Tài liệu Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme phytase từ nấm mốc Aspergillus niger PE1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---------- Ket-noi.com LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP ENZYME PHYTASE TỪ Aspergillus niger PE1 SINH VIÊN THỰC HIỆN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Th.S DƯƠNG THỊ HƯƠNG GIANG LÂM THỊ KIM CHUNG CN NGUYỄN THỊ XUÂN DUNG MSSV: 3072476 LỚP CNSH K 33 CẦN THƠ, Tháng 5/2011 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Th.s Dương Thị Hương Giang Lâm Thị Kim Chung CN Nguyễn Thị Xuân Dung DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2011 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đại học, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi còn nhận được sự hướng dẫn, ủng hộ, giúp đỡ của rất nhiều người. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Cần Thơ, Ban Giám Đốc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn tất cả quý thầy cô trường Đại Học Cần Thơ đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức chuyên môn cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Dương Thị Hương Giang và chị Nguyễn Thị Xuân Dung đã tận tình hướng dẫn, bổ sung kiến thức, góp ý chân thành và tạo mọi điều kiện cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Pha, nguyên cố vấn học tập lớp Công nghệ Sinh học khóa 33 và cô Nguyễn Thị Liên, cố vấn học tập lớp Công nghệ Sinh học khóa 33 và các thầy cô, cán bộ PTN Công nghệ sinh học Thực phẩm, PTN Công nghệ Enzyme - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Cần Thơ đã luôn quan tâm, động viên tôi trong suốt quá trình học và thực hiện đề tài. Xin cảm ơn gia đình đã luôn ở bên tôi, cảm ơn lớp Công Nghệ Sinh Học K33 đã luôn giúp đỡ và ủng hộ tôi. Cảm ơn bạn Nguyễn Thái Nguyên và bạn Đặng Thị Thùy Vân đã hỗ trợ, khuyến khích tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài . Tôi xin kính chúc quý thầy cô cùng các bạn dồi dào sức khoẻ và công tác tốt. Cần Thơ, ngày tháng Lâm Thị Kim Chung năm 2011 TÓM LƯỢC Đề tài “Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme phytase từ nấm mốc Aspergillus niger PE1” được tiến hành nhằm mục đích chọn lựa môi trường nuôi cấy phù hợp để nấm mốc Aspergillus niger PE1 sinh tổng hợp enzyme phytase cho hoạt tính enzyme cao nhất, để tối ưu hóa quá trình thu nhận và hạ giá thành sản xuất enzyme phytase. Các thí nghiệm được tiến hành để chọn ra chủng Aspergillus niger có khả năng sinh enzyme cao trên môi trường thích hợp, khảo sát thời gian, nguồn cơ chất, ẩm độ, pH và các yếu tố dinh dưỡng như: nguồn đường, nguồn nitơ, hàm lượng đường, hàm lượng nitơ và hàm lượng KH2PO4. Thí nghiệm sau sẽ sử dụng điều kiện tối ưu của thí nghiệm trước. Kết quả thí nghiệm cho thấy nấm mốc Aspergillus niger PE1 sinh tổng hợp enzyme phytase cao nhất ở ngày thứ 5, cơ chất sử dụng tốt nhất là bột bắp ở điều kiện độ ẩm là 55% trong môi trường bổ sung dung dịch khoáng có pH là 5, thí nghiệm cũng chọn ra được nguồn đường bổ sung vào môi trường nuôi cấy nấm mốc là Glucose + Sucrose tỉ lệ 1:1 với hàm lượng là 0,5% (w/w) nguồn nitơ chọn được là Malt extract với hàm lượng là 0,5% (w/w), và hàm lượng KH2PO4 thích hợp là 1% (w/w) cơ chất. i MỤC LỤC Trang KÝ TÊN HỘI ĐỒNG ............................................................................................. CẢM TẠ ................................................................................................................ TÓM LƯỢC........................................................................................................... i MỤC LỤC.............................................................................................................. ii DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................. iv DANH SÁCH HÌNH .............................................................................................. v TỪ VIẾT TẮT........................................................................................................ vii CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU..................