Tài liệu Khảo nghiệm vắc xin phòng bệnh phù thũng ở lợn do escherichia coli

Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o tr−êng ®¹i häc n«ng nghiÖp hµ néi ------------------ ®Æng thµnh t©m KHẢO NGHIỆM VẮC XIN PHÒNG BỆNH PHÙ THŨNG Ở LỢN DO ESCHERICHIA COLI luËn v¨n th¹c sÜ N¤NG NGHIÖP Hµ Néi - 2012 Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o tr−êng ®¹i häc n«ng nghiÖp hµ néi ------------------ ®Æng thµnh t©m KHẢO NGHIỆM VẮC XIN PHÒNG BỆNH PHÙ THŨNG Ở LỢN DO ESCHERICHIA COLI luËn v¨n th¹c sÜ N¤NG NGHIÖP Chuyªn ngµnh : Thó y M· sè : 60.62.50 Ng−êi h−íng dÉn khoa häc : ts. Hoµng v¨n hoan TS. NguyÔn B¸ Hiªn Hµ Néi - 2012 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn ðặng Thành Tâm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… i LỜI CẢM ƠN ðể có ñược kết quả nghiên cứu này, ngoài sự nỗ lực và cố gắng của bản thân, tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự giúp ñỡ từ các ñơn vị và cá nhân. Tôi xin ghi nhận và bày tỏ lòng biết ơn tới những tập thể, cá nhân ñã dành cho tôi sự giúp ñỡ quý báu ñó. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng sự giúp ñỡ nhiệt tình của thầy giáo TS. Hoàng Văn Hoan và TS. Nguyễn Bá Hiên, người ñã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện ñề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn những ý kiến ñóng góp quý báu của các thầy, cô giáo trong khoa Thú y, các thầy, cô giáo trong khoa Sau ðại học.. Tôi xin chân thành cảm ơn các ñồng chí lãnh ñạo của Trung tâm nghiên cứu ứng dụng và Chuyển giao công nghệ Thú y – Viên Thú y TW cùng các thầy cô và các anh, chị trong bộ môn Vi trùng – Viện Thú y. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn các ñồng chí lãnh ñạo UBND huyện Tiên Lữ, các ñồng chí phòng NNPTNT, phòng thống kê và UBND các xã ñã tạo ñiều kiện về thời gian và cung cấp số liệu giúp tôi thực hiện ñề tài này. Cảm ơn sự cổ vũ, ñộng viên và giúp ñỡ của gia ñình, các anh, chị ñồng nghiệp, bạn bè trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Hà Nội, ngày …. Tháng ….năm Tác giả luận văn ðặng Thành Tâm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN ............................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................ii MỤC LỤC ........................................................................................................iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................ vi DANH MỤC BẢNG........................................................................................vii DANH MỤC ðỒ THỊ....................................................................................... ix MỞ ðẦU ........................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của ñề tài.................................................................................. 1 2. Mục ñích của ñề tài. ....................................................................................... 2 PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................... 3 1.1 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH PHÙ ðẦU Ở LỢN DO E.COLI GÂY RA..... 3 1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới............................................................. 3 1.1.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ............................................................. 5 1.2 ðặc tính sinh học của vi khuẩn Escherichia coli........................................... 7 1.2.1 ðặc tính hình thái vi khuẩn........................................................................ 7 1.2.3 ðặc tính sinh hóa....................................................................................... 8 1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên ............................................................................ 10 1.2.5 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli ................................................. 