Khảo sát khả năng vi khuẩn lactic kháng vi khuẩn aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus)

  • Số trang: 43 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 12 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THANH SANG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG VI KHUẨN LACTIC KHÁNG VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2013 1 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN THANH SANG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG VI KHUẨN LACTIC KHÁNG VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN Ts. TỪ THANH DUNG 2013 2 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy (cô) giảng viên của Bộ môn Bệnh Học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian làm luận văn. Với lòng kính trọng và biết ơn, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới cô Từ Thanh Dung đã khuyến khích, chỉ dẫn tận tình cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này. Xin chân thành cảm ơn các anh (chị) khóa 34, 35 đã chia sẽ thông tin kinh nghiệm, hỗ trợ rất nhiều cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc đến gia đình tôi và những người bạn Bệnh Học Thủy Sản 36 đã động viên và giúp đỡ tôi rất nhiều trong khi thực hiện đề tài này. Xin chân thành cảm ơn! Trần Thanh Sang i LỜI CAM KẾT Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác. Luận văn đã được chỉnh sửa theo sự góp ý của Hội đồng. Cần Thơ, ngày 17, tháng 12, năm 2013 Cán bộ hướng dẫn Sinh viên thực hiện Từ Thanh Dung Trần Thanh Sang ii TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện nhằm khảo sát khả năng ức chế Aeromonas hydrophila của các dòng vi khuẩn lactic từ 2 nguồn: dạ dày, ruột cá trê phi (hệ vi sinh đường ruột) và dưa cải muối chua (sản phẩm lên men). Các chủng vi khuẩn thu được sẽ được kiểm tra khả năng phân giải CaCO3 trên môi trường MRS agar có bổ sung 1,5% CaCO3 , kiểm tra các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa cơ bản nhằm nhận dạng các chủng vi khuẩn lactic. Thí nghiệm xác định khả năng đối kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch giúp chọn lọc những chủng vi khuẩn lactic kháng mạnh. Qua đó, làm cơ sở cho các ứng dụng liên quan đến sản xuất các sản phẩm vi sinh. Kết quả có 27 chủng vi khuẩn lactic có khả năng kháng Aeromonas hydrophila với đường kính vòng vô khuẩn khác nhau trên môi trường TSA. Trong đó, có 6 chủng vi khuẩn ức chế mạnh (đường kính vòng vô khuẩn > 10mm), 16 chủng có khả năng ức chế ở mức trung bình (đường kính vòng vô khuẩn từ 5 đến 10mm) và 5 chủng ức chế mức độ yếu (đường kính vòng vô khuẩn < 5mm). Bên cạnh đó, chủng vi khuẩn DC322 được đánh giá là kháng Aeromonas hydrophila mạnh nhất (có đường kính vòng vô khuẩn = 17mm) trong tất cả các mẫu thu và cũng là chủng vi khuẩn được chọn để giải trình tự định danh tại công ty TNHH TM & DV Nam Khoa. Kết quả định danh chủng vi khuẩn DC322 đồng hình 99% với Lactobacillus plantarum P-8 (giải trình tự gen 16S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH). Vì vậy, chủng vi khuẩn DC322 thích hợp cho các nghiên cứu ứng dụng liên quan đến sản phẩm vi sinh. iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn .......................................................................................................... i Lời cam kết ........................................................................................................ ii Tóm tắt .............................................................................................................. iii Danh sách bảng ................................................................................................. vi Danh sách hình................................................................................................. vii Danh sách từ viết tắt ....................................................................................... viii Chương 1: Đặt vấn đề ........................................................................................ 1 1.1 Giới thiệu ................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu đề tài ......................................................................................... 