Tài liệu Khảo sát quá trình thủy phân protein phụ phẩm cá tra (pangasius hypophthalmus) bằng enzyme neutrase

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG NGUYỄN HỮU TÀI KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN PHỤ PHẨM CÁ TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS) BẰNG ENZYME NEUTRASE LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 2014 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG NGUYỄN HỮU TÀI KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN PHỤ PHẨM CÁ TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS) BẰNG ENZYME NEUTRASE LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM CÁN BỘ HƢỚNG DẪN TS. NGUYỄN CÔNG HÀ ThS. PHAN NGUYỄN TRANG 2014 Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM ƠN Sau hơn 3 tháng thực hiện luận văn tốt nghiệp tại phòng thí nghiệm, đề tài “Khảo sát quá trình thủy phân protein phụ phẩm cá tra (Pangasius hyphophthalmus) bằng enzyme Neutrase” đã được hoàn thành đúng thời hạn với sự giúp đỡ, chỉ dẫn và chia sẻ của cán bộ hướng dẫn, các cán bộ quản lý phòng thí nghiệm cùng tập thể các anh chị và các bạn làm việc tại phòng thí nghiệm. Nhân đây, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Nguyễn Công Hà cùng cô Phan Nguyễn Trang đã tận tình chỉ dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm cùng những góp ý quý báu trong suốt thời gian học tập và thực nghiệm vừa qua. Bên cạnh đó, em xin được cảm ơn anh Tạ Hùng Cường, chị Nguyễn Tố Mai và tập thể các anh chị Cao học, các bạn cùng lớp Công nghệ Thực phẩm khóa 37. Đồng thời, em xin được cảm ơn chị Nguyễn Phụng Tiên và các cán bộ quản lý phòng thí nghiệm cũng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất có thể, cho em những lời động viên giúp em hoàn thành tốt đề tài này. Hơn nữa, Em xin được cảm ơn các anh chị phòng thí nghiệm Sinh học Đất đã hỗ trợ và giúp đỡ em tận tình trong lúc sử dụng các thiết bị, máy móc của phòng thí nghiệm. Em rất biết ơn sự giúp đỡ của các anh chị và các bạn. Em xin cảm ơn mọi người rất nhiều. Sau cùng em, xin được cảm ơn Ban quản lý Công ty CP XNK Thủy sản Cần Thơ (CASEAMEX) đã hỗ trợ nguyên liệu cho em để thực hiện đề tài này. Xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 Sinh viên thực hiện Nguyễn Hữu Tài Ngành Công nghệ Thực phẩm i Khoa Nông nghiệp & SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Nhằm khảo sát quá trình thủy phân trên cơ chất là phụ phẩm cá tra của enzyme Neutrase, từ đó tìm ra các thông số động học Km, Vmax của enzyme và ảnh hưởng của thời gian phản ứng cũng như nồng độ enzyme và cơ chất lên hiệu suất thủy phân, đề tài đã được tiến hành với các nội dung:  Xác định các thông số động học Km và Vmax của enzyme Neutrase trên cơ chất là phụ phẩm cá tra, tìm ra tỷ lệ khối lượng enzyme: cơ chất (mg enzyme : g protein) tại đó tốc độ phản ứng của enzyme là lớn nhất (trong một thể tích cố định dịch đệm phosphate pH 6,5 là 10 mL).  Khảo sát tác động của việc tăng tuyến tính đồng thời khối lượng enzyme và cơ chất, dựa trên tỷ lệ khối lượng enzyme: cơ chất đã tìm được (trong một thể tích cố định dịch đệm phosphate pH 6,5 là 10 mL) lên hiệu suất thủy phân của enzyme Neutrase.  Sau đó, đề tài đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất thủy phân của Neutrase, nhằm tìm ra thời gian tối ưu để hiệu suất thủy phân đạt cao nhất. Và qua quá trình thực nghiệm, đề tài đã thu được các kết quả như sau:  Enzyme Neutrase hoạt động trên cơ chất phụ phẩm cá tra với các thông số động học Vmax = 0,190 μmol tyrosine/phút, Km = 0,254 g protein, và với tỷ lệ khối lượng enzyme: cơ chất = 0,5 mg enzyme: 0,694 protein thì tốc độ phản ứng của enzyme là lớn nhất.  Việc tăng đồng thời khối lượng enzyme và cơ chất (với thể tích phản ứng là cố định) trên cơ sở tỷ lệ khối lượng enzyme: cơ chất tối ưu đã gây ức chế hoạt động của enzyme nên cặp khối lượng enzyme : cơ chất thích hợp được chọn là 0,5 mg E : 0,694 g Pro.  Khi thời gian phản ứng kéo dài từ 30 đến 240 phút, hiệu quả thủy phân tăng nhanh vào giai đoạn đầu và sau đó tăng chậm lại cho đến khi đạt mức cao nhất tại 240 phút (6,359 % theo tyrosine và 3,244 % theo phương pháp OPA) nên thời gian thủy phân hiệu quả được chọn là 240 phút. Ngành Công nghệ Thực phẩm ii Khoa Nông nghiệp & SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác. Cần Thơ, ngày Cán bộ hướng dẫn TS. Nguyễn Công Hà năm 2014 Người viết ThS. Phan Nguyễn Trang Ngành Công nghệ Thực phẩm tháng iii Nguyễn Hữu Tài Khoa Nông nghiệp & SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN...................................................................................................... i TÓM TẮT ........................................................................................................... ii LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. iii MỤC LỤC ......................................................................................................... iv DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................ vi DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................ vii Chƣơng 1 GIỚI THIỆU .................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 1 Chƣơng 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................... 2 2.1 Sơ lược về cá tra ............................................................................................ 2 2.2 Thành phần hóa học của cá tra ..................................................................... 4 2.2.1 Protein ......................................................................................................... 5 2.2.2 Thành phần trích ly chứa nitơ phi protein .................................................. 5 2.2.3 Enzyme ....................................................................................................... 6 2.2.4 Lipid ............................................................................................................ 6 2.2.5 Carbohydrate ............................................................................................... 6 2.2.6 Vitamin và khoáng chất .............................................................................. 6 2.2.7 Phụ phẩm trong chế biến cá tra................................................................... 7 2.3 Sơ lược về protein .......................................................................................... 7 2.3.1 Biến tính protein ......................................................................................... 9 2.4 Sơ lược về enzyme ........................................................................................ 10 2.4.1 Cấu trúc enzyme ....................................................................................... 10 2.4.2 Động học enzyme ..................................................................................... 10 2.4.3 Cơ chế thủy phân của enzyme .................................................................. 11 2.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác của enzyme ....................... 12 2.4.5 Enzyme Neutrase ...................................................................................... 16 2.5 Máy quang phổ ............................................................................................ 17 2.6 Thuốc thử Folin-Ciocalteu........................................................................... 17 2.7 Trichloroacetic acid (TCA).......................................................................... 18 2.8 Phương pháp OPA ....................................................................................... 19 Chƣơng 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................ 20 3.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................... 20 3.1.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu ................................................................ 20 3.1.2 Nguyên liệu ............................................................................................... 20 3.1.3 Thiết bị, dụng cụ ....................................................................................... 20 3.1.4 Hóa chất .................................................................................................... 21 3.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 21 3.2.1 Chuẩn bị nguyên liệu ................................................................................ 21 3.2.2 Phương pháp thủy phân protein bằng enzyme.......................................... 22 3.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng ẩm ...................................................... 22 3.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein tổng số ................................... 22 3.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng lipid .................................................... 22 Ngành Công nghệ Thực phẩm iv Khoa Nông nghiệp & SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ 3.2.6 Phương pháp xác định hàm lượng tyrosine tổng số ................................. 22 3.2.7 Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân theo lượng tyrosine sinh ra .. 23 3.2.8 Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân theo hàm lượng đạm amine . 23 3.2.9 Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 23 3.3 Nội dung bố trí thí nghiệm ........................................................................... 23 3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác định các thông số động học của enzyme Neutrase trên cơ chất là phụ phẩm cá tra ................................................................................. 