợi dây kẽm gai, bị một cái dằm đâm v ào dưới móng tay, bị xước tay vết đốt của côn trùng, vết răng của chó, mèo... đều có thể là nơi xâm nhập của loại vi khuẩn uốn ván [24]. 1.1.3. Dịch tễ học uốn ván. a. Trên thế giới: Bệnh uốn ván là một trong những vấn đề quan trọng của việc bảo vệ sức khoẻ cộng đồng. Tỷ lệ người mắc bệnh cao, tỷ lệ tử vong đến 60 – 80%. Trong 30 năm gần đây nhiều công trình nghiên cứu về phòng và điều trị bệnh uốn ván nhất l à chương trình tiêm phòng uốn ván cho trẻ sơ sinh do WHO đề xướng đã làm cho tỷ lệ tử vong vì bệnh uốn ván giảm xuống 30 – 48% [10]. Tổ chức Y tế Thế giới công bố, có đến 715.000 người tử vong do uốn ván (1993), trong đó chủ yếu là uốn ván sơ sinh (dưới 28 tháng tuổi) ở các n ước đang phát triển. Con số này có giảm xuống 2 năm sau (chỉ c òn 515.000 năm 1995) [27]. Phân bố bệnh theo địa lý không đồng đều. T ùy thuộc vào sự phát triển kinh tế, mạng lưới Y tế nông thôn và sự đầu tư của chính phủ mà bệnh thay đổi tùy theo từng nước. Các nước càng ở gần xích đạo, kém phát triển kinh tế, mạng l ưới Y tế nông thôn và hộ sinh càng yếu kém thì tỷ lệ bệnh càng cao [27]. Ở Mỹ bệnh uốn ván là bệnh của người già, trong những năm gần đây theo kết quả điều tra về kháng thể uốn ván cho thấy rất nhiều ng ười trưởng thành không có kháng thể đủ để bảo vệ bệnh uốn ván [8]. Ở Anh và Wales trong thời gian từ 1969 – 1972, mỗi năm có 140 trường hợp mắc bệnh uốn ván. Từ năm 1973 đến năm 1982 mỗi năm có 46 tr ường hợp mắc bệnh uốn ván, trong đó có 5 tr ường hợp tử vong. Trong năm 1983 có 10 trường hợp, trong đó có 1 tử vong. Năm 1984 có 20 tr ường hợp trong đó có 3 tử vong. Cũng như ở Mỹ bệnh uốn ván ở Anh l à bệnh của tuổi trưởng thành. 5 Ở các nước đang phát triển tỷ lệ mắc và chết do bệnh uốn ván cao [10]. b. Việt Nam: Ở nước ta, chưa có một tổng kết toàn quốc về uốn ván trong những năm gần đây. Tuy nhiên với sự phát triển của mạng l ưới y tế và hộ sinh và nhất là chương trình chủng ngừa phòng uốn ván cho sản phụ ở quý cuối, uốn ván rốn trở n ên hiếm gặp ở các phòng cấp cứu sơ sinh. Chương trình tiêm chủng mở rông cũng làm giảm tỷ lệ uốn ván ở trẻ em. Tuy nhi ên, ở người lớn, vấn đề phòng ngừa uốn ván chưa được quan tâm nhiều, nên uốn ván cũng thường gặp [27]. Ở Khoa Y học lâm sàng nhiệt đới Bệnh viện Trung ương Huế, tỷ lệ uốn ván người lớn chiếm chừng 0,3% bệnh nhân nhập viện (1996). Tỷ lệ tử vong chừng 50%. Hầu hết là uốn ván toàn thể. Chỉ một vài ca thể cục bộ và thể đầu. Đường vào chủ yếu là từ vết thương ngoài da. Một số không tìm thấy đường vào hay sau một phẫu thuật (0,03%) [27]. Bảng 1.1: Tỷ lệ trẻ sơ sinh phòng tránh được bệnh uốn ván tại Việt Nam (1990 – 2007) [22] Năm Tỷ lệ trẻ sơ sinh phòng tránh được bệnh uốn ván (%). Năm Tỷ lệ trẻ sơ sinh phòng tránh được bệnh uốn ván (%). 1990 24,0 1999 83,0 1991 21,0 2000 86,0 1992 38,0 2001 86,0 1993 69,0 2002 86,0 1994 76,0 2003 87,0 1995 80,0 2004 88,0 1996 89,0 2005 89,0 1997 86,0 2006 88,0 1998 82,0 2007 86,0 6 Công tác loại trừ UVSS ở nước ta ngày càng được tăng cường: Tỷ lệ trẻ sơ sinh phòng tránh được bệnh uốn ván ngày càng tăng, từ 38,0% năm 1992 tăng l ên đến 69,0% năm 1993, các năm sau đó có xu h ướng ổn định ở mức trên 80% [19]. Một vài số liệu cụ thể, năm 1992 có 338 tr ường hợp mắc UVSS, đến năm 2003 giảm chỉ còn 76 trường hợp, và đến năm 2008 tỷ lệ UVSS chỉ còn 0,14/100.000 dân. Tỷ lệ tiêm vacxin uốn ván cho phụ nữ có thai từ năm 1995 đến nay luôn đạt trên 80%, tỷ lệ tiêm vacxin uốn ván cho phụ nữ 15 – 35 tuổi tại các huyện có nguy cơ UVSS luôn đạt trên 90% (Chương trình TCMR quốc gia – Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương). Việt Nam đã loại trừ được bệnh uốn ván sơ sinh trên toàn quốc vào năm 2005 [19]. 