Tài liệu Khảo sát đa dạng di truyền và xác lập chỉ thị phân tử cho việc nhận dạng một số dòng bơ (persea americana miller) đã qua sơ bộ tuyển chọn tại lâm đồng

TRƢỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT KHOA SINH HỌC BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN ĐỀ TÀI KHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC LẬP CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHO VIỆC NHẬN DẠNG MỘT SỐ DÒNG BƠ (Persea americana Miller) ĐÃ QUA SƠ BỘ TUYỂN CHỌN TẠI LÂM ĐỒNG Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: LÊ NGỌC TRIỆU NGUYỄN HOÀNG PHONG (CSK 38) NGUYỄN THANH TIỀN (CSK 38) MAI TIẾN ĐẠT (CSK 39) THÁI THẠCH BÍCH (CSK 39) ĐẶT VẤN ĐỀ   Đánh giá đa dạng di truyền, xác lập chỉ thị phân tử cùng với khảo sát hình thái cũng như đặc điểm nông học của các tập đoàn giống đã được tiến hành phổ biến trên các đối tượng tài nguyên thực vật. Đây là những công việc cần thiết nhằm làm tăng hiệu quả cho quá trình nhận dạng, phát triển và chọn tạo giống mới đối với cây trồng. Bơ là một loại cây ăn quả có giá trị kinh tế cao, có tiềm năng phát triên ở Lâm Đồng. Đã có nhiều chủng giống bơ được trồng nơi đây nhưng cơ sở dữ liệu cho việc nhận dạng, chọn tạo và công nhận giống còn chưa hoàn thiện, cần phải được nghiên cứu thêm. Trước mặt cần triển khai ghi nhận đặc điểm sơ bộ về hình thái quả và năng suất của các dòng bơ đang được phát triển; đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn này và xác lập chỉ thị phân tử cho việc nhận dạng các dòng bơ tiềm năng nhằm: - Bổ sung cho cơ sở dữ liệu nhận dạng dòng đối với cây trưởng thành cũng như ngay từ giai đoạn vườn ươm. - Tạo cơ sở cho chiến lược chọn tạo và phát triển giống. Đó là lý do đề tài này được đăng ký và triển khai thực hiện. Vật liệu: Qua khảo sát ban đầu, có nhiều dòng/giống bơ nhập nội và được chọn tạo trong nước được canh tác tại Lâm Đồng. Tuy vậy có 11 dòng bơ được chọn tạo trong nước đang được phát triển. Đây là đối tượng nghiên cứu chính của đề tài. 11 dòng được khảo sát các đặc điểm cơ bản về năng suất và hình thái quả và đánh giá đa dạng di truyền gồm: 04 05 Hải triều 1 Hải Triều 2 34 36 34 lai HO TO BM00 BM02 Trong đó, 06 dòng cần được xác lập chỉ thị phân tử, gồm: 04 05 Hải triều 1 Hải Triều 2 34 36 Nội dung, phương pháp và kết quả nghiên cứu Nội dung 1: Ghi nhận sơ bộ đặc điểm hình thái và nông học của các dòng bơ khảo sát Phƣơng pháp: Dựa vào dữ liệu ghi nhận thực tế và thu thập thông tin từ người dân, các nhà nghiên cứu, kinh doanh bơ, đặc biệt là tham khảo kết quả nghiên cứu của Trung tâm Nghiên cứu và phát triển cây trồng thành phố Bảo Lộc. Các đặc điểm ghi nhận gồm: + Đặc điểm quả: màu sắc, độ dày vỏ, chất lượng thịt quả, kích thước hạt, trọng lượng và hình dạng chung của quả. + Đặc điểm năng suất thông qua các phiếu hỏi. Kết quả: DÒNG BƠ 04 Địa chỉ thu