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề........................................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu đề tài ................................................................................................. 2 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU.................................................................. 3 2.1. Các nghiên cứu trong và ngoài nước ............................................................... 3 2.2. Giới thiệu chung về nấm mốc Aspergillus niger............................................... 4 2.3. Giới thiệu về phytate........................................................................................ 6 2.4. Enzyme phytase. .............................................................................................. 6 2.5. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của enzyme phytase .............................................. 8 2.6. Phytase trong tự nhiên...................................................................................... 11 2.7.Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình sinh tổng hợp phytase……………............. 13 2.8. Sự điều hòa sinh tổng hợp phytase ................................................................... 15 2.9. Các ứng dụng thực tế của enzyme phytase ...................................................... 15 2.10. Cách sử dụng và bảo quản enzyme phytase.................................................... 18 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................... 20 3.1. Phương tiện nghiên cứu ................................................................................... 20 3.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................. 23 3.3. Tiến hành thí nghiệm ....................................................................................... 23 3.4. Các thí nghiệm................................................................................................. 23 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢVÀ THẢO LUẬN............................................................ 34 ii 4.1. Khảo sát khả năng hoà tan lân hữu cơ của A. niger trên 3 môi trường .............. 34 4.2. Khảo sát thời gian sinh tổng hợp Phytase của Aspergillus niger PE1 ............... 35 4.3. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn phytate khác nhau lên khả năng sinh tổng hợp Phytase của Aspergillus niger PE1.......................................................................... 36 4.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase của Aspergillus niger PE1............................................................................................. 37 4.5. Khảo sát ảnh hưởng của ẩm độ lên khả năng sinh enzyme phytase của Aspergillus niger PE1............................................................................................. 38 4.6. Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến khả năng sinh phytase của Aspergillus niger PE1............................................................................................. 39 4.7. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng Nitơ đến khả năng sinh phytase của Aspergillus niger PE1............................................................................................. 40 4.8. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến khả năng sinh phytase của Aspergillus niger PE1............................................................................................. 41 4.9. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng sinh phytase của Aspergillus niger PE1............................................................................................. 42 4.10. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4 đến khả năng sinh phytase của Aspergillus niger PE1....................................................................................... 43 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................... 47 PHỤ LỤC Phụ lục I: Hình ảnh thí nghiệm Phụ lục II: Các phương pháp phân tích 1. Phương pháp định lượng protein - Phương pháp Bradford 2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase 3. Phương pháp xác định độ ẩm bằng cách sấy khô 4. Phương pháp đếm mật số bằng buồng đếm hồng cầu Phụ lục III: Bảng kết quả các thí nghiệm iii Bảng 1 : Hoạt tính phytase theo thời gian khi nuôi A. niger trong môi trường bán rắn Bảng 2: Hoạt tính phytase thu được khi nuôi A. niger trong môi trường bán rắn với các nguồn cơ chất là nguồn phytate khác nhau Bảng 3: Hoạt tính phytase khi nuôi A. niger trong môi trường bán rắn với các mức pH khác nhau Bảng 4: Hoạt tính phytase khi nuôi A. niger trong môi trường bán rắn với các mức ẩm độ khác nhau Bảng 5: Hoạt tính phytase thu được khi nuôi A. niger trong môi trường bán rắn có nguồn Nitơ khác nhau Bảng 6: Hoạt tính phytase thu được khi nuôi nấm A. niger trong môi trường bán rắn có hàm lượng nitơ khác nhau Bảng 7: Hoạt tính phytase thu được khi nuôi A. niger trong môi trường bán rắn có nguồn đường khác nhau Bảng 8: Hoạt tính phytase thu được khi nuôi nấm A. niger trong môi trường bán rắn có hàm lượng đường khác nhau Bảng 9: Hoạt tính phytase thu được khi nuôi nấm A. niger trong môi trường bán rắn có hàm lượng KH2PO4 khác nhau Phụ lục IV: Kết quả phân tích thống kê iv DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Các chủng vi sinh vật, nhiệt độ và pH tối ưu của chúng................................... 9 Bảng 2: Hàm lượng của phytase trong nguyên liệu thức ăn..................................... ....18 Bảng 3: Nghiệm thức theo dõi quá trình sinh tổng hợp phytase của A. niger theo thời gian......................................................................................................................... 25 Bảng 4: Nghiệm thức theo dõi ảnh hưởng của nguồn phytate lên quá trình sinh tổng hợp phytase của A. niger ........................................................................................ ....26 Bảng 5: Nghiệm thức theo dõi ảnh hưởng pH lên quá trình sinh tổng hợp phytase của A. niger .................................................................................................................. ....27 Bảng 6: Nghiệm thức theo dõi ảnh hưởng của ẩm độ môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp phytase của A. niger ......................................................................... ....28 Bảng 7: Nghiệm thức theo dõi ảnh hưởng của nguồn nitơ lên quá trình sinh tổng hợp phytase của A. niger ............................................................................................... ....29 Bảng 8: Nghiệm thức theo dõi quá trình sinh tổng hợp phytase của A. niger theo hàm lượng nitơ ............................................................................................................... ....30 Bảng 9: Nghiệm thức theo dõi ảnh hưởng của nguồn đường lên quá trình sinh tổng hợp phytase của A. niger................................................................................................ ....31 Bảng 10: Nghiệm thức theo dõi quá trình sinh tổng hợp phytase của A. niger theo hàm lượng đường ........................................................................................................... ....32 Bảng 11: Nghiệm thức theo dõi quá trình sinh tổng hợp phytase của A. niger theo hàm lượng KH2PO4 ........................................................................................................ ....33 Bảng 12: Đường kính thủy phân của các chủng A. niger trên các môi trường ......... ....34 v DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus ............................................... 