Khảo sát lên men, thu nhận, tinh chế và dung hợp Granulocyte Colony Stimulati factor (G-CSF) tái tổ hợp từ E. coli với Polyethylenglycol (PEG)

  • Số trang: 143 |
  • Loại file: DOC |
  • Lượt xem: 117 |
  • Lượt tải: 3
tailieuonline

Đã đăng 27558 tài liệu

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN QUANG HUY KHẢO SÁT LÊN MEN, THU NHẬN, TINH CHẾ VÀ DUNG HỢP GRANULOCYTE COLONY STIMULATI FACTOR (G-CSF) TÁI TỔ HỢP TỪ E. COLI VỚI POLYETHYLENGLYCOL (PEG) Chuyên ngành: VI SINH Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. ĐẶNG THỊ PHƯƠNG THẢO Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2012 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến GS.TS Trần Linh Thước, người thầy đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em học tập và hoàn thành luận văn này. Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS. Đặng Thị Phương Thảo, người cô đã trực tiếp hướng dẫn khoa học, dạy bảo, giúp đỡ, quan tâm và động viên tinh thần những lúc em gặp khó khăn trong suốt quá trình nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn GS. Kaeko Kamei, Viện công nghệ Kyoto, Nhật Bản, đã luôn tạo mọi điều kiện để em có thể nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận văn Thạc sĩ một cách tốt nhất. Em xin chân thành cảm ơn chị Tú Anh, đã luôn nhiệt tình giúp đỡ em những lúc em gặp khó khăn trong công việc cũng như trong cuộc sống trong suốt thời gian em học tập ở Nhật. Chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn và các em phòng thí nghiệm CNSH Phân tử và Môi trường, phòng thí nghiệm Lên Men đã gợi mở và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm việc và nghiên cứu. Với lòng kính trọng và biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô giáo đã dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian học Đại học và sau Đại học. Và trên hết, con xin cảm ơn bố mẹ đã nuôi con khôn lớn, cho con nghị lực để vượt qua khó khăn. Cảm ơn các anh chị luôn yêu thương giúp đỡ em. Gia đình luôn là điểm tựa vững chắc cho con. TP. Hồ Chí Minh, ngày 03 tháng 09 năm 2012 Nguyễn Quang Huy MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ i DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH..........................................................................iii LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. NHÂN TỐ KÍCH THÍCH DÕNG BẠCH CẦU HẠT – GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR (G-CSF) ................................................... 3 1.1. Giới thiệu chung................................................................................................... 3 1.2. Cấu trúc và hình thái ............................................................................................ 3 1.3. Nguồn gốc và cơ chế hoạt động........................................................................... 5 1.3.1. Nguồn gốc .................................................................................................. 5 1.3.2. Cơ chế hoạt động ....................................................................................... 6 1.3.2.1. Sự tương tác của G-CSF với thụ thể ............................................... 6 1.3.2.2. Con đường tín hiệu có liên quan ..................................................... 8 1.4. Hoạt tính sinh học ................................................................................................ 9 2. PHƯƠNG PHÁP CHỮA BỆNH NEUTROPENIA BẰNG G-CSF................... 11 2.1. Bệnh Neutropenia .............................................................................................. 11 2.2. Chữa bệnh Neutropenia bằng G-CSF ................................................................ 12 2.3. Một số sản phẩm G-CSF thương mại ................................................................ 14 3. SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN G-CSF Ở ESCHERICHIA.COLI ........................... 16 3.1. G-CSF dạng thể vùi điển hình ........................................................................... 16 3.2. G-CSF dạng thể vùi non-classical (thể vùi không điển hình)............................ 