mẫu: Đức Giang – Bảo Lâm Năng suất: 300kg/cây/năm Quả thon dài, thịt quả vàng nhạt, ráo, dẻo Khi chín vỏ quả màu xanh Cỡ hạt: Trung bình DÒNG BƠ 05 Địa chỉ thu mẫu: Thôn 8 – Tâm châu – Di Linh Năng suất: 220kg/cây/năm Thịt qủa vàng, hạt nhỏ Quả thuôn dài Vỏ quả chín có màu xanh Cỡ hạt: Trung bình Trọng lượng quả trung bình: 600g DÒNG BƠ 34 Địa chỉ thu mẫu: khu 4 – Phƣờng B’Lao – Bảo Lộc. Năng suất: khoảng 300kg/cây/năm Chín vỏ da màu xanh thuôn dài, cơm vàng, hạt bé ( có trái không hạt ) Chiều dài quả từ 25 cm đến 35 cm Khối lượng quả từ 300g đến 800g DÒNG BƠ 34 LAI Địa chỉ thu mẫu: Trang trại giống bơ Hải Triều – Đambri – Bảo Lộc Năng suất: khoảng 250kg/cây/năm Khi chín vỏ quả có màu xanh, quả hơi tròn Hạt trung bình, không dính vỏ DÒNG BƠ 036 Địa chỉ thu mẫu: Trang trại PGS. Nguyễn Văn Kết - Đức Trọng- Lâm Đồng Năng suất: 200- 300 kg/cây/năm Vỏ quả chín có màu xanh, quả hình bầu dục, thịt quả dày màu vàng đậm, dẻo, béo Trọng lượng quả trung bình 750g Kích cỡ hạt: Trung bình DÒNG BƠ HO Địa chỉ thu mẫu: Trang trại PGS. Nguyễn Văn Kết Đức Trọng- Lâm Đồng Năng suất: 160 – 180 kg/cây/năm Trọng lượng quả: 380 – 450 g Vỏ quả già màu tím nhạt, thịt quả vàng kem, khá béo, không xơ. Hạt gắn khít thịt quả nhưng dễ tách. Hoa sai, khả năng đậu quả cao DÒNG BƠ TO Địa chỉ thu mẫu: Trang trại PGS. Nguyễn Văn Kết Đức Trọng- Lâm Đồng Năng suất: 150 – 200 kg/cây/năm Trọng lượng quả: 380 – 450 g Vỏ quả già màu tím nhạt, hơi sần, không xơ Kích cỡ hạt: Trung bình Hoa trổ đồng thời và đều nhau trên toàn cây DÒNG BƠ BM00 Địa chỉ thu mẫu: Trang trại PGS. Nguyễn Văn Kết Đức Trọng- Lâm Đồng Năng suất: 160 – 180 kg/cây/năm Trọng lượng quả: 380 – 450 g Vỏ quả già màu tím, mỏng, nhẵn bóng, cơm dày, ít sơ Kích cỡ hạt: Trung bình DÒNG BƠ BM02 Địa chỉ thu mẫu: Trang trại PGS. Nguyễn Văn Kết Đức Trọng- Lâm Đồng Năng suất: 140 – 180 kg/cây/năm Trọng lượng quả: 180 – 200 g Quả hình tròn đều Vỏ quả chín xanh, hơi sần, Kích cỡ hạt: Trung bình DÒNG BƠ HẢI TRIỀU 2 Địa chỉ thu mẫu: Trang trại giống bơ Hải Triều – Đambri - Bảo Lộc Năng suất: Vẫn chưa rõ Màu quả khi chín : Xanh Hình hạng quả: Oval hơi dài Thịt quả: Vàng nhạt, không sơ, đặc đều Hạt: Tròn, không lắc Khối lượng của quả: 250- 475g DÒNG BƠ HẢI TRIỀU 1 Địa chỉ thu mẫu: Trang trại giống bơ Hải Triều – Đambri - Bảo Lộc Năng suất: 650 kg/cây/năm Màu quả khi chín : Xanh Hình hạng quả: Oval dài đều -Hạt: Dính thịt quả , không lắc, hình tròn -Khối lượng của quả: 420- 680g Nội dung 2: Tách chiết, kiểm tra nồng độ và chất lƣợng DNA DNA từ mẫu lá được tách chiết theo quy trình CTAB I có cải tiến (bổ sung SDS 10% vào đệm chiết) DNA sau tách chiết được kiểm tra nồng độ và chất lượng bằng phương pháp kiểm tra mật độ quang ở các bước sóng 260nm và 280nm. Kết quả + 11 mẫu DNA của 11 dòng bơ khảo sát, trong đó có 6 dòng cần phát triển marker nhận dạng với 