2 1.3 Nội dung đề tài ........................................................................................ 2 Chương 2: Lược khảo tài liệu ............................................................................ 3 2.1 Tình hình nuôi trồng và quản lý dịch bệnh thủy sản ................................ 3 2.2 Tổng quan nghiên cứu về bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila trong nước và trên thế giới ............................................................................. 3 2.3 Tổng quan về vi khuẩn A. hydrophila ...................................................... 4 2.3.1 Đặc điểm về phân loại và hình thái ................................................... 4 2.3.2 Đặc điểm sinh hóa ............................................................................. 4 2.3.3 Khả năng gây bệnh ............................................................................ 5 2.3.4 Khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn A. hydrophila ....... 5 2.4 Tổng quan về probiotic và vi khuẩn lactic .............................................. 6 2.4.1 Sơ lược về probiotic ......................................................................... 6 2.4.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic ............................................................ 8 2.4.3 Phân loại vi khuẩn lactic ................................................................... 8 2.4.4 Ứng dụng vi khuẩn lactic trong quá trình lên men. ........................ 10 2.4.5 Một số nghiên cứu về vi khuẩn lactic. ............................................ 12 2.5 Định danh vi khuẩn ................................................................................ 14 Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ............................................. 16 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................... 16 3.2 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 16 iv 3.3 Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 17 3.3.1 Phương pháp thu mẫu, phân lập vi khuẩn lactic các sản phẩm lên men. ........................................................................................................... 17 3.3.2 Phương pháp xác định một số đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của vi khuẩn ............................................................................................. 17 3.3.3 Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn A.hydrophila của các dòng vi khuẩn lactic .................................................................................. 17 3.3.4 Định danh chủng vi khuẩn có khả năng ức chế A.hydrophila mạnh nhất ............................................................................................................ 18 3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu .............................................................. 18 Chương 4: Kết quả và thảo luận ...................................................................... 19 4.1 Phân lập vi khuẩn lactic từ ruột cá và sản phẩm lên men ...................... 19 4.1.1 Đặc điểm hình thái và khả năng phân giải CaCO3 của các chủng phân lập ..................................................................................................... 19 4.1.2 Đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập ..................... 20 4.2 Xác định và chọn lọc những chủng vi khuẩn lactic có tính kháng khuẩn cao................................................................................................................. 21 4.3 Kết quả định danh chủng vi khuẩn DC322 ........................................... 23 Chương 5: Kết luận và đề xuất ........................................................................ 24 5.1 Kết luận .................................................................................................. 24 5.2 Đề xuất.................................................................................................... 24 Tài liệu tham khảo ........................................................................................... 25 Phụ lục A ......................................................................................................... 