Tài liệu Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao chiết lá cây nhàu (morinda citrifolia l.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN ‫٭٭٭٭‬ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME α-AMYLASE CỦA CAO CHIẾT LÁ CÂY NHÀU (Morinda citrifolia L.) Cán bộ hướng dẫn: TS. ĐÁI THỊ XUÂN TRANG KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MÔN SINH HỌC Cần Thơ, 2013 sinh viên thực hiện: LÊ BÁ TƯỚC MSSV: 3097459 LỚP: SINH HỌC KHÓA 35 Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Đái Thị Xuân Trang Lê Bá Tước DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. Cần Thơ, ngày 7 tháng 6 năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Ký tên) ii Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 LỜI CẢM TẠ Trong quá trình thực hiện đề tài: “Khảo sát khả năng ức chế enzyme αamylase của cao chiết lá Nhàu (Morinda citrifolia L.)”, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến: Ban lãnh đạo Khoa Khoa Học Tự Nhiên, cùng quý Thầy Cô bộ môn Sinh Học-Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã tận tình truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường. Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cô Đái Thị Xuân Trang là cán bộ hướng dẫn đề tài tận tình giúp đỡ, đóng góp ý kiến cho em trong quá trình thực hiện đề tài. Quí thầy cô, cán bộ Phòng thí nghiệm Sinh học, phòng thí nghiệm Hóa Học Khoa Khoa Học Tự Nhiên, phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi về thời gian cũng như điều kiện thực tập tại Phòng thí nghiệm. Tập thể lớp Sinh Học Khóa 35 đã động viên và đóng góp ý kiến cho em trong quá trình thực hiện luận văn này. Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình tôi. Gia đình đã động viên trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tạo điều kiện tốt cho tôi được học tập. Với kiến thức còn hạn chế của mình chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót, mong quý thầy cô góp ý để bài báo cáo được hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày 20 tháng 5 năm 2013 Sinh viên thực hiện Lê Bá Tước iii Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 LỜI CAM KẾT Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây. Tác giả luận văn Lê Bá Tước iv Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT............................................................................................. i LỜI CẢM TẠ.................................................................................................... iii LỜI CAM KẾT ..................................................................................................iv MỤC LỤC ..........................................................................................................v DANH SÁCH BẢNG...................................................................................... viii DANH SÁCH HÌNH ..........................................................................................ix DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ..............................................................................x TÓM LƯỢC.......................................................................................................xi PHẦN 1: GIỚI THIỆU........................................................................................1 PHẦN 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ....................................................................3 1. Đại cương về bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) ...................................................3 1.1 Định nghĩa bệnh đái tháo đường .............................................................3 1.2 Phân loại bệnh đái tháo đường................................................................3 1.2.1 Bệnh đái tháo đường loại 1: đái tháo đường phụ thuộc insulin .........3 1.2.1 Bệnh đái tháo đường loại 2: đái tháo đường không phụ thuộc insulin .................................................................................................................3 1.3 Tiêu chuẩn để chẩn đoán bệnh đái tháo đường........................................4 1.4 Điều trị ...................................................................................................4 1.6 Tình hình nghiên cứu chữa đái tháo đường bằng thảo dược ....................5 2. Enzyme -amylase ......................................................................................5 