5 Hình 2. Cơ chế thủy phân cơ chất phytate của phytase............................................ 11 Hình 3: Quy trình dự kiến thu nhận phytase thô từ A. niger ................................... 23 Hình 4: Đường kính thủy phân của A. niger PE1 sau 24 giờ ................................... 35 Hình 5: Sinh tổng hợp của A. niger theo thời gian................................................... 36 Hình 6: Sinh tổng hợp phytase từ các nguồn cơ chất phytate khác nhau.................. 37 Hình 7: Ảnh hưởng của pH đối với sinh tổng hợp enzyme phytase ......................... 38 Hình 8: Sinh tổng hợp enzyme phytase với các mức ẩm độ khác nhau.................... 39 Hình 9: Sinh tổng hợp phytase từ các nguồn nitơ khác nhau ................................... 40 Hình 10: Sinh tổng hợp phytase từ hàm lượng nitơ khác nhau ................................ 41 Hình 11: Sinh tổng hợp phytase từ các nguồn đường khác nhau ............................. 42 Hình 12: Sinh tổng hợp phytase từ các hàm lượng đường khác nhau ...................... 43 Hình 13: Sinh tổng hợp phytase từ các hàm lượng KH2PO4 khác nhau.................... 44 Hình 14: Quy trình nuôi cấy và thu nhận enzyme phytase thô từ A. niger PE1........ 45 vi CÁC TỪ VIẾT TẮT A. niger: Aspergillus niger AS: amonium sulphate B. subtilis : Bacillus subtilis B. amyloliquefaciens: Bacillus amyloliquefaciens BB: bột bắp BĐ: bột đậu BM: bột mì BT: bột bắp trích CNSH: Công nghệ sinh học ĐT: đậu trích G: glucose HAP: Histidine acid phytase ME: malt extract P: phospho PTN: phòng thí nghiệm Pvc: phospho vô cơ S: sucrose TACN: thức ăn chăn nuôi TN: thí nghiệm U/gds: U/g dry substracte YE: yeast extract vii Luận văn tốt nghệp Đại Học Khóa 33- 2011 Ket-noi.com Trường ĐHCT CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Ô nhiễm môi trường đang là vấn đề luôn được quan tâm hàng đầu hiện nay. Gần đây, các nhà khoa học đã và đang nổ lực tìm cách làm giảm ô nhiễm từ các chất thải ra trong chăn nuôi. Trong quá trình nghiên cứu, các nhà khoa học đã xác định được rằng cần cải thiện khả năng sử dụng các dưỡng chất trong khẩu phần của vật nuôi để hạn chế tối đa lượng phân thải ra. Việc cho vật nuôi ăn quá nhiều chất dinh dưỡng nhằm tối đa hóa năng suất đã dẫn đến hậu quả là lượng chất dinh dưỡng thải ra quá nhiều qua phân và nước tiểu (chủ yếu là hàm lượng protein, phospho và canxi) dẫn đến hiệu quả chăn nuôi thấp và ô nhiễm môi trường. Chất thải chăn nuôi có khả năng gây ô nhiễm không khí, đất, nước, và đặc biệt là tầng nước mặt. Ở Việt Nam, tình trạng này có phần nghiêm trọng do nơi chăn nuôi thường nằm gần hoặc trong khu dân cư, đặc biệt là khi phần lớn các giếng cung cấp nước sinh hoạt lại khai thác nước ở tầng nước mặt bị ô nhiễm. Phytate thải qua phân của vật nuôi là chất gây ô nhiễm đất và nước ngầm. Bên cạnh đó là nitơ và lưu huỳnh, là những tác nhân gây ô nhiễm khác, gây nên mùi hôi trong khu vực chăn nuôi và gây ô nhiễm nguồn nước. Nitơ và lưu huỳnh có chủ yếu trong lượng đạm và acid amin không được tiêu hoá và hấp thu hết. Qua các nghiên cứu cho thấy việc bổ sung enzyme tỏ ra có hiệu quả trong việc cải thiện các hạn chế trên. Phytase là men tiêu hóa, giúp giải phóng lượng phốt-pho bị giữ trong các phân tử phytate. Phytase được sử dụng ngày càng rộng rãi và giúp làm giảm giá thành thức ăn chăn nuôi (TACN). Ngoài ra, phytase còn có tác dụng làm giảm mùi hôi, giúp cải thiện môi trường chăn nuôi. Để giúp chúng tăng cường hiệu quả tiêu hoá và hấp thu P trong thực vật, cần phải bổ sung phytase vào TACN. Phytase giải phóng P bằng cách phá vỡ liên kết của P với phytate, và khiến P trở nên dễ hấp thu. Khi liên kết này bị phá vỡ, các dưỡng chất khác (khoáng kim loại, acid amin, đạm, tinh bột) bị kết bám bởi phytate cũng trở nên dễ tiêu hoá và hấp thu hơn. Tác dụng bảo vệ môi trường của phytase đến từ việc giải phóng P và các dưỡng chất khác khỏi phức hợp với