Khảo sát khả năng phân hủy hydrogen peroxide của cao chiết lá cây sa kê (artocarpus altilis (park.) fosb) in vitro

  • Số trang: 50 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 21 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN ñó LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY HYDROGEN PEROXIDE CỦA CAO CHIẾT LÁ CÂY SA KÊ (Artocarpus altilis (Park.) Fosb) IN VITRO Cán bộ hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. ĐÁI THỊ XUÂN TRANG BỘ MÔN SINH HỌC KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRƯƠNG THỊ NGỌC TUYỀN MSSV: 3102707 LỚP: SINH HỌC K36 Cần Thơ, Tháng 11/2013 LỜI CẢM ƠN Luận văn tốt nghiệp là một bài học to lớn cũng như một thành quả đầu tiên của thời sinh viên. Thành quả này góp một phần không nhỏ trong hành trang vào cuộc sống đối với sinh viên nói chung và sinh viên ngành Sinh Học nói riêng. Tất cả những điều tôi học được từ luận văn trên giúp tôi trau dồi thêm những kiến thức đã học, kèm theo nhiều kinh nghiệm quý báu có thể cho tôi khả năng định hướng tốt và vững vàng cho những công việc thuộc chuyên ngành trong tương lai. Trong quá trình làm luận văn tôi cũng gặp không ít khó khăn. Tuy nhiên, nhờ có sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, gia đình và bạn bè đã giúp tôi vượt qua. Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc nhất đến Cô TS. Đái Thị Xuân Trang đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin gửi lời biết ơn chân thành đến quí Thầy Cô Bộ môn Sinh học - Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã cho tôi nền tảng kiến thức để tôi có thể học hỏi và trao dồi thêm kỹ năng của mình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến quí Thầy Cô Bộ môn Hóa học - Khoa Khoa Học Tự Nhiên, các anh chị cán bộ Phòng Sinh Học Phân Tử Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành tốt luận văn. Tôi xin cám ơn bạn Huỳnh Ngọc Trúc và chị Hồ Ngọc Phụng lớp Sinh học Khóa 35 đã luôn đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, các bạn lớp Sinh Học K36 đã chia sẻ, động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Trong bước đầu nghiên cứu khoa học, kiến thức còn hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ nên chắc chắn không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quý Thầy Cô và anh chị khóa trước, các bạn học cùng lớp để kiến thức của tôi trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn! Trương Thị Ngọc Tuyền i LỜI CAM KẾT Tôi xin cam đoan Luận văn này được hoàn thành dựa trên kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của Cô Đái Thị Xuân Trang. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa từng được cá nhân nào công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây. Cán bộ hướng dẫn Sinh viên thực hiện Đái Thị Xuân Trang Trương Thị Ngọc Tuyền ii PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. Đái Thị Xuân Trang DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... ............................................................................................................................... .............................................. Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG iii MỤC LỤC CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ...................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề......................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu đề tài .................................................................................................. 1 1.