Khảo sát histamine trong sản phẩm thủy sản bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

  • Số trang: 62 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 50 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT HISTAMINE TRONG SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ThS. ĐỖ TẤN KHANG Cần Thơ, Tháng 01/2013 SINH VIÊN THỰC HIỆN LÊ ANH VŨ MSSV: 3082568 LỚP: CNSH TT34 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) Đỗ Tấn Khang Lê Anh Vũ DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận văn này ngoài những cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến quý thầy cô, bạn bè và gia đình đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Đặc biệt tôi xin hết lòng cảm ơn: Th.S Đỗ Tấn Khang đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ, cung cấp những tài liệu cần thiết và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đề tài luận văn của mình trong thời gian quy định. Cám ơn các anh chị phụ trách phòng thí nghiệm Enzyme tại Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học: Anh Nguyễn Ngọc Phú và bạn Nguyễn Văn Tính đã truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, tận tình giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Tôi cũng vô cùng biết ơn công lao to lớn của cha mẹ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về vật chất lẫn tinh thần cho tôi hoàn thành khóa học, và thực hiện tốt luận văn này. Cuối lời, tôi xin chúc Quý thầy, cô, cha mẹ và các anh chị nhiều sức khỏe và thành đạt trên lĩnh vực mà mình yêu thích. Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 Lê Anh Vũ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện để đánh giá hiệu quả của các dung môi khác nhau trong phân tích hàm lượng histamine trong hải sản. Kết quả cho thấy histamine trong các mẫu hải sản được ly trích hiệu quả nhất với perchloric acid 0.6M và trichloroacetic acid 6%. Ngoài ra, nghiên cứu còn so sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình bezoyl trong phân tích hàm lượng amine trong hải sản bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả thu được cho thấy có sự khác biệt rõ rệt về hiệu quả phân tích giữa hai quy trình này trong định lượng histamine trên mẫu cá ngừ. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản (0 oC, 4oC) đến sự gia tăng hàm lượng histamine và mật số vi khuẩn trong cá ngừ cũng được nghiên cứu. Cá ngừ bảo quản ở 4oC cho thấy hàm lượng histamine sinh ra cao hơn so với khi được quản ở 0oC. Các mẫu bảo quản ở 0oC có hàm lượng histamine khá thấp (49.1 mg/kg sau 11 ngày bảo quản), trong khi đó khi được bảo quản ở 4oC, các mẫu có chứa hàm lượng cao histamine (161.29 mg/kg sau 7 ngày bảo quản). Sự tăng mật số vi khuẩn theo thời gian bảo quản cũng đã được ghi nhận ở các mẫu thí nghiệm. Mật số vi khuẩn tăng từ 4.54 log10 cfu/g đến 5.88 log10 cfu/g trong các mẫu bảo quản ở 0oC, trong khi đối với các mẫu bảo quản ở 4oC, mức tăng này khá đáng kể với mật số vi khuẩn tăng từ 4.54 log10 cfu/g đến 8.88 log10 cfu/g. Bên cạnh đó, hàm lượng histamine trong một số sản phẩm hải sản cũng được báo cáo trong nghiên cứu này. Từ khóa : HPLC, histamine, hải sản, trichloroacetic acid, perchloric acid, nhiệt độ bảo quản. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC MỤC LỤC .......................................................................................................................i DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................................iv DANH SÁCH HÌNH .....................................................................................................vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................................vi CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU .......................