phytate. Phytase có khả năng làm giảm 30-50% lượng P thải ra môi trường do nó giúp làm giảm lượng P bổ sung và giúp hấp thu tối đa lượng P sẵn có trong nguyên liệu. Phytase cũng giúp giải phóng đạm và acid amin, khiến Chuyên ngành CNSH 1 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghệp Đại Học Khóa 33- 2011 Trường ĐHCT chúng được tiêu hoá và hấp thu tốt hơn, qua đó làm giảm lượng thải nitơ và lưu huỳnh, nên làm giảm mùi hôi và ô nhiễm nguồn nước. Phytase có nhiều trong các loại thực vật khác nhau (ngũ cốc và đậu), động vật, và vi sinh vật. Trong thực vật, 60-85% tổng lượng P tồn tại dưới dạng liên kết chặt trong phân tử phytate, là cấu trúc rất khó bị tiêu hoá và hấp thu. Do vậy, lượng P hữu dụng trong thực vật rất thấp. Chỉ khoảng 33% P trong thực vật là tiêu hoá và hấp thu được đối với gia cầm, và đối với heo là khoảng 25-40% (Nguyễn Thanh Hải, BIOMIN Vietnam, http://ildex.com.vn/vn/Tham-Quan-TL/Tin-Tuc/Tin-Cong-Nghiep/Tang- Hieu-Qua-Su-Dung-Phot-Pho-Voi-Phytase/). Từ những lợi ích nêu trên, phytase đã được nghiên cứu trên các đối tượng khác nhau và được thương mại hóa thành sản phẩm phytase. 1.2. Mục tiêu đề tài Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase của nấm Aspergillus niger. Chọn lọc môi trường nuôi cấy thích hợp nhất để thu được phytase có hoạt tính cao. Từ đó làm tăng tính ứng dụng thực tế và giảm giá thành enzyme phytase thu được. Chuyên ngành CNSH 2 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghệp Đại Học Khóa 33- 2011 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Các nghiên cứu trong và ngoài nước 2.1.1 Nghiên cứu trong nước. Trần Thị Tuyết (2004) đã tiến hành sản xuất enzyme phytase từ nấm mốc Aspergillus niger NRRL – 363 theo phương pháp lên men bề mặt từ 3 nguồn cơ chất khác nhau: cám gạo, bột mì, bột bắp. Bổ sung bột mì cho hàm lượng phytase cao nhất (572,78 UI/g) ở thời gian 2 ngày sau khi bắt đầu lên men, độ ẩm thích hợp là 60%. Quá trình sản xuất enzyme phytase từ nấm mốc Aspergillus niger NRRL – 363 tăng lên rất nhiều khi bổ sung thêm nguồn đường là glucose và rỉ đường, một số nguồn nitơ vô cơ và bột đậu nành cũng kích thích quá trình sản xuất enzyme phytase. KH2PO4 và sodium phytate là các chất cảm ứng cho sản xuất enzyme phytase. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme phytase là 550C ở pH 5,5. Enzyme phytase có thể hoạt động trong điều kiện pH acid (pH 3-3,5), có khả năng chịu được nhiệt độ cao, có thể duy trì 42,61 % hoạt tính trong 15 phút ở 70 0C, 40,03% và 10,39% hoạt tính ở 80 0C và 90 0C tương ứng. Lý Phương Trúc (2009) đã nghiên cứu một số điều kiện nuôi cấy và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến enzyme phytase từ Aspergillus niger ATCC – 13497 theo phương pháp bề mặt từ cơ chất bột mì. Bổ sung KH2PO4 và amon citrate đồng thời với hàm lượng tương ứng là 2,0mg/100g và 7,0g/100g cơ chất. Thời gian thích hợp để nấm mốc sinh tổng hợp enzyme phytase cao nhất là 6 ngày ở 300C và pH 5,5. Phytase thô từ nấm mốc Aspergillus niger ACTT – 13497 hoạt động mạnh ở 450C, pH trong khoảng 3-4 và hàm lượng các chất có khả năng ức chế hay hoạt hóa enzyme phytase. Sản phẩm phytase thô tủa bằng acetone có thể bảo quản ở dạng dung dịch pH 5,5 trong 3 tuần ở 40C . 2.1.2 Nghiên cứu ngoài nước Gargova S.và Sariyska M.(2003) nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy Aspergillus niger 307 sinh tổng hợp phytase cao. Kết quả cho thấy A. niger nuôi trong bình tam giác và ủ lắc cho sản lượng phytase cao khi bào tử nấm mốc dùng để chủng vào môi trường nuôi cấy đạt 50 ngày tuổi. Sản lượng phytase tăng gấp đối với hàm lượng P vô cơ là 0.01%. Enzyme phytase thô trích ly từ nấm mốc A. niger 307 có pH tối ưu ở 2.5 và 5.0 và nhiệt độ tối ưu là 56oC và 58 oC. Chuyên ngành CNSH 3 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghệp Đại Học Khóa 33- 2011 Trường ĐHCT El-Batal A.I., Abdel Karem H. (2001) nghiên cứu ảnh hưởng của ẩm