28 Phụ lục B .......................................................................................................... 29 Phụ lục C .......................................................................................................... 31 Phụ lục D ......................................................................................................... 32 Phụ lục E .......................................................................................................... 33 v DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1: Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn A. hydrophila ............................... 5 Bảng 2.2: Các sản phẩm trao đổi chất có tính kháng khuẩn tạo ra bởi LAB (lactic acid bacteria) ................................................................................ 11 Bảng 4.1: Kết quả giải trình tự gen 16s của chủng vi khuẩn DC322 ............. 23 Bảng PLA: Thành phần môi trường MRS (DeMan, Rogosa & Sharpe, 1960) ................................................................................................................ 29 Bảng PLC: Đặc tính khuẩn lạc của các dòng phân lập sau 48 giờ trên môi trường MRS agar ............................................................................................. 32 Bảng PLD: Đặc điểm hình thái các dòng vi khuẩn lactic được phân lập ........ 33 Bảng PLE: Kết quả khả năng đối kháng của các dòng phân lập với A. hydrophia..................................................................................................... 34 vi DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Vi khuẩn A. hydrophila có một tiêm mao. Ảnh kính hiển vi điện tử (theo Bùi Quang Tề, 1998) ................................................................................ 4 Hình 4.1: Khuẩn lạc và khả năng phân giải CaCO3 của các chủng phân lập trên MRS agar bổ sung 1,5% CaCO3 ...................................................................... 19 Hình 4.2: Thử nghiệm catalase và oxidase dòng vi khuẩn phân lập ............... 20 Hình 4.3: a. Chủng vi khuẩn DC322 Gram dương (+), hình que dài .............. 21 b. Chủng vi khuẩn DC12 Gram dương (+), hình que ngắn ............. 21 Hình 4.4: Khả năng ức chế vi khuẩn A. hydrophila từ các chủng vi khuẩn lactic ................................................................................................................ 22 Hình 4.5: Khả năng ức chế vi khuẩn A. hydrophila của vi khuẩn DC322 và DC11 khi so sánh với kháng sinh DO (Doxycyline) ....................................... 23 vii DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT A. hydrophila ĐKVVK ĐBSCL LAB CFU DC TSA RS RG RT MRS Aeromonas hydrophila Đường kính vòng vô khuẩn Đồng Bằng Sông Cửu Long Lactic Acid Bacteria Conlony Forming Unit Dưa cải Trypic Soy Agar Ruột sau Ruột giữa Ruột trước Man, Rogosa and Sharpes viii CHƢƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Trong nhiều năm qua, thủy sản luôn là một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực của Việt Nam ra thị trường thế giới. Tuy nhiên, năm 2012 xuất khẩu ngành hàng này chỉ chiếm tỷ trọng 5,3% trong tổng kim ngạch xuất khẩu tất cả các mặt hàng của cả nước, xuất khẩu thủy sản giảm 0,4% so với 2011. Riêng xuất khẩu cá Tra trong 6 tháng đầu năm 2013 giảm gần 7% so với cùng kì, kim ngạch ước đạt khoảng 682 triệu USD (http://www.customs.gov.vn). Sự suy giảm ở các thị trường trọng điểm như thị trường Châu Âu (EU) và một số quốc gia từng là nhập khẩu chủ lực như Tây Ban Nha, Hà Lan, Đức dẫn đến việc thu mua không tốt, giá cá tra nguyên liệu không tăng nên chưa giải quyết được khó khăn cho người nuôi. Một trong những giải pháp trước mắt là nâng cao chất lượng của cá tra nguyên liệu, cải thiện kỹ thuật nuôi trồng, quản lý dịch bệnh thủy sản nay cần được chú trọng nhiều hơn. Ngoài bệnh mủ gan do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây thiệt hại lớn cho người nuôi cá tra thâm canh ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long thì bệnh xuất huyết hay còn gọi là bệnh đốm đỏ, đỏ mỏ, đỏ kỳ mà tác nhân gây bệnh là vi khuẩn Aeromonas hydrophila thì có tần số xuất