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................1 1.2. Mục tiêu đề tài .........................................................................................2 CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................... 3 2.1. Sơ lƣợc về biogenic amine và histamine ................................................3 2.1.1. Biogenic amine ................................................................................................. 3 2.1.2. Histamine và ngộ độc histamine .................................................................... 4 2.1.3. Sự hình thành biogenic amine ........................................................................ 5 2.1.4. Sự tích lũy histamine trong quá trình chế biến và bảo quản ....................... 5 2.1.5. Các vi khuẩn sinh histamine ........................................................................... 6 2.1.6. Ảnh hưởng đến sức khỏe của histamine và vai trò của các biogenic amine khác ........................................................................................................ 7 2.1.7. Vai trò của các biogenic amine trong đánh giá chất lượng thủy sản ....... 10 2.1.8. Giới hạn cho phép của histamine trong thủy sản ....................................... 11 2.1.9. Phương pháp xác định histamine trong thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................................................................... 12 2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ..............................14 2.2.1. Giới thiệu........................................................................................................ 14 2.2.2 Các bộ phận của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao .......................... 15 CHƢƠNG 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................. 16 3.1. Phƣơng tiện nghiên cứu ........................................................................16 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 16 3.1.2. Hóa chất ........................................................................................................... 16 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ ............................................................................................. 16 3.1.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................ 16 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................16 3.2.1. Tối ưu hóa dung môi ly trích histamine trong hải sản ............................... 16 3.2.2. So sánh quy trình benzoyl và quy trình dansyl trong phân tích histamine trong hải sản ............................................................................ 19 3.2.3. Sự phát triển của hàm lượng histamine và vi khuẩn tổng số trong cá ngừ theo thời gian và nhiệt độ bảo quản ................................................. 20 3.2.4. Xác định hàm lượng histamine có trong một số sản phẩm thủy sản ....... 21 3.2.5. Phương pháp xử lý thống kê ................................................................... 21 CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 22 4.1 Tối ƣu hóa dung môi ly trích histamine trong hải sản ....................... 22 4.2 So sánh quy trình benzoyl và quy trình dansyl trong phân tích histamine trong hải sản ......................................................................... 23 4.3 Sự phát triển của hàm lƣợng histamine và vi khuẩn tổng số trong cá ngừ theo thời gian và nhiệt độ bảo quản .............................. 26 4.4 Xác định hàm lƣợng histamine trong một số sản phẩm thủy sản ..... 31 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................. 33 5.1 Kết luận ................................................................................................... 33 5.2 Kiến nghị................................................................................................. 