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 2 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................. 3 2.1. Stress oxy hóa và gốc tự do.............................................................................. 3 2.1.1. Stress oxy hóa ............................................................................................ 3 2.1.2. Gốc tự do ................................................................................................... 3 2.2. Chất chống oxy hóa .......................................................................................... 4 2.3. Hoạt động của các chất chống oxy hóa tự nhiên .............................................. 6 2.3.1. Các chất chống oxy hóa hòa tan trong nước.............................................. 6 2.3.1.1. Các hợp chất phenol............................................................................ 6 2.3.1.2. Vitamine C .......................................................................................... 7 2.3.2. Các chất chống oxy hóa hòa tan trong chất béo ........................................ 8 2.3.2.1 Các carotenoid...................................................................................... 8 2.3.2.2. Vitamine E .......................................................................................... 9 2.4. Giới thiệu về hydrogen peroxyde (H2O2) ....................................................... 10 2.5. Giới thiệu về Trolox ....................................................................................... 10 2.6. Giới thiệu về cây Sa Kê (Artocarpus altilis (Parkinson) Fosberg) ................ 11 2.6.1. Phân loại .................................................................................................. 11 2.6.2. Nguồn gốc................................................................................................ 11 2.6.3. Hình thái .................................................................................................. 12 2.7 Các nghiên cứu về cây Sa Kê và giống Artocarpus ........................................ 13 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP ......................................... 15 3.1. Phương tiện nghiên cứu.................................................................................. 15 3.1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện............................................................... 15 3.1.2. Dụng cụ và thiết bị................................................................................... 15 3.1.3. Hóa chất ................................................................................................... 15 iv 3.1.4. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 15 3.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 16 3.2.1. Phương pháp khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá cây Sa Kê in vitro .......................................................................................................... 16 3.2.1.1. Phương pháp trích cao lá cây Sa Kê bằng dung môi ethanol ........... 16 3.2.1.2 Khảo sát hoạt động phân hủy gốc hydrogen peroxyde (H2O2) (Hydrogen Peroxyde Scavenging Activity (HPSA) assay) in vitro của cao chiết lá cây Sa Kê........................................................................................... 17 3.2.2. Thống kê phân tích số liệu....................................................................... 17 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 18 4.1. Xác định độ ẩm và hiệu suất tạo cao chiết của lá Sa Kê ................................ 