Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết nấm linh chi (ganoderma lucidum) lên tế bào gốc thần kinh phân lập từ não phôi thai chuột nhắt trắng (mus musculus var. albino)

  • Số trang: 86 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 14 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CAO CHIẾT NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum) LÊN TẾ BÀO GỐC THẦN KINH PHÂN LẬP TỪ NÃO PHÔI THAI CHUỘT NHẮT TRẮNG (Mus musculus var. albino) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. PHẠM VĂN PHÚC NGUYỄN THỊ MAI ĐAN ThS. TRƯƠNG HẢI NHUNG MSSV: 3082584 LỚP: CNSH TT K34 Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 05/2013 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Phạm Văn Phúc Nguyễn Thị Mai Đan Trương Hải Nhung XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT LỜI CẢM TẠ Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến: Tiến sĩ Phạm Văn Phúc và Thạc sĩ Trương Hải Nhung đã định hướng cho tôi thực hiện đề tài, truyền đạt kiến thức, và tận tình chỉ bảo cũng như theo dõi tiến trình thí nghiệm. Chị Đinh Thị Hồng Nhung, bạn Lê Minh Dũng, Nguyễn Thùy Linh, Lâm Thái Thành, cán bộ Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế Bào Gốc – Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ cho tôi kiến thức và trang thiết bị cần thiết để thực hiện và hoàn thành đề tài. Các anh chị cán bộ và các bạn sinh viên cùng làm việc trong Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế Bào Gốc – Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ và động viên tôi. TP. Hồ Chí Minh, ngày 01 tháng 05 năm 2013 Nguyễn Thị Mai Đan Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Các chứng rối loạn hoặc các tổn thương thần kinh (Parkinson, Alzheimer, Huntington, chấn thương cột sống…) đã và đang trở thành một thách thức lớn đối với sức khỏe cộng đồng. Các tổn thương này rất khó để chữa trị do hệ thần kinh không thể tạo ra các tế bào thần kinh mới, do đó yêu cầu cấp thiết là phải có một liệu pháp hữu hiệu để điều trị các chứng bệnh này. Các nghiên cứu gần đây đã hướng đến sử dụng tế bào gốc, cụ thể là tế bào gốc thần kinh, do các tế bào này có khả năng tự làm mới và tiềm năng biệt hóa thành các loại tế bào của hệ thần kinh để thay thế các tế bào đã mất đi trong não. Tế bào gốc thần kinh được phân lập từ não phôi thai chuột 13.515.5 ngày và nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12 không huyết thanh có bổ sung B27, N2, heparin, EGF và FGF ở điều kiện 37oC, 5% CO2. Các tế bào ứng viên sẽ được chứng minh tính gốc thông qua phương pháp neurosphere, sự biểu hiện marker Sox1, CD133, Nestin và được đánh giá khả năng biệt hóa thành astrocyte bằng marker GFAP. Sau đó, những tế bào gốc này được khảo sát trong đĩa 96 giếng có chứa cao chiết nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) ở các nồng độ 100µg/ml, 500µg/ml, 1000µg/ml để đánh giá tác động của dược liệu lên sự tăng sinh và biệt hóa của các tế bào gốc thần kinh. Kết quả thu nhận và chứng minh đặc tính của các tế bào ứng viên cho thấy tỉ lệ nuôi cấy tế bào thành công là 72%, thai ở giai đoạn 13.5-15.5 ngày cho hiệu quả nuôi cấy tốt nhất, các tế bào này đều có khả năng hình thành neurosphere, biểu hiện marker Sox1, CD133, Nestin, có khả năng biệt hóa và biểu hiện marker GFAP. Ngoài ra, kết quả khảo sát ảnh hưởng của dược liệu lên tế bào gốc thần kinh cho thấy cao chiết với nồng độ 500µg/ml có tác dụng kích thích tế bào tăng sinh mạnh nhất so với các nồng độ còn lại. Từ khóa: Ganoderma lucidum, kích thước neurosphere, marker tế bào gốc thần kinh phương pháp nuôi cấy neurosphere (neurosphere assay). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT LỜI CẢM TẠ TÓM LƯỢC MỤC LỤC ................................................................................................................... i DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................ vi DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................ vii CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................................. ix CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ....................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu đề tài ....................................................................................................... 3 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ................................................................... 4 2.1. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc ........................................................................... 4 2.1.1. Trong nước .................................................................................................... 4 2.1.2. Thế giới.......................................................................................................... 4 2.2. Tế bào gốc ............................................................................................................ 5 2.2.1. Định nghĩa ..................................................................................................... 5 2.2.2 Ứng dụng của tế bào gốc ................................................................................. 5 2.3. Tế bào gốc thần kinh ............................................................................................. 7 2.3.1 Khái niệm về tế bào gốc thần kinh................................................................... 7 2.3.2 Đặc điểm của tế bào gốc thần kinh .................................................................. 7 2.3.3 Tế bào gốc thần kinh và sự phát triển của hệ thần kinh trung ương.................. 9 2.3.4 Nguồn tế bào gốc thần kinh ........................................................................... 10 2.3.4.1 Nguồn tế bào gốc thần kinh nội sinh ....................................................... 10 2.3.4.2 Nguồn tế bào gốc thần kinh ngoại sinh ................................................... 10 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT 2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến tính tự làm mới và khả năng biệt hóa của tế bào gốc thần kinh ........................................................................................ 11 2.3.5.1 Các yếu tố bên ngoài .............................................................................. 11 2.3.5.2 Các yếu tố bên trong............................................................................... 12 2.3.6 Marker tế bào gốc thần kinh và tế bào thần kinh trưởng thành ....................... 12 2.3.6.1 Các marker tế bào gốc thần kinh ............................................................. 12 2.3.6.1.1 Nestin ............................................................................................. 12 2.3.6.1.2 Sox1 and Sox2 9SRY-related HMG-box gene ................................ 13 2.3.6.1.3 CD133 ............................................................................................ 13 2.3.6.2 Marker tế bào thần kinh trưởng thành ..................................................... 14 2.3.6.2.1 Tế bào thần kinh đệm ít nhánh (oligodendrocyte) ........................... 14 2.3.6.2.1.1 A2B5 .................................................................................... 14 2.3.6.2.1.2 O4 ......................................................................................... 14 2.3.6.2.2 Tế bào hình sao (astrocyte) ............................................................. 14 2.3.6.2.2.1 GFAP (glial fibrillary acidic protein) .................................... 14 2.3.6.3.2.2 A2B5 .................................................................................... 14 2.3.6.2.3 Neuron............................................................................................ 15 2.3.6.2.3.1 PSA-NCAM (polysialylated neuronal cell adhesion molecule) ......................................................................... 15 2.3.6.2.3.2 MAP-2 (microtubule-associated protein 2) ......................... 