12 1.3 Bệnh phù thũng ở lợn do vi khuẩn E.coli gây ra ......................................... 19 1.3.1 Nguyên nhân gây bệnh ............................................................................ 19 1.3.2 ðặc ñiểm dịch tễ của bệnh....................................................................... 21 1.3.3 Triệu chứng lâm sàng .............................................................................. 22 1.3.4 Bệnh tích ................................................................................................. 23 1.3.5 Phương pháp chẩn ñoán bệnh .................................................................. 24 1.3.6 Phòng và trị bệnh..................................................................................... 25 1.4 Miễn dịch chống bệnh của lợn.................................................................... 26 1.4.1 Miễn dịch không ñặc hiệu........................................................................ 26 1.4.2 Miễn dịch ñặc hiệu .................................................................................. 27 1.5. Một số hiểu biết ñại cương về vắc xin ....................................................... 27 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iii 1.5.1. ðịnh nghĩa.............................................................................................. 27 1.5.2. ðặc tính cơ bản của một vắc xin............................................................. 28 1.5.3. Các loại vắc xin ...................................................................................... 28 1.5.4. Nguyên lý............................................................................................... 28 1.5.5. Một số ñiều cần chú ý khi sử dụng vắc xin ............................................. 28 PHẦN II. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .31 2.1 Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 31 2.2 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu............................................................ 31 2.2.1 Các loại môi trường, hóa chất sử dụng trong quá trình nghiên cứu .......... 31 2.2.2 Các máy móc sử dụng trong quá trình nghiên cứu ................................... 32 2.2.3 Các ñộng vật dùng trong nghiên cứu ....................................................... 32 2.2.4 Giống vi khuẩn ........................................................................................ 32 2.2.5 Vắc xin sử dụng trong thí nghiệm............................................................ 33 2.3. ðối tượng nghiên cứu................................................................................ 33 2.4 ðịa ñiểm nghiên cứu. ................................................................................. 33 2.5. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 33 2.5.1 Phương pháp xác ñịnh hiệu giá kháng thể F4 bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà...................................................................................... 33 2.5.2 Phương pháp lấy mẫu .............................................................................. 34 2.5.3 Phương pháp kiểm tra chỉ tiêu vô trùng ................................................... 34 2.5.4 Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu an toàn theo phương pháp phân lô, phân ñàn 34 2.5.5 Phương pháp kiểm tra hiệu lực. ............................................................... 35 2.5.6 Phương pháp kiểm tra ñộ dài bảo quản vắc xin........................................ 36 2.5.7 Phương pháp kiểm tra ñộ dài miễn dịch của lợn sau khi ñã tiêm phòng vắc xin.... 36 2.5.8 Phương pháp ñếm vi khuẩn. .................................................................... 36 2.5.9 phương pháp nuôi cấy vi sinh vật thường quy ......................................... 37 2.5.10 Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................... 38 PHẦN III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................... 