2.1 Giới thiệu chung về α-amylase ...............................................................5 2.2 Thành phần hệ enzyme amylase .............................................................6 2.3 Đặc tính của enzym α-amylase ...............................................................6 2.4 Cơ chế tác dụng của enzym α-amylase trong phản ứng thủy phân ..........7 4. Sơ lược về cây Nhàu ....................................................................................8 4.1 Phân loại.................................................................................................9 4.2 Đặc điểm hình thái và phân bố................................................................9 4.3 Thành phần hóa học có trong cây nhàu .................................................10 4.3 Tác dụng dược lý của cây Nhàu............................................................10 PHẦN III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ....................12 v Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 1. Phương tiện................................................................................................12 1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện ............................................................12 1.2 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị...........................................................12 1.2.1 Mẫu vật..........................................................................................12 1.2.2 Hóa chất.........................................................................................12 1.2.3 Dụng cụ .........................................................................................12 2. Phương pháp thí nghiệm ............................................................................12 2.1 Phương pháp chiết và tách cao..............................................................12 2.1.1 Ly trích cao lá Nhàu bằng dung môi ethanol ..................................12 2.1.2 Tách phân đoạn cao ethanol lá Nhàu ..............................................13 2.2 Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao ethanol lá Nhàu (Morinda citrifolia L.). ...............................................................................15 2.3 Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao petroleum ether lá Nhàu (Morinda citrifolia L.).......................................................................16 2.4 Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao ethyl acetate lá Nhàu (Morinda citrifolia L.).......................................................................16 3 Phương pháp xử lý kết quả..........................................................................17 PHẦN IV: KẾT QUẢ THẢO VÀ THẢO LUẬN..............................................18 1. Kết quả ly trích và tách phân đoạn cao lá Nhàu..........................................18 1.1 Độ ẩm của mẫu.....................................................................................18 1.2 Kết quả ly trích cao ethanol ..................................................................18 1.3 Kết quả tách phân đoạn cao từ cao ethanol lá Nhàu ..............................18 2. Kết quả thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao ethanol lá Nhàu (Morinda citrifolia L.). .........................................................19 3. Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao petroleum ether lá Nhàu (Morinda citrifolia L.) ..........................................................................22 4. Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao ethyl acetate lá Nhàu (Morinda citrifolia L.) ...................................................................................24 5. So sánh khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao ethanol, cao petroleum ether và cao ethyl acetate ...............................................................................27 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................29 vi Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 1. Kết luận .....................................................................................................29 2. Kiến nghị ...................................................................................................29 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................30 PHỤ LỤC..........................................................................................................32 vii Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 DANH SÁCH BẢNG Bảng trang Bảng 1: Độ ẩm lá Nhàu. .................................................................................... 