15 2.3.7 Các phương pháp nuôi cấy tế bào gốc thần kinh ............................................ 15 2.3.7.1 Phương pháp nuôi cấy lớp đơn ............................................................... 16 2.3.7.2 Nuôi cấy neurosphere ............................................................................. 16 2.3.8 Các phương pháp đánh giá sự tăng sinh NSC in vitro .................................... 17 2.3.8.1 Đếm tế bào bằng máy đếm tự động ........................................................ 17 2.3.8.2 Đo kích thước neurosphere ..................................................................... 18 2.3.9 Các phương pháp chứng minh tế bào ứng viên là NSC .................................. 18 2.3.9.1 Phân tích tính gốc thông qua sự tạo tập đoàn .......................................... 18 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT 2.3.9.2 Khả năng biệt hóa thành các loại tế bào thần kinh .................................. 19 2.3.9.3 Sự biểu hiện marker của các tế bào gốc thần kinh và tế bào thần kinh trưởng thành ................................................................................. 20 2.4 Nấm Linh chi ....................................................................................................... 21 2.4.1 Giới thiệu về nấm Linh chi ............................................................................ 21 2.4.2. Thành phần hóa học của nấm Linh chi ......................................................... 22 2.4.2.1 Polysaccharide và peptidoglycan ............................................................ 23 2.4.2.2 Triterpene .............................................................................................. 23 2.4.3 Công dụng của nấm Linh chi đối với sức khỏe con người ............................. 24 2.4.4 Ảnh hưởng của dịch chiết nấm Linh chi lên sự tăng sinh, biệt hóa của tế bào ........................................................................................................... 25 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 27 3.1 Phương tiện nghiên cứu ....................................................................................... 27 3.1.1 Thời gian và địa điểm .................................................................................... 27 3.1.2 Đối tượng nghiên cứu .................................................................................... 27 3.1.3 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất ............................................................................. 27 3.1.3.1 Dụng cụ ................................................................................................. 27 3.1.3.2 Thiết bị .................................................................................................. 28 3.1.3.3 Hóa chất ................................................................................................. 28 3.2 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 31 3.2.1 Nội dung 1: Phân lập và nuôi cấy tế bào đơn từ não phôi thai chuột nhắt trắng (Mus musculus var. albino) .......................................................... 32 3.2.1.1 Phương pháp phân lập và thu nhận tế bào đơn từ não phôi thai chuột .................................................................................................... 32 3.2.1.2 Phương pháp cấy chuyền neurosphere .................................................... 33 3.2.2 Nội dung 2: Chứng minh tế bào ứng viên là NSC.......................................... 34 3.2.2.1 Phương pháp 1: Đánh giá dựa trên khả năng tự làm mới của NSC ......... 34 3.2.2.2 Phương pháp 2: Đánh giá sự biểu hiện marker của NSC ........................ 35 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT 3.2.2.2.1 Đánh giá sự biểu hiện marker Sox1 của NSC bằng phương pháp RT-PCR ............................................................................... 35 3.2.2.2.2 Đánh giá sự biểu hiện marker CD133 của NSC bằng phương pháp flow cytometry..................................................................... 