23 3.3.2 Thí nghiệm 2 : Xác định khối lượng enzyme và cơ tối ưu dựa trên tỷ lệ enzyme : cơ chất tối ưu ...................................................................................... 25 3.3.3 Thí nghiệm 3 : Xác định thời gian thủy phân tối ưu................................. 27 Chƣơng 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN .............................................................. 30 4.1 Thành phần hóa học của nguyên liệu .......................................................... 30 4.2 Các thông số động học của của enzyme Neutrase trên cơ chất phụ phẩm cá tra .................................................................................................................. 31 4.3 Xác định khối lượng enzyme : cơ chất tối ưu dựa trên tỷ lệ khối lượng enzyme : cơ chất tối ưu của Neutrase trên cơ chất phụ phẩm cá tra ................ 32 4.4 Xác định thời gian phản ứng tối ưu của quá trình thủy phân bởi enzyme Neutrase ............................................................................................................. 34 Chƣơng 5 KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ ................................................................ 38 5.1 Kết luận ........................................................................................................ 38 5.2 Đề nghị ......................................................................................................... 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 39 PHỤ LỤC.......................................................................................................... 41 Ngành Công nghệ Thực phẩm v Khoa Nông nghiệp & SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 Phần trăm các phần thu được trong chế biến cá tra (Pangasius hypophthalmus) phi lê ........................................................................................ 7 Bảng 4.1 Thành phần hóa học của nguyên liệu ............................................... 30 Bảng 4.2 Thành phần hóa học của cá tra (Pangasius hypophthalmus) phi lê . 31 Bảng 4.3 Thành phần hóa học của phụ phẩm cá tra (Pangasius hypophthalmus) ................................................................................................ 31 Bảng 4.4 Hiệu suất thủy phân (tính theo hàm lượng tyrosine) của Neutrase ở các hệ số nhân khác nhau ................................................................................. 33 Bảng 4.5 Hiệu suất thủy phân (tính theo phương pháp OPA) của Neutrase ở các hệ số nhân khác nhau................................................................................. 33 Bảng 4.6 Hiệu suất thủy phân của Neutrase theo thời gian phản ứng ............. 34 Bảng 5.1 Công thức hóa chất để xây dựng đường chuẩn tyrosine .................. 43 Bảng 5.2 Phân tích phương sai (ANOVA) hiệu suất thủy phân (tính theo tyrosine) theo các cặp enzyme: cơ chất khác nhau .......................................... 48 Bảng 5.3 Kiểm định LSD Hiệu suất thủy phân theo các cặp enzyme: cơ chất khác nhau ......................................................................................................... 48 Bảng 5.4 Phân tích phương sai hiệu suất thủy phân (tính theo phương pháp OPA) theo các cặp enzyme: cơ chất khác nhau ............................................... 49 Bảng 5.5 Kiểm định LSD hiệu suất thủy phân (tính theo phương pháp OPA) theo các cặp enzyme: cơ chất khác nhau ......................................................... 49 Bảng 5.6 Phân tích phương sai (ANOVA) hiệu suất thủy phân tính theo tyrosine theo thời gian phản ứng _ thí nghiệm 3 ............................................. 49 Bảng 5.7 Kiểm định LSD hiệu suất thủy phân theo tyrosine theo thời gian phản ứng _ thí nghiệm 3 .................................................................................. 49 Bảng 5.8 Phân tích phương sai (ANOVA) hiệu suất thủy phân tính theo pp OPA theo thời gian phản ứng .......................................................................... 50 Bảng 5.9 Kiểm định LSD hiệu suất thủy phân theo pp OPA theo thời gian phản ứng........................................................................................................... 50 Ngành Công nghệ Thực phẩm vi Khoa Nông nghiệp & SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Sản phẩm cá tra (Pangasius hypophthalmus) nguyên con ................. 3 Hình 2.2 Cá Tra (Pangasius hypophthalmus).................................................... 3 Hình 2.3 Cá Ba sa (Pangasius bocourti) ........................................................... 3 Hình 2.4. Đồ thị biểu diễn phương trình Michaelis-Menten ........................... 