18 Bảng 2: Kết quả tách phân đoạn cao. ................................................................. 18 Bảng 3: Khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao lá Nhàu ........................... 21 Bảng 4: Khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao PE ................................... 23 Bảng 5: Khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao ethyl acetate lá Nhàu....... 25 Bảng 6: So sánh giá trị nồng độ ức chế 50% (IC50) của cao ethanol, cao petroleum ether và cao ethyl acetate .................................................................. 27 Bảng 7: So sánh giữa lượng chất ức chế trong các loại cao với lượng Acarbose 27 viii Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 DANH SÁCH HÌNH Hình trang Hình 1: Cây Nhàu................................................................................................. 9 Hình 2: Tách phân đoạn cao lá........................................................................... 13 Hình 3: Cô quay dịch trích thu được sau khi đã lắt cao với dung môi ................ 14 Hình 4: Sơ đồ tách phân đoạn cao từ cao ethanol lá nhàu .................................. 14 Hình 5: Đường chuẩn khả năng ức chế của Acarbose đến hoạt động của enzyme α-amylase .......................................................................................................... 20 Hình 6: Khả năng ức chế của cao ethanol lá Nhàu đến hoạt động của enzyme αamylase ............................................................................................................. 22 Hình 7: Khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao petroleum ether lá Nhàu .. 24 Hình 8: Khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao ethyl acetate lá nhàu........ 26 ix Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BuOH: Butanol DMSO: Dimethyl sulfoxid ĐTĐ: Đái tháo đường EA: Ethyl acetate IC50: Nồng độ ức chế 50% PE: Petroleum ether x Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 TÓM LƯỢC Đái tháo đường là một căn bệnh mãn tính với nhiều biến chứng nguy hiểm, biểu hiện đặc trưng của bệnh là hiện tượng tăng đường huyết và rối loạn chuyển hóa carbohydrate. Sử dụng thảo dược dân gian trong điều trị bệnh đái tháo đường là một trong những hướng đi đầy tiềm năng. Cây Nhàu được biết đến với khả năng làm hạ đường huyết. Đề tài “Khảo sát khả năng ức chế enzyme αamylase của cao chiết lá Nhàu (Morinda citrifolia L.)” được thực hiện nhằm chứng minh cơ chế hạ đường huyết của cây Nhàu. Khả năng ức chế enzyme αamylase được xác định dựa vào lượng tinh bột ban đầu và lượng tinh bột còn lại sau khi cho phản ứng với enzyme α-amylase. Khảo sát khả năng ức chế bằng cách ủ enzyme α-amylase với các loại cao ethanol, cao Petroleum ether, cao ethyl acetate, cao butanol và cao nước trước khi cho tinh bột vào phản ứng. Kết quả khảo sát cho thấy cao butanol và cao nước không có khả năng ức chế enzyme αamylase. Cao ethyl acetate cho hiệu quả ức chế cao nhất là 81,8 ± 0,53% ở nồng độ 4,5 mg/ml. Trong khi đó cao ethanol cho hiệu quả ức chế cao nhất là 36,37 ± 0,51% ở nồng độ cao 25 mg/ml. Cao petroleum ether cho hiệu quả ức chế cao nhất là 20,39 ± 0,38%. Giá trị IC50 của cao ethanol là 41,93mg/ml, cao petroleum ether là 194,48mg/ml và cao ethyl acetate là 3,75mg/ml. Chứng minh được một trong những cơ chế làm hạ đường huyết của Nhàu là thông qua tác dụng ức chế sự hoạt động của enzyme α-amylase. xi Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 PHẦN 1: GIỚI THIỆU Bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) hay còn gọi bệnh “tiểu đường” là một trong những vấn đề đáng quan tâm trong xã hội ngày nay. Đái tháo đường là một căn bệnh mãn tính với nhiều biến chứng nguy hiểm, có thể dẫn đến tử vong. Gánh nặng bệnh tật do đái tháo đường đang tăng lên trên toàn cầu, đặc biệt là ở các nước đang phát triển, nơi quá trình đô thị hóa đang làm thay đổi tập quán ăn uống, giảm hoạt động thể lực và tăng cân. Theo WHO, năm 1985 thế giới có khoảng 30 triệu người mắc bệnh đái tháo đường, năm 2004 con số này đã là 98,9 triệu và dự đoán vào năm 2025 số bệnh nhân ĐTĐ trên toàn thế giới vào khoảng 300 - 330 