Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên khả năng tạo enzym của vi khuẩn

  • Số trang: 53 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 235 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC ÁNH KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG LÊN KHẢ NĂNG TẠO ENZYM CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC ÁNH KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG LÊN KHẢ NĂNG TẠO ENZYM CỦA VI KHUẨN Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS. Đàm Thanh Xuân Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp dược HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô giáo, TS. Đàm Thanh Xuân và DS. Lê Ngọc Khánh, những người thầy đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi trong thời gian làm khóa luận. Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Công Nghiệp Dược đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu để hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua. Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013. Sinh viên Nguyễn Ngọc Ánh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ.........................................................................................................1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ....................................................................................2 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto ........................................................................2 1.1.1. Phân loại khoa học.................................................................................2 1.1.2. Nguồn gốc .............................................................................................2 1.1.3. Đặc điểm hình thái .................................................................................2 1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng.............................................................................3 1.1.5. Đặc điểm sinh lý ....................................................................................3 1.1.6. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto ..........................................3 1.2. Natto và Nattokinase.........................................................................................4 1.2.1. Natto.......................................................................................................4 1.2.2. Các enzym có khả năng tiêu huyết khối trước Nattokinase......................5 1.2.3. Nattokinase.............................................................................................6 1.3. Quá trình lên men sản xuất enzym ..................................................................10 1.3.1. Các phương pháp lên men sản xuất enzym từ vi sinh vật......................10 1.3.2. Thu nhận chế phẩm enzym....................................................................11 1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzym........................................11 1.4. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzym Nattokinase của vi khuẩn ...........................................................................12 1.4.1. Ngoài nước...........................................................................................13 1.4.2. Trong nước...........................................................................................13 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................14 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị sử dụng.................................................................14 2.1.1. Vi sinh vật sử dụng ...............................................................................14 2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng:............................................................. 14 2.1.3. Các môi trường sử dụng: ......................................................................14 2.1.4. Thiết bị .................................................................................................15 2.1.5. Dụng cụ ................................................................................................ 16 2.