18 4. SẢN XUẤT THỂ VÙI KHÔNG ĐIỂN HÌNH ..................................................... 22 4.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành thể vùi không điển hình G-CSF ................................................................................................................ 22 4.2. Đánh giá thể vùi không điển hình ...................................................................... 24 4.2.1. Phân tích phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) ................................ 24 4.2.2. Đánh giá khả năng hòa tan trong dung môi gây biến tính nhẹ ................ 25 4.2.3. Xác định đặc tính của thể vùi bằng kính hiển vi điện tử ......................... 25 4.2.4. Xác định xứ thay đổi thể tích thể vùi trong các điều kiện pH ................. 26 5. DUNG HỢP VÀ TINH CHẾ PROTEIN G-CSF................................................. 27 5.1. Dung hợp protein ............................................................................................... 27 5.2. Tinh chế protein ................................................................................................. 31 5.2.1. Sắc ký trao đổi ion ................................................................................... 31 5.2.2. Sắc ký lọc gel ........................................................................................... 34 5.2.3. Đánh giá hiệu quả của quá trình tinh chế................................................. 35 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 1. VẬT LIỆU ............................................................................................................... 36 1.1. Thiết bị - dụng cụ ............................................................................................... 36 1.2. Hóa chất ............................................................................................................. 37 1.2.1. Hóa chất dùng cho nuôi cấy vi sinh ......................................................... 37 1.2.2. Hóa chất dùng để phá tế bào .................................................................... 37 1.2.3. Hóa chất dùng cho điện di SDS-PAGE ................................................... 38 1.2.4. Hóa chất dùng trong điện di NATIVE-PAGE ......................................... 39 1.2.5. Hóa chất nhuộm bạc................................................................................. 39 1.2.6. Hóa chất lai Western ................................................................................ 39 1.2.7. Hóa chất dùng cho định lượng protein bằng phương pháp Bradford ...... 40 1.2.8. Hóa chất tinh chế bằng sắc ký trao đổi anion .......................................... 40 1.2.9. Hóa chất thử nghiệm hoạt tính G-CSF .................................................... 40 1.2.10.Hóa chất dùng trong sắc ký lỏng cao áp đảo pha (RP-HPLC) ................ 40 1.2.11.Hóa chất dùng trong dung hợp protein .................................................... 40 1.2.12.Hóa chất dùng trong phân tích phổ khối (mass spectrometry) ................ 41 1.3. Môi trường ......................................................................................................... 41 1.4. Nguyên vật liệu .................................................................................................. 42 1.4.1. Chủng vi sinh vật ..................................................................................... 42 1.4.2. Dòng tế bào M-NFS60 ............................................................................. 43 1.4.3. Các thang phân tử lượng dùng trong điện di và chuyển màng ................ 43 1.4.4. Các kháng thể sử dụng cho phương pháp lai Western............................. 43 1.4.5. Cột tinh chế .............................................................................................. 44 2. PHƯƠNG PHÁP .................................................................................................... 44 2.1. Cảm ứng biểu hiện hG-CSF dạng thể vùi không điển hình và khảo sát khả năng thu nhận hG-CSF có hoạt tính từ thể vùi không điển hình .............................. 