hiện cao trên cá tra. Theo một số nghiên cứu gần đây thì bệnh do vi khuẩn này hiện hầu như quanh năm, phổ biến nhất là giao mùa, lúc bị sốc do đánh bắt, vận chuyển, ao nuôi có hàm lượng khí nitrite và ammonia cao, oxy hòa tan thấp. Bệnh có thể xuất hiện ở tất cả giai đoạn phát triển của cá nuôi (Dung et al., 2005) Hiện nay, biện pháp điều trị đang phổ biến và hiệu quả nhất vẫn là sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên, nhiều kết luận cho rằng trong vài năm gần đây hiện tượng kháng thuốc, đa kháng thuốc trên vi khuẩn này là rất phổ biến (Hương et al., 2011), do việc sử dụng thuốc bừa bãi, không theo chỉ định liều lượng, thời gian điều trị bệnh thường thấp hoặc đa phần sử dụng thuốc kháng sinh để phòng bệnh. Vì thế, thách thức trong việc phòng trị bệnh này là dần sẽ không còn thuốc kháng sinh có hiệu quả cao và cần một giải pháp mới trong điều trị. Do đó, một số nghiên cứu thực hiện gần đây cho rằng vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn kháng lại một số vi khuẩn gây bệnh (Dhanasekaran et al., 2010; Dung et al., 2011; Abimbola et al., 2011) đặc biệt chúng có khả năng ức chế với vi khuẩn Aeromonas hydrophila (Nguyễn Ngọc Trai, 2011; Nguyễn Văn Thành và Nguyễn Ngọc Trai, 2012; Mohammed et 1 al., 2012). Tuy nhiên, hầu hết việc nghiên cứu và ứng dụng vẫn còn rất hạn chế. Vì vậy đề tài “Khảo sát khả năng vi khuẩn lactic kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá Tra” được thực hiện nhằm đánh giá khả năng kháng vi khuẩn A. hydrophila của vi khuẩn lactic giúp tìm hiểu thêm khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic, làm cơ sở cho việc ứng dụng tạo ra các sản phẩm chế phẩm sinh học hiện nay. 1.2 Mục tiêu đề tài Chọn lọc những dòng vi khuẩn lactic có khả năng kháng mạnh đối với vi khuẩn gây bệnh Aeromonas hydrophila, nhằm làm cơ sở cho các ứng dụng trong sản xuất các chế phẩm sinh học liên quan đến vi khuẩn lactic để phòng bệnh xuất huyết do vi khuẩn này gây ra trên cá tra nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long. 1.3 Nội dung đề tài Phân lập vi khuẩn lactic từ dạ dày, ruột cá trê phi và dưa cải muối chua Tuyển chọn vi khuẩn lactic thông qua thí nghiê ̣m đánh giá khả năng đối kháng khuẩn Aerommonas hydrophila Định danh chủng vi khuẩn có khả năng ức chế Aeromonas hydrophila mạnh nhất. 2 CHƢƠNG 2 LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi trồng và quản lý dịch bệnh thủy sản Theo Tổng cục Thủy Sản, tổng sản lượng thủy sản 7 tháng đầu năm 2013 ước đạt 567 nghìn tấn, tăng 10,19% so với cùng kỳ năm trước, riêng sản lượng nuôi trồng đạt 354 nghìn tấn, tăng 14,35% so với cùng kỳ năm trước. Trong khi đó, nghề nuôi cá tra vẫn còn nhiều khó khăn. Đến hết tháng 7, ước diện tích thả nuôi ước đạt hơn 3.500 ha. Diện tích thả nuôi mới chủ yếu là từ các doanh nghiệp. Trong bối cảnh khó khăn, hộ nuôi cá thể gần như không thả nuôi mới. Tổng sản lượng thu hoạch 7 tháng đầu năm 2013 ước đạt 620 nghìn tấn. Theo báo cáo của Cục Thú y, 10 tháng đầu năm 2013, các loại dịch bệnh trên cá tra đã xảy ra phức tạp và tăng cao hơn: Gan thận mủ (chiếm khoảng 48%), xuất huyết (khoảng 32%), ký sinh trùng (khoảng 4%) và một số bệnh khác. Dịch bệnh xuất hiện quanh năm, nhưng bị nặng nhất vào giai đoạn từ tháng 12-2 và tháng 6-8. Tình hình xuất hiện bệnh ngày càng khó quản lý do hầu hết các hộ nuôi với hình thức nhỏ lẻ, chưa liên kết được hoạt động sản xuất và tiêu thụ sản phẩm. Mặt khác, việc sử dụng các loại thuốc cấm và thuốc trên người vẫn đang hoạt động mạnh mẽ, chưa có biện pháp ngăn chặn. 2.2 Tổng quan nghiên cứu về bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila trong nƣớc và trên thế giới Bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila được nghiên cứu đầu tiên bởi Scaperclous, 1930, trích dẫn bởi: Aoki, 1999. Thập niên 1960, bệnh do vi khuẩn này đã được tập trung nghiên cứu. Loài vi khuẩn này đã được biết đến là nguyên nhân gây bệnh xuất huyết trên cá chình (Anguilla anguilla) và cá chép (Cyprinus carpio) ở nhiều nước trên thế giới (Aoki, 1999). Ở Châu Âu, bệnh vi khuẩn A. hydrophila trên cá chình thường xuất hiện vào mùa xuân-hè, nhiệt độ nước khoảng 17-22°C, khoảng nhiệt độ này cũng được cho