18 4.1.1. Độ ẩm của lá Sa Kê ................................................................................. 18 4.1.2. Hiệu suất tạo cao chiết ............................................................................. 19 4.2. Khảo sát hoạt động phân hủy gốc Hydrogen Peroxyde (H2O2) (Hydrogen Peroxyde Scavenging Activity (HPSA) assay) in vitro của cao chiết lá cây Sa Kê ............................................................................................................................... 19 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................... 25 5.1. Kết luận .......................................................................................................... 25 5.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 26 v DANH SÁCH HÌNH Hình 4.1 Lá Sa Kê dùng trong thí nghiệm 17 Hình 4.2 Đường chuẩn khảo sát khả năng phân hủy H2O2 in vitro của Trolox ...................................................................................... 20 Hình 4.3 Phần trăm lượng Hydrogen Peroxyde (H2O2) còn lại sau phản ứng với chất chống oxy hóa có trong cao chiết lá Sa Kê ........ 23 vi DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học (Fouad, 2006) ............ 4 Bảng 2.2 Cơ chế hoạt động của các chất chống oxy hóa (Shi & Noguchi, 2001) .......................................................................................... 5 Bảng 4.1 Độ ẩm và hiệu suất tạo cao của lá Sa Kê................................. 19 Bảng 4.2 Khả năng phân hủy gốc tự do H2O2 của cao chiết lá cây Sa Kê . ................................................................................................. 21 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ROS: Reactive Oxygen Species RNS: Reactive Nitrogen Species HPSA: Hydrogen Peroxyde Scavenging Activity DCM: Dichloromethane Trolox: 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid OD: Optical Density IC50: Inhibitory Concentration viii TÓM LƯỢC Cây Sa Kê (Artocarpus altilis (Park.) Fosb.) là loài cây được người dân ở các nước nhiệt đới sử dụng rộng rãi trong việc điều trị một số căn bệnh phổ biến như tiểu đường, gout, cao huyết áp,… Nhiều nghiên cứu gần đây đã cho rằng lá Sa Kê mang nhiều tác dụng tiêu biểu của họ Dâu Tằm (Moraceae). Trong đó lá Sa Kê có thể thu hái quanh năm. Chính vì vậy việc nghiên cứu một cách chuyên sâu về các tác dụng dược lý để tăng giá trị sử dụng của loài cây này là cần thiết. Đề tài này được tiến hành nhằm xác định khả năng phân hủy gốc tự do Hydrogen peroxyde (H2O2) của cao chiết lá cây Sa Kê in vitro. Sự phân hủy gốc tự do của cao chiết được đo lường thông qua khả năng hoạt động phân hủy gốc Hydrogen peroxyde (Hydrogen Peroxyde Scavenging Activity, HPSA). Kết quả của nghiên cứu cho thấy cao chiết lá Sa Kê có khả năng chống oxy hóa dựa trên khả năng phân hủy H2O2. Khả năng phân hủy gốc H2O2 của cao chiết tăng dần ở các nồng độ khảo sát 12,5; 25; 50; 100; 200; 400; 600; 800; 1000; 1200 và 1400 µg/ml. Vì vậy, kết quả thí nghiệm chứng minh cao chiết lá Sa Kê có khả năng phân hủy H2O2 cao nhất lên đến 98,4% ở các nồng độ 800 µg/ml. Từ khóa: cây Sa Kê, HPSA, Hydrogen peroxyde, Trolox, stress oxy hóa, chất chống oxy hóa, gốc tự do. ix CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Sự tạo thành các gốc tự do là quá trình tất yếu ở mọi cơ thể sống. Trong khoảng hai thập niên gần đây, giới khoa học nói riêng và xã hội nói chung dành sự quan tâm đặc biệt cho các “gốc tự do”, “stress oxy hóa” và các “chất chống oxy hóa” (Lại Thị Ngọc Hà et al, 