36 3.2.2.2.3 Đánh giá sự biểu hiện marker Nestin của NSC bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch ..................................................... 37 3.2.2.3 Phương pháp 3: Đánh giá khả năng biệt hóa của NSC thành astrocyte bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch......................... 38 3.2.3 Nội dung 3: Khảo sát tác động kích thích tăng sinh tế bào của cao chiết nấm Linh chi ................................................................................................ 39 3.2.4 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 40 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 41 4.1. Kết quả phân lập và nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột ........ 41 4.1.1. Kết quả phân lập và nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc thần kinh ứng viên .............. 41 4.1.2. Kết quả cấy chuyền tế bào............................................................................ 44 4.2. Kết quả chứng minh tế bào ứng viên là tế bào gốc thần kinh ............................... 46 4.2.1 Kết quả đánh giá khả năng tự làm mới thông qua sự hình thành neurosphere .................................................................................................. 46 4.2.2 Kết quả đánh giá marker của tế bào ứng viên ................................................ 48 4.2.2.1 Khả năng biểu hiện marker Sox1 của tế bào ứng viên ............................. 48 4.2.2.2 Khả năng biểu hiện marker CD133 của tế bào ứng viên ......................... 49 4.2.2.3 Khả năng biểu hiện marker Nestin của tế bào ứng viên .......................... 50 4.2.2.4 Khả năng biệt hóa thành tế bào và sự biểu hiện marker GFAP ............... 51 4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của cao chiết nấm Linh chi lên sự tăng sinh tế bào gốc thần kinh ................................................................................................ 53 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 57 5.1 Kết luận ............................................................................................................... 57 5.1.1 Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc thần kinh ................................................. 57 5.1.2 Chứng minh tế bào ứng viên là NSC ......................................................... 57 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT 5.1.3 Ảnh hưởng của cao chiết nấm Linh chi lên sự tăng sinh của NSC ............. 57 5.2 Kiến nghị ............................................................................................................. 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 59 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các primer dùng cho RT-PCR Phụ luc 2. Kết quả khảo sát sự thay đổi đường kính neurosphere sau 72 giờ Bảng 4.5 Đường kính và tỉ lệ gia tăng đường kính của neurosphere ở các nghiệm thức 1000µg/ml, 500µg/ml, 100µg/ml và đối chứng sau 72 giờ Bảng 4.6 Đường kính của các neurosphere qua 72 giờ ở các nghiệm thức 1000µg/ml, 500µg/ml, 100µg/ml và đối chứng Phụ lục 3. Kết quả xử lí thống kê 1. Kết quả thống kê mô tả sự gia tăng đường kính neurosphere sau 72 giờ ở các nghiệm thức đối chứng, 100µg/ml, 500µg/ml và 1000µg/ml 2. Kết quả kiểm định T so sánh giá trị trung bình về tỉ lệ gia tăng đường kính của neurosphere sau 72 giờ ở hai nghiệm thức 100µg/ml và 1000µg/ml 3. Kết quả kiểm định T so sánh giá trị trung bình về tỉ lệ gia tăng đường kính của neurosphere sau 72 giờ của nghiệm thức 500µg/ml so với đối chứng 4. Kết quả kiểm định T so sánh giá trị trung bình về tỉ lệ gia tăng đường kính của neurosphere sau 72 giờ của nghiệm thức 1000µg/ml so với đối chứng 5. Kết quả kiểm định T so sánh giá trị trung bình về tỉ lệ gia tăng đường kính của neurosphere sau 72 giờ của nghiệm thức 100µg/ml so với đối chứng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1. Các hóa chất cho phản ứng RT-PCR .......................................................... 