39 3.1 MÔ TẢ SƠ LƯỢC QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT VẮC XIN PHÙ ðẦU BẰNG CÔNG NGHỆ LÊN MEN SỤC KHÍ................................................................ 39 3.2. KẾT QUẢ KIỂM NGHIỆM VẮC XIN PHÙ ðẦU LỢN ......................... 42 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… iv 3.2.1 Mẫu ......................................................................................................... 42 3.2.2 Kết quả kiểm tra vô trùng 5 lô vắc xin..................................................... 42 3.2.3 Kết quả kiểm tra an toàn vắc xin ............................................................. 43 3.2.4 Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin ............................................................ 45 3.3. KẾT QUẢ XÁC ðỊNH KHÁNG THỂ KHÁNG E.COLI GÂY BỆNH Ở LỢN . 48 3.3.1 Kết quả xác ñịnh kháng thể kháng E.coli gây bệnh phù thũng ở lợn sau khi tiêm vắc xin phù ñầu 30 ngày. ......................................................................... 48 3.3.2 Phân bố hiệu giá kháng thể......................................................................... 49 3.4. XÁC ðỊNH THỜI GIAN BẢO QUẢN VẮC XIN.................................... 51 3.4.1 Kết quả kiểm tra vô trùng của 5 lô vắc xin phù ñầu sau các thời ñiểm 3, 6, 9, 10 tháng....................................................................................................... 52 3.4.2 Kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vắc xin phù ñầu trong thời gian bảo quản 3, 6, 9, 10, 12 tháng.............................................................................................. 54 3.4.3 Kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực của vắc xin phù ñầu trong thời gian bảo quản 3, 6, 9, 10 tháng.................................................................................................... 55 3.5. KẾT QUẢ ỨNG DỤNG VẮC XIN PHÙ ðẦU TRÊN THỰC ðỊA ......... 61 3.5.1 Xác ñịnh an toàn của vắc xin phù ñầu trên lợn ứng dụng vào thực tế sản xuất trên ñịa bàn huyện Tiên lữ - tỉnh Hưng Yên....................................................... 61 3.5.2 Kết quả kiểm tra hiệu lực của vắc xin phù ñầu bằng phương pháp thử nghiệm lâm sàng tại huyện Tiên Lữ - Hưng yên............................................... 63 3.6 XÁC ðỊNH HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ HÌNH THÀNH Ở LỢN SAU KHI TIÊM PHÒNG VẮC XIN PHÙ ðẦU.............................................................. 68 3.6.1 Xác ñịnh hiệu giá kháng thể. ................................................................... 68 3.6.2 Xác ñịnh thời gian miễn dịch bảo hộ ....................................................... 69 PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ ............................................................ 73 4.1 KẾT LUẬN................................................................................................ 73 4.2 ðỀ NGHỊ ................................................................................................... 73 5. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 74 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NN-PTNT Nông nghiệp và phát triển nông thôn. UBND Uỷ ban nhân dân. TW Trung ương. ED Edema disease( bệnh phù thũng). EDP Edema disease pathogenic(yếu tố gây bệnh phù ñầu). Hly Hemolysin(yếu tố gây dung huyết). JICA Japan International cooperation Agency(tổ chức hợp tác quốc tế Nhật bản). LT Heat- Labile enterotoxin( ðộc tố không chịu nhiệt). ST Heat-Stable enterotoxin( ðộc tố chịu nhiệt). ADN Acid Deoxyribonucleotide PCR Polymerase Chain Reaction(phản ứng nhân gen) ETEC Enterotoxingenic Escherichia coli(ðộc tố ñường ruột vi khuẩn E.coli) VTEC Verotoxigenic Escherichia coli TCN Tiêu chuẩn nghành PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn). BHI Brain Heart Infusion. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết quả kiểm tra vô trùng 5 lô vắc xin phù ñầu.............................. 43 Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra an toàn vắc xin trên ñộng vật thí nghiệm............. 44 Bảng 3.3 kết quả kiểm hiệu lực của vắc xin trên chuột bạch ......................... 46 Bảng 3.4 kết quả xác ñịnh khả năng bảo hộ của vắc xin phù ñầu phòng bệnh phù thũng ở lợn............................................................................................. 47 Bảng 3.5 kết quả xác ñịnh kháng thể kháng E.coli sau khi tiêm vắc xin phù ñầu 30 ngày................................................................................................... 49 Bảng 3.6 Phân bố hiệu giá kháng thể trong huyết thanh lợn sau 30 ngày tiêm vắc xin phù ñầu .................................................................................................... 50 Bảng 3.7 Kết quả kiểm tra vô trùng vắc xin phù ñầu sau các thời ñiểm 3, 6, 9, 10 tháng ........................................................................................................ 53 Bảng 3.8 Kết quả kiểm tra vô trùng vắc xin phù ñầu sau 12 tháng ................ 54 Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn vắc xin phù ñầu sau 3, 6, 9, 10, 12 tháng bảo quản.............................................................................................. 55 Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin phù ñầu sau 3 tháng................. 56 Bảng 3.11 Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin phù ñầu sau 6 tháng................. 57 Bảng 3.12 Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin phù ñầu sau 9 tháng................. 58 Bảng 3.13 Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin phù ñầu sau 10 tháng.............. 59 Bảng 3.14 Kết quả kiểm tra hiệu lực vắc xin phù ñầu sau 12 tháng............... 60 Bảng 3.15 Kết quả xác ñịnh an toàn vắc xin phù ñầu trên lợn ....................... 62 Bảng 3.16 ðánh giá khả năng bảo hộ lợn nuôi ñã tiêm phòng vắc xin phù ñầu tại xã ðức Thắng – Tiên lữ ........................................................................... 63 Bảng 3.17 ðánh giá khả năng bảo hộ lợn nuôi ñã tiêm phòng vắc xin phù ñầu tại xã Hải Triều – Tiên lữ ............................................................................. 65 Bảng 3.18 ðánh giá khả năng bảo hộ lợn nuôi ñã tiêm phòng vắc xin phù ñầu tại xã Ngô Quyền – Tiên lữ.......................................................................... 66 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… vii Bảng 3.19 Kết quả bảo hộ lợn sau khi tiêm phòng vắc xin phù ñầu tại huyện Tiên Lữ - Hưng Yên...................................................................................... 67 Bảng 3.20 Kết quả xác ñịnh kháng thể hình thành sau khi tiêm phòng vắc xin phù ñầu phòng bệnh phù thũng ở lợn ............................................................ 69 Bảng 3.21 Kết quả phân bố kháng thể kháng E.coli trong huyết thanh lợn sau 5 tháng tiêm phòng vắc xin phù ñầu.............................................................. 70 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… viii DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Tóm tắt quy trình sản xuất vắc xin phù ñầu bằng công nghệ lên men sục khí ............................................................................................... 41 Hình 3.2 Biểu ñồ phân bố hiệu giá kháng thể trong huyết thanh lợn trước và sau tiêm phòng 30 ngày ............................................................................. 51 Hình 3.3 Biểu ñồ biểu diễn sự phân bố kháng thể kháng E.coli trong huyết thanh lợn trong 5 tháng sau tiêm phòng vắc xin phù ñầu ........................... 