1.2. Miễn dịch chống lại bệnh uốn ván. 1.2.1. Miễn dịch tự nhiên [14]. Kể từ lúc tìm ta nguyên nhân gây bệnh uốn ván, một số tác giả đ ã quan tâm nghiên cứu miễn dịch tự nhiên có hay không đối với bệnh uốn ván. Song đến năm 1993 Tổ chức Y tế Thế giới đã đúc kết và chính thức nhận định loại miễn dịch n ày hầu như không có và nếu hạn hữu có thì cũng không đủ lượng kháng thể để phòng bệnh uốn ván. Do đó việc gây miễn dịch chủ động bằng ph ương pháp tiêm vacxin uốn ván giữ một vai trò quan trọng trong việc phòng bệnh uốn ván. 1.2.2. Miễn dịch chủ động. Miễn dịch chủ động (active immunity) l à trạng thái miễn dịch của một c ơ thể do bộ máy miễn dịch của bản thân c ơ thể đó chủ động sinh ra khi đ ược kháng nguyên (được gọi là vacxin) kích thích. Đưa vacxin u ốn ván vào cơ thể kích thích tạo kháng thể kháng bệnh l à phương pháp phòng bệnh uốn ván có hiệu lực nhất. Vacxin uốn ván kích thích cơ thể con người tạo ra kháng thể trung hoà độc tố uốn ván, nhờ đó bảo vệ được cơ thể chống lại bệnh. Khả năng bảo vệ n ày tuỳ thuộc vào lượng độc tố uốn ván, hàm lượng của kháng thể uốn ván [10], [1]. Để gây miễn dịch chủ động có kết quả tốt, ng ày nay người ta nghiên cứu sản xuất những vacxin đơn giá như TT dùng cho người lớn; vacxin phối hợp hai thành phần như DT dùng cho trẻ em dưới 6 tuổi, Td dùng cho trẻ em từ 6 tuổi trở lên; vacxin phối hợp ba thành phần giải độc tố uốn ván, giải độc tố bạch hầu, xác vi khuẩn ho gà gọi là DTP dùng cho trẻ em dưới 6 tuổi. Các giải độc tố th ường được 7 dùng kết hợp với tá chất để làm tăng hiệu quả đáp ứng miễn dịch cho c ơ thể [13], [14]. Có thể phòng bệnh uốn ván suốt đời bằng cách ti êm vacxin như sau:  Tiêm vacxin DTP cho trẻ em dưới 6 tuổi.  Tiêm vacxin Td cho trẻ em từ 6 tuổi trở lên.  Tiêm vacxin TT cho phụ nữ mang thai và lứa tuổi sinh đẻ (15 – 44 tuổi): Tiêm đủ 5 liều trong vòng 31 tháng, tiêm càng s ớm càng tốt khi có thai.  Tiêm vacxin TT cho những người có nguy cơ mắc cao (người làm vườn, người làm việc ở các trang trại, công nhân xây dựng công tr ình…): Tiêm miễn dịch 3 liều trong vòng 6 tháng, cứ sau 5 – 10 năm tiêm nhắc lại một liều [14]. 1.2.3. Miễn dịch thụ động. Năm 1890, Berhing và Kitazato đ ã đặt nền móng cho kiểu miễn dịch thụ động. Về sau Roux đã đưa ra một quan điểm là có thể dùng huyết thanh miễn dịch để điều trị cho tất cả bệnh nhiễm tr ùng. Kiểu miễn dịch thụ động đ ược sử dụng trong những trường hợp phải tạo miễn dịch nhanh chóng khi có nguy c ơ mắc bệnh cao hoặc nghi ngờ bị nhiễm bệnh [8]. Nguyên tắc của miễn dịch thụ động l à đưa vào cơ thể bệnh nhân một lượng kháng thể đặc hiệu được sản xuất từ súc vật hay ng ười đã được gây miễn dịch với kháng nguyên đặc hiệu. Kháng thể này sẽ trung hoà các độc tố hay virut trong máu của bệnh nhân. Một vấn đề q uan trọng trong miễn dịch thụ động l à thời gian miễn dịch rất ngắn, kháng thể đặc hiệu sẽ bị thải ra ngo ài. Vì vậy trong việc điều trị dự phòng bệnh uốn ván hay bệnh dại bao giờ ng ười ta cũng có sự phối hợp giữa miễn dịch thụ động và miễn dịch chủ động. Ngoài ra khi sử dụng huuyết thanh miễn dịch để phòng ngừa hay điều trị thường gây ra phản ứng dị ứng, bệnh huyết thanh. Để loại bỏ những phản ứng tr ên, người ta phải tinh chế huyết thanh miễn dịch để loại bỏ các phần tử không cần thiết đối với huyết thanh kh ác loài hay điều chế huyết thanh miễn dịch cùng loài (huyết thanh từ người) hoặc kháng thể đơn dòng [10]. 