35 Bảng 3.2. Các nghiệm thức sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của dược liệu lên sự tăng sinh của NSC ..................................................................................... 38 Bảng 4.1. Bảng tổng kết số lượng mẫu tế bào nuôi cấy .............................................. 40 Bảng 4.2. Bảng tổng kết tuổi thai ............................................................................... 41 Bảng 4.3. Tỷ lệ gia tăng kích thước của neurosphere sau 72 giờ ................................ 53 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1. Ứng dụng của tế bào gốc trong điều trị rối loạn thần kinh ............................ 6 Hình 2.2. Vị trí vùng SVZ (subventricular zone) của não thất bên và SGZ (subgranular zone) của vùng đồi hải mã ..................................................... 8 Hình 2.3. Các vị trí thu nhận NSCs ở động vật có vú ................................................... 9 Hình 2.4. Neurosphere biểu hiện nestin khi nhuộm với kháng thể kháng nestin được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang Hoechst 33342 và FITC khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang đảo ngược ............................. 13 Hình 2.5. Các tế bào astrocyte biểu hiện GFAP khi nhuộm với kháng thể kháng GFAP được đánh dấu bởi thuốc nhuộm huỳnh quang Hoechst 33342 và rhodamine khi quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang đảo ngược ............ 15 Hình 2.6. Neurosphere ............................................................................................... 17 Hình 2.7. Khả năng tự làm mới bằng cách hình thành neurosphere, khả năng biệt hóa thành các loại tế bào thần kinh (neuron, astrocyte, oligodendrocyte) của các tế bào gốc thần kinh và các yếu tố phiên mã (transcription factor) điều hòa hai đặc tính này ................................................................ 19 Hình 2.8. Ganoderma lucidum ................................................................................... 21 Hình 3.1. Chuột nhắt trắng (Mus musculus var. albino) ............................................ 26 Hình 3.2. Quy trình thực hiện thí nghiệm ................................................................... 30 Hình 3.3. Các thao tác trong quy trình thu nhận tế bào đơn ........................................ 32 Hình 3.4. Chu kì nhiệt của phản ứng RT-PCR ........................................................... 35 Hình 4.1. Tế bào chết và bị nhiễm.............................................................................. 40 Hình 4.2. Sự hình thành neurosphere từ mẫu nuôi cấy sơ cấp .................................... 42 Hình 4.3. Tế bào biệt hóa ........................................................................................... 44 Hình 4.4. Sự hình thành neurosphere sau khi cấy chuyền ........................................... 45 Hình 4.5. Sự hình thành neurosphere trong phương pháp neurosphere ....................... 46 Hình 4.6. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR ............................................................. 48 Hình 4.7. Đồ thị 2D của tế bào biểu hiện CD133 ....................................................... 49 Hình 4.8. Biểu đồ tần số của tế bào biểu hiện CD133................................................. 49 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT Hình 4.9. Kết quả nhuộm nestin ................................................................................. 50 Hình 4.10. Kết quả nhuộm GFAP .............................................................................. 52 Hình 4.11 Tỉ lệ gia tăng kích thước neurosphere sau 72 giờ ở các nghiệm thức 100µg/ml, 500µg/ml và 1000µg/ml so với nghiệm thức đối chứng ........ 54 Hình 4.12. Tốc độ gia tăng kích thước neurosphere ở các nghiệm thức sau mỗi 24 giờ ............................................................................................................ 