2009). Stress oxy hóa là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi có sự mất cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do và hoạt động của các chất chống oxy hóa. Hiện tượng này là nguyên nhân của rất nhiều bệnh nguy hiểm trong đó có ung thư, các bệnh tim mạch, các bệnh suy giảm hệ thần kinh (Alzheimer. Parkinson) và lão hóa sớm. (Favier, 2003; Gardès – Albert et al, 2003; Pincemail et al, 1998; Fouad, 2006; Edeas, 2006). Cây Sa Kê, hay còn gọi là cây bánh mì (breadfruit) có tên khoa học là Artocarpus altilis (Park.) Fosb. là một loài thuộc chi Artocarpus (chi Mít), họ Dâu tằm (Moraceae). Sa Kê có nguồn gốc ở Tây Thái Bình Dương, cụ thể là ở Papua New Guinea và quần đảo Bismarck. Sa Kê có khả năng thích nghi với điều kiện sinh thái rộng, ít bị sâu bệnh (Ragone, 1997, 2006). Đặc biệt, lá Sa Kê còn dùng được để chữa một số bệnh như gãy xương, bong gân, giảm đau thần kinh hông, bệnh do nấm gây ra như bệnh tưa miệng (thrush), tiêu chảy, đau dạ dày và lỵ, giúp giảm huyết áp (Ragone, 2006). Vì vậy, ngày nay ở nước ta Sa Kê được trồng rộng rãi, vừa làm thực phẩm, vừa làm cảnh trong vườn nhà, các cơ quan, đường phố, hoặc công viên và dùng chữa các bệnh. Trong dân gian lá Sa Kê được dùng để chữa phù thủng, viêm gan vàng da bằng cách nấu lá tươi để uống. Việc việc chứng minh một cách khoa học về hiệu quả của các bài thuốc chữa bệnh bằng lá Sa Kê trong dân gian là cần thiết, từ đó có thể làm phong phú hơn nguồn dược liệu trong nước và thế giới. Đề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY H2O2 CỦA CAO CHIẾT LÁ SA KÊ (Artocarpus altilis (Park.) Fosb.) IN VITRO” được thực hiện nhằm đánh giá khả năng phân hủy H2O2 ở mức độ in vitro trong việc giảm bớt lượng gốc tự do tích tụ trong cơ thể mà gốc H2O2 là điển hình. 1.2. Mục tiêu đề tài 1 Mục tiêu của đề tài là đánh giá khả năng phân hủy H2O2 (một dạng chất oxy hóa) của cao chiết lá cây Sa Kê. Khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá cây Sa Kê được đánh giá in vitro bằng phương pháp HPSA (Hydrogen Peroxyde Scavenging Activity). 1.3. Nội dung nghiên cứu - Trích các chất từ lá cây Sa Kê bằng dung môi ethanol 99%. - Sử dụng phương pháp HPSA để xác định khả phân hủy H2O2 của lá cây Sa Kê in vitro. 2 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Stress oxy hóa và gốc tự do 2.1.1. Stress oxy hóa Stress oxy hóa (oxydative stress) là sự rối loạn cân bằng giữa các chất chống oxy hóa và các chất oxy hóa trong cơ thể theo hướng tạo ra nhiều các chất oxy hóa (Katalinic et al., 2006). Stress oxy hóa là kết quả của sự hình thành gốc tự do vượt quá mức kiểm soát của các hệ thống chống oxy hóa trong cơ thể. Điều này xảy ra khi các chất chống oxy hóa có nồng độ quá thấp, không đủ để trung hòa các gốc tự do. Kết quả các gốc tự do sẽ tấn công các phân tử lipid, protein, acid nucleic của tế bào dẫn đến tổn thương cục bộ và kết quả cuối cùng là gây sự hoạt động bất thường của cơ quan (Meister, 1992). Stress oxy hóa là nguyên nhân gây ra sự phát triển của ung thư, lão hóa, bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer, xơ vữa động mạch , suy tim, nhồi máu cơ tim, tiểu đường, gout,…(Halliwell, 2007; Valko et al, 2007; Singh et al, 1995). 