11 Hình 2.5 Phản ứng xúc tác đơn giản của enzyme ............................................ 12 Hình 2.6 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng. .................... 13 Hình 2.7 Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng enzyme vào nhiệt độ................ 14 Hình 2.8 Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng enzyme vào pH ......................... 15 Hình 2.9 Trichloroacetic acid .......................................................................... 19 Hình 2.10 Phản ứng theo phương pháp OPA .................................................. 19 Hình 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 .................................................................. 25 Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 (với thuốc thử Folin-Ciocalteu) ............... 27 Hình 3.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 (với thuốc thử Folin-Ciocalteu) ............... 28 Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào lượng cơ chất .......................................................................................................................... 32 Hình 4.2 Hiệu suất thủy phân của Neutrase theo thời gian phản ứng ............. 35 Hình 4.3 Ảnh chụp gel chạy điện di của dịch protein thủy phân bởi Neutrase 35 Hình 5.1 Đường chuẩn tyrosine ....................................................................... 44 Ngành Công nghệ Thực phẩm vii Khoa Nông nghiệp & SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ Chƣơng 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Trong những năm gần đây, cá tra đã và đang trở thành mặt hàng chế biến và xuất khẩu vượt trội hơn rất nhiều so với các loài thủy sản khác ở nước ta. Con cá tra đã góp phần giải quyết vấn đề việc làm cho người lao động với sự xuất hiện ngày càng nhiều các nhà máy, xí nghiệp chế biến và xuất khẩu mặt hàng thủy sản này. Tuy nhiên, bên cạnh thu về cho đất nước nguồn thu từ việc xuất khẩu cá tra phi lê và các sản phẩm khác từ cá tra, sự tăng lên cả ở lĩnh vực nuôi trồng lẫn chế biến cá tra xuất khẩu cũng đồng thời tạo ra một lượng phụ phẩm, những phần còn lại sau khi thu lấy phần phi lê cá để xuất khẩu, rất lớn. Do đó, khi quy mô sản xuất và chế biến mặt hàng cá tra ngày càng mở rộng, lượng phụ phẩm được thải ra ngày càng nhiều hơn. Nếu lượng phụ phẩm này không được xử lý đúng cách sẽ gây ô nhiễm nặng nề cho môi trường. Mặt khác, nguồn phụ phẩm này vẫn còn giá trị dinh dưỡng tương đối cao. Nếu tận dụng được nguồn phế liệu này sẽ tạo ra nguồn thu nhập cho người sản xuất, giảm thiểu lãng phí và tăng hiệu suất thu hồi chất dinh dưỡng trong sản xuất, chế biến sản phẩm từ cá tra. Về hướng xử lý phụ phẩm các mặt hàng thủy sản, có thể sử dụng phần bỏ đi sau khi chế biến cá tra phi lê để chế biến bột cá dùng trong chăn nuôi, bong bóng cá dùng làm thực phẩm, dầu cá giàu dinh dưỡng và không chứa cholesterol, nhiên liệu sinh học (biodiesel), … Tuy nhiên, các hướng xử lý này vẫn chưa tận dụng được nguồn protein còn lại một cách hiệu quả. Gần đây một hướng xử lý mới đang được quan tâm là chế biến các sản phẩm thủy phân protein từ phụ phẩm cá, tạo ra những sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có thể sử dụng ngay cả trong thực phẩm. Tuy nhiên, các nghiên cứu về hướng xử lý mới này trên các loài cá khác là khá phổ biến nhưng trên cá tra vẫn còn hạn chế. Vì vậy, đề tài “Khảo sát sự thủy phân protein phụ phẩm cá tra (Pangasius hypophthalmus) bằng enzyme Neutrase” đã được tiến hành. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Đề tài “Khảo sát quá trình thủy phân protein phụ phẩm cá tra (Pangasius hypophthalmus) bằng enzyme Neutrase” được tiến hành nhằm mục tiêu tìm ra các thông số tối ưu cho quá trình thủy phân như tỷ lệ khối lượng enzyme: cơ chất, khối lượng enzyme và cơ chất tối đa có thể sử dụng (trên một thể tích phản ứng) và thời gian thủy phân tối ưu để thu được hiệu suất thủy phân cao nhất. Ngành Công nghệ Thực phẩm 1 Khoa Nông nghiệp và SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ Chƣơng 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lƣợc về cá tra Cá tra thuộc họ Pangasiidae. Họ Pangasiidae (họ cá Tra) có 3 chi: chi Sinopangasius (1 loài), chi Helicophagus (3 loài) và chi Pangasius (27 loài). Tuy nhiên chi và loài Sinopangasius, theo vài tài liệu như FishBase và một số bảng từ đồng nghĩa (trích dẫn của https://voer.edu.vn), được coi là từ đồng nghĩa của Pangasius Kempfi (cá Bông Lau). Ngoài ra, trong chi Pangasius, trong 2 bảng phân loại khoa học nêu trên có 3 cặp tên đồng nghĩa. Như vậy, có thể kể họ Pangasiidae có 2 chi và chi Pangasius có 24 loài. Ở Việt Nam, cá tra sống chủ yếu ở lưu vực sông Cửu Long và lưu vực các sông lớn cực Nam. Loại cá này có thân dẹp, da trơn và râu ngắn. Cá tra (theo Từ điển tiếng Việt, Nhà xuất bản Khoa học Xã