55 Hình 4.13. Neurosphere sau 72 giờ và 96 giờ nuôi cấy trong môi trường không có và có bổ sung cao chiết ở các nồng độ khác nhau ..................................... 56 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT CÁC TỪ VIẾT TẮT CNF: ciliary neutrophic factor CNS: central nervous system CREB: cAMP response element-binding protein DMEM: Dulbecco’s modified eagle medium EGF: epidermal growth factor ERK: extracellular receptor kinase F3: fucose-containing polysaccharide fraction FBS: fetal bonvine serum FGF-2: fibroblast growth factor 2 GalC: galactosylceramidase GFAP: glial fibrillary acidic protein GLPG: Ganoderma lucidum proteoglycan GLPP: Ganoderma lucidum protein-bound polysaccharide HMG box: high mobility group box HSC: hematopoietic stem cell IL-1β: interleukin 1β IL-2: interleukin 2 IL-6: interleukin 6 iPSC: induced pluripotent stem cell JAK: Janus associated tyrosine kinase LIF: leukemia inhibitor factor MAP-2: microtubule-associated protein 2 MAPK: mitogen activated protein kinase MBP: Myelin basic protein mES: mouse embryonic stem cell NCSC: neural crest stem cell NGF: nerve growth factor Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ix Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT NSC: neural stem cell OSM: oncostatin M PI3K: phosphoinositide-3 kinase PSA-NCAM: polysialylayed neural cell adhesion molecule RMS: rostral migratory stream SDF-1α1: stromal cell-derived factor 1α1 SEZ: subendymal zone SGV: subgranular zone STAT: signal transducer and activator of transcription SVZ: subventricular zone WHO: World health organization Chuyên ngành Công nghệ Sinh học x Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU    1.1 Đặt vấn đề Các bệnh về thần kinh là những rối loạn xảy ra ở não bộ, cột sống cũng như các dây thần kinh trong cơ thể, gây ảnh hưởng đến khả năng vận động, nói, nhai nuốt, hít thở, điều hòa cảm xúc, ghi nhớ và học tập của con người. Theo thống kê năm 2007 của WHO (World Health Organization), trên thế giới có khoảng 1 tỉ người mắc phải các chứng rối loạn liên quan đến thần kinh, trong đó có khoảng 50 triệu người mắc bệnh động kinh và 24 triệu bệnh nhân Alzheimer cũng như các chứng mất trí khác, và có khoảng 6.8 triệu ca tử vong mỗi năm được ghi nhận. Vì vậy, các bệnh rối loạn về thần kinh ngày nay được xem như một thách thức đối với sức khỏe cộng đồng. Theo Rita Levi-Montalcini, một nhà thần kinh học người Ý đã đoạt giải Nobel y khoa năm 1986, đã khẳng định rằng: “Các chứng rối loạn thần kinh đang trở thành một gánh nặng đáng kể đối với nhiều quốc gia với tỉ lệ dân số mắc các căn bệnh này đang trên đà gia tăng trong vòng 65 năm qua”. Hiện nay, có hơn 600 chứng rối loạn thần kinh ghi nhận, trong đó Parkinson (Parkinson’s disease) và Alzheimer (Alzheimer’s disease) là một trong những bệnh thần kinh được biết đến phổ biến nhất. Alzheimer là một chứng bệnh liên quan đến sự thoái hóa não bộ, bao gồm sự suy giảm có tiến triển về khả năng ghi nhớ, suy nghĩ, nhận thức, tính toán, ngôn ngữ, học tập và phán đoán. Theo thống kê của WHO (2001) thì có khoảng 37 triệu người trên thế giới mắc chứng mất trí nhớ mà nguyên nhân chủ yếu là Alzheimer, trong đó bao gồm 5% nam giới và 6% nữ giới ở độ tuổi trên 60. Con số này được ước tính là sẽ gia tăng nhanh chóng trong vòng 20 năm tới. Tương tự, Parkinson cũng là một dạng thoái hóa của hệ thần kinh trung ương, thường gặp ở người lớn tuổi, có thể gây tàn phế và làm giảm chất lượng cuộc sống. Tuổi thọ trung bình của người Việt Nam ngày càng được cải thiện do đó Parkinson cũng trở thành một vấn đề sức khỏe đáng được lưu ý nhiều hơn. Theo thống kê, hiện nay trên thế giới có 6 triệu người mắc bệnh Parkinson, trong đó có khoảng 1 triệu trường hợp được ghi nhận tại Mỹ và 130 nghìn trường hợp tại Anh. Tuy nhiên, vẫn chưa có con số thống kê cụ thể nào về Parkinson tại Việt Nam. Bệnh Parkinson thường gặp phổ biến ở người cao tuổi, chủ yếu là ở độ tuổi từ 50 trở lên, tuy nhiên gần Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT đây, nhiều trường hợp