là khoảng nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển. Bệnh rất phổ biến kể cả các nước nhiệt đới và ôn đới như: Liên Xô, Đức, Tiệp Khắc, Ba Lan, Hungari, Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam,…Bệnh thường phát sinh và phát triển từ cuối xuân đến đầu thu (Dung et al., 2005) Ở Việt Nam, bệnh gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá tra tại ĐBSCL bệnh thường xảy ra quanh năm, nhưng nặng nhất xảy ra vào lúc giao mùa giữa mùa khô và mùa mưa (Dung et al., 2005). Mô ̣t số nghiên cứu đã ghi nhâ ̣n bê ̣nh xảy 3 ra nhiề u nhấ t vào tháng 6, 7 khi lươ ̣ng mưa gia tăng . Ngươ ̣c la ̣i nh ững tháng mùa khô (tháng 1-4) dịch bệnh này trên cá tra ít xảy ra . Tần số xuất hiện bệnh xuất huyết do vi khuẩ n A. hydrophila trên cá tra nuôi ở ĐBSCL rất phổ biến và thành dịch bệnh ở một số địa phương. Tại các tỉnh An Giang, Cần Thơ qua khảo sát cho thấy có đến 100% ao nuôi bị nhiễm bệnh xuất huyết gây ra tỷ lệ hao hụt từ 60-70% nếu không được điều trị kịp thời (Nguyễn Chính, 2005). Tuy nhiên, các tỉnh Trà Vinh, Bến Tre thì tỷ lệ nhiễm này chỉ khoảng 70% (Trần Duy Phương, 2009). Điều này cho thấy khả năng gây bệnh của loài vi khuẩn này có sự khác nhau giữa những vùng địa lý khác nhau, nên gây khó khăn cho người nuôi trong công tác phòng trị bệnh này. 2.3 Tổng quan về vi khuẩn A. hydrophila 2.3.1 Đặc điểm về phân loại và hình thái Về hình thái Aeromonas hydrophila là trực trùng hình que ngắn, chiều dài 23µm, hai đầu hơi tròn, đầu có 1 tiêm mao, không có nha bào, không có giác mạc, di động, Gram âm (G-). Nuôi cấy chúng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 28300C. Sinh trưởng trong môi trường có độ pH thích hợp 7,1-7,2. Trong môi trường dinh dưỡng sau 24 giờ phát triển làm đục môi trường, trên mặt có một lớp váng mỏng, nhớt, vài ngày sau màng này chìm xuống. Trên môi trường thạch, khuẩn lạc tròn, rìa đều hơi lồi, ướt, nhẵn bóng, màu vàng rất nhạt (Dung et al., 2005). Hình 2.1: Vi khuẩn A. hydrophila có một tiêm mao. Ảnh kính hiển vi điện tử (theo Bùi Quang Tề, 1998). 2.3.2 Đặc điểm sinh hóa Là vi khuẩn kị khí không bắt buộc, lên men đường. Catalase, oxidase dương tính. Vi khuẩ n A. hydrophila dương tính với O/F, nitrate dương tính, không thể phát triển trong môi trường chứa 6,5% NaCl và kháng tự nhiên với ampicillin, (MacInnes et al., 1979; Inglis, 1999; Noga, 2010). Vi khuẩn này rất khó tiêu 4 diệt bởi nó thuộc nhóm vi khuẩn có sức chịu đựng cao. Vi khuẩn A. hydrophila có khả năng kháng lại chlorine và sự đông lạnh hay nhiệt độ lạnh Bảng 2.1: Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn A. hydrophila Đặc điểm Di động (<= 25°C) Phát triển 25°C 35°C Catalase Oxidase Voges-Proskauer Indole Salicin A. hydrophila + + + + + + Đặc điểm Nitrate Glucose Sucrose Ornithine Adonitol Maltose Urease H2 S Histidine & Arginine A. hydrophila + + + + + 2.3.3 Khả năng gây bệnh Vi khuẩn A. hydrophila được biết như là một vi khuẩn gây bệnh cơ hội, có nghĩa là chúng chỉ gây bệnh khi phản ứng miễn dịch của ký chủ suy yếu. Theo tác giả Aoki (1999) vi khuẩn A. hydrophila phân bố rộng khắp trong ruột cá nuôi, trong nước và bùn của ao nuôi nước ngọt nơi có nhiều vật chất hữu cơ. Những chủng có độc lực trong môi trường là nguồn bệnh. Bệnh thường bộc phát khi điều kiện môi trường thay đổi. Tình trạng sốc do mật độ cao, nhiệt độ cao bất ngờ, đánh bắt, vận chuyển cá, hàm lượng oxy thấp, nghèo dinh dưỡng, sự xâm nhiễm của nấm và ký sinh trùng góp phần làm thay đổi cá chức năng sinh lý trong cơ thể và làm tăng cường sự nhạy cảm của cá đối với mầm bệnh. Vi khuẩ n A. hydrophila gây bệnh trên tất cả các giai đoạn của cá (Dung et al., 2005) Độc chất của A. hydrophila được hấp thu vào ruột cá và tạo ra tình trạng nhiễm trùng máu ở cá. Các mao mạch của lớp hạ bì ở vây, thân, niêm mạc dạ dày có hiện tượng xuất huyết. Tế bào gan và tế bào biểu mô ống thận có hiện tượng thoái hóa. 2.3.4 Khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn A. hydrophila Mặt dù có nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về vấn đề kháng thuốc của vi khuẩn để nâng cao hiệu quả phòng và cải thiện chất lượng điều trị nhưng do nghề nuôi phát triển nhanh chóng, chưa có