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 34 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Tên bảng Bảng Trang Bảng 1 Danh mục biogenic amine trong đánh giá chất lượng thủy sản 11 Bảng 2 Thời gian lấy mẫu của các mẫu cá ngừ theo nhiệt độ bảo quản 20 Bảng 3 Chú thích về các mẫu hải sản 21 Bảng 4 Giá trị trung bình hàm lượng histamine trong các mẫu hải sản 31 Bảng 5 Giá trị diện tích peak của dung dịch histamine chuẩn (đo bằng quy Phụ lục trình dansyl) Bảng 6 Giá trị diện tích peak của dung dịch histamine chuẩn (đo bằng quy Phụ lục trình benzoyl) Bảng 7 Hiệu quả của dung môi tách chiết đến hàm lượng histamine định Phụ lục lượng bởi quy trình dansyl Bảng 8 Hiệu quả của dung môi tách chiết đến hàm lượng histamine định Phụ lục lượng bởi quy trình benzoyl Bảng 9 So sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình benzoyl trong Phụ lục phân tích hàm lượng histamine (mẫu 1) Bảng 10 So sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình benzoyl trong Phụ lục phân tích hàm lượng histamine (mẫu 2) Bảng 11 So sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình benzoyl trong Phụ lục phân tích hàm lượng histamine (mẫu 3) Bảng 12 So sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình benzoyl trong Phụ lục phân tích hàm lượng histamine (mẫu 4) Bảng 13 So sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình benzoyl trong Phụ lục phân tích hàm lượng histamine (mẫu 5) Bảng 14 So sánh hiệu quả giữa quy trình dansyl và quy trình benzoyl trong Phụ lục phân tích hàm lượng histamine (mẫu 6) Bảng 15 Sự gia tăng hàm lượng histamine trong cá ngừ trữ ở 4oC theo thời Phụ lục Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ gian bảo quản Bảng 16 Sự gia tăng hàm lượng histamine trong cá ngừ trữ ở 0oC theo thời Phụ lục gian bảo quản Bảng 17 Sự gia tăng mật số vi khuẩn trong cá ngừ trữ ở 4oC theo thời gian Phụ lục bảo quản Bảng 18 Sự gia tăng mật số vi khuẩn trong cá ngừ trữ ở 0oC theo thời gian Phụ lục bảo quản Bảng 19 Hàm lượng histamine theo dung môi ly trích (định lượng bởi quy Phụ lục trình dansyl) Bảng 20 Hàm lượng histamine theo dung môi ly trích (định lượng bởi quy Phụ lục trình benzoyl) Bảng 21 Hàm lượng histamine các mẫu cá ngừ trữ ở 4oC theo thời gian lưu Phụ lục trữ Bảng 22 Hàm lượng histamine các mẫu cá ngừ trữ ở 0oC theo thời gian lưu Phụ lục trữ Bảng 23 Mật số vi khuẩn có trong các mẫu cá ngừ trữ ở 4oC theo thời gian Phụ lục lưu trữ Bảng 24 Mật số vi khuẩn có trong các mẫu cá ngừ trữ ở 0oC theo thời gian Phụ lục lưu trữ Bảng 25 Hàm lượng histamine có trong một số mẫu thủy sản mua tại các Phụ lục siêu thị tại thành phố Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1 Các amino acid tiền chất và các enzyme amino acid decarboxylase 3 trong sự hình thành biogenic amine trong thủy sản Hình 2 Cấu trúc hóa học của histamine 4 Hình 3 Các con đường chuyển hóa của sự hình thành các biogenic amine 9 Hình 4 Giá trị trung bình hàm lượng histamine thu được khi ly trích bằng 22 các dung môi khác nhau. Hình 5 Sắc ký đồ của dung dịch histamine chuẩn và dung dịch mẫu ly trích 24 Hình 6 Giá trị trung bình hàm lượng histamine định lượng bằng quy trình 25 dansyl và quy trình benzoyl Hình 7 Giá trị trung bình hàm lượng histamine trong các mẫu cá ngừ trữ ở 27 4oC theo thời gian bảo quản Hình 8 Giá trị trung bình hàm lượng histamine trong các mẫu cá ngừ trữ ở 27 0oC theo thời gian bảo quản Hình 9 Giá trị trung bình mật số vi khuẩn trong các mẫu cá ngừ trữ ở 4 oC 29 theo thời gian bảo quản Hình 10 Giá trị trung bình mật số vi khuẩn trong các mẫu cá ngừ trữ ở 0 oC 29 theo thời gian bảo quản Hình 11 Biểu đồ đường chuẩn histamine (đo bằng quy trình dansyl) Phụ lục Hình 12 Biểu đồ đường chuẩn histamine (đo bằng quy trình benzoyl) Phụ lục Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AOAC