mắc bệnh Parkinson trong độ tuổi 20-40 và dưới 20 cũng được ghi nhận. Trước đây, các nhà y học sử dụng thuốc trong điều trị các chứng bệnh này nhằm kìm hãm các triệu chứng của bệnh, nhưng việc sử dụng thuốc có thể gây ra một số tác dụng phụ không mong muốn. Ngoài ra, một số phương pháp phẫu thuật cũng được sử dụng nhưng không điều trị được tận gốc và bệnh nhân phải được tái phẫu thuật nhiều lần. Nhiều nghiên cứu gần đây đã hướng đến việc sử dụng liệu pháp tế bào gốc trong điều trị các bệnh liên quan đến thần kinh, đáng lưu ý là Parkinson, do hiệu quả cao trong việc điều trị. Trong phương pháp này, các tế bào gốc sẽ được biệt hóa thành tế bào thần kinh có khả năng sản sinh chất dẫn truyền thần kinh dopamine và chúng sẽ được cấy ghép vào não bộ của bệnh nhân. Tuy nhiên, các tế bào gốc này hiện diện rất ít ở các mô và cơ quan trưởng thành, do đó việc sử dụng các tế bào gốc phôi thai được quan tâm nhiều hơn. Các tế bào gốc có nguồn gốc từ thai có tính đa năng cao hơn nên khả năng tăng sinh mạnh hơn so với các tế bào gốc trưởng thành. Ngoài ra, chúng còn có thể sinh trưởng và biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau dễ dàng trong quá trình nuôi cấy in vitro nên có tiềm năng ứng dụng lớn trong việc cấy ghép cũng như điều trị các căn bệnh liên quan đến rối loạn thần kinh. Nhiều nghiên cứu đã và đang xác định các điều kiện nuôi cấy in vitro nhằm kích thích sự biệt hóa các tế bào gốc này thành kiểu tế bào mong muốn. Một số nghiên cứu gần đây cho rằng nguồn NSC nội sinh thụ động trong việc di cư đến các khu vực riêng biệt trong não bộ, vì vậy mà việc sử dụng các yếu tố ngoại sinh để biệt hóa tế bào có thể giúp khắc phục các hạn chế của nguồn NSC nội sinh, đồng thời kích thích khả năng tái tạo của các tế bào gốc này bằng các tín hiệu thích hợp (Reimers et al., 2008). Vì vậy, đề tài nghiên cứu “Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) lên tế bào gốc phân lập từ não phôi thai chuột nhắt trắng (Mus musculus var. albino)” được thực hiện nhằm làm rõ tác dụng dược liệu của nấm Linh chi lên sự sinh trưởng và phát triển của tế bào gốc ở mức độ lâm sàng và làm cơ sở cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn trong điều trị các bệnh rối loạn thần kinh, đặc biệt là Parkinson và Alzheimer. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT 1.2 Mục tiêu đề tài - Phân lập và nuôi cấy được tế bào gốc thần kinh từ não phôi thai chuột nhắt trắng (Mus musculus var. albino). - Xác định được nồng độ cao chiết nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) có tác động tốt nhất lên sự tăng sinh của tế bào gốc thần kinh trong điều kiện in vitro. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU    2.1. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc 2.1.1. Trong nước Theo tài liệu của Bộ Y tế, những nghiên cứu đầu tiên về tế bào gốc tại Việt Nam được tiến hành khá sớm, cách đây khoảng 20 năm. Năm 1995, Bệnh viện Truyền máu - Huyết học TP.HCM đã tiến hành ca ghép tế bào gốc tạo máu đầu tiên để điều trị cho bệnh nhân bị bệnh máu. Ngoài ra còn có các nghiên cứu về nuôi cấy tinh tử, tế bào sợi và tế bào sừng ứng dụng trong điều trị các bệnh nan y, nghiên cứu về tế bào gốc và nhân bản vô tính trên động vật (sao la, bò, chuột nhắt)… Theo báo cáo về hiện trạng nghiên cứu, ứng dụng tế bào gốc tại Việt Nam của hai tác giả Phạm Mạnh Hùng và Lê Văn Đông: “Nghiên cứu tế bào gốc tại Việt Nam hình thành 3 mảng lớn là: tạo nguồn tế bào gốc (phân lập và lưu trữ), biệt hóa tế bào gốc thành các tế bào chuyên biệt và ứng dụng tế bào gốc”. Theo tiến sĩ Lê Văn Đông, biệt hóa tế bào gốc thành một số loại tế bào giống như tế bào cơ tim, tế bào thần kinh, tế bào da, tế bào xương, sụn, mỡ… tại Việt Nam được coi là hướng nghiên cứu song hành với các nước trên thế giới, nhưng các kết quả chúng ta đạt được còn tương đối khiêm tốn. Mặc dù vậy, những nghiên cứu về tế bào gốc tại Việt Nam, theo đánh giá của một số chuyên gia trong lĩnh vực này, vẫn còn khá tản mác và chưa có tính liên thông cao. Nước