sự quản lý chặt chẽ nên việc canh tác và giải pháp ngăn chặn việc sử dụng thuốc hóa chất bừa bải còn hạn chế, Do đó, vi khuẩn biến thể, đề kháng thuốc, kể cả hiện tượng đa kháng thuốc xảy ra, nên ngày càng khó hơn trong công tác quản lí dịch bệnh. 5 Trong các trường hợp kháng thuốc của vi khuẩn thì kháng thuốc kháng sinh thông qua plasmid là rất nguy hiểm, bởi vì các loài vi khuẩn kháng thuốc có thể truyền các gen kháng thuốc không chỉ cùng 1 loài mà cả các loài vi khuẩn khác, ngay cả vi khuẩn gây bệnh cho người và động vật trên cạn (Aoki, 1988). Theo nghiên cứu của Hương et al. (2011), có 21 chủng A. hydrophila trong nghiên cứu cho thấy các chủng A.hyrophila đã xảy ra hiện tượng đa kháng thuốc (vi khuẩn kháng ít nhất 3 kháng sinh) cũng như kháng cao với cả 3 loại thuốc kháng sinh streptomycin và trimethoprim + sulfamethoxazol. Mặt khác, theo Nguyễn Bảo Trung (2012), hầu như tất cả các chủng vi khuẩn A. hyrophila đều thể hiện sự đa kháng thuốc. Trong đó, thì trường hợp chiếm tỷ lệ cao nhất là kháng với 4 và 5 loại kháng sinh với tỷ lệ 37,5% và thấp nhất là với 7, 8 loại với tỷ lệ 2,5%. Cũng theo tác giả thì tỷ lệ đa kháng này cao hơn hẳn so với những nghiên cứu trước đây của Phạm Thanh Hương (2011). 2.4 Tổng quan về probiotic và vi khuẩn lactic 2.4.1 Sơ lƣợc về probiotic Theo nghĩa gốc, “biotic” hay “biosis” từ chữ “life” là đời sống, và “pro” là thân thiện, nên probiotic có thể hiểu theo nghĩa là những gì thân thiện với đời sống con người và động vật. Hiểu sát nghĩa hơn, đó là chất bổ sung dinh dưỡng chứa những vi khuẩn hay vi nấm có ích. Năm 1905, Dr. Elie Metchnikoff lần đầu tiên đưa ra và nâng cao vai trò của một số loài vi khuẩn trong sữa khi chữa bệnh cho những người nông dân "sự phụ thuộc vào các vi khuẩn đường ruột làm cho thực phẩm làm có thể thực hiện các bước để thay đổi hệ thực vật của cơ thể ra ngoài mồi trường và thay thế các vi khuẩn có hại sẽ là các vi khuẩn có lợi". Tuy nhiên, thuật ngữ đó được giới thiệu mãi đến năm 1965, Lily & Stillwell bổ nghĩa và sữa đổi thành từ “probiotika”. Nó được mô tả một loài sinh vật có khả năng sản xuất vật chất tăng trưởng giai đoạn theo logarit ở các loài khác nhau. Nó được mô tả như một tác nhân có những chức năng ngược lại với thuốc kháng sinh. Đến năm 1999, Gatesoupe định nghĩa rằng “Probiotic là những tế bào sinh vật sống, với nhiều hình thức khác nhau chúng có khả năng ổn định, duy trì và cải thiện đường tiêu hóa tốt cho sức khỏe của con người và động vật”. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu được thực hiện trên sự ức chế tác nhân gây bệnh dựa vào việc sử dụng chế phẩm sinh học, định nghĩa này được mở rộng nhằm “… giúp bổ sung sinh vật sống có lợi vào cơ thể con người và động vật, mục đích cân bằng và cải thiện hệ vi sinh” (theo Patricia et al., 2012). Tương tự, theo định nghĩa của Tổ chức lương thực thế giới (FAO) 6 hay Tổ chức y tế thế giới (WHO), probiotic là những vi sinh vật còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ sẽ có lợi cho sức khỏe của ký chủ. Mặt khác, các nghiên cứu còn tập chung vào những vi sinh vật đặc trưng của hệ sinh vật đường ruột, chủ yếu được giới hạn nghiên cứu trong vi khuẩn lactic gram dương (G+) thuộc các giống Bifidobecterium, Lactobacillus và Streptococcus. Trong đó, Lactobacillus là nhóm vi khuẩn lactic được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất trong lĩnh vực probiotic. Hoạt động của Lactobacillus rất hiệu quả trong việc tạo ra khả năng bám dính vào tế bào, loại trừ và làm giảm sự lan truyền bệnh, tính bền vững và khả năng nhân lên Probiotic bao gồm 3 nhóm: Vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria), Bacillus và nấm men. Trong số đó thì vi khuẩn lactic được nghiên cứu và được sử dụng nhiều nhất trong việc sản xuất các sản phẩm probiotics (Nguyễn Ngọc Trai, 2011) Theo Phạm Thị Tuyết Ngân (2007), Probiotic là hỗn hợp bổ sung có bản chất vi sinh vật sống có tác động có lợi đối với vật chủ nhờ cải thiện hệ vi sinh liên kết với vật chủ và sống tự do trong môi trường, nhờ cải thiện việc sử dụng thức ăn hoặc tăng cường giá trị dinh dưỡng của thức ăn, nhờ vào sự tăng khả năng đề kháng của vật chủ đối với mầm bệnh hoặc nhờ vào