Association of Official Analytical Chemists BA Biogenic Amine DAO Diamine Oxidase FAA Free Amino Acid FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations FDA Food and Drug Administration HACCP Hazard Analysis and Critical Control Points HMT Histamine-N-methyltransferase HPLC High Performance Liquid Chromatography IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry MAO Monoamine Oxidase OPA o-Phthalaldehyde ppb parts per billion ppm parts per million PCA Perchloric Acid TCA Trichloroacetic Acid WHO World Health Organization Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay ngộ độc histamine đang là một trong những mối nguy phổ biến nhất đối với sức khỏe của người tiêu dùng. Ngộ độc histamine xảy ra sau khi ăn phải một số hải sản có chứa hàm lượng cao histamine và có thể là một số biogenic amine khác. Các loài cá có liên quan bao gồm cá thu, cá ngừ, cá nục và một số loài cá khác thuộc họ Scombroidiae. Các loài cá này có chứa hàm lượng cao histidine tự do trong mô của chúng. Và khi điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn (ví dụ khi cá được bảo quản trong nhiệt độ không thích hợp), enzyme decarboxylase do vi khuẩn sinh ra sẽ chuyển hóa histidine thành histamine. Một vài biogenic amine khác sinh ra trong quá trình phát triển của vi khuẩn có thể làm tăng độc tính của histamine. Các triệu chứng ngộ độc có thể khác nhau tùy thuộc vào hàm lượng histamine và sự nhạy cảm của mỗi người đối với histamine. Tại một số nơi trên thế giới, ngộ độc histamine chiếm tỷ lệ lớn nhất trong các trường hợp ngộ độc liên quan đến cá (FAO/WHO, 2012). Tại Việt Nam, ngộ độc histamine thường xảy ra và các loài cá thường liên quan đến các trường hợp này là cá ngừ, cá thu (Bộ Thủy Sản, 2003). Sau khi đánh bắt, cá tươi có hàm lượng histamine rất thấp nhưng hàm lượng này tăng lên cùng với sự phân hủy của cá. Do đó, histamine cũng đã được sử dụng làm chất chỉ thị hóa học để đánh giá chất lượng của cá. Cơ quan FDA đã thiết lập tiêu chuẩn cho hàm lượng histamine trong cá ăn được là 50 mg/kg (FDA, 2005) và các loại cá có hàm lượng histamine cao hơn quy định này sẽ bị cấm bán cho người tiêu dùng. Để cung cấp cơ sở cho thực hành phân tích mối nguy và điểm kiểm soát tới hạn (HACCP) trong cá và các sản phẩm từ cá một phương pháp nhanh chóng, chính xác, độ tin cậy cao để xác định hàm lượng histamine là cần thiết. Nhiều phương pháp định lượng histamine đã được phát triển. Phương pháp chính thức của AOAC (AOAC, 1995) sử dụng quang phổ để định lượng histamine có ưu điểm là nhạy, tính lặp lại cao nhưng phức tạp và tốn thời gian. Bên cạnh đó, nhiều phương pháp sắc ký cũng đã được áp dụng để phân tách và định lượng histamine trong thực phẩm, bao gồm: sắc ký khí, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng, và sắc ký lỏng hiệu năng cao. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Histamine có tầm quan trọng cao trong công nghiệp thực phẩm. Những năm gần đây xuất hiện nhiều nghiên cứu tập trung vào histamine do tiềm năng ứng dụng to lớn của amine này trong đánh giá chất lượng hải sản và các sản phẩm làm từ hải sản. Ngoài ra, hàm lượng cao histamine trong hải sản cũng là một mối nguy đối với sức khỏe người tiêu dùng. Vì tầm quan trọng của histamine, nhằm mục đích nghiên cứu quy trình định lượng histamine nhanh chóng, chính xác trong thực phẩm nên đề tài “Khảo sát histamine trong sản phẩm thủy sản bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” được thực hiện. 1.2. Mục tiêu đề tài Tối ưu hóa quy trình ly trích và định lượng histamine bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Khảo sát sự gia tăng hàm lượng histamine trong sản phẩm thủy sản theo thời gian và nhiệt độ bảo quản. Định lượng histamine trong một số sản phẩm thủy sản phổ biến trên thị trường, từ đó so sánh với tiêu chuẩn cho phép. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU Sơ lƣợc về biogenic amine và histamine 2.1. 2.1.1. Biogenic amine Biogenic amine là những hợp chất hữu cơ có một hoặc nhiều nhóm amine trong phân tử và có trọng lượng phân tử nhỏ (Hình 1). Các hợp chất này hiện diện trong nhiều loại thực phẩm, bao gồm cá và các sản phẩm làm từ cá. Dựa vào cấu trúc hóa học, các biogenic amine có thể được chia thành 3 nhóm: aromatic amine (histamine, tyramine, serotonin, β-phenylalanyl, và tryptamine), aliphatic amine (putrescine và cadaverin), hoặc aliphatic polyamine (agmatine, spermidine, và spermine) (Smith, 1980). Hình 1. Các amino acid tiền chất và các enzyme amino acid decarboxylase trong sự hình thành biogenic amine trong thủy sản. (Nguồn: Nollet và Toldra, 2011) Quá trình trao đổi chất ở động vật, thực vật và vi sinh vật tạo thành một trong các chất trên (putrescine, spermidine, cadaverine và agmatine và spermine) một cách tự nhiên. Một vài trong số các amine này đóng vai trò quan trọng đối với sinh lý người và Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ động vật. Chúng cần thiết cho sự phát triển tế bào và có vai trò quan trọng trong điều hòa tổng hợp nucleic acid và protein (Barzdoc và cs, 1995). Ngoài ra, biogenic amine cũng được sinh ra từ sự khử nhóm carboxyl của các amino acid tự do (Smith, 1980; Halasz et al., 1994; Bazdoc, 1995; Shalaby, 1996). Các biogenic amine quan trọng vì hai lý do. Thứ nhất, việc tiêu thụ thực phẩm chứa nhiều biogenic amine có thể nguy hiểm cho sức khỏe (Bazdoc, 1995; Shalaby, 1996; Lehane và Olley, 2000). Thứ hai, chúng có thể dùng làm chất chỉ thị để đánh giá chất lượng thủy sản (Mietz và Karmas, 1977; Ruiz-Capillas và Moral, 2001; Yamanaka et al., 1989). 2.1.2. Histamine và ngộ độc histamine Histamine là ―một amine được tạo thành trong quá trình chuyển hóa amino acid histidine dưới sự xúc tác của các enzyme thuộc nhóm decarboxylation enzyme; một chất kích thích mạnh mẽ cho sự tiết dịch vị, chất gây giãn mạch máu và đồng thời cũng là chất dẫn truyền của các dây thần kinh trung tâm‖ (Pubchem, 2012). Histamine có công thức hóa học là C5H11Cl2N3 (Hình 1). Phân tử này có danh pháp theo IUPAC là 2-(3H-imidazol-4-yl)ethanamine dihydrochloride và có trọng lượng phân tử là 111.14506 g/mol (Pubchem, 2012). Hình 2. Cấu trúc hóa học của histamine. (Nguồn: Pubchem, 2012) Ngộ độc histamine (histamine poisoning) thường được biết đến như ngộ độc scrombroid (scrombroid poisoning) do các triệu chứng ngộ độc xảy ra là kết quả của việc ăn phải các loài cá bị ôi, ươn thuộc họ Scombridae và Scombresocidae như cá thu, cá dũa (mahi mahi), cá bluefish, cá ngừ, cá skipjack, cá thu đao (saury), cá nục và một số loài cá khác. Ngộ độc histamine thường được phát hiện trong các trường hợp ngộ độc thực phẩm liên quan đến các biogenic amine (Halasz et al., 1994). Tuy nhiên, các Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ biogenic amine khác như putrescine và cadaverine cũng có thể gây ngộ độc, thậm chí ngay cả khi không có sự hiện diện của histamine (FDA, 2001). Các enzyme histidine decarboxylase và histaminase là những enzyme được biết đến nhiều nhất trong vai trò chuyển hóa histidine thành histamine (Taylor, 1986; Middlebrooks et al. 1988; Flick et al., 2001). 2.1.3. Sự hình thành biogenic amine Sự hình thành các biogenic amine có thể xảy ra theo hai cách: bằng quá trình decarboxylation nội sinh hoặc quá trình decarboxylation ngoại sinh. Quá trình decarboxylation nội sinh bao gồm sự hình thành các biogenic amine bởi các enzyme decarboxylase có trong tế bào của các loài cá và các loài sinh vật biển khác, trong khi quá trình decarboxylation ngoại sinh diễn ra dưới sự hoạt động của các vi sinh vật có khả năng tạo ra các enzyme decarboxylase ngoại bào. Tuy nhiên, quá trình sinh tổng hợp histamine và các biogenic amine cũng có thể được thực hiện bởi động vật. Ở trạng thái bình thường, tế bào động vật có chứa sẵn histamine, nhưng không có hoạt tính vì ở dạng phức hợp protein. Khi cơ thể động vật bị mẫn cảm hay bị kích thích, kháng nguyên ức chế yếu tố kháng protease; protease không bị kiềm chế nữa, tác động lên phức hợp protein và giải phóng histamine. (Medina et al., 2003; Rodrigues-Caso et al., 2003). 