1.3. Huyết thanh. Sử dụng huyết thanh là phương pháp tạo miễn dich thụ động rất có hiệu quả. Có thể điều chế kháng huyết thanh chống độc tố v à vi khuẩn từ máu ngựa được gây miễn dịch với kháng nguyên hoặc từ máu người đã tiêm vacxin và có kháng th ể 8 cao. Ngoài ra, miễn dịch thụ động còn được tạo ra bởi γ - globulin lấy từ máu nhau thai. γ - globulin được tinh chế có ưu điểm đáng kể là giảm hẳn các phản ứng phụ cho người tiêm, đặc biệt có nồng độ kháng thể cao điều trị bệnh rất hữu hiệu [10]. 1.3.1. Tính chất lý hoá chung của huyết thanh [8]. Máu là dịch lỏng, nhớt, màu đỏ. Máu toàn phần gồm hai phần: - Tế bào máu: Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu. - Huyết tương: Huyết thanh (serum), các yếu tố đông máu (sợi huyết fibrinogen)… Khi máu để đông tự nhiên thì các tế bào máu và các yếu tố đông máu bị đông lại, phần còn lại tách ra khỏi cục máu l à chất dịch màu vàng rơm gọi là huyết thanh. Máu có độ nhớt cao hơn nước: nước = 1; máu = 5; huyết tương = 1,7 – 2,2. Độ nhớt của huyết tương thay đổi trong các trường hơp sinh lý và bệnh lý. Độ pH: độ pH của huyết thanh phụ thuộc chủ yếu v ào nồng độ H +, OH- và có ý nghĩa rất quan trọng. Khi pH của huyết thanh không phải l à hằng số thì pH của máu cũng thay đổi, do đó các phản ứng trong c ơ thể không xảy ra. Bởi vậy pH của huyết thanh luôn ở khoảng giá trị cố định 7,2 – 7,5. 1.3.2. Thành phần hoá học của huyết thanh. Huyết thanh chiếm tỉ lệ 55 – 60% tổng lượng máu, là dịch trong suốt màu vàng nhạt. Trong huyết thanh nước chiếm 90 – 91%, chất khô chiếm 9 – 10% gồm protein, đường, lipit, muối khoáng. Các chất vô cơ chính trong huyết thanh gồm cation nh ư Na+, K+, Ca2+, Mg2+, và các anion Cl –, HCO3-, SO42-, PO43-… Ngoài ra huyết thanh còn chứa các yếu tố như I, Cu, Fe, Zn…, chúng t ồn tại ở dạng ion hoặc kết hợp với protein [10]. Các thành phần hữu cơ trong máu rất phức tạp, gồm: a. Protein: Là thành phần hữu cơ quan trọng nhất của huyết thanh động vật. Có nhiều loại protein huyết thanh, khoảng 100 – 150 loại khác nhau tuỳ theo cấu tạo v à nhiệm vụ của nó: albumin, globulin, fibrinogen, các men… số l ượng và tính chất 9 của các protein thay đổi tuỳ theo lo ài. Nghiên cứu bằng phương pháp lưỡng chiết quang, nhiễu xạ tia X, kính hiển vi điệ n tử thì mọi protein (trừ fibrinogen) đều có dạng hình cầu như albumin, globulin… Protein huyết thanh gồm 5 thành phần: albumin, 1– globulin, 2– globulin và γ - globulin. Nếu điện di miễn dịch trên gel tinh bột hoặc gel polyacrilamide có thể tách được 18 – 21 thành phần protein khác nhau. Protein huyết thanh có ở dạ ng tự do hoặc phức hợp với lipide (lipoprotein), glucid (metaloprotein), nucleic acid (nucleoprotein). - (glucoprotein), kim loại Albumin: Albumin thuộc protein thuần, hoà tan trong nước, bị đông vón bởi nhiệt, bị kết tủa bởi dung dịch muối b ão hoà. Trong các protein c ủa huyết thanh albumin chiếm một lượng lớn tới 56,6% vì vậy nó đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì áp suất thẩm thấu của huyết t ương, ảnh hưởng đến điều hoà nước trong cơ thể, tham gia vận chuyển các chất không tan trong máu nh ư bilirubin tự do, axit béo, một số thuốc… [2]. - Globulin: Là một protein huyết thanh quan trọng thứ hai, nó thuộc protein thuần. Globulin hoà tan trong dung d ịch muối loãng, không tan trong nước tinh khiết hoặc trong các dung dịch có nồng độ vừa phải, bị đông vón bởi nhiệt. Có nhiều loại globulin:  1, 2 – globulin chiếm khoảng 13% tổng số protein huyết thanh: 1 tham gia cấu tạo glucoprotein, lipoprotein c òn 2 có ceruloplasmin (protein v ận chuyển đồng).  - globulin chiếm khoảng 11,7% trong đó có siderophilin (protein ch ứa sắt).  γ - globulin chiếm khoảng 18,6% protein huyết thanh, bao gồm những kháng thể. b. Các enzyme: Có rất nhiều enzyme trong huyết thanh như Amylase, Phosphatase, Transaminase… [10]. 10 c. Những chất có nitơ phi protein: Là những sản phẩm thoái hoá của protein, trong đó đa số l à những sản phẩm thoái hoá cuối cùng được cơ thể đào thải ra ngoài như ure, uric acid, bilirubin… Ngoài ra huy ết thanh còn có những sản phẩm thoái hoá trung gian của protein như polypeptide và các amino acid tự do [2], [10]. d. Glucose [2]: Glucose máu dao động trong khoảng cố định. Chỉ số n ày tăng giảm trong các trường hợp bệnh lý. e. Lipide [2]: Lipide trong huyết thanh bao gồm triglyceride, phospholipide, ster ide, cholesterol. 1.3.3. Kháng thể [1],[ 10]. Kháng thể chính là protein thường được phát hiện ở phần γ - globulin của huyết thanh, dịch bạch huyết v à các dịch khác của cơ thể. Về cấu trúc và hoá tính đó là những γ - globulin điển hình, vì vậy không thể phân biệt được chúng với các γ globulin “bình thường” bằng phương pháp hoá học. Chỉ có thể phát hiện kháng thể bằng “thuốc thử” đặc hiệu l à kháng nguyên tương ứng. Kháng thể được phát hiện từ những năm đầu của lịch sử miễn dịch. Sự kết hợp đặc biệt giữa k háng nguyên và kháng thể với khả năng sản xuất đ ược kháng thể đặc hiệu đ ã làm cho kháng thể được dùng rộng rãi vào mục đích chẩn đoán và điều trị. Các kháng thể còn được gọi là globulin miễn dịch (Ig). Có nhiều lớp globulin miễn dịch khác nhau nhưng tất cả các lớp đều có đặc điểm cấu trúc giống nhau:  Mỗi phân tử Ig có hai chuỗi polypeptide nặng (H) và hai chuỗi polypeptide nhẹ (L).  Các chuỗi H và L bao giờ cũng từng đôi và giống nhau hoàn toàn trong mỗi phân tử Ig.  Tất cả các chuỗi Ig đều có chuỗi L thuộc t ype kappa hoặc lamda còn chuỗi H thì khác nhau. Các lớp globulin miễn dịch: IgG, IgA, IgD, IgE, IgM. 11 IgG: Là lớp kháng thể có nồng độ cao nhất trong huyết thanh, có thể đạt 12 mg/ml (chủ yếu trong máu). Phân tử l ượng nhỏ cỡ 150.000 dalton. Chính v ì nhỏ nên nó có mặt trong huyết thanh và cả dịch kẽ tế bào. Khi IgG bị thuỷ phân sẽ tạo thành 3 mảnh có khối lượng tương đối giống nhau khoảng 50.000 dalton. Hai mảnh có cấu trúc giống nhau gọi là Fab (Angtigen binding fragment) có kh ả năng kết hợp kháng nguyên. Một mảnh khác không có khả năng kết hợp kháng nguy ên nhưng có khả năng kết tinh gọi là Fc (Crystallisable fragment) giúp cho phân t ử kháng thể bám trên bề mặt tế bào thực bào. Papain S –S S –S Pepsin Hình 1.1: Sơ đồ các mảnh của phân tử IgG khi xử lý bằng enzyme Papain và Pepsin [10] IgG có bốn phân lớp do khác nhau về cầu nối disulfur S – S nên dẫn đến sự khác nhau về cấu trúc không gian và có tỷ lệ phân bố trong huyết thanh cũng khác 12 nhau tương ứng với IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4 là 75%, 8 – 10%, 7 – 8%, 4 – 8%. IgG 1 và IgG 3 có khả năng bám tốt trên đại thực bào còn IgG 2 và IgG 4 không có khả năng này [1]. Có thể chiết IgG từ huyết thanh bằng ph ương pháp sắc ký trên DEACellulose. Dùng enzyme có thể cắt IgG ra nhiều mảnh khác nhau. Với papain hoạt hoá sẽ tách được 3 mảnh gần bằng nhau; với pepsin chỉ tách đ ược một mảnh gần giống 2 Fab hợp lại nhưng không giống hoàn toàn nên có ký hiệu là F(ab)2 có hai vị trí kết hợp kháng nguyên. Phần còn lại tương ứng với Fc bị chặt thành nhiều mảnh peptide nhỏ, mỗi mảnh trên có hoat tính sinh học khác nhau [10]. 