sự cải thiện chất lượng của môi trường sống. Probiotic bao gồm những vi khuẩn có lợi (vi sinh vật hữu ích) và trong thủy sản hầu hết những sinh vật này thuộc nhóm vi khuẩn lactic như (Lactobacillus plantarum, L. acidophillus, L. case, L. rhamnosus, L. bulgaricus), giống Vibrio (V. alginolyticus), giống Bacillus (B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. polymyxa,…), Actinomycetes, Nitrobacteria, Denitrifying, Bifidobacterium,… được áp dụng trong các bể ương nuôi thủy sản để hạn chế nhiễm bệnh đối với các vi khuẩn gây bệnh (Lê Đình Duẩn et al., 2007). Mặt khác, cũng theo tác giả thì một số thành phần khác cũng được tìm thấy trong probiotic đó là những tập hợp các enzyme có nguồn gốc vi sinh vật như amylase, protease, lipase, cellulase, chitinase, chất khoáng và cùng một số vitamin thiết yếu. 7 2.4.2 Tổng quan về vi khuẩn lactic Đặc điểm chung Vi khuẩn lactic (LAB: Lactic Acid Bacteria) là những trực khuẩn hoặc cầu khuẩn, catalase âm tính, có khả năng chịu đựng cao trong môi trường pH thấp. Do đó, LAB có khả năng cạnh tranh với vi khuẩn khác trong quá trình lên men tự nhiên tạo ra sản phẩm cuối cùng là axit hữu cơ (axit lactic) (http://en.wikipedia.org/wiki/Lactic_acid_bacteria). Hầu hết các loài đều hô hấp kỵ khí tùy tiện hoặc vi hiếu khí. Đặc biệt LAB có nhu cầu chất sinh trưởng phức tạp, không có khả năng phát triển trên môi trường thuần khiết chứa khoáng, glucose và NH4+. Đa số vi khuẩn lactic cần các vitamin nhóm B, biotin, axit folic, axit nicotinic và các acid amin khác. Trong tự nhiên vi khuẩn lactic sống hoại sinh, chúng sử dụng protein, hyđratcacbon, acid amin từ xác động thực vật. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn lactic từ 10 - 400C (Nguyễn Thành Đạt và Nguyễn Duy Thảo, 1986). Chúng phát triển trên môi trường giàu dinh dưỡng , khuẩ n la ̣c nhỏ , lên men ky ̣ khí và không hình thành bào tử, sản phẩm lên men chủ yếu là lactate (Marples, 1969). LAB được sử dụng rộng rãi trong sản xuất sản phẩm lên men bởi vì hoạt tính trao đổi chất đặc biệt của nó. Sự acid hóa, sản phẩm của acid hữu cơ và các chất kháng khuẩn khác như bacteriocin, góp phần to lớn trong bảo quản thực phẩm bằng cách ức chế mầm bệnh và chất gây ô nhiễm. Sự chuyển hóa lactase nhờ nuôi cấy vi khuẩn lactic làm cho thực phẩm lên men dễ tiêu hóa hơn. Ngoài ra, nhiều hoạt tính biến dưỡng và tạo enzyme của LAB dẫn đến sự sản xuất chất bay hơi hình thành mùi thơm và đặc trưng cho các sản phẩm lên men. 2.4.3 Phân loại vi khuẩn lactic Các vi khuẩn lactic thuộc bộ Lactobacillales, bao gồm các họ: Aerococcaceae, Carnobacteriaceae, Enterococcaceae, Lacbacillaceae, Leuconostocaceae, Streptococcaceae. Các giống chủ yếu thuộc nhóm vi khuẩn lactic là: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Sporolactobacillus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weisella nm(http://en.wikipedia.org/wiki/Lactic_acid_bacteria). Người ta thường dựa vào quá trình lên men chia vi khuẩn lactic thành hai loại: vi khuẩn lactic lên men đồng hình và dị hình. 8 Vi khuẩn lactic lên men đồng hình (homofermentaires): sử dụng glucose trong điều kiện thiếu oxi bằng con đường Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) tạo ra sản phẩm cuối cùng chủ yếu là acid lactic. Các chi đại diện cho nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình như: Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, và Lactobacillus nhóm I (L. acidophilus, L. delbrueckii, L. helveticus, L. salivarius). Quá trình lên men đồng hình: 1 Glucose --> 1 Acid lactic + 1CO2 + 1 Ethanol + 1 ATP + sản phẩm phụ. Một số vi khuẩn lactic lên men đồng hình như: (1) Lactococcus lactis: là vi khuẩn Gram dương, tế bào hin ̀ h cầ u da ̣ng song cầ u hoă ̣c chuỗi ngắ n , và tùy thuộc vào điều kiện phát triển có thể xuất hiện hình trứng với chiề u dài 0,5 - 1,5 m. L. lactis không sinh bào tử (nonsporulating) và không di động (nonmotile), được sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất bơ và pho mát (Madigan and Martinko, 2005). Quá trình trao đổi chấ t sản phẩ m chủ yế u là L (+) acid lactic (Roissart & Luquet ). Tuy nhiên , trong điề u kiê ̣n pH thấ p có thể sản xuấ t acid lactic da ̣ng D (-) acid