72 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… ix MỞ ðẦU 1. Tính cấp thiết của ñề tài Chăn nuôi lợn từ lâu ñã trở thành ngành có vị trí quan trọng trong cơ cấu chăn nuôi của nước ta. Trong những năm gần ñây ngành chăn nuôi ñã có những thay ñổi ñáng kể và ñóng góp không nhỏ trong quá trình phát triển ngành nông nghiệp Việt Nam cũng như vào việc nâng cao mức sống cho người chăn nuôi. ðể phát huy ñược các nguồn lực sẵn có ñồng thời chủ ñộng trong việc sản xuất và cung ứng thực phẩm, nhà nước ñã có nhiều chính sách hỗ trợ phát triển chăn nuôi, Thủ tướng chính phủ ñã ra quyết ñịnh số 10/2008/Qð-TTg ngày 16 tháng 01 năm 2008 phê duyệt chiến lược phát triển chăn nuôi ñến năm 2020. Mục tiêu chung của chiến lược ñến năm 2020, ngành chăn nuôi cơ bản chuyển sang phương thức trang trại, công nghiệp, ñáp ứng phần lớn nhu cầu thực phẩm và ñảm bảo chất lượng cho người tiêu dùng và xuất khẩu. Tỷ trọng chăn nuôi trong nông nghiệp ñến năm 2020 ñạt trên 42% trong ñó năm 2010 ñạt khoảng 32% và 38% vào năm 2015. ðảm bảo an toàn dịch bệnh và vệ sinh an toàn thực phẩm, khống chế có hiệu quả dịch bệnh trong chăn nuôi [1]. ðối với chăn nuôi lợn quyết ñịnh cũng ñịnh hướng ñến năm 2020 phát triển nhanh quy mô ñàn lợn ngoại theo hướng trang trại, duy trì quy mô nhất ñịnh ñối với chăn nuôi lợn lai, lợn ñặc sản phù hợp với ñiều kiện chăn nuôi của nông hộ và của một số vùng. Tăng tổng ñàn lợn bình quân 2% năm, ñạt 35 triệu con trong ñó ñàn lợn ngoại nuôi trang trại công nghiệp chiếm 37% [1]. Tuy nhiên trong những năm gần ñây, ngành chăn nuôi lợn gặp không ít khó khăn như: con giống, thức ăn….ñặc biệt là công tác phòng bệnh bằng vắc xin cho vật nuôi chưa ñược tốt gây thiệt hại lớn về kinh tế. Việc bùng phát các ổ dịch bệnh Lở mồm long móng, hội chứng PRRS, và các bệnh truyền nhiễm khá gây thiệt hại lớn trên ñàn lợn là ñiều cảnh báo cho chúng ta về mối nguy hại của dịch bệnh trong chăn nuôi lợn. Bên cạnh ñó hiện nay ở nước ta phương thức Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 1 chăn nuôi nông hộ nhỏ lẻ vẫn chiếm tỷ lệ lớn dẫn ñến dịch bệnh thường xuyên xảy ra. ðể chăn nuôi ñược thành công thì người chăn nuôi phải có quy trình chăm sóc và phòng chống bệnh cho ñàn lợn. Một trong những bệnh hay xảy ra là bệnh phù thũng ở lợn, căn bệnh là do một loại vi khuẩn gây dung huyết, vi khuẩn chủ yếu gây ra cho lợn con giai ñoạn sau khi bú mẹ và bướcc sang tập ăn, bệnh làm cho vật nuôi chết rất nhanh. Hiện nay, có rất nhiều loại vắc xin phòng bệnh phù thũng ở lợn ñược sản xuất và lưu hành trên thị trường Việt Nam. Trung tâm nghiên cứu ứng dụng và Chuyển giao công nghệ Thú y - Viện Thú y TW cũng ñã và ñang sản xuất vắc xin phù ñầu cho lợn theo công nghệ ñược Bộ môn Vi trùng chuyển giao cho kết quả phòng bệnh rất tốt và phù hợp với thực tế. Theo quy ñịnh của nhà nước bất kỳ loại vắc xin nào trước khi xuất xưởng, lưu hành trên thị trường ñều phải ñạt ñược các chỉ tiêu ñã ñược quy ñịnh. Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Khảo nghiệm vắc xin phòng bệnh phù thũng ở lợn do Escherichia coli ” làm cơ sở khoa học ñể sản xuất vắc xin phòng bệnh phù thũng cho ñàn lợn nuôi ở Việt Nam. 2. Mục ñích của ñề tài. Khảo nghiệm tính ổn ñịnh của vắc xin phù ñầu ñặc biệt là chất lượng của vắc xin sau một thời gian dài ñưa vào sản xuất và bán trên thị trường. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 2 PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH PHÙ ðẦU Ở LỢN DO E.COLI GÂY RA Bệnh phù thũng ở lợn (Edema Disease) ñược mô tả lần ñầu tiên vào năm 1938 bởi Shanks và cs (1963) [40] dựa trên quan sát căn bệnh qua nhiều năm ở Ireland. Sau ñó, bệnh phù thũng ở lợn phát hiện ở nhiều nước, bệnh trở thành phổ biến trong những năm sau khi ngành chăn nuôi lợn phát triển. Cái tên “bệnh phù” (Edema Disease), “sưng phù ruột” ñầu tiên ñược phát hiện do các vết sưng dưới lớp niêm mạc của dạ dầy và niêm mạc kết tràng thường là nét ñặc trưng nổi bật của bệnh. Bởi vì một số lợn chết do không có tổn thương nào và hội chứng ñầu tiên ñược phát hiện do chủng ngừa lợn với dịch truyền từ thành phần trong ruột của những lợn ñã chết do bệnh. Phù thũng ở lợn là sự tích ñọng nhiều nước dịch ở các tổ chức trong cơ thể tại nhiều các cơ quan bộ phận khác nhau nhưng ở não là quan trọng nhất và gây ra triệu chứng lâm sàng. Bệnh phù thũng ở lợn phát hiện ở nhiều nước trên thế giới và ñã có những nghiên cứu sâu về bệnh này. 1.