1.3.4. Huyết thanh phòng và chữa bệnh: Huyết thanh chữa bệnh là huyết thanh của động vật đ ã được gây miễn dịch bằng những phương pháp khác nhau hay là huy ết thanh của người mới lành bệnh. Các huyết thanh này chứa rất nhiều kháng thể và gây được miễn dịch thụ động cho người dùng sau vài giờ nhưng thời gian được miễn dịch rất ngắn (khoảng 8 –15 ngày sau khi tiêm) [10]. Huyết thanh động vật: Được chế từ máu động vật (th ường là ngựa hoặc bò, cừu đã được miễn dịch với những bệnh nhiễ m trùng khác nhau) đem lo ại bỏ các protein không đặc hiệu, còn kháng thể giữ ở nồng độ cao. Tuỳ theo tác nhân gây miễn dịch, người ta phân biệt:  Huyết thanh kháng độc tố: huyết thanh động vật đ ã được tiêm độc tố vi khuẩn như huyết thanh chống bạch hầu (SAD ), chống uốn ván (SAT).  Huyết thanh kháng virus: huyết thanh động vật đ ã được miễn dịch đối với virus dại dùng để chống bệnh dại (SAR), huyết thanh kháng virut Vi êm gan B…  Huyết thanh kháng nọc độc: huyết thanh của động vật đ ã được tiêm nọc độc đã làm giảm độc của những loài có nọc độc, chẳng hạn như nọc rắn (SAV).  Huyết thanh của người mới lành bệnh: hiện nay ít dùng. Ở Việt Nam huyết thanh kháng độc tố uốn ván tinh chế đ ược sản xuất duy nhất tại viện Vacxin Nha Trang theo ph ương pháp của Pope và quy trình của Lavergne - Pháp (Paris): quy trình IVAC 2 – 1995 [10]. Đây là một sinh phẩm có nguồn gốc động vật (từ ngựa) chứa các globulin miễn dịch đặc hiệu thu được bằng phương pháp tinh chế huyết thanh kháng uốn ván 13 thô khi xử lý với enzym và kết tủa phân đoạn trong muối amonium sulphate. Chế phẩm được bảo quản bằng merthiolate 1/10.000. Mỗi năm viện sản xuất h àng trăm ngàn ống (loại 1500 IU) để phục vụ công tác ph òng ngừa uốn ván ở Việt Nam [8]. Tác dụng phụ của protein có trong huyết thanh [10]: Hàm lượng protein cao trong huyết thanh do quá trình tinh chế chưa loại hết albumin sẽ gây phản ứng.  Phản ứng tức khắc: xảy ra sau khi ti êm vài phút hay vài giờ. Thường tai biến xảy ra sau khi tiêm lần thứ hai, đặc biệt là nếu tiêm hai huyết thanh của cùng một loại động vật trong vòng 10 ngày. Chỗ tiêm bị phù nề, ban đỏ (thường biến mất sau 24 – 36 giờ). Triệu chứng toàn thân: Trạng thái lo âu, tức ngực khó thở, ho; run, sốt cao, nôn, tiêu chảy; tim đập nhanh, huyết áp giảm; có thể bị ngoại ban to àn thân. Tuy nhiên tình trạng nguy kịch chỉ xảy ra trong v ài phút, trường hợp tử vong rất ít.  Phản ứng chậm: xảy ra vào khoảng 9 – 15 ngày sau khi tiêm:  Sốt nhẹ, nhức đầu, suy nh ược, biếng ăn, buồn nôn, tiêu chảy; nổi mề đay, ban đỏ, phù Quinck…  Ngoài ra có thể gây đau khớp, lách to; các biểu hiện viêm đường hô hấp cấp; tiểu ít, albumin niệu, trụ niệu; Cá biệt gây vi êm dây thần kinh tiến triển làm teo cơ. Các phản ứng nói chung có thể khỏi sau v ài ngày, tuy nhiên cũng có trường hợp kéo dài, cá biệt có thể gây viêm nút quanh động mạch. 1.4. Tá chất gây miễn dịch. 1.4.1. Khái niệm tá chất [7]: Năm 1922, Ramon phát hiện và đưa ra khái niệm về tá chất (Adjuvant) trong lĩnh vực vacxin và các chế phẩm sinh học, đó là những chất khi chộn lẫn với kháng nguyên có thể làm tăng đáp ứng miễn dịch trên người hoặc động vật. Người ta ứng dụng tá chất trong lĩnh vực sản xuất vacxin để tạo ra đáp ứng miễn dịch mạnh và kéo dài. Tá chất được sử dụng cả ở người và động vật nhưng khác nhau về chủng loại và bản chất. Trong quy trình sản xuất kháng huyết thanh SAT từ máu ngựa, tá chất có vai tr ò đặc biệt quan trọng vì vậy việc sử dụng nó như một điều kiện bắt buộc. 14 1.4.2. Cơ chế hoạt động [5]. Một tá chất trong vacxin có thể ảnh h ưởng đến đáp ứng miễn dịch theo một chiều hoặc nhiều cơ chế sau:  Đưa kháng nguyên vào vị trí thích hợp trong cơ thể.  