2.1.4. Sự tích lũy histamine trong quá trình chế biến và bảo quản Sự tích lũy histamine là kết quả của sự lạm dụng thời gian/ nhiệt độ trong quá trình chế biến và bảo quản dẫn đến hư hỏng thực phẩm. Để giảm thiểu nguy cơ này, tổ chức FDA (2001) đề xuất các loại cá sau khi đánh bắt cần được bảo quản dưới 4oC. Thời gian từ lúc cá chết đến lúc cá được bảo quản không được quá 6 giờ. Mức nhiệt độ 4oC hoặc thấp hơn được xem như đủ để hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật mang mầm bệnh. Các vi khuẩn sinh histamine có mặt khá phổ biến trong môi trường nước biển. Chúng thường có mặt trong mang và ruột của các loài cá biển. Theo Letker et al. (1978), hàm lượng histamine trong cá ngừ bị ôi, ươn có thể cao đến 9190 ppm. Hàm lượng histamine ở phần thân trên của cá thường cao hơn hàm lượng ở phần thân dưới. Do đó, phần thân trên của cá thường được lựa chọn để thực hiện phân tích hàm lượng histamine (FDA, 2004). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Sau khi chết, cơ chế bảo vệ các cơ quan của cá trước sự nhiểm khuẩn không còn hoạt động (Connell, 1990). Từ đó, vi khuẩn có thể xâm nhập qua da, qua các lỗ trên cơ thể, qua đường ruột hoặc thâm nhập qua các mạch máu ở mang và thận (Gram và Huss, 1996). Những vi khuẩn này có thể sinh histamine trong quá trình phát triển của chúng. Do đó, việc moi ruột và loại bỏ mang cá trong quá trình sơ chế có thể làm giảm số lượng vi khuẩn sinh histamine, và kết quả là tạo ra các sản phẩm có chất lượng cao hơn (Craven et al., 2001). Tuy nhiên, những biện pháp này không thể loại bỏ hoàn toàn sự phát triển của vi khuẩn. 2.1.5. Các vi khuẩn sinh histamine Enterobacter, Clostridium, Hafnia, Klebsiella, Lactobacillus, Photobacterium, Proteus, Pseudomonas và Vibrio spp. là những loài vi khuẩn có khả năng sinh các enzyme decarboxylase, nhất là enzyme histidine decarboxylase (Taylor et al., 1979; Eitenmiller et al., 1982; Yoshinaga và Frank, 1982; Ababouch, 1991; Ben-Gigirey et al., 2000; Flick et al., 2001; Kim et al., 2001; Takahashi et al., 2003). Vi khuẩn sinh histamine có thể phát triển trong một khoảng nhiệt độ rộng. Nhiều nghiên cứu về khả năng sinh sinh histamine đã được thực hiện trên những điều kiện khác nhau và trên những loài cá khác nhau (Lerke, 1978; Eitenmiller et al., 1982; Kim et al., 2002; Ozogul, 2004) . Sự phát triển của vi khuẩn hay khả năng sinh ra histamine thường không xuất hiện ở nhiệt độ 5oC hoặc thấp hơn. Nghiên cứu của Cravel et al. (2001) cho rằng cá ngừ albacore được làm lạnh ngay lập tức ở nhiệt độ 10 oC hoặc thấp hơn có hàm lượng histamine thấp. Kết quả phân tích ngay sau khi cá được đưa lên bờ cho thấy hàm lượng histamine cao nhất ghi nhận được chỉ có 1.5 ppm, mặc dù các mẫu cá này đã được làm lạnh từ 6 đến 8 ngày trong quá trình đánh bắt. Nghiên cứu về vi khuẩn sinh histamine trên các mẫu cá ngừ albacore tươi bởi Kim et al. (2002) đã phân lập được các chủng vi khuẩn Hafnia alvi, Photobacterium damselae, Acinetobacter lwoffi, Enterobacter cloacae từ mang; H. alvei, E. cloacae, E. aerogenes và A. lwoffi từ da; A. lwoffi và 3 chủng chưa được định danh từ ruột. Mật số vi khuẩn cao nhất được tìm thấy trên mang dao động từ 6.9x104 đến 7.7x104 cfu/g. Trong số các vi khuẩn tìm thấy, P. damselae được cho là vi khuẩn sinh histamine nhiều nhất. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ Klausen và Huss (1987) cho rằng enzyme histidine decarboxylase được tạo ở nhiệt độ cao vẫn có thể hoạt động ở nhiệt độ thấp hơn nhiều. Tuy nhiên, sự hình thành histamine có vẻ thường là kết quả của sự ôi thiu thực phẩm ở nhiệt độ cao trong thời gian ngắn hơn là sự ôi thiu ở nhiệt độ thấp trong thời gian dài (FDA, 2001). Nhận định này được ủng hộ bởi nghiên cứu của Eitenmiller et al. (1982) về hoạt động của enzyme decarboxylase và sự gia tăng hàm lượng histamine trong cá ngừ vây vàng bị nhiễm vi khuẩn Proteus morganii. 2.1.6. Ảnh hƣởng đến sức khỏe của histamine và vai trò của các biogenic amine khác Các biogenic amine được xem như là các yếu tố kháng dinh dưỡng tự nhiên và là tác nhân gây ngộ độc thực phẩm. Khả năng của chúng trong việc kích thích các phản ứng dược lý trong cơ thể con người là mối quan tâm hàng đầu đối với sức khỏe cộng đồng. 2.1.6.1. Ảnh hưởng dược lý của các biogenic amine Histamine có thể gây ra nhiều hiệu ứng dược lý như giải phóng adrenaline và noradrenaline; kích thích cử động cơ trơn của dạ con, ruột non và đường hô hấp; kích thích các neuron thần kinh vận động và cảm giác; điều khiển sự tiết dịch vị. Putrescine và cardaverine có thể gây hạ huyết áp, cứng hàm, giảm nhịp tim, gây liệt các chi và tăng tiềm lực độc tố của các amine khác. Tryptamine có thể làm tăng huyết áp, trong khi tyramine có thể tác dụng như chất làm giảm sự co mạch, tăng lượng máu ra khỏi tim, gây chảy nước mắt, tăng hô hấp, tăng lượng đường huyết, giải phóng noradrenaline từ hệ thống thần kinh giao cảm, và có thể gây ra hội chứng đau nửa đầu (Shalaby, 1996). Triệu chứng ngộ độc histamine có thể chia ra làm bốn nhóm chính: đường tiêu hóa, da, thần kinh và máu. Các triệu chứng xuất hiện trên da bao gồm nổi mẩn ngứa, rát, nổi mề đay, phù da và viêm da tại chỗ (Purohit et al., 2002). Các triệu chứng đường tiêu hóa có thể gồm buồn nôn, ói mửa và tiêu chảy (Scoging, 1998). Đau đầu, cảm giác nóng ran, phồng rộp và nóng trong miệng là những triệu chứng ảnh hưởng của amine đến hệ thần kinh. Các triệu chứng về máu bao gồm sự tăng huyết áp. Sabroe và Black (1998) cho rằng phát ban đỏ, tức ngực, cảm giác hồi hộp, lo lắng, hoa mắt, chóng mặt, khó thở cũng là những triệu chứng của ngộ độc histamine. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ 2.1.6.2. Sự chuyển hóa histamine Histamine có thể được tìm thấy ở nhiều bộ phận ở nhiều sinh vật, trong đó có cả con người. Nhìn chung, hàm lượng histamine thường tập trung nhiều nhất ở tế bào nội tiết (ở biểu mô) và trong các dưỡng bào (Befus et al., 1999). Theo Klawasser et al. (1994), tế bào bạch cầu và tế bào lympho ở người chứa khoảng 0.05 pg histamine trên mỗi tế bào. Cũng có nhiều báo cáo cho rằng rất nhiều loại tế bào khác, bao gồm đại thực bào có chứa histamine. Ngộ độc histamine và triệu chứng ngộ độc chỉ xuất hiện khi amine này xâm nhập vào đường máu. Cơ thể người có hệ thống khử độc khá hiệu quả trong ruột non giúp chuyển hóa histamine bởi các vi khuẩn đường ruột (Shalaby, 1996). Các enzyme monoamine oxidase (MAO), diamine oxidase (DAO) và histamineN-methyltransferase (HMT) là một trong số những enzyme trong ruột non đã được xác định có thể chuyển hóa histamine thành các chất không độc (Taylor, 1986; Bodmer et al., 1999). Hệ thống khử độc này hoạt động khá hiệu quả để xử lý một lượng histamine mà con người hấp thụ trong bữa ăn hằng ngày. Tuy nhiên, hệ thống này là không đủ để xử lý một lượng lớn histamine có trong các sản phẩm cá bị ôi, ươn. 2.1.6.3. Sự tăng tiềm lực ngộ độc histamine Các chất có khả năng ức chế/ngăn chặn sự chuyển hóa histamine được gọi là các chất tăng tiềm lực histamine. Các chất này làm tăng ảnh hưởng ngộ độc histamine và có thể đi vào cơ thể qua thức ăn. Cơ chế tăng tiềm lực có thể giải thích qua một trong những cơ chế sau: - Gây ức chế các enzyme chuyển hóa histamine (Sattler et al., 1988), - Cạnh