độ, hàm lượng glucose, phosphate, các chất hoạt động bề mặt ảnh hưởng đến sự sản sinh phytase của Aspergillus niger A-98 (giống địa phương) trên bã nho (môi trường lên men rắn). Kết quả cho thấy với ẩm độ là 60%, hàm lượng glucose 6%, hàm lượng P 0.5 mg/25g bã nho , tween 80 0.3% (v/w) cho sản lượng phytase cao nhất. Purva Vats, Banerjee U.C. (2009) nghiên cứu trên dòng nấm mốc sản xuất enzyme phytase cao Aspergillus niger trong các bình tam giác ủ lắc. Hoạt tính enzyme phytase đạt tối ưu ở nhiệt độ lên men 30 oC, pH ban đầu là 6.5, nguồn đường tối ưu là hỗn hợp Glucose+tinh bột (3%+1%), hoạt tính phytase cao với nguồn nitơ là biopeptone (0.5%), kế đó là amonium sulphate và amonium nitrate (0.5%). Tuy nhiên phospho vô cơ lại ức chế sinh tổng hợp phytase ngay cả ở hàm lượng khá thấp 0.05%. 2.2. Giới thiệu chung về nấm mốc Aspergillus niger A. niger là loài phổ biến nhất trong chi Aspergillus. A. niger phân bố rộng rãi trên các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm nông công nghiệp và ở nhiều vùng địa lý khác nhau trên thế giới. 2.2.1 Vị trí phân loại A. niger là loài nấm mốc không thấy có giai đoạn sinh sản hữu tính, chúng sinh sản vô tính chủ yếu bằng bào tử đính (Gam W., 1985) Theo hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm hình thái kết hợp đặc điểm phát sinh bào tử đính của Nấm bất toàn (Deuteromycotina), Apergillus niger thuộc: Ngành : Eumycota Ngành phụ : Deuteromycotina Lớp : Hypomycetes Bộ : Euhypomycetidae Họ : Phialoconidiae Giống : Aspergillus Loài : Aspergillus niger Chuyên ngành CNSH 4 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghệp Đại Học Khóa 33- 2011 Trường ĐHCT 2.2.2 Đặc điểm hệ sợi của nấm Aspergillus niger Khuẩn ty của nấm chỉ tăng trưởng ở ngọn và có vách ngăn, gồm hai loại: - Khuẩn ty dinh dưỡng (vegetative mycelium): khuẩn ty phát triển trong cơ chất, có kích thước nhỏ, màu trắng. Các khuẩn ty bện chặt thành một khối rất dai, ăn sâu vào môi trường nuôi cấy để hút dưỡng chất. Khi già hệ sợi ngã sang màu vàng. - Khuẩn ty sinh sản (reproduction mycelium): khuẩn ty phát triển trong không khí, có kích thước lớn hơn khuẩn ty dinh dưỡng rất nhiều, trong suốt. Chúng hướng vào không khí để lấy oxy. Khi già chúng có khả năng tạo bào tử. Tóm lại, khi già hệ sợi có nhiều biến đổi. Một số khuẩn ty dinh dưỡng tạo thành các hạch nấm làm hệ sợi chuyển sang màu vàng. Trong khi đó, khuẩn ty dinh dưỡng hình thành các bào tử đính làm cho khuẩn lạc có màu đen. Hình 1. Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus. (Samson et al.,1995) (a. 1 lớp, b. 2 lớp, c. phiến, d. tia, e. tể 2.2.3 Cấu tạo cơ quan sinh sản A. niger sinh sản vô tính bằng bào tử đính. Cơ quan sinh sản có dạng như hoa cúc, gồm các phần: bào tử đính (conidi) phát triển từ một tế bào có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các đoạn lân cận của hệ sợi nấm gọi là tế bào gốc (foot – cell). Nó tạo thành sợi cuống (stalk) không ngăn vách, kéo dài với phần đỉnh phồng to tạo thành túi hình cầu, không màu cho đến vàng nhạt. Xung quanh bề mặt túi là các cuống thể Chuyên ngành CNSH 5 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghệp Đại Học Khóa 33- 2011 Trường ĐHCT bình (metulae) màu nâu, dài 10 – 15 µm, là nơi sinh ra các thể bình (phiales). Thể bình có một tầng hoặc hai tầng. Các bào tử đính được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình thành chuỗi hướng gốc, không phân nhánh (bào tử ở ngay miệng bình là bào tử non nhất, càng xa miệng thể bình là bào tử càng già). Bào tử đính hình cầu, thường dẹt, đường kính 4 – 5 µm, nhưng thường nhỏ hơn (Onion et al., 1981). Loài A. niger được phân biệt với các loài khác trong chi Aspergillus bởi khối bào tử đính màu đen. 2.3. Giới thiệu về phytate Phytate là một dạng phospho hữu cơ chiếm từ 1 đến 5% (w/w) của đậu hạt, ngũ cốc, hạt có dầu, phấn hoa và hạnh nhân; hầu hết thực phẩm có nguồn gốc thực vật chứa từ 50% đến 80% phospho