ta hiện cũng đang tiến hành một số nghiên cứu về tế bào gốc có tính quan trọng cho việc giúp đỡ các bệnh nhân - phục vụ nghiên cứu y học như, tách tế bào gốc từ màng dây rốn, tế bào gốc biệt hóa thành tế bào cơ tim, tế bào gốc điều trị bệnh đái tháo đường; tế bào gốc nuôi thành tế bào gan, tế bào gốc điều trị bỏng - tái tạo răng, giác mạc từ tế bào gốc. 2.1.2. Thế giới Việc nghiên cứu tế bào gốc trong Y học đã được tiến hành từ những năm 1960 trên thế giới, nhất là các nước phát với các nghiên cứu về tế bào gốc trưởng thành và tế bào gốc tạo máu. Những thành công đầu tiên trong lĩnh vực này là việc cấy ghép tế bào gốc tạo máu được tiến hành vào những năm 80 của thế kỷ XX ở hầu hết các nước Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT tiên tiến. Nguồn tế bào gốc cho ghép được lấy từ xương, từ máu ngoại vi, gần đây là từ máu cuống rốn và màng lót cuống rốn. Việc cấy ghép tế bào gốc là một phương pháp được ứng dụng trong điều trị các bệnh hiểm nghèo, bệnh di truyền, u lympho và cho hiệu quả cao nhất ở bệnh nhân trẻ và trẻ em. Gần đây, việc nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc trong y học không chỉ dừng lại ở việc ghép tế bào gốc tạo máu mà còn được nghiên cứu và phát triển ở rất nhiều chuyên khoa khác như: mắt, tim mạch, bỏng, da… Gần đây nhất là giải Nobel Y học 2012 về phát hiện khả năng tái lập trình tế bào trưởng thành thành tế bào giống tế bào gốc phôi, gọi là tế bào gốc vạn năng nuôi cấy (iPSC), được xem là bước đột phá của con người với hy vọng “cải lão hoàn đồng” của John Gurdon (sinh năm 1933, người Anh) và Shinya Yamanaka (sinh năm 1962, người Nhật). 2.2. Tế bào gốc 2.2.1. Định nghĩa Tế bào gốc là các tế bào không hoặc chưa chuyên hóa trong mô sống, chúng có khả năng trở thành các tế bào chuyên hóa với các chức năng sinh lý đặc trưng. Trong điều kiện in vivo hoặc in vitro, mỗi tế bào gốc có thể trải qua phân bào nguyên nhiễm thông qua tính tự làm mới để tạo ra nhiều tế bào gốc mới hoặc biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau, vì vậy một tế bào gốc đòi hỏi phải ít nhất phải có hai đặc tính như sau:  Khả năng tự làm mới: tế bào có khả năng tiến hành một số lượng lớn chu kỳ phân bào nguyên nhiễm mà vẫn duy trì trạng thái không biệt hóa.  Khả năng biệt hóa : tế bào có khả năng biệt hóa thành các loại tế bào có chức năng. 2.2.2 Ứng dụng của tế bào gốc Vì các nghiên cứu về tế bào gốc chỉ mới ở giai đoạn sơ khởi và các ứng dụng của chúng chỉ được ghi nhận trên lí thuyết nên các nhà khoa học đang tập trung tìm hiểu và thử nghiệm tiềm năng ứng dụng của chúng. Một trong những hướng nghiên cứu quan trọng là tìm hiểu bản chất của các tế bào gốc nhằm tìm ra điều kiện duy trì trạng thái không biệt hóa của các tế bào này cũng như biệt hóa chúng theo hướng mong muốn. Mặc dù các nghiên cứu này đang được bước đầu tiến hành, các nhà khoa học đã có nhiều dự đoán về tiềm năng sử dụng của các tế bào này, bao gồm: Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường ĐHCT Hình 2.1. Ứng dụng của tế bào gốc trong điều trị rối loạn thần kinh. Các tế bào gốc được phân lập và cấy ghép vào não hoặc cột sống của bệnh nhân bằng phương pháp tiền biệt hóa hoặc biến đổi di truyền trong điều kiện nuôi cấy in vitro để tạo thành các neuron và các loại tế bào thần kinh đệm (Lindvall và Kokaia, 2006).  Nghiên cứu về sự phân chia bất thường của tế bào: Trong một số các trường hợp như ung thư, khiếm khuyết bẩm sinh đều có liên quan đến sự phân chia không bình thường của tế bào hoặc các rối loạn trong điều hòa trạng thái hoạt động của tế bào. Vì vậy, việc hiểu rõ bản chất tế bào gốc, cơ chế điều hòa của chúng ở cấp độ di truyền và phân tử sẽ giúp cho việc điều trị bệnh được hiệu quả hơn.  Thử nghiệm thuốc: các tế bào gốc cũng được sử dụng trong thử nghiệm các loại thuốc mới bằng cách biệt hóa chúng thành các loại tế bào đích đặc trưng mà thuốc có thể tác dụng lên. Các tế bào biệt hóa này là được các nhà khoa học sử dụng như mô Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Xem thêm -