hội, 1997, trích dẫn của https://voer.edu.vn) là loài cá nước ngọt, không vảy, giống cá trê nhưng không ngạnh. Sự so sánh giữa cá tra và cá trê càng thêm tối nghĩa vì hai nhóm cá này có nhiều điểm khác biệt. Bên cạnh đó, trong phân loại khoa học chúng thuộc 2 họ khác nhau là Pangasiidae và Clariidae. Cá thuộc họ Pangasiidae (họ cá Tra) với tên Việt có những loài sau : Helicophagus waandersii – cá Tra Chuột Pangasius gigas – cá Tra Dầu Pangasius kunyit – cá Tra Bần Pangasius hypophthalmus – cá Tra nuôi Pangasius micronema – cá Tra Pangasius larnaudi – cá Vồ Đém Pangasius sanitwonsei – cá Vồ Cờ Pangasius bocourti – cá Xác Sọc (cá Ba Sa) Pangasius macronema – cá Xác Sọc Pangasius pleurotaenia – cá Xác Bầu Pangasius Conchophilus – cá Hú Pangasius polyuranodon – cá Dứa Pangasius krempfi – cá Bông Lau Ngành Công nghệ Thực phẩm 2 Khoa Nông nghiệp và SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ Nhóm cá Cá Tra nuôi (Pangasius hypophthamus) có hình dáng đặc trưng như trên các hình sau : Hình 2.1 Sản phẩm cá tra (Pangasius hypophthalmus) nguyên con (www.caseamex.com.vn) Hình 2.2 Cá Tra (Pangasius hypophthalmus) (www.pangasius-vietnam.com) Hình 2.3 Cá Ba sa (Pangasius bocourti) (www.pangasius-vietnam.com) Trong 13 loài trên có 12 loài thuộc chi Pangasius và 1 loài thuộc chi Helicophagus. Ngoại trừ 3 loài : cá Hú, cá Dứa và cá Bông Lau, những loài cá trong họ cá Tra có 3 nhóm : nhóm cá Tra, nhóm cá Vồ và nhóm cá Xác. Ngành Công nghệ Thực phẩm 3 Khoa Nông nghiệp và SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ Trở về nguồn gốc tên Việt của 3 nhóm cá này: tên cả 3 nhóm đều thuộc vào từ ngữ vay mượn từ tiếng Khmer : cá Tra từ chữ Trey Pra, cá Vồ từ chữ Trey Po và cá Xác từ chữ Trey Chhwaet. Còn 3 loài còn lại thì cá Hú trong tiếng Khmer thuộc Trey Pra (cá Tra) và cá Dứa được gọi là Trey Chhwaet (cá Xác). Chỉ riêng cá Bông Lau, tiếng Khmer gọi là Trey Bong Lao. Tuy còn nhiều điểm chưa thống nhất giữa hai ngôn ngữ Việt-Khmer, nhưng việc gọi tên từng nhóm cá của người Khmer và người Việt đã khơi màu cho vấn đề đặt tên phân chi cho chi Pangasius. Trong số 13 loài cá này, có hai loài cá đã được ghi vào sách đỏ Việt Nam. Loài cá Vồ Cờ (Pangasius sanitwonsei) được ghi tên trong sách đỏ từ năm 1996. Loài cá Tra Dầu (Pangasius gigas) có tên trong sách đỏ từ năm 2002. Ngoài ra, có một số loài đã trở thành cá nuôi, vài loài được nuôi với tầm vóc qui mô. Trong họ cá Tra có một số loài được nuôi trong hồ từ lâu đời, đặc biệt là cá Tra (cá Tra nuôi). Ngày nay ngành cá nuôi trở thành một ngành công nghiệp nuôi và chế biến mà họ cá Tra là trọng điểm. Đối với 2 loài có tên trong sách đỏ, đã có những dự kiến bảo vệ bằng cách cấm hoàn toàn việc săn bắt và nghiên cứu phương thức để nuôi. Về sản lượng nuôi trồng, vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long đạt mức 400.000 tấn cá Tra và cá Xác Bụng vào năm 2005 và còn nhiều tiềm năng để gia tăng trong giai đoạn tới (https://voer.edu.vn). 2.2 Thành phần hóa học của cá tra So với cơ thịt động vật máu nóng, cơ thịt cá có sự khác biệt ở một số điểm sau:  Hàm lượng mô liên kết trong cơ thịt cá thấp hơn.  Nhiệt độ collagen hóa ở cá thấp hơn nhiệt độ này ở thịt hàng chục độ.  Myosin chiếm 40% protein tổng số và rất khó tách ra khỏi actin. Protein này rất nhạy với biến tính nhiệt và rất dễ bị thủy phân bởi protease hơn myosin ở động vật máu nóng.  Hiện tượng cứng và chín của thịt cá diễn ra nhanh hơn. Đặc biệt, sau khi cá chết, pH giảm ít hơn (từ 7 xuống 6,5-6,2). Do đó, cá rất không bền đối với vi sinh vật (Lê Ngọc Tú và ctv., 2003). Ngành Công nghệ Thực phẩm 4 Khoa Nông nghiệp và SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ 2.2.1 Protein Protein của cá có giá trị dinh dưỡng cao hơn so với protein của các loại ngũ cốc vì chúng giàu các amino acid không thay thế như lysine, methionine và cysteine, trong khi hầu hết các loại ngũ cốc thường thiếu các loại amino acid này. Về phân loại, protein của cá có thể được phân chia làm 3 nhóm sau đây: Protein cấu trúc: Protein cấu trúc gồm các sợi myosin, actin, actomyosin và tropomyosin, chiếm khoảng 65-75% tổng hàm lượng protein trong cá. Chúng có chức năng co rút, đảm nhận các hoạt động của cơ. Trong đó, myosin và actin là các protein tham gia trực tiếp vào quá trình co duỗi cơ. Các protein thuộc nhóm này có khả năng hòa tan trong dung dịch muối trung tính có nồng độ ion khá cao (trên 0,5 M) (Phan Thị Thanh Quế, 2006). Protein chất cơ : Protein chất cơ bao gồm myoglobin, myoalbumin, globulin và các enzyme, chiếm khoảng 25-30% hàm lượng protein trong cá. Các protein này hòa tan trong nước, trong dung dịch muối trung tính có nồng độ ion thấp (dưới 0,5 M). Bên cạnh đó, hầu hết các protein chất cơ bị đông tụ khi đun nóng ở nhiệt độ trên 50 0C (Phan Thị Thanh Quế, 2006). Protein