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................16 2.2.1. Phân lập vi khuẩn B. subtilis natto từ sản phẩm Natto và xác định enzym do Bacillus subtilis natto tạo ra. .....................................................................16 2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện dinh dưỡng lên khả năng tạo enzym của B. subtilis natto. .......................................................................................16 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:..................................................................16 2.3.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn từ sản phẩm Natto.............................. 16 2.3.2. Phương pháp nhuộm Ogiestka.............................................................. 17 2.3.3. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng ..........................................17 2.3.4. Phương pháp nhân giống trong môi trường lỏng ..................................17 2.3.5. Phương pháp lên men chìm vi khuẩn ....................................................18 2.3.6. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên khả năng sinh enzym ............................................................................................. 18 2.3.7. Phương pháp xác định sự có mặt của enzym trong sản phẩm Natto......19 2.3.8. Phương pháp xác định enzym trong dịch trong và trong sinh khối của dịch lên men vi khuẩn Bacillus subtilis natto ..................................................19 2.3.9. Phương pháp thử hoạt tính protease:....................................................19 2.3.10. Phương pháp thử hoạt tính amylase....................................................20 2.3.11. Phương pháp thử hoạt tính cellulase: .................................................20 2.3.12. Phương pháp thử hoạt tính fibrinolytic (tiêu fibrin) ............................ 21 CHƯƠNG BA: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...........................22 3.1. Phân lập vi khuẩn B. subtilis natto từ chế phẩm Natto và xác định enzym do vi khuẩn sinh ra .........................................................................................................22 3.1.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ chế phẩm Natto.................22 3.1.2. Xác định một số enzym do vi khuẩn sinh ra...........................................23 3.1.3. Xác định enzym trong sản phẩm Natto.................................................25 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzym của vi khuẩn B. subtilis natto .......................................................................................26 3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon ......................................26 3.2.2. Lựa chọn nồng độ maltose thích hợp nhất ............................................30 3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của đậu tương và chất cảm ứng............................ 32 3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của một số muối vô cơ..........................................34 3.2.5. Xây dựng môi trường tổng hợp cho vi khuẩn Bacillus subtilis natto sinh protease .........................................................................................................35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................................................ 39 DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1: Thành phần chính trong 100g Natto 4 Bảng 2.2: Thực phẩm chức năng chứa Nattokinase 9 Bảng 2.1 . Các nguyên liệu, hóa chất sử dụng 14 Bảng 2.2. Các thiết bị sử dụng 15 Bảng 3.1. Kết quả định tính enzym trong dịch ly tâm và trong sinh 24 khối Bảng 3.2. Hoạt tính enzym thể hiện bằng đường kính vòng phân 25 giải cơ chất của dịch enzym chiết từ phần hạt đậu và phần dịch nhớt của Natto Bảng 3.3. Hoạt tính protease của dịch lên men khi nuôi cấy trong 27 môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung các nguồn hydratcarbon khác nhau thể hiện bằng đường kính vòng phân giải casein Bảng 3.4. Hoạt tính amylase và cellulase của dịch lên men khi 27 nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung các nguồn hydratcarbon khác nhau thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất Bảng 3.5. Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men thu được khi nuôi 29 cấy trong môi trường có bổ sung các nguồn hydratcarbon khác nhau Bảng 3.6. Hoạt tính protease của dịch lên men khi nuôi cấy trong 30 môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung maltose ở các nồng độ khác nhau thể hiện bằng đường kính vòng phân giải casein Bảng 3.7. Hoạt tính amylase và cellulase của dịch lên men khi 31 nuôi cấy trong môi trường MT2 có bổ sung maltose ở các nồng độ khác nhau thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất Bảng 3.8. Hoạt tính protease của dịch lên men khi nuôi cấy trong 32 môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung đậu tương và casein thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất Bảng 3.9. Hoạt tính enzyme của dịch lên men khi nuôi cấy trong 34 môi trường MT2 và MT2 có bổ sung một số muối vô cơ, thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất Bảng 3.10. Hoạt tính enzyme của dịch lên men khi nuôi cấy trong 36 môi trường MT2 và môi trường tổng hợp, thể hiện bằng đường kính vòng phân giải cơ chất Bảng 3.11. Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men thu được khi nuôi cấy trong môi trường canh thang và môi trường tổng hợp 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ Tên hình Trang Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis natto 2 Hình 1.2. Cấu trúc bậc 3 của Nattokinase 7 Hình 1.3. Cơ chế tiêu fibrin của Nattokinase 8 Hình 3.1. Ảnh khuẩn lạc phân lập được và hình ảnh tế bào vi 22 khuẩn khi soi trên kính hiển vi độ phóng đại 1.000 lần Hình 3.2. Kết quả thử hoạt tính protease, amylase, cellulase 24 trong dịch ly tâm và dịch chiết từ sinh khối Hình 3.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon 28 đến hoạt tính enzym của vi khuẩn Hình 3.4. Biểu đồ so sánh khả năng sinh enzym của Bacillus subtilis natto khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường tổng hợp 37 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Tên đầy đủ 1 B. subtilis natto Bacillus subtilis natto 2 E. coli Escherichia coli 3 CU Caseinolytic units 4 FU Fibrinolytic units 5 U Unit 6 t- PA Tissue plasminogen activator 7 γ – PGA γ - polyglutamat 8 Na CMC Natri carboxymethylcellulose 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, tỷ lệ mắc bệnh nghẽn động mạch do các cục máu đông như chứng nhồi máu cơ tim hay nhồi máu não đang tăng cao ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Các loại thuốc đang dùng hiện nay như urokinase, streptokinase,... được sử dụng chủ yếu trong cấp cứu tai biến và có nhiều tác dụng phụ. Nattokinase là enzym có nguồn gốc từ Natto, một món ăn truyền thống của Nhật Bản. Nattokinase là một enzym protease do vi khuẩn Bacillus subtilis natto sinh ra, được sử dụng để phòng và phá các cục máu đông do có tác dụng tiêu fibrin mạnh, an toàn khi sử dụng. Trong điều kiện lên men chìm, vi khuẩn Bacillus subtilis natto còn có khả năng sinh nhiều enzym ngoại bào như protease, amylase, cellulase... Việc thay đổi môi trường dinh dưỡng có thể ảnh hưởng đến sự sinh enzym của vi khuẩn. Vì thế, lựa chọn một môi trường tốt nhất cho enzym sinh lượng lớn protease và giảm bớt các enzym khác đóng vai trò quan trọng trong việc tách chiết protease, sau đó là Nattokinase. Do đó, khóa luận “Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzym của vi khuẩn Bacillus subtilis natto” được thực hiện với hai mục tiêu: 1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis natto từ sản phẩm Natto trên thị trường và xác định một số enzym do vi khuẩn sinh ra. 2. Bước đầu lựa chọn môi trường nuôi cấy cho Bacillus subtilis natto sản xuất protease tiêu fibrin. 2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto B. subtilis natto (còn được gọi là Bacillus subtilis var. natto) là một chủng thuộc loài Bacillus subtilis, được giáo sư Sawamura phân lập và định danh lần đầu tiên vào năm 1905 [ 21]. 1.1.1. Phân loại khoa học B. subtilis natto là một vi khuẩn thật (Eurobacteria) thuộc: Họ (Family): Bacillaceae Chi (Genus): Bacillus Loài (Species): Bacillus subtilis Phân loài (Subspecies): Bacillus subtilis natto [32]. 1.1.2. Nguồn gốc B. subtilis natto được giáo sư Sawamura tìm thấy trong Natto, một món ăn truyền thống có từ hàng ngàn năm trước của người Nhật. B. subtilis natto có nhiều trong rơm rạ, cỏ khô... và phát triển tốt trong các loại đậu, đặc biệt là đậu tương; vi khuẩn này cũng phát triển trên thực phẩm có nguồn gốc động vật và thực vật khác như: tảo biển, cá, thịt, tôm, cua...[13], [22]. 