2.1.2. Gốc tự do Các gốc tự do là các chất hoạt động chứa oxy và nitơ (Reactive Oxygen Species – ROS và Reactive Nitrogen Species – RNS) là các dẫn xuất dạng khử của oxy và nitơ phân tử. Gốc tự do là tất cả các phân tử hóa học chỉ có một điện tử duy nhất (electron mang điện âm) hay số điện tử lẻ. Do các phân tử mang điện tử lẻ không cân bằng, không bền vững, dễ tạo ra phản ứng. Các phân tử mang điện tử lẻ luôn luôn tìm cách chiếm đoạt điện tử mà nó thiếu từ các phân tử khác, và lần lượt tạo ra một chuỗi những gốc tự do mới (Pal et al., 2011). Gốc tự do được chia thành hai nhóm lớn là các “gốc tự do” và dẫn xuất không phải gốc tự do (Bảng 2.1). Các gốc tự do là các phân tử hoặc nguyên tử có một hoặc nhiều điện tử đơn lẻ. Các dẫn xuất không phải gốc tự do như oxy đơn, hydroperoxyde, nitroperoxyde là tiền chất của các gốc tự do. Các ROS và RNS phản ứng rất nhanh với các phân tử quanh nó, do đó gây tổn thương và làm thay đổi giá trị sinh học của các đại phân tử sinh học như DNA, protein, lipid. (Proctor, 1989; Favier, 2003; Pincemail et al., 1998; Minn, 2005; Fouad, 2006) Các ROS và RNS được tạo ra là một quá trình tất yếu trong sự trao đổi chất nhưng còn tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động tốt hoặc xấu đến cơ 3 thể. Ở nồng độ thấp, các ROS và RNS là các tín hiệu làm nhiệm vụ: điều hòa phân ly tế bào (apoptosis); kích hoạt các yếu tố phiên mã (NFkB, p38-MAP kinase,…) cho các gen tham gia quá trình miễn dịch, kháng viêm; điều hòa biểu hiện các gen mã hóa cho các enzyme chống oxy hóa (Pincemail et al., 1998; Favier, 2003; Pincemail, 2006). Ở nồng độ cao, các ROS và RNS oxy hóa các đại phân tử sinh học gây nên: đột biến ở DNA; biến tính protein; oxy hóa lipid (Favier, 2003; Pincemail et al., 1998). Bảng 2.1. Các ROS và RNS trong cơ thể sinh học (Fouad, 2006) ROS/RNS O2 - Gốc superxyde o OH Gốc hydroxyl ROOo Gốc peroxyde H2 O2 Hydrogenperoxyde 1 O2 Oxy đơn NOo Oxyde nitrice ONOO- Peroxynitrite HOCl Acid hypochlorique 2.2. Chất chống oxy hóa Chất chống oxy hóa là hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đảo ngược quá trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể (Jovanovic và Simic, 2000; Lachman et al., 2000; Singh và Rajini, 2004). Có nhiều cách phân loại chất chống oxy hóa, dựa trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy hóa được phân thành hai loại: các chất chống oxy hóa bậc một và các chất chống oxy hóa bậc hai. Các chất chống oxy hóa bậc một khử hoặc kết hợp với các gốc tự do nên kìm hãm pha khởi phát hoặc bẻ gãy dây chuyền phản ứng của quá trình oxy hóa. Các chất chống oxy hóa bậc hai kìm hãm sự tạo thành các gốc tự do (hấp thụ các tia cực tím; tạo phức với các kim loại kích hoạt sự tạo gốc tự do như Cu, Fe; gây bất hoạt oxy đơn) (Singh và Rajini, 2004; Rolland, 2004). Cơ chế hoạt động tóm tắt của các chất chống oxy hóa được trình bày trong Bảng 2.2 4 Bảng 2.2 Cơ chế hoạt động của các chất chống oxy hóa (Shi & Noguchi, 2001) 1. Các chất chống oxy hóa bậc một: làm vô hiệu hóa tác động của các gốc tự do Khử các gốc tự do L° + AH → LH + A° LOO° + AH → LOOH + A° LO° + AH → LOH + A° Tạo hợp chất với các gốc tự do A° + LOO° → LOO A° + LO° → LOA 2. Các chất chống oxy hóa bậc hai: ngăn chặn sự tạo các gốc tự do 2.1. Phân giải hydroperoxyde và hydrogen peroxyde Phân giải hydrogen peroxyde Catalase 2 H 2 O 2 → 2 H2 O + O 2 Phân giải hydrogen peroxyde và hydroperoxyde của acid béo tự do Glutathion peroxydase (tế bào) 2 H2O2 + 2 GSH → 2 H2O + GSSG LOOH + 2GSH → LOH + H2O +GSSG Phân giải hydrogen peroxyde và hydroperoxyde của phospholipide Glutathion peroxydase (huyết tương) 2 H2O2 + 2 GSH → 2 H2O + GSSG PLOOH + 2GSH → PLOH+H2O+GSSG Phân giải hydrogen peroxyde và hydroperoxyde của chất béo Peroxydase LOOH + AH2 → LOH + 2 H2O + A H2O2 + AH2 → 2 H2O + A 2.2. Tạo phức với kim loại gây phản ứng Fenton và Haber-Weiss Transferrin, lactoferrin Tạo phức