triệu người, chiếm tỉ lệ khoảng 5,4% dân số toàn cầu. trong đó tỉ lệ mắc bệnh ở các nước đang phát triển tăng 42% và tỉ lệ ở các nước này tăng lên 170% vào năm 2025 (Tạ Văn Bình và ctv., 2007). Bệnh đái tháo đường gây ra do rối loạn các enzyme chuyển hóa carbohydrate trong cơ thể khi hormone insulin của tuyến tụy bị thiếu hoặc giảm tác động, biểu hiện bằng mức đường trong máu cao hơn bình thường. Trong các enzyme chuyển hóa carbohydrate, enzyme α-amylase có vai trò thủy phân các hợp chất polychaccharide tạo glucose, phản ứng này trực tiếp tăng hàm lượng đường trong máu. Do đó, nếu có thể ức chế được enzyme này, việc điều trị bệnh đái tháo đường sẽ dễ dàng hơn. Bệnh đái tháo đường đến nay vẫn chưa có thuốc trị khỏi hoàn toàn. Những loại thuốc trị bệnh đái tháo đường phải được uống thường xuyên và suốt đời như: Meformin, sulfonylureas, glinides, chất ức chế enzyme -glucosidase (Acarbose), thiazolidinediones, insulin…(Nathan et al., 2006). Nhìn chung, các liệu pháp này có tác dụng nhất định, công dụng chính của các nhóm thuốc này là hạ đường huyết hoặc cung cấp insulin thay thế tạm thời cho người bệnh ĐTĐ. Tuy nhiên hiệu quả điều trị chưa cao và gây ra nhiều tác dụng phụ như béo phì, vàng da, suy đường huyết, ngộ độc gan…(Sudha et al., 2011; Nathan et al., 2006). Các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ tự nhiên được quan tâm nghiên cứu vì rất an toàn và hiệu quả trong việc phòng và điều trị nhiều bệnh ở người trong đó có bệnh đái tháo đường (Addis và Warner, 1991; 1 Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 Halliwell,1994; Rice-Evans et al., 1997; Lu và Foo, 2000). Trong dân gian, các bộ phận của cây Nhàu đã được sử dụng như một loại thuốc trị bệnh ĐTĐ. Các nghiên cứu cũng đã chứng minh tác dụng hạ đường huyết của cao chiết Nhàu trên chuột bệnh (Võ Thị Ngọc Diễm và ctv, 2012). Đề tài “Khảo sát khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao chiết lá Nhàu (Morinda citrifolia L.)” được thực hiện nhằm đánh giá một cách khoa học tác dụng hạ đường huyết của lá Nhàu trên invitro. Từ đó làm rõ cơ chế hạ đường huyết của cao chiết lá Nhàu. Mục tiêu của đề tài đánh giá khả năng ức chế enzyme α-amylase của cao chiết lá Nhàu trong phản ứng chuyển hóa tinh bột. 2 Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 PHẦN 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1. Đại cương về bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) 1.1 Định nghĩa bệnh đái tháo đường Bệnh đái tháo đường (diabetes mellitus - DM) được định nghĩa là một nhóm các bệnh chuyển hóa được đặc trưng bởi tăng đường huyết mãn tính, do hậu quả từ tình trạng thiếu insulin tuyệt đối hay tương đối của tuyến tụy. Biểu hiện đặc trưng của bệnh là tình trạng tăng đường huyết cùng rối loạn các chuyển hóa carbohydrate. Rối loạn này có thể đưa đến các biến chứng cấp tính, các tình trạng dễ bị nhiễm trùng và lâu dài sẽ gây ra các biến chứng ở các mạch máu nhỏ và mạch máu lớn (Nguyễn Thị Bay, 2007). Đái tháo đường cũng là một phức hợp rối loạn các chuyển hóa lipid, protein (Nguyễn Huy Cường, 2005). 1.2 Phân loại bệnh đái tháo đường Theo phân loại của WHO năm 1999, thì bệnh đái tháo đường có những thể loại sau: 1.2.1 Bệnh đái tháo đường loại 1: đái tháo đường phụ thuộc insulin Nguyên nhân do tế bào  bị phá hủy, gây nên sự thiếu hụt insulin tuyệt đối cho cơ thể (nồng độ insulin giảm thấp hoặc mất hoàn toàn). Đái tháo đường loại 1 chiếm tỷ lệ khoảng 5-10% bệnh đái tháo đường trên thế giới. Đái tháo đường loại 1 phụ thuộc nhiều vào yếu tố gen (di truyền) và thường được phát hiện trước 40 tuổi. Đa số các trường hợp được chẩn đoán bệnh đái tháo đường loại 1 thường là người có thể trạng gầy, tuy nhiên người béo cũng không loại trừ. Người bệnh đái tháo đường loại 1 sẽ có đời sống phụ thuộc insulin hoàn toàn. 1.2.1 Bệnh đái tháo đường loại 2: đái tháo đường không phụ thuộc insulin Nguyên nhân do kháng insulin ở cơ quan đích, kèm theo suy giảm chức năng tế bào  hoặc do suy giảm chức năng tế bào  kèm theo kháng insulin của cơ quan đích. Tùy trường hợp cụ thể mà một trong hai trường hợp trên nổi trội hoặc cả hai. Đái tháo đường loại 2 chiếm tỷ lệ khoảng 90% đái tháo đường trên thế giới. (Zimmet et al., 2001). 