1.1.3. Đặc điểm hình thái Hình 1.1: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis natto [27], [30] B. subtilis natto là trực khuẩn hiếu khí, bắt màu Gram dương, nội bào tử hình que có kích thước dưới 1μm. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau thành 3 chuỗi. Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, có kích thước lớn và hình dạng bất định. Bề mặt hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan rộng trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [20],[ 22]. 1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng B. subtilis natto là sinh vật dị dưỡng, có khả năng sử dụng nhiều nguồn hydratcarbon: đường đơn như glucose, fructose..., đường đôi như maltose, lactose, saccharose..., polysaccharid như tinh bột... Nguồn nitơ cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn là protein và aminoacid. B. subtilis natto có thể sử dụng dễ dàng acid glutamic, arginine, acid aspartic... nhưng không sử dụng được threonine, trypophan, phenylalanine và methionine [13],[22]. B. subtilis natto cần biotin cho sự phát triển, trong môi trường không có biotin các tế bào sinh dưỡng không thể phát triển và bào tử của chúng không nảy mầm được. Nồng độ biotin tối thiểu cần thiết cho sự nảy mầm của bào tử là 0,1% [13], [22]. 1.1.5. Đặc điểm sinh lý B. subtilis natto là sinh vật hiếu khí bắt buộc, cần oxy để sinh trưởng và có thể phát triển ở nồng độ oxy lớn hơn 3%. B. subtilis natto phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là từ 30- 50ºC, nhiệt độ tối ưu là 37°C. Nhiệt độ tối ưu cho sự nảy mầm của bào tử là 40°C. Bào tử B. subtilis natto vẫn có thể nảy mầm sau khi bảo quản ở 0°C. Ở 55°C, vi khuẩn ngừng phát triển và sự ly giải tế bào sinh dưỡng diễn ra. B. subtilis natto phát triển ở pH trung tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là 7,2- 7,6. Sự nảy chồi và phát triển bị ức chế ở pH ≤ 4,5 [ 13], [22]. 1.1.6. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto Các sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto rất đa dạng, nhưng quan trọng nhất là hệ enzym. Vi khuẩn này sản xuất một lượng lớn các enzym được ứng dụng nhiều trong công nghiệp như: protease, amylase, phytase...[22], trong đó có Nattokinase, một protease ngoại bào là có ý nghĩa nhất và đang được nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi. 4 1.2. Natto và Nattokinase 1.2.1. Natto Natto là một món ăn truyền thống của Nhật Bản, là những hạt đậu nành đã luộc chín và lên men với vi khuẩn B. subtilis natto ở nhiệt độ khoảng 40oC trong vòng 14-18 giờ [13],[19]. Natto chứa nhiều chất bổ dưỡng cho sức khỏe trong đó enzym Nattokinase là một hoạt chất sản sinh trong quá trình lên men Natto được xem là hoạt chất có hiệu quả trong việc ngăn ngừa các chứng bệnh tim mạch [19]. Bảng 1.1: Thành phần chính trong 100g natto: [15], [24] Thành phần Hàm lượng Calorie 200 Kcal Protein 16,5 g Lipid 10,0 g Đường 9,8 g Nattokinase 7100 CU Vitamin B1 0,07 mg Vitamin B2 0,56 mg Vitamin B3 1,1 mg Vitamin K2 870 μg Calci 90 mg Từ hàng ngàn năm trước, Natto đã trở thành món ăn không thể thiếu của người Nhật do nó chứa nhiều chất bổ dưỡng cho sức khỏe, có lợi cho tiêu hóa, tim mạch và là một trong những món ăn làm tăng tuổi thọ của người Nhật. Vì thế, nhiều nghiên cứu về Natto đã được tiến hành. Năm 1905, tiến sĩ Shin Sawamura (đại học Tokyo) đã tách được hai loại vi khuẩn từ Natto gồm vi khuẩn B. subtilis natto có vai trò lên men hạt đậu, gây ra mùi hương đặc biệt và vi khuẩn Bacillus mesentericus vulgaris tạo chất chất nhớt đặc trưng và vị ngọt [21]. Năm 1913, Sawamura công bố kết quả nghiên cứu của mình 5 qua nhiều mẫu Natto và kết luận vi khuẩn chủ yếu trong các mẫu chính là B. subtilis natto. Ông đã đưa ra mô tả chi tiết về đặc điểm vi khuẩn, enzyme và nhu cầu dinh dưỡng của nó. Ngày nay, các sản phẩm Natto trên thị trường được lên men với vi khuẩn B. subtilis natto [21]. Năm 1986, tiến sĩ Sumi Hiroyuki công bố toàn bộ kết quả nghiên cứu về tác dụng của Natto sau khi thử nghiệm gần 200 loại thực phẩm khác nhau để so sánh, xác định Natto có khả năng phân hủy huyết khối một cách hữu hiệu và mạnh nhất trong các loại thực phẩm. Ông đã xác định enzym Nattokinase, một hoạt chất sản sinh trong quá trình lên men Natto có vai trò phân hủy huyết khối một cách hữu hiệu, mạnh gấp 4 lần enzym nội sinh làm tan máu đông là plasmin [21, [23]. Tại hội nghị quốc tế về dinh dưỡng tổ chức tại New Zealand (30/4-3/5/2006) giáo sư Masafumi Kitakaze đã khẳng định Natto có tác dụng làm giảm rõ rệt các chứng mỡ máu cao (triglyceride và cholesterol). Ông kêu gọi cộng đồng thế giới cải thiện nếp sống sinh hoạt và tiêu thụ Natto trước nguy cơ béo phì do “thừa” dinh dưỡng và các chứng bệnh hiểm nghèo, nan y (tiểu đường, ung thư) ngày càng tăng khắp nơi trên thế giới [31]. 