với Fe Ceruloplassmin, albumin Tạo phức với Cu 2.3. Gây bất hoạt oxy đơn và ion superoxyd Gây bất hoạt oxy đơn Carotenoid 5 Biến đổi ion superoxyde Superoxyde dimutase 2 O°-2 + 2 H+ → 2 H2O + O2 Hệ thống các chất chống oxy hóa ở cơ thể người có nguồn gốc nội sinh và ngoại sinh. Các chất chống oxy hóa nội sinh bao gồm các protein (ferritine, transferrine, albumine, protein sốc nhiệt - heat shock protein) và các enzyme chống oxy hóa (superoxyde dismutase, glutathion peroxydase, catalase). Các chất chống oxy hóa ngoại sinh là các cấu tử nhỏ được đưa vào cơ thể qua con đường thức ăn bao gồm vitamine E, vitamine C các carotenoid và các hợp chất phenolic. Các chất này có nhiều trong rau, quả và được xem là các chất chống oxy hóa tự nhiên. Việc sử dụng nhiều rau quả là con đường đơn giản và hữu hiệu nhất để tăng cường hoạt động của hệ thống chống oxy hóa và ngăn ngừa các bệnh có nguồn gốc stress oxy hóa (Niki et al., 1995; Pincemail et al., 1998; Lachman et al., 2000; Vansant et al., 2004). 2.3. Hoạt động của các chất chống oxy hóa tự nhiên 2.3.1. Các chất chống oxy hóa hòa tan trong nước 2.3.1.1. Các hợp chất phenol Các hợp chất phenol là một trong các nhóm sản phẩm trao đổi chất bậc hai chủ yếu của thực vật, rất đa dạng về cấu trúc và chức năng. Ở thực vật, các hợp chất phenol tạo màu cho thực vật (anthocyanin); bảo vệ thực vật trước tia cực tím, chống lại sự oxy hóa; là hợp chất tín hiệu cho sự cộng sinh giữa thực vật và vi khuẩn nốt sần; bảo vệ thực vật trước sự tấn công của vi sinh vật gây hại (như vi khuẩn gây thối rễ ở khoai tây); là vật liệu góp phần vào độ bền của tế bào thực vật và tính thấm của màng tế bào đối với nước và khí (Al-Saikhan et al., 1995; Chirinos et al., 2007). Đối với các thực phẩm, các hợp chất phenol là những chất hoạt động giữ vai trò chủ đạo quyết định hương vị của nhiều loại sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật. Các hợp chất này ảnh hưởng đến màu sắc và vị của hầu hết các sản phẩm thực vật và ở một mức độ nhất định các hợp chất phenol còn tham gia vào quá trình tạo ra các cấu tử thơm mới hình thành nên hương thơm đặc biệt cho sản phẩm (Lê Ngọc Tú, 2003). 6 Các hợp chất phenol rất đa dạng về cấu trúc. Tùy vào cấu tạo mạch carbon mà các hợp chất phenol được phân thành phenol đơn giản (C6), acid phenolic, flavonoid (C6-C3-C6), stilbene (C6-C2-C6) và lignine (C6-C2)n. Cấu trúc của các hợp chất phenol quyết định cơ chế hoạt động chống oxy hóa (Scalbert và Wiliamson, 2000). Các cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất phenol bao gồm khử và gây bất hoạt các gốc tự do nhờ thế oxy hóa khử thấp; tạo phức với các ion Fe2+ và Cu+; kìm hãm hoạt động của các enzyme có khả năng tạo các gốc tự do như xanthine oxydase (Jovanovic và Simic ,2000). Hoạt động của xanthine oxydase cũng là một nguồn tạo các gốc tự do. Khi có mặt của oxy, enzyme này xúc tác sự oxy hóa xanthine thành acid uric, phân tử oxy nhận điện tử và trở thành ion superoxyde. Xantine oxydase Acid uric + 2O2- + 2H+ Xanthine + 2O2 + H2O Các flavanoid có cấu tạo vòng giống như vòng purin của xanthine được xem như chất kìm hãm cạnh tranh của xanthine oxydase do đó ngăn ngừa sự tạo ion superoxyde (Nicole, 2001). Khả năng chống oxy hóa của các hợp chất phenol phụ thuộc chặt chẽ vào đặc điểm cấu tạo của chúng. Các bộ phận đảm nhiệm chức năng chống oxy hóa của phenol gồm các nhóm hydroxyl ở dạng ortho có khả năng cho điện tử; liên kết đôi giữa C2 và C3 và nhóm ceton ở C4 đảm bảo khả năng tạo phức với kim loại (Nicole, 2001; Amic et al., 2003). 