44 2.1.1. Các bước chuẩn bị.................................................................................... 44 2.1.2. Lên men cảm ứng biểu hiện hG-CSF dạng thể vùi không điển hình và không điển hình................................................................................................... 46 2.1.3. Các phương pháp phân tích thể vùi thu được sau quá trình lên men....... 46 2.1.3.1. Phương pháp phá tế bào thu nhận thể vùi điển hình và không điển hình ....................................................................................................... 48 2.1.3.2. Phương pháp hòa tan thể vùi ........................................................ 48 2.1.3.3. Kiểm tra khả năng biểu hiện hG-CSF bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE .................................................................................................... 49 2.1.3.4. Xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford ............... 51 2.1.3.5. Xác nhận cấu hình tự nhiên của hG-CSF bằng kỹ thuật điện di NATIVE-PAGE và sắc ký lỏng cao áp đảo pha (RP-HPLC) ....................... 52 2.1.3.6. Đánh giá hoạt tính sinh học của hG-CSF bằng phương pháp thử hoạt tính trên tế bào invitro ..................................................................... 55 2.1.3.7. Đánh giá hiệu quả lên men thu nhận hG-CSF .............................. 57 2.2. Khảo sát khả năng hòa tan thể vùi không điển hình bằng N-lauroylsarcosine, Tween20 và DMSO .................................................................................................. 57 2.2.1. Đánh giá mức độ biểu hiện G-CSF bằng phần mềm Quantity One ........ 58 2.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình dung hợp G-CSF với chất cao 2.3.1. Khảo sát thời gian phản ứng .................................................................... 59 phân tử Polyethyleneglycol (PEG) được xúc tác bởi transglutaminase (TGase) ..... 58 2.3.1. Khảo sát thời gian phản ứng .................................................................... 59 2.3.2. Khảo sát dung dịch đệm và nồng độ TGase trong phản ứng dung hợp PEG vào G-CSF .................................................................................................. 59 2.3.3. Khảo sát nhiệt độ phản ứng dung hợp ..................................................... 59 2.4. Tinh sạch protein sau dung hợp bằng sắc ký trao đổi anion và sắc ký lọc gel .. 61 2.5. Xác định trọng lượng phân tử của protein dung hợp bằng MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption/ionization-Time Of Flight).................................. 64 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 1. CẢM ỨNG BIỂU HIỆN hG-CSF DẠNG THỂ VÙI KHÔNG ĐIỂN HÌNH VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THU NHẬN hG-CSF CÓ HOẠT TÍNH TỪ THỂ VÙI KHÔNG ĐIỂN HÌNH ................................................................................ 66 1.1. Phân tích sự biểu hiện G-CSF dạng thể vùi không điển hình bằng SDSPAGE và lai Western................................................................................................ 66 1.2. Thu nhận G-CSF có hoạt tính từ thể vùi không điển hình................................. 67 1.2.1. Hòa tan thể vùi trong N-lauroylsarcosine ................................................ 67 1.2.2. Phân tích cấu hình tự nhiên của G-CSF thu nhận được bằng NATIVEPAGE và RP-HPLC ............................................................................................ 69 1.2.3. Đánh giá hoạt tính sinh học ..................................................................... 72 2. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG HÕA TAN THỂ VÙI KHÔNG ĐIỂN HÌNH BẰNG N-LAUROYLSARCOSINE, TWEEN20 VÀ DMSO ................................... 73 2.1. Khảo sát khả năng hòa tan ................................................................................. 73 2.2. Khảo sát nồng độ dung dịch hòa tan Tween20 .................................................. 76 2.3. Khảo sát tỉ lệ hòa tan của Tween20 đối với thể vùi không điển hình................ 76 3. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH DUNG HỢP PROTEIN G-CSF VỚI PEG ĐƯỢC XÖC TÁC BỞI TGase .................................. 