tổng là phytate và dĩ nhiên phytate chứa khoáng liên kết với acid amin và protein. Trong tự nhiên, acid phytic tồn tại chủ yếu trong các dạng muối phytate dưới dạng phức hợp với các cation quan trọng cho dinh dưỡng như Ca2+, Zn 2+ và Fe2+ và phytate chứa 14 - 25% phospho, 1,2 - 2% Canxi, 1 - 2% kẽm và sắt. Lượng phytate cao nhất trong các loại ngũ cốc, bắp (0,83 - 2,22%) và trong các loại hạt đậu (5,92 - 9,15%). Phytate làm giảm khả năng tiêu hóa protein, tinh bột và lipid vì phytate tạo phức với protein làm protein kém tan và kháng lại được sự phân giải protein. Acid phytic có thể ảnh hưởng đến sự tiêu hóa tinh bột thông qua sự tương tác với enzyme amylase (Kerovuo et al., 2000). Ở pH thấp [acid], acid phytic có điện tích âm mạnh vì các nhóm phosphate phân ly không hoàn toàn. Dưới điều kiện này, acid phytic có ảnh hưởng xấu đến khả năng hòa tan protein vì liên kết ion của các nhóm phosphate của acid phytic và các gốc acid amin bị ion hóa (lysyl, histidyl, arginyl). Trong pH acid, acid phytic có thể gắn chặt với các protein thực vật, vì điểm đẳng điện của protein này nằm trong pH 4,0 - 5,0. Ở pH 6,0 - 8,0, acid phytic và protein thực vật đều có điện tích âm, phức hợp acid phytic và protein vẫn được hình thành. Việc gắn kết này làm giảm giá trị dinh dưỡng của protein thực vật (Vohra et al., 2003). 2.4. Enzyme phytase. 2.4.1 Giới thiệu Phospho dự trữ trong thực vật ở dưới dạng acid phytic, acid này không thể phân giải trong đường ruột của động vật dạ dày đơn. Chuyên ngành CNSH 6 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghệp Đại Học Khóa 33- 2011 Trường ĐHCT Enzyme phytase phân giải acid phytic cho ra 6 phân tử phosphat, enzyme này đã được đưa vào sử dụng từ giữa năm 1990. Bổ sung phytase vào khẩu phần có thể làm giảm lượng phospho vô cơ và từ đây giảm lượng phospho thải tiết ở phân. Giảm thấp lượng phospho phế thải là một lợi thế đặc biệt của các cơ sở chăn nuôi thâm canh vì nó là một chất gây ô nhiễm (Vũ Duy Giảng, 2004). 2.4.2 Sự phân loại và hệ danh pháp của phytase Dựa vào đặc điểm sinh hóa và trình tự acid amin, có thể phân phytase thành hai lớp: Histidine acid phytase (HAP; EC 3.1.3.2 ; Van Etter et al., 1991) và Alkaline phytase (chưa có EC). Lớp enzyme HAP có tính đặc hiệu với cơ chất rộng và thủy phân các phytate không liên kết với kim loại ở pH acid tạo ra sản phẩm cuối là Myoinositol monophophate. Trái lại, lớp Alkaline phytase chỉ đặc hiệu đối với phức hợp Canxi- phytate và tạo sản phẩm cuối là Myo-inositol triphotphate. Theo Ủy Ban Thuật Ngữ thuộc Hiệp Hội Sinh Hóa và Sinh Học Phân Tử Quốc Tế (Nonmenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology- NC-IUBMB), Hiệp Hội Quốc Tế về Hóa Học và Ứng Dụng (The International Union of Biochemistry – IUB), phytase được phân thành hai nhóm dựa trên thứ tự ưu tiên nhóm phosphate bị tấn công trong vòng cacbon của Inositol. 1- EC 3.1.3.8 Tên thông thường: 3- phytase Tên hệ thống: Myo- inositol- hexakisphosphate 3- phosphohydrolase Các tên khác : phytase; phytate 3- phosphatase Hầu hết các phytase các nguồn gốc vi sinh vật (đặc biệt các phytase có nguồn gốc nấm) thuộc nhóm này. 2- EC 3.1.3.26 Tên thông thường: 6- phytase. Tên hệ thống : Myo- inositol- hexakisphosphate 6- phosphohydrolase Các tên khác : phytase, phytate 6- phosphatase. Chuyên ngành CNSH 7 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghệp Đại Học Khóa 33- 2011 Trường ĐHCT 2.5. Đặc điểm sinh lý và sinh hóa của phytase 2.5.1 Nhiệt độ Hầu hết phytase có nhiệt độ tối ưu từ 46 - 600C. Trong chế biến thức ăn gia súc, phytase cần phải có nhiệt tối ưu cao vì quá trình kết vón thực phẩm (feed pelleting) được thực hiện ở 80 - 100oC trong một vài giây (Vohra et al., 2003; Oh et al., 2004). Trong số các nấm ưa nhiệt, Themomyces lanuginosus thể hiện hoạt tính tối ưu tại 60oC và Sporotrichum thermophile tại 45oC. Phytase của A. fumigatus và A. niger NRRL 3135 thể hiện hoạt tính tối ưu lần lượt tại 37 oC và tại 55oC (Howson và Davis, 1983). 