mô liên kết : Protein mô liên kết gồm có các sợi collagen, elastin. Hàm lượng collagen ở cơ thịt cá thấp hơn ở động vật có vú, thường khoảng 1-10% tổng lượng protein. Các protein này có trong mạng lưới ngoại bào. Chúng không tan trong nước, trong dung dịch kiềm hoặc trong dung dịch muối có nồng độ cao. Khi so sánh về khả năng hòa tan trong nước giữa 3 nhóm protein của cá, các protein tương cơ là dễ hòa tan nhất. Vì vậy, khi rửa, ướp muối hoặc tan giá, … không đúng cách có thể làm thất thoát một lượng protein đáng kể, làm mất giá trị dinh dưỡng (Phan Thị Thanh Quế, 2006). Protein của cá có điểm đẳng điện pI (isoelectric point) nằm trong khoảng pH 4,5-5,5. Do đó, độ hòa tan của protein của cá có giá trị thấp nhất trong khoảng pH này (Phan Thị Thanh Quế, 2006). 2.2.2 Thành phần trích ly chứa nitơ phi protein Các chất trích ly chứa nitơ phi protein là nhữngthành phần hòa tan trong nước, có vai trò rất quan trọng trong chế biến thủy sản vì chúng ảnh hưởng đến mọi tính chất của thực phẩm như màu sắc, mùi vị, trạng thái cấu trúc, dinh Ngành Công nghệ Thực phẩm 5 Khoa Nông nghiệp và SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ dưỡng, sự an toàn và sự hư hỏng sau thu hoạch. Các chất này chiếm khoảng 918% tổng hàm lượng protein ở cá xương và khoảng 33-38% ở cá sụn. Nhóm chất này có thành phần chính bao gồm các chất bay hơi (ammonia, amine, trimethylamine, dimethylamine), trimethylamine N-oxide (TMAO), dimethylamine N-oxide (DMAO), creatine, các amino acid tự do, nucleotide, urea (có nhiều trong cá sụn), … (Phan Thị Thanh Quế, 2006). 2.2.3 Enzyme Enyme tham gia vào quá trình trao đổi chất ở tế bào, quá trình tiêu hóa thức ăn và quá trình tê cứng ở cá. Sau khi cá chết, enzyme vẫn còn hoạt động nên gây ra quá trình tự phân giải của cá. Trong nguyên liệu cá có nhiều enzyme khác nhau. Các nhóm enzyme chính ảnh hưởng đến chất lượng nguyên liệu là enzyme thủy phân và enzyme oxy hóa khử. Nhiều loại protease được tách từ cơ thịt cá và có tác dụng làm mềm mô cơ. Các enzyme thủy phân protein quan trọng trong nguyên liệu gồm: cathepsin, protease kiềm, collagenase, pepsin, trypsin, chimotrypsin. Còn các enzyme thủy phân lipid quan trọng trong cá gồm có lipase và phospholipase. Chúng tồn tại trong các cơ quan nội tạng và trong cơ thịt (Phan Thị Thanh Quế, 2006). 2.2.4 Lipid Cá sử dụng lipid làm nguồn năng lượng dự trữ để duy trì sự sống trong những tháng mùa đông, khi nguồn thức ăn khan hiếm. Hàm lượng lipid trong cá dao động nhiều (0,1-30%) (Phan Thị Thanh Quế, 2006). 2.2.5 Carbohydrate Hàm lượng carbohydrate trong cơ thịt cá rất thấp, thường dưới 0,5%, tồn tại dưới dạng dự trữ glycogen. Cá vừa đẻ trứng lượng carbohydrate dự trữ rất thấp (Phan Thị Thanh Quế, 2006). 2.2.6 Vitamin và khoáng chất Cá là nguồn cung cấp chính vitamin nhóm B (B1, B2 và B12). Ngoài ra, vitamin A và D có chủ yếu trong các loài cá béo. Vitamin A và D tích lũy chủ yếu ở gan, vitamin nhóm B có nhiều trong cơ thịt cá. Thông thường, các vitamin rất nhạy cảm với oxy, ánh sáng và nhiệt độ. Ngoài ra, các quá trình chế biến thực phẩm như sản xuất đồ hộp, tan giá, ướp muối, … ảnh hưởng lớn đến thành phần vitamin. Vì vậy, cần phải chú ý để tránh tổn thất vitamin trong các quá trình chế biến. Ngành Công nghệ Thực phẩm 6 Khoa Nông nghiệp và SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ Về thành phần khoáng, chất khoáng của cá phân bố chủ yếu trong mô xương, đặc biệt trong xương sống. Trong đó, calcium và phosphorus là hai nguyên tố chiếm nhiều nhất trong xương cá còn thịt cá là thì giàu sắt, đồng, lưu huỳnh và iodine. Ngoài ra còn có nickel, cobalt, chì, arsenic, kẽm (Phan Thị Thanh Quế, 2006). 2.2.7 Phụ phẩm trong chế biến cá tra Cá tra sau khi phi lê, qua các công đoạn chỉnh sửa và đi đến công đoạn thành phẩm thì hiệu suất thu hồi chỉ đạt khoảng 38,6% (Nguyen Phuoc Minh, 2014, Bảng 2.1). Điều này có nghĩa là 61,4% còn lại của con cá tra, được xem là phụ phẩm bao gồm đầu, xương, da, nội tạng,… chiếm một khối lượng rất lớn. Bảng 2.1 Phần trăm các phần thu được trong chế biến cá tra (Pangasius hypophthalmus) phi lê Thành phần Phần trăm (%) Phi lê 38,6 Da 4,9 Mỡ 3,5 Thịt dè 10,5 Nội tạng 5,8 Đầu và xương 37 (Nguyen Phuoc Minh, 2014) Do vậy, nếu không có biện pháp xử lý lượng phụ phẩm này đúng cách sẽ gây nguy hại đến môi trường và gây lãng phí rất nhiều, bởi vì ngoài phần phi lê, các phần còn lại sau quá trình sản xuất cá phi lê vẫn chứa những giá trị dinh dưỡng đáng kể. Tuy nhiên, thực trạng trên cũng đã và đang được xã hội quan tâm. Bằng chứng là việc tạo ra được những sản phẩm giá trị gia tăng từ những phần phụ phẩm của con cá tra như bột cá dùng cho chăn nuôi, mỡ cá, xăng sinh học (biodiesel), bao tử cá, bong bóng cá, vây cá,… Thế nhưng, những nhà máy chế biến phụ phẩm vẫn còn hạn chế và những sản phẩm