Lưu giữ và giải phóng kháng nguyên chậm từ vị trí mà nó lắng đọng.  Tuyển mộ và hoạt hoá các tế bào trình diện kháng nguyên (APC) và lympho bào.  Hoạt hoá bổ thể, tăng cường tổng hợp tiết và gắn kết của các cytokin.  Mang các epitope của tế bào T đến MHC lớp I và lớp II. 1.4.3. Vai trò [5], [7]. Nhờ các cơ chế hoạt động trên mà tá chất có những vai trò sau:  Tăng cường hiệu lực của các peptide tổng hợp hoặc tái tổ hợp nhỏ, có tính kháng nguyên yếu.  Tăng cường tốc độ, sức mạnh và sự tồn lưu đáp ứng miễn dịch cho những kháng nguyên lớn hơn.  Điều hoà miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế b ào.  Điều hoà sản xuất kháng thể, số l ượng kháng thể, tính đặc hiệu của kháng thể, loại kháng thể ứng với các epitop e trên các phức hợp sinh miễn dịch.  Làm giảm lượng kháng nguyên trong vacxin, nhờ vậy có thể giảm sự cạnh tranh kháng nguyên và sự chèn ép epitope đặc hiệu, giảm lượng kháng nguyên trong một liều vacxin nhờ đó tăng số l ượng vacxin và giảm giá thành sản xuất. 1.4.4. Tính an toàn của tá chất [7]. Ưu điểm lớn nhất của tá chất trong vacxin hấp phụ l à khả năng tăng cường miễn dịch. Tuy nhiên, sử dụng tá chất vẫn tiềm ẩn những quy c ơ đối với sức khoẻ con người. Các nguy cơ theo thực tế và lý thuyết của tá chất là:  Gây nhiễm trùng cấp tính hoặc mãn tính, hình thành các ổ mủ gây đau, các u nhọt lâu khỏi.  Gây ra các triệu chứng như cúm, sốt, nhức đầu, nhức mỏi c ơ, khớp. 15  Gây dị ứng, độc lâm sàng cho các mô và cơ quan.  Phản ứng chéo với các kháng nguy ên của bể cầu thận hay bao th ần kinh, gây ra viêm thận hay viêm màng não.  khác. Nhạy cảm với tuberculin hoặc các kháng nguy ên thử nghiệm trong da  Gây ung thư, đẻ non và quái thai.  Gieo rắc và phát tán các vector vào vật chủ và môi trường. 1.4.5. Các loại tá chất thông dụng [7]. Tá chất được xếp nhóm theo nguồn gốc h ơn là theo cơ chế hoạt động bởi vì cơ chế hoạt động của hầu hết các tá chất ch ưa được hiểu đầy đủ. a.Hợp chất nhôm (Al 3+). Hợp chất nhôm (bao gồm hydroxyde nhôm Al(OH) 3, phosphate nhôm AlPO4 hoặc kết hợp cả hai) được sử dụng trong sản xuất nhiều loại vacxin nh ư vacxin uốn ván hấp phụ, vacxin bạch hầu - ho gà - uốn ván, vacxin viêm gan A, B và vacxin dại… Tá chất nhôm đã trở thành căn cứ để đánh giá các tá chất mới trong vacxin dùng cho người. Tá chất nhôm khó được tạo ra theo cách tổng hợp hoá lý, điều này ảnh hưởng đến đặc tính lý hoá của kháng nguy ên, loại tá chất nhôm, điều kiện hấp phụ và nồng độ tá chất. Không phải tất cả các hợp chất nhôm đều có hiệu quả như nhau, chẳng hạn hydroxyde nhôm có hiệu quả hơn phosphate nhôm. Do đó, một dạng pha chế đặc biệt của hydroxyde nhôm (Alhydrogen ) đã được khuyến cáo dùng như một tá chất chuẩn.  Ưu điểm của tá chất nhôm:  Ưu điểm chính của việc sử dụng tá chất nhôm l à tính an toàn đã được ghi nhận qua hàng tỷ liều vacxin và sự hình thành kháng thể sớm hơn, cao hơn và kéo dài hơn sau khi mi ễn dịch sơ cấp so với các dạng vacxin không sử dụng tá chất tương ứng đặc biệt đối với các giải độc tố.  Hình thành kho lưu giữ tại vị trí tiêm nên cho phép giải phóng kháng nguyên chậm, kích thích các tế bào miễn dịch qua con đường hoạt hóa bổ thể, hoạt hóa đại thực bào. 16  Kháng nguyên hấp phụ được nhận diện nhờ bản chất v à kích thước hạt tối ưu (<10µg).  Nhôm kích thích miễn dịch qua trung gian tế b ào.  Là các thành phần trong vacxin đã được cho phép sử dụng.  Nhược điểm của tá chất nhôm:  Gây phản ứng tại chỗ như sưng phồng và ban đỏ tại vết tiêm.  