lactic (Åkerberg et al., 1998). Ngoài việc được ứng dụng trong sản xuất bơ , sữa, vi khuẩn L. lactics đươ ̣c ứng du ̣ng trong việc sản xuất rau dưa, bia hoặc rượu vang, một số bánh mì, và các loại thực phẩm lên men khác. (2) Lactobacillus acidophilus phát triển tố t trong môi trường pH khá thấp (pH < 5.0), nhiệt độ tăng trưởng tối ưu khoảng 37°C L.acidophilus hiê ̣n diê ̣n tự nhiên trong đường tiêu hóa của con người và động vật. Một số chủng của L.acidophilus có thể được coi là có đặc tính probiotic, những chủng này được sử dụng trong nhiều sản phẩm sữa, đôi khi cùng với S. salivarius spp. Thermophilus và Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus trong việc sản xuất các loại sữa chua acidophilus (Ljungh & Wadström, 2006) . (3) Streptococcus salivarius ssp. thermophilus (trước đây tên là Streptococcus thermophilus) là một loại vi khuẩn Gram dương và yếm khí tùy tiện. S. thermophilus được tìm thấy trong các sản phẩm sữa lên men. Nó không phải là một probiotic (nó không tồn tại trong dạ dày của ngư ời khỏe mạnh) và thường được sử dụng trong sản xuất sữa chua, cùng với Lactobacillus delbrueckii spp. Bulgaricus (Kiliç et al., 1996). Vi khuẩn lactic lên men dị hình (heterofermentaires): sử dụng đường bằng con đường pentose phosphate tạo sản phẩm cuối cùng không chỉ acid lactic mà còn các sản phẩm khác như: CO2, ethanol, axit acetic,… Các chi đại diện cho nhóm vi khuẩn lactic lên men dị hình như: Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, và Lactobacilli nhóm III (L. brevis, L. buchneri, L. fermentum, L. 9 reuteri). Quá trình lên men dị hình: 1 Glucose --> 2 Acid lactic + 2 ATP. Một số vi khuẩn lactic lên men dị hình như: (1) Lactobacillus brevis (tên cũ là L. brassica fermeentati) tìm thấy chủ yếu trong muối chua cải bắp, rau cải, dưa chuột. Nó được chứng minh có tác dụng cải thiện chức năng miễn dịch của con người. Trong lên men, ngoài axit lactic nó còn tạo ra axit axetic, rượu etylic và CO2, nó còn tạo cho sản phẩm có hương thơm dễ chịu (2) Lactobacillus fermentum thường được tìm thấy trong quá trình lên men động vật và nguyên liệu thực vật. Nó còn đư ợc tìm thấy trong bô ̣t chua , L. fermentum được xem là probiotic hoặc vi khuẩn "thân thiện" ở động vật. Lactobacillus fermentum cũng có thể hiê ̣n diê ̣n bình thường trong đường ruột của con người và một số chủng có liên quan đến quá trình chuyển hóa cholesterol (3) Lactobacillus reuteri số ng t ự nhiên trong ruột của động vật có vú và các loài chim. Lần đầu tiên vào đầu những năm 1980, một số chủng của L. reuteri được sử dụng như các chế phẩm sinh học. Các nhà nghiên cứu nhận thấy L. reuteri thực sự có thể tiết ra một lượng đủ reuterin để gây ra các tác dụng kháng khuẩn mong muốn. Điều này sẽ cho phép L. reuteri loại bỏ những vi khuẩ n có ha ̣i cho đường ruột trong khi vẫn giữ ruột bình thường Qua nhiều nghiên cứu cho thấy rằng để phân biệt vi khuẩn lactic dựa vào khả năng sinh CO2 từ glucose trong điều kiện yếm khí (lên men đồng hình chỉ sinh acid lactic, trong khi đó kiểu lên men dị hình không chỉ sinh acid lactic mà còn có cả CO2). Mặt khác, các chi Lactobacillus cũng được đánh giá chỉ tồn tại trong môi trường pH thấp (pH < 5) (Trần Quốc Thiện et al., 2009), cũng không tránh khỏi một số trường hợp ngoại lệ việc các chủng vi khuẩn hình que, gram dương, catalase âm tính, không tồn trong môi trường pH 9.6 cũng đã kết luận là những chủng thuộc chi Lactobacillus (Gyu Sung Cho và Hyung Ki Do, 2006; trích dẫn bởi Trần Quốc Thiện et al., 2009) 2.4.4 Ứng dụng vi khuẩn lactic trong quá trình lên men. Theo Nguyễn Thành Đạt (2001), việc sử dụng vi khuẩn lactic để muối chua rau, quả, ủ chua thức ăn gia súc là hình thức bảo quản thực phẩm bằng công nghệ lên men vi sinh vật. Các vi khuẩn lên men lactic chủ yếu thuộc các giống: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus. Khi muối rau quả lên men lactic, sẽ tạo ra sản phẩm đạt yêu cầu sau: (1) Tạo được lượng sinh khối vi khuẩn có ích, át chế các vi sinh vật gây thối. (2) Gây chua, tạo hương vị thơm ngon cho sản phẩm. (3) Chuyển rau quả về dạng chín sinh học đo đó mà hiệu suất tiêu hóa tăng. Quá trình chuyển hóa sinh học trong muối 10
- Xem thêm -