3 mẫu/dòng đã được tách chiết và tinh sạch + Các mẫu DNA sau tách chiết đạt độ tinh sạch cao với lượng đủ cho các thực nghiệm tiếp theo. Nội dung 3: Làm nảy sinh đặc trƣng nhận dạng DNA dựa trên PCR Phƣơng pháp: Sử dụng kỹ thuật ISSR (Khuếch đại đoạn giữa các trình tự lặp đơn giản) để làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA với 10 mồi được sử dụng sau: STT Tên mồi Trình tự Ta (0C) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ISSR 808 ISSR 844B ISSR 17899B HB9 HB14 HB13 UBC 856C UBC 856T UBC 873 UBC 859G Tổng thể 5' –(AG)8 C-3' 5' –(CT)8 GC-3' 5'-(CA)6 GG-3' 5'-(GT)6 GG-3' 5'-(CTC)3 GC-3' 5'-(GAG)3 GC-3' 5'-(AC)8 CA-3' 5'-(AC)8 TA-3' 5'-(GACA)4 -3' 5' –(TG)8 GC-3' 52 52 54 52 52 52 52 52 52 51,5 Số band ghi nhận cho đánh giá đa dạng di truyền11 dòng bơ 7 10 16 7 10 11 9 11 15 2 98 Số band ghi nhận cho việc xác lập chỉ thị phân tử nhận dạng 6 dòng bơ 17 18 12 14 11 10 14 13 14 02 125 Khuếch đại DNA: Phản ứng PCR được thực hiện với dung tích 20 µl chứa 2 mM MgCl2, 0.25 mM mỗi loại dNTP, 1U Taq DNA polymerase (ThermoScientific), 0.2 µM mồi và khoảng 30 ng khuôn mẫu DNA, BSA 0.5%. Chương trình nhiệt sau: 94 0C trong 5 phút; 10 chu kỳ, mỗi chu kỳ có tiến trình nhiệt 94 0C trong 45 giây Nhiệt độ bắt mồi thích hợp +5 (Ta +5) 0C (Ta trong bảng trên) trong 45 giâygiảm dần 0,5 0C/chu kỳ Kéo dài mạch ở 720C trong 1 phút 30 giây; 36 chu kỳ, mỗi chu kỳ có tiến trình nhiệt 94 0C trong 45 giây Nhiệt độ bắt mồi thích hợp (Ta) trong 45 giây Kéo dài mạch ở 720C trong 1 phút 30 giây Bước kéo dài mạch cuối cùng ở 720C trong 15 phút. (Touchdown PCR) Điện di, chụp ảnh gel: Sản phẩm khuếch đại được phân tách trên gel agarose 2%, sử dụng đệm TBE với điện thế 60 Volt, gel sau điện di được nhuộm với ethidium bromide (0.5 µg/ml), và được chụp ảnh dưới các ánh sáng cực tím có bước sóng 254/312 nm Kết quả: Ảnh gel Đặc trưng nhận dạng DNA phục vụ cho đánh giá đa dạng di truyền 11 dòng bơ theo 10 mồi Mồi ISSR 808 Mồi ISSR 844B Mồi ISSR 856C Mồi ISSR 856T Mồi ISSR 17899B Mồi ISSR HB13 Mồi ISSR UBC859G Mồi ISSR UBC873 Mồi ISSR HB9 Mồi ISSR HB14 Ghi chú: 1: dòng 04, 2: dòng 05, 3: dòng Hải Triều 2, 4: dòng Hải Triều 1, 5: dòng 34; 6: dòng 36; 7: dòng 34 lai; 8: dòng HO, 9: dòng TO; 10: dòng BM00, 11: dòng BM020. Ảnh gel Đặc trưng nhận dạng DNA phục vụ cho việc xác lập marker phân tử nhận dạng 06 dòng bơ theo 10 mồi Mồi ISSR 808 Mồi ISSR 844B Mồi ISSR 856C Mồi ISSR 856T Mồi ISSR 17899B Mồi ISSR HB9 Mồi HB13 Mồi HB14 Mồi ISSR UBC873 Mồi ISSR UBC859G Ghi chú: 1, 2, 3: các mẫu dòng 04; 4, 5, 6: các mẫu dòng 05; 7, 8, 9: các mẫu dòng Hải Triều 2; 10, 11, 12: các mẫu dòng Hải Triều 1; 13, 14, 15: các mẫu dòng 34; 16, 17, 18: các mẫu dòng 36. Dựa trên sự xuất hiện hay vắng mặt các band trên gel, thiết lập ma trận 0/1 để đánh giá đa dạng và xây dựng marker cho việc nhận dạng dòng