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới. Vi khuẩn E.coli cũng như một số loài vi khuẩn ñường ruột khác, trước kia người ta coi là những vi khuẩn cộng sinh sống ở ñường ruột, nhưng ngày càng thấy chúng là tác nhân gây ra nhiều bệnh ñường ruột, bệnh nhiễm trùng huyết (Moon và cs, 1993)[30]. Nhiều công trình nghiên cứu ñã chỉ ra rằng trong quá trình sống vi khẩn E.coli có khả năng sản sinh các yếu tố gây bệnh như yếu tố gây dung huyết (Hly), yếu tố cạnh tranh, yếu tố bám dính (K88, K99), yếu tố ñộc tố ñường ruột và yếu tố kháng kháng sinh. Các yếu tố này nằm trong AND ngoài Chromosome gọi là Plasmid và ñược di truyền ngang bằng phương thức tiếp hợp (Moon và cs. 1993)[30]. Vi khuẩn E.coli gây bệnh phù thũng ở lợn có khả năng bám dính vào vách tế bào ruột, phá hủy tế bào niêm mạc ruột, tế bào nhung mao ruột non, sản sinh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 3 ñộc tố ñường ruột gây tiêu chảy và nhiễm ñộc huyết, Smith (1963)[41], ñã thông báo có 2 thành phần enterotoxin ñược thấy ở các vi khuẩn E.coli gây bệnh. Sự khác biệt giữa chúng là khả năng chịu nhiệt bao gồm ñộc tố chịu nhiệt ST và ñộc tố không chịu nhiệt LT. Các vi khuẩn E.coli gây bệnh ñường ruột có khả năng bám dính vào vách tế bào thành ruột, yếu tố bám dính này nằm ở Pili. ðến nay ñã xác ñịnh ñược các yếu tố bám dính là: F4, F5, F6, F18, F41. Trong các típ kháng nguyên bám dính này chia thành các subtyp như F4ab, F4ac, F4ad, (Nagy và cs, 1992 [48]). Kyriakis (1997)[29] cho rằng, bệnh phù thũng ở lợn xảy ra ở lợn từ 1-2 tuần sau cai sữa. Tỷ lệ chết có thể lên tới 80% hay nhiều hơn ñối với lợn cùng lứa tuổi, trung bình tỷ lệ chết từ 30 – 40%. Triệu chứng lâm sàng của bệnh này chủ yếu là lợn con ñi vòng tròn, có triệu chứng thần kinh, có thể xảy ra hiện tượng tiêu chảy tuy nhiên ñó không phải là triệu chứng ñiển hình. Chủng vi khuẩn E.coli gây bệnh phù thũng ở lợn sau cai sữa chủ yếu là các nhóm kháng nguyên O139, O138, O141. Parma (2000)[35], các chủng E.coli gây bệnh phù thũng ở lợn trên lợn con sau cai sữa xếp vào nhóm VTEC, thuộc các subtyp kháng nguyên O138, O139, O141. Những chủng E.coli sản sinh ñộc tố Vero VT2E làm hủy hoại tế bào Vero, những chủng E.coli này có thể mang những gen quy ñịnh sản xuất ra các ñộc tố ñường ruột, tiêm các ñộc tố Vero VT2E vào bắp thịt lợn sau cai sữa ñã gây ñược bệnh phù thũng ở lợn có những triệu chứng, bệnh tích giống như lợn mắc bệnh ngoài tự nhiên. Bosworth (1998)[18] cho rằng, vi khuẩn E.coli gây dung huyết chính là nguyên nhân gây tiêu chảy ở lợn con sơ sinh và bệnh phù thũng ở lợn con sau cai sữa. Việc sử dụng vắc xin phòng bệnh phù thũng ở lợn là tạo ra kháng thể ngăn cản sự bám dính của vi khuẩn trong ñường tiêu hóa. Verotoxin và Enterotoxin là hai yếu tố ñộc lực quan trọng gây bệnh. Trong các Serotyp gây bệnh có một số chủng mang ñộc tố như STa, STb, LT, VT2E. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 4 Garabal (1997)[19], cho rằng ở Tây Ban Nha Serotyp gây bệnh phù thũng ở lợn là O8, O101, O138, O149, O157; Ở ðức là O149, O139, O141 và O147. Những chủng vi khuẩn E.coli gây bệnh phù thũng ở lợn không có những ñặc tính sinh hóa riêng biệt, nên không thể xác ñịnh ñược bằng các xét nghiệm sinh hóa thông thường. Verdonck và cs (2003)[47], nghiên cứu ñặc tính của các chủng vi khuẩn E.coli ở một số trại tại Bỉ cho rằng các yếu tố gây bệnh chủ yếu là F18+ Enterotoxin, Verotoxin. Wilson và cs (1986)[52], các Serotyp E.coli ñề kháng với hầu hết các loại kháng sinh thông dụng, ngoại trừ Gentamicin, Trimethroprin kết hợp với Sulfamide. Nghiên cứu về khả năng bám dính Clarence và cs (1986)[21] cho rằng ba kháng nguyên gây bệnh phù thũng ở lợn là F4, F5, F6. Docic và cs (2003)[25], ñã nghiên cứu sử dụng vắc xin có chứa giải ñộc tố VT2E tiêm cho lợn con, vắc xin ñã giảm tỷ lệ bệnh phù thũng ở lợn xuống còn 6,9%. Việc sử dụng vắc xin có các yếu tố kháng nguyên F4, F18 với ETEC và VTEC tiêm phòng cho lợn con ñã ñược nghiên cứu trên thế giới. 1.1.