trên vẫn chưa phát huy hết được tiềm năng vốn có của phụ phẩm từ con cá tra. Hiện nay, những sản phẩm từ quá trình thủy phân phụ phẩm cá là xu hướng mới đang được quan tâm. 2.3 Sơ lƣợc về protein Các amino acid bên cạnh tồn tại ở dạng tự do còn liên kết với nhau thông qua liên kết peptide tạo nên những đoạn peptide. Tùy thuộc vào số lượng các amino acid trong mạch peptide mà có di-, tri-, tetra-,… oligopeptide. Khi số lượng amino acid trong chuỗi peptide lớn hơn 10 thì chuỗi này được gọi là polypeptide. Protein cũng được tạo thành từ các amino acid qua liên kết Ngành Công nghệ Thực phẩm 7 Khoa Nông nghiệp và SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ peptide khi số amino acid trong mạch polypeptide đạt khoảng 100 đến trên 900, với khối lượng phân từ tương ứng từ 10 đến trên 100 kDa. Về phân loại, các protein có thể được phân loại dựa vào tính đồng thể (homoprotein và heteroprotein) hay dựa vào chức năng của chúng trong các bộ phận, các cơ quan sinh học (protein cấu trúc, protein chức năng và protein dự trữ). Enzyme là những protein chức năng. Bên cạnh các protein chỉ có các amino acid trong thành phần (protein đơn giản), còn có một số loại protein phức tạp khác như: phosphoprotein – chứa các gốc ester với phosphoric acid (như casein, phosvitin của lòng đỏ trứng), glycoprotein – chứa một hoặc nhiều monosaccharide hoặc oligosaccharide trong thành phần (như một số protein trong lòng đỏ và lòng trắng trứng, collagen của các mô liên kết, serum ở một số loài cá) (Hoàng Kim Anh, 2007). Về cấu trúc không gian, protein được phân thành 4 loại như sau: Cấu trúc bậc một: Cấu trúc bậc một của protein được hiểu là số lượng và trình tự các amino acid trong mạch polypeptide. Các mạch này có hai đầu C-terminal (-COOH) và N-terminal (-NH2), trong đó gốc amine luôn ở bên trái (Hoàng Kim Anh, 2007). Cấu trúc bậc hai: Cấu trúc bậc hai của protein là sự sắp xếp không gian tương ứng với mạch polypeptide. Các cấu trúc bậc hai đã biết chủ yếu của protein là cấu trúc xoắn α và cấu trúc tấm xếp gấp β-sheet. Khả năng tạo cấu trúc xoắn, cấu trúc tấm xếp gấp hoặc không tạo cấu trúc này phụ thuộc vào loại amino acid. Do đó, có thể dự đoán cấu trúc không gian cho một chuỗi polypeptide khi đã biết trình tự các amino acid. Ngoài ra, nhiều cấu trúc xoắn α và cấu trúc tấm xếp gấp β-sheet có thể kết hợp lại với nhau để tạo thành siêu cấu trúc bậc hai, như trường hợp các cuộn xoắn nhỏ nằm trong một đoạn xoắn lớn hay trường hợp cấu trúc tấm nối tiếp cấu trúc xoắn… (Hoàng Kim Anh, 2007) Cấu trúc bậc ba: Cấu trúc bậc ba của protein tương ứng với sự sắp xếp không gian ba chiều của mạch polypeptide có cấu trúc bậc hai ở các đoạn khác nhau. Hai dạng cấu trúc chính bậc ba gồm cấu trúc dạng sợi và cấu trúc dạng hình cầu. Các liên kết trong cấu trúc bậc ba của protein chủ yếu là liên kết Ngành Công nghệ Thực phẩm 8 Khoa Nông nghiệp và SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ hydro và liên kết kỵ nước (hydrophobe). Tuy nhiên, cũng tồn tại cả liên kết tĩnh điện và liên kết disulfide (Hoàng Kim Anh, 2007). Cấu trúc bậc bốn : Một phân tử protein có thể có một hoặc nhiều tiểu đơn vị (còn được gọi là các subunit hay những chuỗi peptide độc lập – single peptide chain). Các tiểu đơn vị này có thể liên kết với nhau nhờ các liên kết không đồng hóa trị tạo thành cấu trúc bậc bốn của protein. Các tiểu đơn vị này có thể cùng loại hoặc khác loại và các liên kết tạo nên cấu trúc bậc bốn bao gồm các liên kết đã tạo nên cấu trúc bậc ba (trừ các cầu đồng hóa trị sulfide). Chính cấu trúc bậc bốn sẽ thể hiện hoạt tính sinh học của các protein chức năng (Hoàng Kim Anh, 2007). 2.3.1 Biến tính protein Biến tính là hiện tượng thay đổi thuận nghịch hoặc không thuận nghịch cấu trúc không gian ban đầu của protein nhưng không làm biến đổi các liên kết hóa trị trong phân tử (trừ liên kết disulfide). Các liên kết bị phá vỡ có thể là các cầu hydro, liên kết kỵ nước hoặc liên kết ion. Khi protein bị biến tính, các tính chất của chúng cũng bị thay đổi. Hiện tượng biến tính xảy ra khi có mặt tác nhân gây biến tính và phục hồi lại (một phần hay hoàn toàn) các tính chất của protein khi loại bỏ các tác nhân này được gọi là sự biến tính thuận nghịch. Ngược lại, biến tính không thuận nghịch không có khả năng phục hồi lại các tính chất ban đầu và thường xảy ra khi các cầu disulfide bị phá vỡ. Khi các protein bị biến tính, chúng dễ bị thủy phân bởi các protease hơn khi ở dạng chưa biến tính, còn các protein có hoạt tính sinh học như các enzyme thì thường sẽ bị mất hoạt tính (Hoàng Kim Anh, 2007). Các tác nhân gây biến tính protein có thể gồm những loại sau:  Đun nóng: Đun nóng ở nhiệt độ cao sẽ dẫn đến sự phá vỡ các liên kết hydro, làm cấu trúc bậc hai, ba và bốn của protein bị thay đổi. Hệ quả là các tính chất lý hóa học và hoạt tính sinh học đặc hiệu cũng bị thay đổi.  