3 Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 Đái tháo đường loại 2 không phụ thuộc nhiều vào yếu tố di truyền, và thường được phát hiện sau 40 tuổi (Nguyễn Thị Bay, 2007). Người mắc bệnh đái tháo đường loại 2 thường có thể trạng béo. Bệnh đái tháo đường loại 2 có thể điều trị bằng cách thay đổi thói quen ăn uống, hoạt động kết hợp dùng thuốc để kiểm soát đường huyết, tuy nhiên nếu quá trình này thực hiện không tốt thì bệnh nhân cũng sẽ phải điều trị bằng cách dùng insulin. 1.3 Tiêu chuẩn để chẩn đoán bệnh đái tháo đường Tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán đái tháo đường là dựa trên nồng độ glucose huyết tương lúc đói (tức là không ăn qua đêm hoặc ít nhất sau khi ăn 8 giờ). Năm 1998, WHO đã công nhận tiêu chuẩn chẩn đoán do Hiệp Hội ĐTĐ Mỹ đề nghị là: Nồng độ glucose huyết tương bất kỳ ≥ 200 mg/dl, kèm theo các triệu chứng của tăng đường máu. Glucose huyết tương lúc đói ≥ 126 mg/dl. 1.4 Điều trị Với người bệnh đái tháo đường việc kiểm soát đường huyết ổn định là vô cùng quan trọng. Nếu như việc thay đổi thói quen ăn uống và luyện tập chưa kiểm soát tốt được mức đường huyết thì cần phải kết hợp với dùng thuốc. Xét cho cùng mục đích chính của việc điều trị đái tháo đường hiện tại là làm ổn định lượng đường trong máu. Đối với bệnh nhân đái tháo đường loại 1 thì chỉ có một phương pháp là dùng insulin. Insulin là một nội tiết tố của cơ thể, có khả năng làm hạ đường huyết. Insulin được tế bào  của tụy Langerhans tiết ra. Việc bài tiết insulin của cơ thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó sự thay đổi đường huyết có vai trò quan trọng. Ở người bệnh đái tháo đường, khả năng bài tiết insulin của cơ thể giảm hoặc không còn là nguyên nhân làm cho đường máu tăng cao. Một số nhóm thuốc được dùng trong điều trị đái tháo đường Nhóm Biguanide (như Metformin với biệt dược là Siofor 500 mg, 850 mg) tác dụng chủ yếu là ức chế sản xuất đường từ gan và tăng tính nhạy cảm của cơ thể đối với insulin, hiệu quả là làm giảm đường huyết. Nhóm Sulfonylurea (như Diamicron MR 30 mg) tác dụng kích thích tuyến tụy tăng tiết insulin để làm hạ đường huyết, tác dụng phụ hay gặp là hạ đường huyết quá mức. 4 Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 Nhóm ức chế -glucosidase (như Acarbose 50 mg, 100 mg) tác dụng tại ruột non làm chậm hấp thu do đó làm thấp đường huyết sau ăn. Nhóm Meglitinide (các chế phẩm như Repaglinide và Nateglinide) có cơ chế tác dụng gần giống như nhóm Sulfonylurea. Nhóm Thiazolidinnedione Thuốc đang được dùng là Rosiglitazone và Pioglitazone, nhóm này tác dụng nên nhiều khâu trong cơ chế bệnh sinh của đái tháo đường loại 2 (cả kháng insulin và cải thiện chức năng tế bào ). Việc kiểm soát khẩu phần ăn và chế độ hoạt động cũng góp phần giúp người bệnh không gia tăng lượng đường trong máu. Kiểm soát khẩu phần ăn không cung cấp nhiều glucose hay kiểm soát quá trình tiêu hóa tạo glucose từ thức ăn. Để không tăng glucose đột biến sau bữa ăn là một trong những liệu pháp cho người đái tháo đường. 1.6 Tình hình nghiên cứu chữa đái tháo đường bằng thảo dược Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy các thảo dược có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh ĐTĐ như lá ổi (Psidum guyjava L.) của Oh et al., (2003), Trái ổi (Psidum guyjava L.) của Yusof et al., (2007), mướp đắng (Momordica charantia), cỏ cari (trigonella foenum graecum) của Tripathi et al., và rất nhiều công trình khác đã chứng minh tác dụng làm hạ đường huyết của các loai thảo dược. Ở Việt Nam, có nhiều nghiên cứu liên quan đến bệnh đái tháo đường. Tuy nhiên các nghiên cứu khoa học về dược liệu dân gian sử dụng trong hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường còn rất ít. Công trình nghiên cứu của Võ Thị Ngọc Diễm và ctv, 2012 cũng đã chứng minh cao lá Nhàu có khả năng làm hạ đường huyết trên chuột bạch bệnh đái tháo đường. 2. Enzyme -amylase 2.1 Giới thiệu chung về α-amylase Tên thay thế: 1,4-α-glucan-glucanhydrolase glycogenase Mã số enzyme: EC 3.2.1.1 α-amylase (EC 3.2.1.1) là một enzyme quan trọng trong hệ thống tiêu hóa và xúc tác bước đầu tiên trong thủy phân tinh bột tạo ra một hỗn hợp của oligosaccharides nhỏ hơn bao gồm maltose, maltotriose và một số α-(l-6) và α- 5 Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 (1-4) oligoglucans (Sudha et al., 2011). Do sự tác động lên các liên kết 1,4-O glycoside. Trong cơ thể người và hầu hết các động vật có vú dạng chủ yếu của amylase là α-amylase. Ở người α-amylase có trong nước bọt và dịch tụy. Phần lớn các enzyme amylase sử dụng trong y học và công nghiệp thực phẩm ngày nay điều có nguồn gốc từ vi sinh vật (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 2.2 Thành phần hệ enzyme amylase Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước. Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm là endoamylase và exoamylase. Endoamylase (enzyme nội phân tử) gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại. Khử trực tiếp là Pullulanase (hay α-dextrin 6-glucosidase), khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) và maylo-1,6-glucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide. Exoamylase (enzyme ngoại phân tử) gồm có β-amylase và γ-amylase. Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen. 2.3 Đặc tính của enzym α-amylase α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần acid amin khác nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp acid amin đặc hiệu riêng. α-amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng acid amin cấu thành nên phân tử enzyme. α-amylase có ít methionine và có khoảng 7 - 10 gốc cysteine. Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc: 45.000 - 50.000 Da (Protein của các αamylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4,2 - 5,7. Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 6 Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 α-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 130 nguyên tử gram Ca/mol. Canxi tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme. Do đó, canxi còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết canxi thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Tất cả các amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg+. Một số kim loại như: Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+ không có ảnh hưởng đến α-amylase (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Thành phần amino acid của α-amylase ở nấm mốc Aspergillus như sau (g/100 g protein): Alanine = 6,8, glycine = 6,6, valine = 6,9, leucine = 8,3, Isoleucine = 5,2, prolin = 4,2, phenylalanine = 4,2, tyrosine = 9,5, trytophan = 4,0, xetin = 6,5, trionin = 10,7, cystein + cystine = 1,6, glutamic acid= 6,9, amide= 1,5 (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,0 4,8 (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Asp.oryzae trong vùng 5,6 - 6,2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0 - 7,0 (Nguyễn Đức Lượng, 2004). α-amylase trích từ tụy heo có vùng pH hoạt động trong khoảng 5,5 - 8, pH tối thích là 7 (www.sigmaaldrich.com/enzymeexplorer). pH tối thích cho hoạt động của α-amylase trích từ mầm lúa là 5,3 (Nguyễn Minh Chơn và ctv, 2005). 2.4 Cơ chế tác dụng của enzym α-amylase trong phản ứng thủy phân Enzyme α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc đột rất chậm. Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 7 Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa), chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh). Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa), các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose (vì vậy, người ta cho rằng αamylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1). Sau đó, các polyglucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%. Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 4. Sơ lược về cây Nhàu Tên khoa học: Morinda citrifolia L. Tên khác: Cây ngao, nhàu rừng, nhàu núi Tên nước ngoài: Indian mulberrry, eats indian muberry, awl tree (tiếng Anh); morinde (Pháp) 8 Luận văn tốt nghiệp Sinh học K35 Hình 1: Cây Nhàu. 4.1 Phân loại • Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) • Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) • Phân lớp: Hoa môi (Lamiidae) • Bộ: Cà phê (Gentianales) • Họ: Cà Phê (Rubiaceae) • Giống: Morinda • Loài: Morinda citrifolia L. (Phạm Hoàng Hộ, 2003) 4.2 Đặc điểm hình thái và phân bố Nhàu là cây thân gỗ, cao từ 6 - 8 m, lá mọc đối có hình bầu dục, đầu nhọn, dài khoảng 12 - 15 cm, rộng 6 - 8 cm. Mặt trên lá màu xanh lục bóng, mặt dưới của lá nhạt. Lá kèm to khoảng 0,8 - 1,3 cm. Hoa Nhàu có màu trắng về sau vàng nhạt, thường kết thành khối và dính bởi đài. Quả thịt gồm nhiều quả hạch dính vào nhau, hình trứng, dài khoảng 3 - 4,5 cm. Khi chín màu trắng vàng hoặc hồng nhạt, mặt ngoài lồi lõm. Chứa một lớp cơm mềm, ăn được, hạt nhiều, vị cay, nồng, khó ngửi. Mùa hoa Nhàu tháng 11 - 2, mùa quả: tháng 3 - 5. Cây Nhàu có nguồn gốc từ Nam Á (Indonesia) và Úc Châu, phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam... Ở nước ta, Nhàu mọc nhiều ở những vùng ẩm 9