tranh vị trí bám với histamine trong cơ chế bám vào phức hợp mucinehistamine (Lehane và Olley, 2000), - Kích thích sự giải phóng histamine nội bào từ các dưỡng bào (Veien et al., 2000). Ảnh hưởng đến sức khỏe gây ra bởi ngộ độc histamine do ăn phải cá bị ôi, ươn nhìn chung nguy hiểm hơn những trường hợp bị ngộ độc do tiêm một lượng tương đương histamine vào cơ thể (FAO, 2003). Có những đề xuất cho rằng các amine khác Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ có thể đóng vai trò như chất làm tăng độc tính của histamine. Theo Durand et al. (1973) thì lượng độc tố gây ra bởi 150 ppb putrescine dihydrochloride hấp thụ cùng lúc với 300 ppb histamine dihydrochloride bằng với lượng độc tố gây ra bởi 1200 ppb putrescine dihydrochloride hay 300 ppb histamine dihydrochloride. Rượu và một số loại thuốc như d-Tubocurarine, pancuronium, alcuronium và aminoguanidine được biết đến như những chất làm tăng hoạt lực (Sattler et al., 1985; Sattler và Lorenz, 1990; Stratton et al., 1991). Các chất này ức chế enzyme diamine oxidase trong quá trình chuyển hóa histamine. Các amine khác, ví dụ như spermine, spermidine, putrescine, cadarverine, tryptamine, tyramine và b-phenylethylamine cũng có thể hoạt động như chất tăng tiềm lực bằng cách làm tăng sự vận chuyển histamine qua màng dạ dày (Chu và Bjeldanes, 1981). Hình 3. Các con đƣờng chuyển hóa của sự hình thành các biogenic amine. (Nguồn: Halasz et al., 1994) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 - 2013 2.1.7. Trường Đại học Cần Thơ Vai trò của các biogenic amine trong đánh giá chất lƣợng thủy sản Mặc dù sự kiểm soát các biogenic amine trong thủy sản thường được cam kết vì sự liên quan của các amine này trong các trường hợp ngộ độc thực phẩm, sự định lượng các biogenic amine này cũng được đề xuất như là chỉ tiêu chất lượng để phát hiện cá ôi, ươn hay sai sót trong quá trình bảo quản, chế biến thủy sản (Mietz và Karzas, 1977; Ruiz-Capillas và Moral, 2001; Yamanaka et al., 1987; Yamanaka et al., 1989). Các biogenic amine thường được sử dụng như chất chỉ thị chất lượng vì chúng biến đổi hàm lượng trong quá trình chế biến và bảo quản. Các biogenic amine này được tìm thấy ở nồng độ thấp ở cá tươi và có xu hướng tăng lên trong quá trình bảo quản và thường gắn với sự ôi thiu thực phẩm do vi khuẩn (Halasz et al., 1994; Emborg et al., 2002). Hàm lượng histamine thường được sử dụng như chỉ thị xác định độ tươi/ôi thiu của cá ngừ, do ở cá tươi hàm lượng histamine rất thấp (Mietz và Karmas, 1977; Farn và Sims, 1987; Wei et al., 1990). Hàm lượng cao histamine thường liên quan đến các sản phẩm thối rữa, nhưng không áp dụng cho mọi trường hợp. Do đó, cả hàm lượng histamine và sự đánh giá cảm quan được dùng để đánh giá sự chấp nhận sản phẩm cá ngừ (FDA, 2004). Danh mục biogenic amine của Mietz và Karmas (1977) được dùng phổ biến như tiêu chuẩn để đánh giá sự ôi, ươn của cá dựa trên hàm lượng một số biogenic amine phổ biến (histamine, cadaverine, putrescine, spermidine, and spermine) (Bảng 1). Giới hạn chấp nhận được cho danh mục chất lượng này được thiết lập là 10. Sau đó, một số tác giả khác đề xuất chỉ số được tính toán từ việc cộng hàm lượng histamine, tyramine, cadaverine, và putrescine cho thấy mối tương quan tốt với thời gian lưu trữ và đánh giá cảm quan trong đánh giá chất lượng cá ngừ (Veciana-Nogues, 1997). Một số biogenic amine cũng đã được sử dụng riêng lẻ để đánh giá chất lượng thủy sản. Tổ chức Food and Drug Administration (Commission Regulation, 2005) khuyến cáo không chỉ histamine có thể chỉ ra mức độ khiếm khuyết trong bảo quản thực phẩm, mà các số liệu khoa học khác cũng có thể sử dụng để đánh giá độ tươi của cá, ví dụ như sự hiện diện của các biogenic amine khác liên quan đến sự thối rữa của cá. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Xem thêm -