2.3.1.2. Vitamine C Vitamine C có khả năng gây bất hoạt các gốc tự do rất tốt do loại vitamine này có thể chuyển cho các gốc tự do hai nguyên tử hydro của chúng và khi đó vitamine C trở thành dehydroascorbic acid (Pincemail et al., 1998; Pincemail, 2006). Ngoài khả năng gây bất hoạt trực tiếp các gốc tự do, vitamine C còn có khả năng hoạt động hiệp lực với các chất chống oxy hóa khác trong cơ thể như vitamine E, carotenoid và flavonoid. Khi có sự tiếp xúc giữa vitamine E và gốc tự do peroxyde của acid béo, vitamine E chuyển điện tử của chúng cho gốc tự do nhưng đồng thời bản thân vitamine E lại trở thành gốc tự do tocopheryl (vitamine E ở dạng oxy hóa). Vitamine C tiến hành khử gốc tocopheryl thành vitamine E 7 nguyên dạng, sẵn sàng gây bất hoạt các gốc tự do peroxyde mới. Các carotenoid và các flavonoid khi gây bất hoạt các gốc tự do cũng được hoàn nguyên với cơ chế tương tự bởi vitamine C. Điều này góp phần hạn chế sự tự kích hoạt oxy hóa (pro-oxydante) của các gốc vitamine E và flavonoid (Jovanovic và Simic, 2000; Burke et al., 2001). 2.3.2. Các chất chống oxy hóa hòa tan trong chất béo 2.3.2.1 Các carotenoid Carotenoid là các hợp chất màu hữu cơ có trong thực vật và một số sinh vật có khả năng quang hợp. Carotenoid đem lại màu vàng đến đỏ cho thực vật đồng thời tham gia quá trình quang hợp với vai trò là sắc tố phụ. Về mặt cấu tạo, các carotenoid thường chứa một mạch carbon dài (35 – 40 carbon) mang nhiều nối đôi, kết thúc bởi một cấu trúc vòng hoặc không; tùy thuộc vào sự có mặt hay không của nhóm hydroxyl ở cấu trúc vòng mà các carotenoid được chia thành caroten và xanthophylle. Đối với con người, các carotenoid là các chất chống oxy hóa quan trọng vì nó có mặt trong rất nhiều loại thực phẩm đồng thời nó có khả năng hoạt động trong môi trường chất béo là nơi rất dễ xảy ra sự oxy hóa và gây hậu quả nghiêm trọng (màng tế bào) (Sergio và Robert, 1999). Các hoạt động chống oxy hóa của các carotenoid bao gồm việc vô hoạt oxy đơn và vô hoạt các gốc tự do (Mortensen et al., 2001; Stahl và Sies, 2003; El-Agamey et al., 2004; Stahl và Sies, 2005). Oxy đơn (O2) là sản phẩm phụ của quá trình oxy hóa sinh học và là một cấu tử có mặt trong không khí (Jovanovic và Simic, 2000; Corol et al., 2002; Baier et al., 2006). Dưới tác dụng của tia cực tím A (UVA, λ = 320 - 400 nm), các phân tử riboflavine, flavinmononucleotid (FMN) và flavin adenine dinucleotid (FAD) hấp thu năng lượng và chuyển lên trạng thái kích thích. Các chất này chuyển năng lượng cho oxy phân tử để trở lại trạng thái bình thường. Oxy khi nhận năng lượng của các chất này trở thành oxy đơn (Krinsky, 1998; Baier et al., 2006). Để chuyển một phân tử oxy bình thường thành oxy đơn cần một năng lượng 22 kcal. Phân tử oxy đơn không ở dạng thuận từ như bình thường mà ở dạng nghịch từ. Chính do vậy các oxy đơn rất dễ dàng phản ứng với 8 DNA, lipid, các phân tử không no của màng tế bào và gây bệnh (Corol et al., 2002; Baier et al., 2006). Trong số tất cả các chất chống oxy hóa tự nhiên, các carotenoid có khả năng gây bất hoạt oxy đơn mạnh nhất (Krinsky, 1998) bởi một cơ chế vật lí. Năng lượng dư của oxy đơn được chuyển cho carotenoid, oxy trở về trạng thái bình thường trong khi carotenoid được chuyển lên trạng thái kích thích. Các carotenoid này sau đó quay trở lại trạng thái bình thường bằng cách phát ra môi trường năng lượng dư thừa mà nó nhận được từ oxy đơn. Khả năng gây bất hoạt oxy đơn của carotenoid phụ thuộc vào số liên kết đôi có trong mạch C. Mỗi phân tử carotenoid có khả năng gây bất hoạt 1000 phân tử oxy