78 3.1. Khảo sát thời gian phản ứng dung hợp .............................................................. 78 3.2. Khảo dung dịch đệm và nồng độ TGase trong phản ứng dung hợp PEG vào 3.3. Khảo sát nhiệt độ phản ứng dung hợp ............................................................... 81 G-CSF ....................................................................................................................... 79 3.3. Khảo sát nhiệt độ phản ứng dung hợp ............................................................... 81 4. TINH SẠCH PROTEIN SAU QUÁ TRÌNH DUNG HỢP BẰNG SẮC KÝ TRAO ĐỔI ANION VÀ SẮC LÝ LỌC GEL............................................................ 82 4.1. Sắc ký trao đổi anion.......................................................................................... 83 4.2. Sắc ký lọc gel ..................................................................................................... 84 5. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ CỦA PROTEIN SAU DUNG HỢP BẰNG MALDI-TOF .......................................................................................... 86 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN .............................................................................................................. 89 2. ĐỀ NGHỊ.................................................................................................................. 90 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .................................................. 91 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 92 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 96 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Amp Ampicilline ANC Asolube neutrophil count ATCC American Type Culture Collection bp base pair CHO Chinese hamster ovary CRH Cytokine receptor homologous CSF Colony stimulating factor DMSO DiMethylSulfOxide DNA Deoxyribose nucleic acid E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine TetraAcetic acid FDA Food And Drug Administration G-CSF Granulocyte colony stimulating factor g-csf Gen mã hoá cho protein hG-CSF G-CSFR Thụ thể của protein hG-CSF (hG-CSF receptor) G-MCSF Granulocyte macrophage colony stimulating factor IBs Inclusion Bodies IL-1 Interleukine-1 kDa kilo Dalton LB Môi trường Luria-Bertani MCS Multiple Cloning Site ncIBs non-classical Inclusion Bodies OD Optical Density PBST Phosphate Buffered Saline Tween PEG PolyEthylenGlycol RNA Ribose nucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulphate i TGase TransGlutaminase ii DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. So sánh ưu nhược điểm của mỗi phương pháp sản xuất protein ở E.coli ... 16 Bảng 1.2. So sánh ưu điểm và nhược điểm giữa việc sản xuất protein tái tổ hợp ở dạng thể vùi điển hình và thể vùi không điển hình ...................................................... 21 Bảng 2.1. Môi trường lên men chủng E. coli BL21(DE3)/pET-G-CSF (TV) ............ 42 Bảng 2.2. Thí nghiệm đo Bradford với dung dịch chuẩn Albumin ............................. 51 Bảng 2.3. Chương trình chạy RP-HPLC phân tích mẫu hG-CSF ............................... 55 Bảng 3.1. So sánh kết quả hòa tan giữa thể vùi không điển hình và điển hình ........... 68 Bảng 3.2. Hoạt tính của protein trong dịch hòa tan thể vùi điển hình và không điển hình ............................................................................................................................... 77 Bảng 3.3. Hiệu suất tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion và lọc gel .... 85 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc gen g-csf, mRNA và protein G-CSF ............................................... 4 Hình 1.2. Cấu trúc mô hình bó xoắn 4 chuỗi của G-CSF.............................................. 5 Hình 1.3. Sự điều hòa sản xuất G-CSF ......................................................................... 6 Hình 1.4. Cấu trúc thụ thể G-CSF ................................................................................. 7 Hình 1.5. Cấu trúc phức hợp tương tác giữa G-CSF và G-CSFR ................................. 