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Bệnh phù thũng ở lợn do vi khuẩn E.coli gây ra ñã ñược nhiều nhà nghiên cứu Thú y trong nước quan tâm. Tại Việt Nam, các tác giả ñã từng có những nghiên cứu rất sâu về bệnh như TS. Nguyễn Ngọc Nhiên, TS Cù Hữu Phú, tác giả Dương Thị Nội tại Viện Thú y, bên cạnh ñó bộ môn Vi trùng ñã có rất nhiều công trình nghiên cứu chuyên sâu về bệnh này và ñã xây dựng thành công quy trình sản xuất vắc xin phù ñầu vào năm 2003, ñã ñược kiểm nghiệm cho hiệu quả phòng bệnh tốt và ổn ñịnh. Bùi Xuân ðồng (2001)[3] cho rằng, bệnh phù thũng ở lợn có tỷ lệ chết từ 27 – 45,6%, vi khuẩn E.coli gây bệnh mang kháng nguyên K88 chiếm tới 88%, K99(22,2%), kháng sinh ñiều trị bệnh có hiệu quả là Ampicilin, Streptomicin. Nghiên cứu bệnh phù thũng ở lợn xảy ra trên ñàn lợn con ở ñồng bằng sông Cửu Long, Nguyễn Khả Ngự (2000)[11], cho rằng tỷ lệ ốm ñối với lợn bị Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 5 bệnh phù thũng ở lợn chiếm tới 58,78%, tỷ lệ tử vong là 53,54%. Các chủng E.coli chủ yếu thuộc 2 Serotyp O26 và O119. Trong ñó các chủng có khả năng gây dung huyết chiếm 38,14%, sản sinh ñộc tố chịu nhiệt ST 83,33%, ñộc tố không chịu nhiệt LT 56,6%, cả hai loại ñộc tố chịu nhiệt và không chịu nhiệt 50%. Các chủng mang kháng nguyên K88 là 90,48%. Khi dùng vắc xin ñược chế từ các chủng phân lập tiêm cho lợn tại ñịa phương lúc 21- 45 ngày tuổi, liều 3ml/con làm giảm 40% lợn ốm và 23,75% lợn chết. Nguyễn Ngọc Hải và cs (2001)[4], ñã xác ñịnh ñược Serotyp kháng nguyên gây bệnh phù thũng ở lợn bao gồm O138, O139, O141; K81, K82, K45ab, K88, K87, ứng dụng kỹ thuật PCR ñã xác ñịnh ñược ñộc tố Verotoxin và chỉ thấy ñộc tố ñường ruột ST, LT ở các chủng O141, ít gặp ở O138 và O139. Khi nghiên cứu bệnh phù thũng ở lợn, Nguyễn Thị Kim Lan (2003)[8], cho rằng tỷ lệ mắc bệnh trong ñàn là 45,77%, tỷ lệ chết 61,44%, lứa tuổi mắc bệnh cao nhất là 45 – 60 ngày tuổi, những biểu hiện lâm sàng chủ yếu: Thân nhiệt tăng cao tới 40 – 41,50C, phù mặt, tím tai, khó thở, khản tiếng, tiêu chảy, liệt hai chân trước, có triệu chứng thần kinh…. Bệnh tích chủ yếu là thủy thũng. Phạm Ngọc Thạch (2004)[13], ñã kiểm tra một số chỉ tiêu sinh hóa máu, sắc tố mật của lợn bị bệnh phù mặt, mí mắt và gan sưng, phù thũng ở lợn, phổi sưng, ruột non căng phồng chứa ñầy dịch lỏng và hơi, hạch màng treo ruột sưng, tích nước xoang bụng xoang ngực thũng ở lợn cho biết Protein tổng số, Globulin, hàm lượng ñường huyết, hàm lượng Bilirubin trong huyết thanh, Urobilin trong nước tiểu và trong phân tăng. Kháng sinh ñiều trị có hiệu quả là Enrofloxacin, Oxytetracilin, Colistin. Nghiên cứu về dịch tễ học bệnh phù thũng ở lợn tại Sóc Sơn - Hà Nội, Lê Thanh Nghị và cs (2005)[10], cho biết lợn thường mắc bệnh vào mùa hè (24,2%), mùa ñông (19,27%). Nếu cai sữa cho lợn lúc 45 ngày tuổi tỷ lệ mắc bệnh là 22,97%, cai sữa lúc 21 ngày tuổi tỷ lệ mắc chỉ là 12,65%. Tỷ lệ mắc bệnh ở lợn ngoại là 29,97%, lợn nội là 19,27%. Phân lập vi khuẩn E.coli từ bệnh phẩm ñạt tỷ lệ cao (72,76%), trong ñó 60% số chủng phân lập ñược gây dung Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 6 huyết dạng Anpha và Beta. Sử dụng kháng sinh Enrofloxacin ñiệu trị mức ñộ mẫn cảm ñối với vi khuẩn là 90,47%, Oxytetracylin 80,95%, Norfloxacin 71,42%. Dùng kháng sinh mẫn cảm cao ñể ñiều trị lợn bị phù thũng ở lợn ñạt hiệu quả 51,2%. Nghiên cứu và xác ñịnh các yếu tố gây bệnh của E.coli trong bệnh tiêu chảy và phù thũng ở lợn trong chăn nuôi tập trung thấy tỷ lệ mắc bệnh cao ñối với lợn từ 22- 60 ngày tuổi (77%), Serotyp gây bệnh chủ yếu là O139, O138, O149. Tỷ lệ các chủng E.coli gây dung huyết 55,4%, ST 