đơn trước khi tham gia vào các phản ứng hóa học và bị biến đổi thành các hợp chất khác (Krinsky, 1998). Ngoài khả năng gây bất hoạt oxy đơn, các carotenoid còn gây bất hoạt các gốc tự do bằng cách kết hợp các gốc này theo một trong các cơ chế: (1) chuyển điện tử: Car + ROO → Car+ + ROO- ; (2) chuyển hydro: Car + ROO → Car+ + ROOH ; (3) cộng hợp: Car + ROO → ROOCar (với Car: carotenoid) (Britton, 1995; Mortensen et al., 2001; El-Agamey et al., 2004). Trong cơ thể, các carotenoid hoạt động hiệp lực với các chất chống oxy hóa khác. Các gốc tocopheryl được khử thành dạng hoạt động tocopherol nhờ nhận được hydro từ vitamine C với chất vận chuyển trung gian là carotenoid (Niki et al., 1995; Stahl và Sies, 2003). Thay vì bị thải ra ngoài qua con đường nước tiểu như polyphenol và vitamine C (Jovanovic và Simic, 2000; Tapiero et al., 2002) thì các carotenoid sẽ có đặc điểm hòa tan trong chất béo và được tích lũy trong cơ thể, xâm nhập dễ dàng vào các vị trí dễ bị oxy hóa như màng tế bào do đó hiệu quả chống oxy hóa của chúng cao hơn các chất chống oxy hóa hòa tan trong nước (Huang et al., 2002; Brown et al., 2003). 2.3.2.2. Vitamine E Trong tự nhiên vitamine E tồn tại ở dạng tocopherol và dạng tocotrienol. Cả hai đều chứa một vòng thơm và một chuỗi mạch thẳng 16 carbon. Trong cấu tạo, các hợp chất tocotrienol khác với các tocopherol là có thêm ba nối đôi ở chuỗi mạch C thẳng. Nhóm hydroxyl gắn với vòng thơm quyết định tính chống 9 oxy hóa của vitamine E trong khi mạch carbon đảm bảo khả năng hòa tan trong chất béo của chúng (Huang et al., 2002). Vitamine E tan trong chất béo nên có khả năng thâm nhập sâu vào các màng sinh học vốn chứa nhiều acid béo không no và ngăn cản chuỗi phản ứng oxy hóa lipid. Các vitamine E sẽ chuyển hydro cho gốc tự do peroxyde. Gốc tocopheryl tạo thành được khử về trạng thái ban đầu nhờ vitamine C (Niki et al., 1995; Huang et al., 2002; Pincemail, 2006). Với LOO:+ gốc tự0 do Tocopherol-OH LOO → peroxyde. Tocopherol-O + LOOH, với LOO: gốc tự do peroxyde. Khả năng chống oxy hóa của vitamine E phụ thuộc vào mức độ cản trở không gian của các nhóm methyl ở vị trí ortho đối với nhóm hydroxyl ở vòng thơm. Nhóm hydroxyl càng bị cản trở ít (trường hợp δ-tocopherol và δtocotrienol), khả năng chống oxy hóa càng cao (Huang et al., 2002). 2.4. Giới thiệu về hydrogen peroxyde (H2O2) Hydrogen peroxyde là một chất lỏng không màu ở nhiệt độ phòng có vị đắng. Một lượng nhỏ khí hydrogen peroxyde xảy ra tự nhiên trong không khí. Hydrogen peroxyde là chất không ổn định, dễ dàng phân hủy thành oxy và nước, sinh nhiệt (ATSDR, 2002). Hydrogen peroxyde (H2O2) có vai trò tích cực trong sản xuất năng lượng trong hệ thống cơ thể, thực bào, chuyển tín hiệu tế bào, điều chỉnh tăng trưởng tế bào và tổng hợp các hợp chất sinh học quan trọng (Packer et al., 2008). Tuy nhiên, ở nồng độ cao các hydrogen peroxyde (H2O2) góp phần làm thay đổi cấu trúc DNA, oxy hóa lipid là nguyên nhân gián tiếp gây ra các căn bệnh nguy hiểm như ung thư, gout, tiểu đường, suy tim (Pincemail et al., 1998; Favier, 2003). Hiện nay có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng chất chống oxy hóa có trong thực vật trong việc phân hủy gốc H2O2 có trong cơ thể (Ranju et al., 2009; Anuj et al., 2011; Serhat et al., 2012). 2.5. Giới thiệu về Trolox Trolox là chất chống oxy hóa chuẩn thường được sử dụng để so sánh khả năng làm sạch gốc tự do của các chất cần được khảo sát (Wong et al., 2005). Trolox (6-hydroxy-2, 5, 7, 8 axit-tetramethylchromane-2-carboxylic) là một dẫn 10
- Xem thêm -