Thời gian tồn tại ở chỗ tiêm có thể lên tới một năm ở chuột.  Có một số hạn chế về miễn dịch bao gồm: không có khả năng tăng cường miễn dịch dịch thể cho một số vacxi n dùng cho người và hầu như không có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế b ào đặc biệt đáp ứng qua tế b ào T độc đối với các sinh vật nội b ào. Không tạo ra miễn dịch qua trung gian tế b ào là một hạn chế của vacxin chống lại các sinh vật ký sinh nội bào như sốt rét và HIV. Thậm chí tá chất nhôm kìm hãm một cách có chọn lọc sự phát triển của các tế b ào hoạt động CD8 + bởi một số kháng nguyên.  Các dung dịch tá chất nhôm không phải lúc n ào cũng tạo được gel, không thể tiệt trùng bằng phương pháp lọc, không được để đông đá, không đông khô được. b.Chitosan. Chitosan là một amino polycsharide, có cấu trúc tứ các đ ơn vị β-Dglucosamin liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucoside. Chitosan là ch ất rắn, xốp, nhẹ, ở dạng bột màu trắng ngà, không mùi, không vị. Tính chất của chitosan phụ thuộc rất nhiều vào độ tinh khiết, độ deacetyl hóa, phân tử l ượng và độ rắn. Phân tử lượng của chitosan quyết định khả năng kết dính, tạo m àng, tạo gel. Chitosan và các dẫn xuất được sử dụng làm tá chất phải có độ deacetyl í t nhất là 75%. Chitosan hay các dẫn xuất có thể sử dụng l àm tá chất dưới các dạng vật lý khác nhau: dung dịch, bột hay các dạng đặc biệt. Các dạng đặc biệt hay d ùng là dạng hạt nhỏ, có liên kết chéo hay không liên kết chéo và có thể tạo thành dạng xịt rất thuận tiện cho việc sử dụng. Chính v ì vậy chitosan đã được dùng như một tá chất đặc biệt cho vacxin miễn dịch qua đ ường niêm mạc (niêm mạc mũi). Ngoài ra, vacxin hấp phụ chitosan có thể đ ược đưa vào cơ thể qua đường tiêm phúc mạc, tiêm tĩnh mạch, tiêm dưới da, tiêm bắp. 17 c.Tá chất Freund. Tá chất Freund là hỗn dịch nước trong dầu, bao gồm hai loại là tá chất hoàn toàn (FCA) và không hoàn toàn (FIA). FCA có thêm vi khu ẩn Mycobacteria tuberculosis hàm lượng khoảng 0,5 mg/ml. Đây l à tá chất chuẩn, hiệu quả tác dụng mạnh, đã từng được sử dụng rộng rãi trong các vacxin thử nghiệm trên súc vật. Dầu khoáng kết hợp với xác vi khuẩn lao c ùng với chất tạo nhũ (mannide mono oleate) tạo đáp ứng miễn dịch dịch thể v à trung gian tế bào. Tuy nhiên FCA cũng có thể tạo các khối u biểu mô, các vết loét khi ti êm dưới da, gây sốt và bệnh tự miễn như thấp khớp. Do đó, loại tá chất này thường chỉ được dùng trên súc vật thí nghiệm. Để giảm các phản ứng có hại của tá chất Freund, một số nghi ên cứu cải tiến về loại dầu khoáng trong tá chất Freund được phát triển như Montanide 80, Montanide ISA 51, ISA 720 và ISA 724… 1.5. Tá chất Montanide ISA 50 V2. 1.5.1. Định nghĩa [17]: Montanide ISA là loại tá chất dạng nước trong dầu (W/O – 50 thể tích nước/50 thể tích dầu). Thành phần của nó bao gồm dầu khoáng, mannitol v à oleic acid tinh chế có nguồn gốc từ thực vật. Dạng nhũ dịch W/O của Montanide ISA 50V2 đ ược thể hiện qua hình vẽ sau: Hình 1.2: Thành phần và dạng nhũ dịch của tá chất Montanide ISA 50V2 18 1.5.2. Những tính chất của MONTANIDE ISA 50V2 [17]. Bảng 12:Tính chất vật lý của MONTANIDE ISA 50V2 Hình thái Nhận dạng Độ nhớt (Brookfield LVF, S2,) Trọng lượng riêng (tại 250C) Chỉ số khúc xạ (tại 250C) Thời hạn sử dụng Dịch màu vàng sáng Tương ứng với vùng dưới phổ đỏ Xấp xỉ 18 mPa,s (tại 25 0C) Xấp xỉ 0,86 Xấp xỉ 1,459 2 năm Bảng 1.3:Tính chất hoá học của MONTANIDE ISA 50V2 Thử nghiệm Chỉ số acid (mg KOH/g) Chỉ số xà phòng hoá (mg KOH/g) Chỉ số baze (mg KOH/g) Hàm lượng nước % Giới hạn Cao nhất 0,5 16 – 19 9 – 14 Cao nhất 0,5 Phương pháp NFT 60 204 S 52 008 S 52 080A S 52 006B 1.5.3. Tính chất tạo nhũ dịch [17]. Bảng 1.4: Tính chất tạo nhũ dịch của Montanide ISA 50V2 Loại W/O (nước trong dầu) Độ nhớt (Brookfield LVF, S2) Xấp xỉ 200 mPa,s tại 25 0C Độ dẫn điện < 10µS/cm Cỡ giọt 1 micron hay nhỏ hơn Độ ổn định 0 Sau khi ủ ở 4 C Hơn 12 tháng 0 Sau khi ủ ở 25 C Khoảng 6 tháng 0 Sau khi ủ ở 37 C Khoảng 15 ngày 1.5.4. Các thử nghiệm về độc tính [17]. Tá chất MONTANIDE ISA đạt ti êu chuẩn an toàn của Hội đồng chung Châu Âu trên súc vật thí nghiệm, 2377/90/EC Phụ bản II. 19 Bảng 1.5: Các thử nghiệm độc tính của Montanide ISA Liều LD 50 theo đường uống (trên >2 g/ kg. chuột). Thử nghiệm Berlin trong m àng Không chết hay không viêm màng bụng (chuột). bụng, tăng cân bình thường, so với nhóm chuột chứng. Trạng thái kích động. Bị kích động rất nhẹ. An toàn không đặc hiệu (chuột Không chết sau 7 ngày. nhắt và chuột lang). Không mổ phân tích các trường hợp bất thường. Chất gây sốt (thỏ). Không có chất gây sốt. 1.5.5. Số liệu về công hiệu [17]. Montanide ISA 50V2 đã được sử dụng thành công trong một số công thức như là vacxin FMD (Foot anh mouth desease), vacxin Pasteurella multocida, vacxin ký sinh trùng Tick, vacxin cowdriosis,...  Đáp ứng trên chuột: Các nhóm chuột gồm 10 con cho một nhóm được tiêm miễn dịch với BSA (ovalbumin formulated) (10µg) hỗn hợp với Montanide ISA 50V, Al(OH) 3, hay không có tá chất. Montanide ISA 50V 2 làm tăng đáp ứng kháng thể IgG 1 cao và thời gian đáp ứng miễn dịch kéo d ài đồng thời cũng làm tăng đáp ứng sản sinh tế bào lympho. Vì vậy loại tá chất này có khả năng làm tăng đáp ứng miễn dịch tế bào.  Đáp ứng trên cừu: Montanide ISA 50V làm khơi d ậy hàm lượng cao kháng thể trung ho à kháng virus bluetongue. Vào ngày 117, t ại thời điểm bảo vệ, hiệu giá kháng t hể trung hoà vẫn còn cao hơn nhiều khi so sánh với FIA.  Đáp ứng trên bò: Nghiên cứu so sánh trên gia súc về công hiệu của vacxin FMD hỗn hợp với tá chất dầu hay nhôm hydroxyde, kết quả cho thấy r õ ràng rằng Montanide ISA 50V làm tăng tính miễn dịch mạnh và dài hơn nhôm hydroxyde. 20 1.5.6. Cơ chế và tính ưu việt của Montanide ISA 50V2 [16], [18], [25]. Hoạt tính của tá chất Montanide ISA 50V2 chưa thực sự được hiểu rõ ràng, nó có những điểm khác biệt trong các tr ường hợp khác nhau. Đầu tiên, tá chất là kho chứa và giải phóng chậm kháng nguy ên từ vị trí tiêm. Tùy theo kiểu nhũ dịch của tá chất (l à W/O, W/O/W, O/W) mà đ ộng học của quá trình giải phóng kháng nguyên khác nhau. Người ta đã thực hiện thí nghiệm sử dụng phương pháp thẩm tích nghịch đảo để đánh giá invitro động học quá trình giải phóng kháng nguyên từ nhũ dịch, kết quả cho thấy r õ ràng động học của quá trình sẽ khác nhau tùy thuộc vào kiểu nhũ dịch. Cụ thể là: Những protein không có tá chất sẽ bị giải phóng ngay tức thời. Nhũ dịch O/W cho phép quá tr ình này chậm hơn chút ít nhưng protein v ẫn bị giải phóng nhanh. Nhũ dịch W/O là có hiệu quả nhất, nó làm cho quá trình giải phóng kháng nguyên xảy ra rất chậm chạp; điều n ày liên quan đến độ ổn định của nhũ dịch, ngay khi trạng thái nhũ t ương bị phá vỡ kháng nguyên sẽ được giải phóng ồ ạt. Tuy nhiên, quá trình giải phóng của dạng nhũ dịch n ày vẫn chậm hơn dạng O/W. Còn loại nhũ dịch W/O/W thì có độ hoạt động nằm giữa hai loại nhũ dịch tr ên, nghĩa là nó sẽ giải phóng kháng nguy ên chậm hơn dạng O/W và nhanh hơn dạng W/O [16]. Hình 1.3: Quá trình giải phóng kháng nguyên của một số tá chất khác nhau theo thời gian [25]
- Xem thêm -