8 Hình 1.6. Con đường tín hiệu trong tế bào khi G-CSF gắn với G-CSFR ..................... 9 Hình 1.7. Sự hoạt động và biệt hóa tế bào máu do G-CSF và các cytokine khác....... 11 Hình 1.8. Một số sản phẩm hG-CSF thương mại ........................................................ 14 Hình 1.9. Mô hình hấp dẫn giải thích sự hình thành của thể vùi ................................ 18 Hình 1.10. Các công đoạn chính của quá trình thu nhận G-CSF từ thể vùi điển hình và không điển hình sau quá trình sản xuất ở E. coli .................................................... 20 3 Hình 1.11. Phổ hồng ngoại (IR) ở các vùng Amit I và Amit II của G-CSF ở dạng dung dịch, dạng tủa và dạng thể vùi............................................................................. 24 Hình 1.12. Ảnh cắt dọc của tế bào E. coli dưới kính hiển vi điện tử truyền suốt ....... 26 Hình 1.13. Thể vùi không điển hình của G-CSF dưới kính hiển vi điện tử quét ........ 26 Hình 1.14. Sự giảm thể tích cặn thể vùi khi thay đổi pH môi trường từ 7 xuống 4 .... 27 Hình 1.15. Quá trình dung hợp PEG với phân tử G-CSF tại đầu N-terminal ............ 29 Hình 1.16. Quá trình dung hợp PEG với phân tử G-CSF tại nhóm acyl thuộc Glutamine tại vị trí 133 trên phân tử GCSF ................................................................ 31 Hình 1.17. Nguyên tắc sắc kí trao đổi anion ............................................................... 33 Hình 1.18. Nguyên tắc sắc kí trao đổi cation ............................................................. 33 Hình 1.19. Nguyên tắc sắc kí lọc gel........................................................................... 34 Hình 2.1. Các vị trí lắp đặt thiết bị trên bình lên men ................................................. 45 Hình 2.2. Hệ thống thiết bị lên men ............................................................................ 46 Hình 2.3. Sơ đồ các bước đánh giá khả năng thu nhận G-CSF từ hai dạng thể vùi điển hình và không điển hình ....................................................................................... 47 Hình 2.4. Phương pháp điện di SDS-PAGE................................................................ 50 Hình 2.5. Phản ứng cho màu Coomassie..................................................................... 51 Hình 2.6. Đồ thị miêu tả đường chuẩn Bradford......................................................... 52 Hình 2.7. Sơ đồ đánh giá lượng G-CSF qua các bước xử lý sau lên men................... 57 Hình 3.1. Xác nhận sự biểu hiện protein G-CSF ở dạng thể vùi không điển hình bằng điện di SDS PAGE và lai Western ...................................................................... 66 Hình 3.2. Khả năng hòa tan của protein nằm trong thể vùi điển hình và thể vùi không điển hình ............................................................................................................ 68 Hình 3.3. So sánh khả năng hòa tan giữa thể vùi điển hình và không điển hình ........ 69 Hình 3.4. So sánh cấu hình tự nhiên của G-CSF so với mẫu neupogen chuẩn bằng điện di NATIVE PAGE ............................................................................................... 70 Hình 3.5. Kiểm tra cấu hình tự nhiên của protein nằm trong dịch hòa tan bằng RPHPLC............................................................................................................................ 71 4 Hình 3.6. Lượng G-CSF có hoạt tính trong dịch hòa tan từ thể vùi điển hình và thể vùi không điển hình...................................................................................................... 72 Hình 3.7A. Định tính khả năng hòa tan thể vùi không điển hình bằng N-lauroylsarcosine, DMSO và Tween20 ..................................................................... 74 Hình 3.7B. Lượng G-CSF trên 1g thể vùi không điển hình ........................................ 75 Hình 3.8. Lượng G-CSF hòa tan được tính trên 10mg thể vùi không điển hình với tỉ lệ hòa tan 1g thể vùi : 40ml dung dịch hòa tan ............................................................ 