1.2.2. Các enzym có khả năng tiêu huyết khối trước Nattokinase Trước khi Nattokinase được nghiên cứu rộng rãi, có nhiều enzym đã được ứng dụng trong trị liệu về huyết khối như Streptokinase, Urokinase, Alteplase... Cơ chế chung của các enzym này là: hoạt hóa plasminogen thành plasmin có tác dụng phân giải fibrin, fibrinogen cùng các yếu tố của quá trình đông máu (yếu tố V, VIII, XIIIa), đồng thời các sản phẩm giáng hóa của fibrin và fibrinogen cũng có tác dụng kháng thrombin, ức chế kết tập tiểu cầu để ngăn quá trình đông máu. Vì thế plasmin có tác dụng làm tan huyết khối, giúp tái lập lại sự tưới máu cho các mô [1], [2]. Căn cứ vào tính chọn lọc trên fibrin mà người ta chia các enzyme tiêu huyết khối thành hai nhóm: a. Enzym tiêu huyết khối không tác dụng chọn lọc trên fibrin: là những thuốc tác động đến cả plasminogen gắn hoặc không gắn với fibrin vì thế gây tác dụng không mong muốn là chảy máu toàn thân. Một số enzym điển hình của nhóm này như: 6 - Streptokinase (SK): chiết xuất từ môi trường nuôi cấy các chủng Streptococcus haemolyticus tan huyết β nhóm C. Streptokinase là protein lạ nên khi vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể sinh kháng thể làm mất hoạt tính và gây dị ứng. -Urokinase (UK): chiết xuất từ nước tiểu người, từ môi trường nuôi cấy tế bào thận bào thai, hoặc có thể sản xuất bằng công nghệ gen. -Anistreplase (APSAC): là streptokinase thay đổi cấu trúc phân tử bằng công nghệ sinh học [1], [2]. b. Enzym tiêu huyết khối tác dụng chọn lọc trên fibrin: là những enzym hoạt hóa plasminogen gắn trên fibrin nên có ưu điểm là ít gây chảy máu toàn thân, hiệu lực tiêu fibrin mạnh hơn và không gây dị ứng khi sử dụng. Tuy nhiên, do sản xuất bằng công nghệ cao nên giá thành của chúng khá đắt. Một số enzym điển hình của nhóm này như: - Alteplase (t-PA): có nguồn gốc từ các tế bào nội mạc của thành mạch, được tiết ra trong hầu hết dịch ngoại bào của cơ thể như huyết tương, nước tiểu, nước bọt, nước mắt... Alteplase trong lâm sàng được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp ADN từ tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc và gọi là rt- PA. - Pro-urokinase: là tiền chất của Urokinase, có trong nước tiểu. Pro-urokinase được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp từ vi khuẩn E. Coli. Mặc dù một số enzym đề cập ở trên được sử dụng rộng rãi trong điều trị huyết khối hiện nay, chúng vẫn có nhược điểm, chẳng hạn như chi phí cao, thời gian bán thải ngắn, nguy cơ chảy máu toàn thân, riêng Streptokinase còn gây phản ứng dị ứng [9]. Hiện nay, các tác nhân làm tan huyết khối có trong tảo, nấm và thực phẩm lên men đang được nghiên cứu để cung cấp nguồn thuốc trị huyết khối an toàn và giá rẻ [9]. 1.2.3. Nattokinase a. Nguồn gốc Nattokinase (ký hiệu EC 3.4.21.62) là một enzym có hoạt tính tiêu fibrin rất mạnh có nguồn gốc từ món ăn truyền thống của Nhật Bản có tên là Natto [23]. 7 Nattokinase còn được gọi là: Subtilisin NAT, Subtilisin BSP, enzyme trong Natto [32]. b. Đặc điểm cấu tạo Nattokinase có cấu trúc là một chuỗi polypeptid đơn gồm 275 gốc acid amin và không có cầu nối disulfid trong phân tử. Trọng lượng phân tử là 27,728 Da và pI= 8,6 ± 0,3 [12]. Là enzym thuộc họ subtilisin của protease serin, Nattokinase cũng có trung tâm hoạt động bao gồm nhóm hydroxyl của Ser-221, imidazol của His-64 và nhóm carboxyl của Asp-32. Cơ chất đặc hiệu của Nattokinase là: Suc-Ala-Ala- ProPhe-pNA [12]. Hình 1.2 . Cấu trúc bậc 3 của Nattokinase [32] c. Tính chất Nattokinase bền vững ở pH từ 6,0 – 10,0, bất hoạt ở pH nhỏ hơn 5 và pH lớn hơn 11, hoạt tính tối ưu ở pH =8- 9. Nattokinase bền vững ở nhiệt độ dưới 40°C, bị giảm hoạt tính khi nhiệt độ tăng lên 50°C và bị phân hủy ở 70°C [12], [13]. Hoạt tính của Nattokinase bị ức chế 1 phần bởi HgCl2, H2O2 và bị ức chế hoàn toàn bởi phenylmethylsulfonyl fluorides (PMSF), ethylendiamin tetraacetic acid (EDTA), các ion