2.5.2 pH pH tối ưu của phytase từ các nguồn khác nhau dao động từ 2,2 – 8. Hầu hết các phytase vi sinh vật thể hiện pH tối ưu giữa 4,5 và 5,5, đặc biệt đối với phytase từ nấm mốc. Tuy nhiên phytase từ nấm mốc A. fumigatus có phổ pH khá rộng, từ 4,0 - 7,3. A. niger NRRL 3135 tiết ra hai loại phytase khác nhau, một có pH tối ưu tại 5,5 và 2,5, một có pH tối ưu tại 2,0, các enzyme này được gọi lần lượt là phyA và phyB (Howson và Davis, 1983). Phytase của S. castelli có pH tối ưu là 4,4 và của A. adeninivorans là 4,5 (Vohra et al., 2004). Phytase vi khuẩn có pH tối ưu tại 6,5 - 7,5, đặc biệt đối với giống Bacillus. Hầu hết các phytase từ nấm men có pH tối ưu trong khoảng 4 - 5. Tuy nhiên, giá trị pH tối ưu của các phytase nấm men tùy thuộc vào nhiệt độ (Nakamura et al., 2000). Các phytase có nguồn gốc thực vật có pH tối ưu trong khoảng 4,0 - 7,5, đa số trong khoảng pH 4,0 - 5,6 (Kerovuo, 2000). Chuyên ngành CNSH 8 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghệp Đại Học Khóa 33- 2011 Trường ĐHCT Bảng 1. Các chủng vi sinh vật, nhiệt độ và pH tối ưu của chúng (Vohra et al., 2004). Phân Trọng lượng Nhiệt độ tối ưu pH Aerobacter aerogenes 25 4-5 Bacillus sp. DS11 70 7,0 Bacillus subtilis 55 7,0 Entergobacter sp.4 50 7,0 -7.5 Escherichia coli 55 4,5 42 Klebsiella aerogenes 60 4,5-5,2 700 Lactobacillus amylovorus 45 4,4 Pseudomonas sp. 40 5.5 Selenomonas ruminantium 50-55 4-5,5 Arxula adeninivorans 75-80 4,5 C. intermedia 53 4,5 C. tropicalis 65 4,5 Clavispora lusitaniae 70 4,0 Nấm Hanseniaspora valbyensis 60 4-5 men Kluyveromyces thermotolerans 60-65 4-5 Pichia anomala 60 4 P. rhodanensis 70-75 4,0-4,5 P. spaartinae 75-80 4,5-5,5 Schwanniomyces occidentalis 75-80 4-5 Aspergillus careus 40 5,6 A. cacbonarius 53 4,7 A. niger 92 55 5,0 100 A. tereus 70 4,5 214 A. niger NRRL 3135 58 2,2;5,0;5,5 85-100 Neurospora sp. 60 5,0-6,0 Pennicillium caseoicolum 45 3,0 Chủng loại Vi khuẩn Nấm mốc Chuyên ngành CNSH 9 phân tử (kDa) 36,5 46 64 490 60-81 Viện NC & PT CNSH Luận văn tốt nghệp Đại Học Khóa 33- 2011 Trường ĐHCT 2.5.3 Tác động của cơ chất Phytase thể hiện sự đặc hiệu cơ chất rộng và có ái lực cao nhất đối với phytate. Chỉ một vài phytase có tính đặc hiệu cao đối với acid phytic. Phytase từ các loài Bacillus DS11 rất đặc hiệu đối với phytate và thể hiện hoạt tính rất yếu hoặc không có hoạt tính đối với phosphat ester như p-nitrophenyl phosphat, ATP, ADP, AMP, βglycerophosphat, sodium pyrophosphat, và α- naphthylphosphat (Irving và Cosgrove, 1971). Các phytase từ A. fumigatus, E. nidulans, và M. thermophia thể hiện sự đặc hiệu cơ chất rộng, trong khi các phytase từ A. niger, A. terrus CBS, và E.coli có tính đặc hiệu cao hơn đối với acid phytic (Wyss et al., 1999). Hàm lượng cơ chất quá cao sẽ gây ức chế enzyme. Ullah và Cummins (1998) cho biết nồng độ myo-inositol-P6 vượt qua mức 2 nmol/L sẽ gây hiện tượng ức chế. Sự hiện diện của cơ chất trong dịch enzyme giúp enzyme kháng lại sự biến tính do nhiệt khi nhiệt độ vượt quá nhiệt độ tối ưu. Phytase sẽ bị bất hoạt đến 90% khi ủ trong điều kiện 75oC, 20 phút (Vohra et al., 2003). 2.5.4 Khả năng chịu nhiệt Enzyme thường được dùng như nguồn bổ sung vào thức ăn gia súc nên thường phải chịu nhiệt độ từ 60-900C, đây là nhiệt độ cần thiết trong quá trình kết vón thực phẩm. Phytase là một enzyme bền nhiệt và có thể tác động lên nhiều cơ chất khác nhau. Phytase là A. fumigatus có khả năng bền nhiệt cao, có thể chịu được nhiệt độ lên đến 100oC trong 20 phút mà chỉ mất 10% hoạt tính so với ban đầu. Khả năng hồi tính sau khi biến tính bởi nhiệt của các loại phytase cũng khác nhau. A. niger phytase bị biến đổi một cách không thuận nghịch, khi ủ ở 55 - 90 oC và mất đến 70 - 80% hoạt tính (Wyss et al., 1998). A. carneus phytase mất 68% hoạt tính khi ủ ở 450C trong 60 phút (Vohra et al., 2003). Chuyên ngành CNSH 10 Viện NC & PT CNSH