Làm lạnh: Vài enzyme bền ở nhiệt độ phòng nhưng trở nên kém bền ở 0 C (như L-threonine deaminase). Một số protein cũng sẽ bị biến đổi khi ở nhiệt độ thấp hoặc ở nhiệt độ đóng băng. 0  Áp suất: Xử lý áp suất cao có thể dẫn đến sự phá vỡ cấu trúc bậc bốn của protein tạo thành các tiểu đơn vị ở áp suất từ 1000-2000 bar. Các protein cấu tạo từ một sợi polypeptide sẽ bị mất một phần cấu trúc bậc ba ở áp suất trên 3000 bar (có thể là do làm yếu tương tác kỵ nước và phá vỡ các cầu muối). Ngành Công nghệ Thực phẩm 9 Khoa Nông nghiệp và SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ  Tác nhân hóa học: Ở pH cực trị, khả năng tích điện của protein bị ảnh hưởng dẫn đến sự giãn mạch. Urea và guanidine thì tác dụng lên liên kết hydro và tương tác kỵ nước. Còn các chất tẩy rửa tổng hợp sẽ phá vỡ tương tác kỵ nước và làm tăng xu hướng tháo cuộn. Bên cạnh đó, các chất khử (β-mecapto ethanol) phá vỡ liên kết cầu disulfide. Sự biến tính protein thường không thuận nghịch trừ trường hợp tác nhân gây biến tính nhẹ hoặc đối với protein có phân tử lượng thấp (Nguyễn Thị Thu Thủy, 2009). 2.4 Sơ lƣợc về enzyme Hầu hết các phản ứng trong tế bào sống đều đòi hỏi sự có mặt của một enzyme cụ thể. Chúng là những chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Các enzyme này có chức năng xúc tác cho việc tạo ra và phá vỡ các liên kết hóa học. Do đó, giống như bất kỳ chất xúc tác khác, các enzyme làm gia tăng tốc độ phản ứng mà không làm thay đổi về mặt hóa học của bản thân nó (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011). 2.4.1 Cấu trúc enzyme Enzyme được cấu tạo từ các L-α-amino acid nối với nhau qua liên kết peptide. Dưới tác dụng của acid, kiềm hoặc enzyme peptidehydrolase, enzyme sẽ bị thủy phân cho ra các đơn vị L-α-amino acid (enzyme đơn giản hay một cấu tử). Ngoài ra, trong một số trường hợp, sau khi enzyme bị thủy phân, bên cạnh các amino acid tạo ra, các thành phần chất khác như vitamin, nucleotide,… cũng được tìm thấy. Các enzyme đó được gọi là enzyme đa cấu tử hay enzyme phức tạp. Đối với enzyme đa cấu tử, phần protein được gọi là “feron” hay “apoenzyme” còn phần phi protein được gọi là nhóm ngoại “agon”. Khi nhóm ngoại được tách khỏi phần protein, tồn tại độc lập, chúng được gọi là “coenzyme”. Thông thường, các enzyme trong tế bào tồn tại dạng cấu trúc bậc bốn. Khi chịu tác động bởi một số yếu tố nhất định, chúng sẽ phân ly thành các tiểu đơn vị và hoạt tính của enzyme lúc này bị mất hoàn toàn. Tuy nhiên, hoạt tính của enzyme có thể được phục hồi nếu các tiểu đơn vị này kết hợp lại với nhau khi gặp điều kiện thuận lợi (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011). 2.4.2 Động học enzyme Động học của enzyme là những thông tin về cơ chế cơ bản và những tham số khác của enzyme đặc trưng cho tính chất của chúng. Hai tham số quan trọng trong quá trình nghiên cứu động học enzyme là Vmax và Km. Km chính là Ngành Công nghệ Thực phẩm 10 Khoa Nông nghiệp và SHƯD Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 37 Trường Đại học Cần Thơ hằng số phân ly hiệu quả (dissociation constant), nó thể hiện độ nhạy của một phản ứng enzyme còn Vmax là tốc độ phản ứng cực đại. Km nhỏ chỉ ra rằng enzyme chỉ cần một lượng nhỏ cơ chất để đạt trạng thái bão hòa. Do đó, tốc độ phản ứng cực đại Vmax đạt được tại một nồng độ cơ chất tương đối thấp. Ngược lại, Km lớn nói lên rằng phản ứng của enzyme cần một lượng cơ chất lớn để có thể đạt đến tốc độ cực đại Vmax (Hình 2.4). Tốc độ phản ứng (v) Các thông số động học của enzyme được biểu diễn thông qua nhiều phương trình động học khác nhau. Trong đó, phương trình Michaelis-Menten được sử dụng phổ biến hơn cả do dễ sử sụng trong việc đánh giá các thông số động học của enzyme (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011). Vmax Vmax/2 Km Nồng độ cơ chất [S] Hình 2.4. Đồ thị biểu diễn phương trình Michaelis-Menten (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011) 2.4.3 Cơ chế thủy phân của enzyme Bản chất của cơ chế tác động bởi enzyme trong các phản ứng hóa học là khả năng hoạt hóa cơ chất để cơ chất tham gia phản ứng mạnh hơn. Đặc biệt, khi có sự xúc tác của enzyme thì phản cần một năng lượng hoạt hóa nhỏ hơn so với trường hợp không có mặt enzyme. Quá trình xúc tác của enzyme gồm ba giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất: Enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất không bền. Phản ứng này xảy ra rất nhanh và cần một ít năng lượng. Giai đoạn thứ hai: Cơ chất bị biến đổi dẫn đến làm căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị. Giai đoạn thứ ba: Sản phẩm được tạo thành, enzyme được giải phóng, trở lại trạng thái tự do (Nguyễn Công Hà và Lê Nguyễn Đoan Duy, 2011). Ngành Công nghệ Thực phẩm 11 Khoa Nông nghiệp và SHƯD