76 Hình 3.9. Đồ thị biểu thị lượng G-CSF sau hòa tan tính trên 10mg thể vùi không điển hình với các tỉ lệ hòa tan khác nhau ..................................................................... 77 Hình 3.10. Kết quả dung hợp G-CSF với PEG5kDa ở các khoảng thời gian khác nhau .............................................................................................................................. 78 Hình 3.11. Kết quả dung hợp PEG5kDa với G-CSF ở hai hệ đệm nước miliQ và phosphate buffer ........................................................................................................... 80 Hình 3.12. Kết quả khảo sát nhiệt độ tối ưu cho enzyme TGase hoạt động ............... 81 Hình 3.13. Kết quả tinh sạch sản phẩm sau dung hợp bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion ....................................................................................................................... 83 Hình 3.14. Kết quả điện di SDS-PAGE sản phẩm tinh chế bằng phương pháp sắc ký lọc gel ...................................................................................................................... 85 Hình 3.15. Kết quả phân tích phổ khối sản phẩm sau dung hợp bằng MALDI-TOF . 87 5 Luận văn Thạc sĩ Sinh học LỜI MỞ ĐẦU Ung thư là căn bệnh có nguy cơ toàn cầu vì mức độ lan rộng cũng như tỉ lệ gia tăng số người mắc bệnh ngày càng cao. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) số người tử vong vì ung thư vào năm 2008 là 7,6 triệu, chiếm 13% trong tổng số ca tử vong. Ở Việt Nam, ung thư là một vấn đề được toàn xã hội quan tâm vì mức độ gia tăng nhanh chóng cũng như nhiều hạn chế trong điều trị. Với chức năng kích thích sự biệt hóa, tăng sinh, trưởng thành và chức năng của các tế bào bạch cầu trung tính trong vùng máu ngoại vi chống lại sự nhiễm khuẩn và các rủi ro khác khi điều trị ung thư, G-CSF đã được quan tâm sản xuất trong nhiều hệ thống biểu hiện khác nhau như vi khuẩn, nấm men, tế bào động vật... Trong đó, G-CSF tái tổ hợp đươc biểu hiện trong hệ thống vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) được sử dụng rộng rãi do có ưu điểm nuôi cấy đơn giản, chi phí sản xuất thấp, và năng suất cao, tuy nhiên, protein thu nhận được thường ở dạng thể vùi, và không có hoạt tính sinh học. Gần đây, Spela Petenel và cộng sự đã khám phá ra một dạng mới của thể vùi khi biểu hiện vượt mức trong tế bào E.coli, bên trong lớp thể vùi có cấu trúc gấp cuộn sai là các tiền chất gấp cuộn đúng, dễ dàng hoà tan trong dung dịch chất biến tính nhẹ, và đặc biệt là có hoạt tính sinh học sau khi hoà tan, được nhóm tác giả này gọi là thể vùi không điển hình (non classical inclusion body). Năm 1991, sản phẩm G-CSF tái tổ hợp đầu tiên được thương mại hóa có tên Neupogen, do công ty Amgen - Hoa Kỳ sản xuất, với giá thành một lọ tiêm 300µg/ml khoảng 1,7 triệu đồng. Do mức độ đào thải Neupogen ra khỏi cơ thể bởi các protease cũng như là khả năng gây đáp ứng miễn dịch trong tế bào khá cao, nên người bệnh cần phải được tiêm nhắc mỗi ngày trong suốt quá trình điều trị ung thư. Một lần nữa công ty Amgen đã đi đầu trong nghiên cứu khắc phục nhược điểm của Neupogen bằng cách tiến hành dung hợp G-CSF với chất cao phân tử Polyethylenglycol (PEG) và đã dung hợp thành công G-CSF với NH2-PEG20kDa 1 Luận văn Thạc sĩ Sinh học tại vị trí đầu N của protein, Năm 2002, cơ quan quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa kỳ đã phê duyệt và đồng ý cho sản phẩm dung hợp này, có tên thương mại là Neulasta, được sử dụng thay thế cho các protein G-CSF tái tổ hợp đơn thuần, giúp cho quá trình điều trị ung thư dễ dàng và chi phí cũng thấp hơn. Việc nhập khẩu các sản phẩm G-CSF cũng như PEG-G-CSF từ nước ngoài để điều trị cho các bệnh nhân đã làm cho chi phí điều trị tăng lên khá cao và không phù hợp với phổ rộng người bệnh nước ta. Do đó, việc nghiên cứu các qui trình công nghệ để sản xuất protein G-CSF tái tổ hợp dung hợp với chất cao phân tử PEG nhằm đáp ứng nhu cầu trong nước, giúp giảm chi phí điều trị, phù hợp với thu nhập của đại bộ phận bệnh nhân nước ta là một yêu cầu cấp thiết. Với mục tiêu như trên, chúng tôi thực hiện đề tài thạc sỹ: “Khảo sát lên men, thua nhận, tinh chế và dung hợp Grannlocyte colony stimulati factor (G-CSF) tái tổ hợp từ E. coli với Polyethylenglycol (PEG)” với các nội dung chính như sau: – Cảm ứng biểu hiện hG-CSF dạng thể vùi không điển hình – Khảo sát khả năng thu nhận hG-CSF có hoạt tính từ thể vùi không điển hình – Khảo sát khả năng hoà tan thể vùi không điển hình bằng N-lauroylsarcosine, Tween20 và DMSO – Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình dung hợp hG-CSF với chất cao phân tử Polyethyleneglycol (PEG) bằng enzyme transglutaminase (TGase) – Tinh sạch protein sau quá trình dung hợp – Phân tích trọng lượng phân tử của protein dung hợp sau tinh chế bằng phương pháp phổ khối (mass spectrometry) 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. NHÂN TỐ KÍCH THÍCH DÕNG BẠCH CẦU HẠT – GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR (G-CSF) 1.1. Giới thiệu chung G-CSF là một loại cytokine có bản chất là glycoprotein, đóng vai trò kích thích sự tăng sinh, biệt hóa và quy định chức năng của những tế bào tiền thân của bạch cầu trung tính (neutrophil) hay chính sự trưởng thành của bạch cầu trung tính [30] G-CSF chuột lần đầu tiên được nhận diện và tinh chế tại Úc vào năm 1983. Đến năm 1986, G-CSF người chính thức được tạo dòng phân tử bởi Nigata và cộng sự, họ sử dụng mẫu dò oligonucleotide để thu nhận cDNA mong muốn bằng lai Southern Blot [9]. Từ đó mở ra một thời kì sản xuất G-CSF tái tổ hợp số lượng lớn trên vi sinh thông qua kĩ thuật tái tổ hợp DNA. 1.2. Cấu trúc và hình thái Gen g-csf mã hóa cho G-CSF ở người nằm trên nhiễm sắc thể số 17, tại vị trí q11-12, dài khoảng 2.5Kb, có 5 exon và 4 intron. Trong đó, vùng 300bp ở đầu 5’ của sự phiên mã đóng vai trò kiểm soát sự biểu hiện gen g-csf. Ngoài ra, với sự hiện diện của đoạn trình tự giàu AU trong vùng 3’ không mã hóa lại là vị trí cốt yếu làm mất ổn định mRNA g-csf và ảnh hưởng đến mức độ phiên mã và hậu phiên mã mRNA của g-csf. (Hình 1.1) [9] Gen g-csf mã hoá cho hai mRNA khác nhau, tùy thuộc vị trí cắt bỏ intron thứ hai trong quá trình splicing mRNA. Hai mRNA này mã hoá cho hai protein tiền GCSF (preG-CSF) chứa 204 và 207 axít amin. Sau khi được dịch mã, preG-CSF được vận chuyển qua mạng lưới nội chất nhám để được tiết ra khỏi tế bào. Trong quá trình này, đầu N chứa trình tự tín hiệu tiết 30 axít amin bị cắt bỏ để tạo nên hai phân tử GCSF có hoạt tính chứa 174 và 177 axít amin. Trong đó, dạng hoạt động gồm 174 axít amin có hoạt tính cao và được sử dụng nhiều làm protein dược phẩm. [30] Hình 1.1. Cấu trúc gen g-csf, mRNA và protein G-CSF Cấu trúc G-CSF người (hG-CSF) được xác định qua phân tích cấu trúc tinh thể tia X và phổ hạt nhân [9]. hG-CSF trưởng thành bao gồm 174 axít amin và trọng lượng phân tử khoảng 18,7kDa. Phân tử hG-CSF được O-glycosyl hóa ở threonine vị trí thứ 133, đặc điểm này giúp phân tử hG-CSF tránh được sự kết tụ protein và giúp làm tăng tính bền đối với nhiệt độ và pH. Phân tử hG-CSF tái tổ hợp được sản xuất ở E. coli mặc dù không có nhóm O-glycosyl hóa nhưng vẫn đảm bảo hoạt tính, do nhóm này không ảnh hưởng đến tương tác của hG-CSF với thụ thể. Trong phân tử có năm cystein, bốn cystein tạo thành hai cầu nối disulfide là Cys36-Cys42 và Cys64-Cys74, nhờ hai cầu nối này hG-CSF mới có hoạt tính. Cys thứ 17 còn lại ở dạng tự do, có nhiều nghiên cứu cho thấy nó có liên quan đến sự kết tụ của protein hG-CSF. Thêm vào đó, hai đoạn aa ngắn từ vị trí axít amin 44-47 (310) và 48-53 (α) giúp duy trì sự ổn định cấu trúc G-CSF trong không gian. (Hình 1.2) [16] Hình 1.2. Cấu trúc mô hình bó xoắn 4 chuỗi của G-CSF 1.3. Nguồn gốc và cơ chế hoạt động 1.3.1. Nguồn gốc G-CSF cũng như các loại nhân tố tăng trưởng (HGF) khác, được sản xuất ở nhiều loại tế bào và mô khác nhau. G-CSF được sản sinh từ các nguyên bào sợi, các đại thực bào và những tế bào nội mô (Hình 1.3) qua trung gian là các cytokine (interleukine-1, interleukine-6 và nhân tố hoại tử khối u α (TNFα)) bằng con đường tín hiệu thông tin thứ hai (second-messenger). Sau khi được tạo ra, G-CSF lập tức làm nhiệm vụ biệt hóa giúp cho sự trưởng thành của bạch cầu trung tính từ những tế bào gốc tủy xương đồng thời kích thích đưa chúng vào hệ máu ngoại vi để thực hiện chức năng sinh học [5].
- Xem thêm -