57,6%, LT 42,4%, ST+ LT 39,1%, các yếu tố kháng nguyên bám dính F4 21,7%, F5 5,4%, F18 40,2%, F6 7,6%. Sử dụng vắc xin chế từ chủng phân lập tiêm cho lợn trước khi cai sữa, tỷ lệ bị bệnh giảm từ 14,3% xuống 1,5%; tỷ lệ chết giảm từ 8,2% xuống 0,7%, Trịnh Quang Tuyên (2006)[16]. Nhiều tác giả nghiên cứu về bệnh phù thũng ở lợn ở nước ta trong những năm gần ñây, các công trình nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc xác ñịnh ñặc ñiểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và các biện pháp phòng chống. Tuy nhiên chưa có nhiều công trình nghiên cứu tập trung vào lĩnh vực vắc xin phòng bệnh phù thũng ở lợn do vi khuẩn E.coli gây ra. 1.2 ðặc tính sinh học của vi khuẩn Escherichia coli. 1.2.1 ðặc tính hình thái vi khuẩn Vi khuẩn E.coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, kích thước từ 2-3 x 0,6 micromet. Trong cơ thể vi khuẩn có hình cầu trực khuẩn, ñứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi ngắn. ðôi khi trong môi trường nuôi cấy trực khuẩn có ñộ dài ñạt 48 micromet, những vi khuẩn này hay gặp trong canh trùng già. Phần lớn vi khuẩn E.coli có khả năng di ñộng do có lông bao quanh thân, không sinh nha bào, có khả năng sinh giáp mô, bắt màu Gram (–), vi khuẩn bắt màu ñều hoặc sẫm ở 2 ñầu, khoảng giữa nhạt hơn. Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhầy ñể nhuộm có thể quan sát thấy giáp mô mà soi tươi không thấy ñược. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 7 1.2.2 ðặc tính nuôi cấy nuôi cấy Vi khuẩn E.coli dễ dàng phát triển trong các môi trường nuôi cấy thông thường. Là loại trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện có thể sinh trưởng và phát triển ở nhiệt ñộ từ 5 – 400C, tuy nhiên nhiệt ñộ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 370C, pH thích hợp từ 7,2 -7,4. Sau khi nuôi cấy ñể trong tủ ấm 370C/24h trên các loại môi trường thấy các ñặc ñiểm sau: - Môi trường thạch thường: Hình thành khuẩn lac dạng tròn, ướt, không trong suốt màu tro, hơi lồi, ñường kính từ 2-3 mm. Nuôi lâu trong tủ ấm khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R (Rough) và dạng M (Mucous). - Môi trường nước thịt BHI: Vi khuẩn phát triển rất nhanh, tốt môi trường ñục ñều và có lắng cặn màu tro nhạt ở dưới ñáy, ñôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi thối như mùi phân. - Trong môi trường thạch MacConKey, khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, rìa gọn, không làm chuyển màu của môi trường. - Trong môi trường thạch máu, khuẩn lạc to, ướt, lồi rìa không gọn, màu xám nhạt, gây dung huyết (ñối với một số chủng gây dung huyết), hoặc không gây dung huyết. - Trong môi trường thạch Brilliant green, khuẩn lạc không màu trên nền vàng chanh. - Trong môi trường Simmon citrart, khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục. - Trong môi trường Endo: Khuẩn lạc màu ñỏ. - Trong môi trường EMB: Khuẩn lạc có màu tím ñen. - Trong môi trường SS: Khuẩn lạc có màu ñỏ. 1.2.3 ðặc tính sinh hóa - Chuyển hóa ñường: Vi khuẩn E.coli lên men sinh hơi các loại ñường Fructose, Glucose, Levulose, Galactose, Xylose, Ramnose, Malito, Mannit và Lactose. Hầu hết vi khuẩn E.coli ñều lên men sinh ñường Lactose nhanh và sinh hơi, ñây là ñặc ñiểm quan trọng ñể dựa vào ñó phân biệt E.coli và Samonella. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 8 ðặc tính sinh hóa của vi khuẩn E.coli (Edwasrds và cs 1972) Kiểm tra Ký hiệu (%) Indol + 98,6 Methyl red + 99,9 Voges – Proskauer - 0 Citreate - 0,2 Urease - 0 Phenylanin deaminase - 0 Arginin dihydrolase D 17,6 Lysin decarboxylase D 80,6 Ornithin decarboxylase D 64,2 Gelatin liquefraction (220C) - 0 Oxidase - 0 - Acid + 100 - Gas + 91,1 Lactose + 90,8 Sucrose D 48,9 Dulcitol D 49,5 Salicin D 40 Sorbitol + 93,4 Arabinose + 99,4 Manitol + 96,8 Glucerol + 89,3 Rhamnose D 82,3 Xylose D 81,1 Maltose + 89,9 Esculin D 30,9 Glucose Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………… 9