Fe3+ và Al3+ cũng ức chế enzym này [9], [13], [25]. Hoạt tính của Nattokinase tăng lên khi có mặt MgSO4, CaCl2, MnCl2 [ 9]. d. Cơ chế tiêu fibrin Nattokinase phân huỷ fibrin trực tiếp hay gián tiếp thông qua ba con đường khác nhau: 8 Hình 1.3 . Cơ chế tiêu fibrin của Nattokinase [19] A. Nattokinase trực tiếp giáng hoá fibrin trong cục máu đông, làm biến đổi fibrin từ dạng polymer không tan thành các sản phẩm giáng hoá có trọng lượng phân tử thấp, hoà tan. Như vậy, Nattokinase có cơ chế tiêu fibrin giống với plasmin. B. Nattokinase giáng hoá fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hoá Pro-urokinase thành Urokinase, dẫn đến thúc đẩy quá trình biến đổi plasminogen thành plasmin, làm tăng plasmin nội sinh là enzyme phân giải fibrin tự nhiên trong cơ thể. C. Nattokinase giáng hoá fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hoá quá trình tổng hợp tPA (Alteplase) trong huyết tương. Kết quả là tăng cường tạo thành plasmin. Đặc biệt, Nattokinase không ảnh hưởng đến quá trình hình thành fibrin từ fibrinogen, do đó không làm suy giảm cơ chế đông máu bình thường của cơ thể. Vì vậy, Nattokinase không gây ra biến chứng chảy máu như các thuốc chống đông máu bình thường [19]. e. Công dụng Nattokinase có tác dụng phòng và phá các cục máu đông do có khả năng tiêu fibrin một cách hữu hiệu (cao gấp 4 lần plasmin), đồng thời rất an toàn cho cơ thể khi hấp thụ qua đường uống [23]. Nattokinase có thể hòa tan cục máu đông khi uống 100mg/ ngày và tác dụng của nó kéo dài 8- 12 giờ. Do ưu điểm an toàn, hiệu lực cao, giá rẻ hơn rất nhiều so với các thuốc tan huyết khối thông thường, 9 Nattokinase có tiềm năng lớn trong trị liệu huyết khối [21],[28]. Ngoài ra, Nattokinase còn có tác dụng tốt trong các bệnh tim mạch như làm giảm huyết áp, giảm lipid máu, ngăn xơ vữa động mạch...[ 28] f. Nattokinase dùng trong thực phẩm chức năng và thuốc Nattokinase lần đầu tiên được phân lập và bán trên thị trường dưới tên NSK-SD vào năm 1998 bởi Phòng thí nghiệm sinh học Nhật Bản, đã loại bỏ vitamin K2. Nattokinase đôi khi được sử dụng trong y học như là một tác nhân làm giảm cục máu đông, thay thế cho điều trị bằng aspirin hàng ngày. Tuy nhiên, sự thay thế này không được khuyến cáo [28]. Hiện nay, có rất nhiều các sản phẩm chứa Nattokinase được sản xuất dưới dạng thực phẩm chức năng với mục đích hỗ trợ phòng ngừa và điều trị các bệnh lý về tim mạch [28]. Bảng 2.2: Thực phẩm chức năng chứa Nattokinase [28], [29] Sản phẩm Hàm lượng Nattokinase Dạng bào Nhà sản xuất (FU) chế Nattopes 300 Viên nang Công ty IMC, Việt Nam S- Nattokinase 5.000 Viên nang United Biomedical, Mỹ Nattokinase 1.000 Viên nang CNS PHARM KOREA Co., Ltd, Hàn Quốc Nattokinase 3.000 Viên nang plus Nattokinase plus Fucoidan Food Science of Vermont dba Da Vinci Laboratories, Mỹ 2.000 Viên nang Umeken, Nhật Bản 10 1.3. Quá trình lên men sản xuất enzym 1.3.1. Các phương pháp lên men sản xuất enzym từ vi sinh vật a. Phương pháp lên men bề mặt Đây là phương pháp chủ yếu sử dụng cơ chất là các loại cám và bột: cám mì, cám gạo, bột đậu, bột ngô...được hấp chín và làm ẩm sau đó trộn thêm trấu và mùn cưa để tăng độ xốp. Vi sinh vật được nuôi ở nhiệt độ khoảng 28- 30°C, độ ẩm 5565%, trong thời gian nuôi từ 36- 48 giờ. Ưu điểm của phương pháp lên men bề mặt là : - Nồng độ enzym cao hơn lên men chìm. - Dễ sấy khô và ít hao tổn hoạt tính enzym. - Chế phẩm thô dễ vận chuyển. - Thiết bị đơn giản, tốn ít năng lượng. - Có thể xử lý cục bộ khi bị nhiễm. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có nhược điểm đó là khó kiểm soát chính xác độ ẩm, sinh khối, lượng O2, CO2 nên chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều, tốc độ sản xuất sản phẩm thấp hơn lên men chìm, khó cơ giới hóa, tự động hóa, cần diện tích nuôi lớn...[4], [5]. Hiện nay, phương pháp lên men bề mặt ít được sử dụng trong sản xuất kháng sinh và các chế phẩm sinh học nhưng vẫn được sử dụng trong lên men sản xuất enzym [4]. b. Phương pháp lên men chìm Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng với cơ chất là tinh bột, nitơ, chất khoáng... Phương pháp nuôi cấy chìm đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy. Ưu điểm của phương pháp lên men chìm là: - Dễ kiểm soát quá trình do đó có thể sản xuất công nghiệp, cơ giới hóa, tự động hóa. - Năng suất cao và chất lượng đồng đều.
- Xem thêm -