Tài liệu Hiệu quả của benzyl andenine và naphthalene acetic acid lên sự tạo mô sẹo và tái sinh chồi cây cà chua (lycopersicon esculentum l.)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN KHOA HỌC ĐẤT ………  ……… ĐẶNG THỊ THÚY VÂN HIỆU QUẢ CỦA BENZYL ANDENINE VÀ NAPHTHALENE ACETIC ACID LÊN SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ TÁI SINH CHỒI CÂY CÀ CHUA (Lycopersicon esculentum L.) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NÔNG NGHIỆP SẠCH KHÓA 36 Cần Thơ - 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN KHOA HỌC ĐẤT ………  ……… ĐẶNG THỊ THÚY VÂN HIỆU QUẢ CỦA BENZYL ANDENINE VÀ NAPHTHALENE ACETIC ACID LÊN SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ TÁI SINH CHỒI CÂY CÀ CHUA (Lycopersicon esculentum L.) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NÔNG NGHIỆP SẠCH KHÓA 36 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths. LÊ HỒNG GIANG Cần Thơ - 2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN KHOA HỌC ĐẤT ---XÁC NHẬN CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Xác nhận chấp thuận báo cáo luận văn tốt nghiệm với đề tài “Hiệu quả của Benzyl adenine và Naphthalene acetic acid lên sự tạo mô sẹo và tái sinh chồi cây cà chua (Lycopersicon esculentum L.)”. Do sinh viên: Đặng Thị Thúy Vân Lớp Nông nghiệp sạch Khóa 36 – Bộ môn Khoa học đất – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng thực hiện từ tháng 8/2013 đến tháng 12/2013. Nhận xét của cán bộ hướng dẫn: ................................................................................................................................... ................................................................................................................................... ................................................................................................................................... ................................................................................................................................... ................................................................................................................................... .................................................... Cần Thơ, ngày …. tháng …. năm 2013 Cán bộ hướng dẫn Lê Hồng Giang i TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN KHOA HỌC ĐẤT ---NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG Hội đồng chấm báo cáo luận văn tốt nghiệm với đề tài “Hiệu quả của Benzyl adenine và Naphthalene acetic acid lên sự tạo mô sẹo và tái sinh chồi cây cà chua (Lycopersicon esculentum L.)”. Do sinh viên: Đặng Thị Thúy Vân Lớp Nông nghiệp sạch K36 – Bộ môn Khoa học đất – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng thực hiện từ tháng 8/2013 đến tháng 12/2013 và báo cáo trước hội đồng ngày …. tháng …. năm 2013. Ý kiến của hội đồng khoa học: ................................................................... ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ ........................................................................................................................................ Luận văn tốt nghiệp được Hội đồng đánh giá ở mức: ................................ Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2013 Thành viên hội đồng -------------------------- --------------------------- --------------------------- DUYỆT KHOA Trưởng Khoa Nông Nghiệp Và Sinh Học Ứng Dụng ii TÓM TẮT TIỂU SỬ CÁ NHÂN ---1. Sơ lược lịch sư - Họ và tên: ĐẶNG THỊ THÚY VÂN - Ngày sinh: 10/10/1991 - Nơi sinh: Huyện Kế Sách – Tỉnh Sóc Trăng - Họ và tên cha: ĐẶNG VĂN MỚI - Họ và tên mẹ: HUỲNH THỊ NHUNG - Quê quán: Ấp Kinh Giữa 1 – xã Kế Thành – huyện Kế Sách – tỉnh Sóc Trăng 2. Quá trình học tập - 1998 – 2003: Trường Tiểu Học Kế Thành - 2003 – 2007: Trường Trung Học Cơ Sở Kế Sách - 2007 – 2010: Trường Trung Học Phổ Thông Kế Sách - 2010 – 2014: Trường Đại học Cần Thơ – Khoa Nông nghiệp & SHƯD – Ngành Nông nghiệp sạch – Khóa 36 Tác giả luận văn Đặng Thị Thúy Vân iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của bản thân và cán bộ hướng dẫn. Các số liệu, kết quả trong bài luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trước đây. Tác giả luận văn Đặng Thị Thúy Vân iv LỜI CẢM TẠ Kính dâng! Con xin thành kính biết ơn công lao sinh thành và nuôi dưỡng tựa trời biển của cha mẹ đã giúp con khôn lớn nên người và tận tâm lo lắng, tạo mọi điều kiện cho con được học tập đến ngày hôm nay. Thành kính biết ơn! Cô Lê Hồng Giang đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành bài luận văn. Chân thành biết ơn! Cô Nguyễn Đỗ Châu Giang cố vấn học tập lớp Nông nghiệp sạch Khóa 36 đã tận tình giúp đỡ, ũng hộ và động viên truyền đạt cho chúng em rất nhiều kinh nghiệm quý báo. Cô Lê Minh Lý, cô Phan Thị Hồng Nhung đã nhiệt tình chỉ bảo, động viên giúp đỡ trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành bài luận văn. Toàn thể quý Thầy, Cô trường Đại Học Cần Thơ đã dìu dắt truyền đạt kiến thức quý báo cho chúng em trong suốt thời gian theo học ở trường. Chân thành cám ơn! Anh Mai Vũ Duy, chị Ngô Phương Ngọc, chị Lê Võ Thùy Ngân, chị Đặng Phương Duyên, bạn An lớp Hoa viên cây cảnh khóa 36, bạn Trân và bạn Cu Ba lớp Nông học liên thông khóa 38 , bạn Nhiên, bạn Diệp và bạn Nghiệp, ban Điền, ban Xuyên lớp Nông nghiệp sạch khóa 36 đã nhiệt tình đã nhiệt tình giúp đỡ em trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Cảm ơn tất cả các bạn lớp Nông nghiệp sạch K36 đã cùng giúp đỡ nhau trong suốt bốn năm học tại trường Đại Học Cần Thơ. Cảm ơn tất cả các bạn tôi quen biết đã động viên, giúp đỡ trong suốt thời gian học tập và rèn luyện và hoàn thành luận văn. Xin kính chúc quý Thầy, Cô, anh, chị, tất cả các bạn trong Bô môn Khoa học đất – Khoa nông nghiệp & SHƯD – Trường Đại Học Cần Thơ nhiều sức khỏe và công tác tốt. Trân trọng kính chào! Đặng Thị Thúy Vân v MỤC LỤC Xét duyệt luận văn ........................................................................................... i Tóm tắt tiểu sử cá nhân .................................................................................... iii Lời cam đoan ................................................................................................... iv Lời cảm tạ ........................................................................................................ v Mục lục ............................................................................................................ vi Danh sách hình.............................................................................................. viii Danh sách bảng ............................................................................................... ix Danh sách chử viết tắt ..................................................................................... x Tóm lược ......................................................................................................... xi MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................... 2 1.1 NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CÀ CHUA ......... 2 1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố ............................................................ 2 1.1.2 Đặc điểm thực vật ........................................................................ 2 1.2 SƠ LƯỢC VỀ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT ..................................... 3 1.2.1 Giới thiệu về nuôi cấy mô thực vật ............................................. 3 1.2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật ............................ 3 1.3 SỰ HÌNH THÀNH MÔ SẸO VÀ TÁI SINH CHỒI ........................... 7 1.3.1 Định nghĩa mô sẹo ....................................................................... 7 1.3.2 Tạo và nuôi cấy mô sẹo ............................................................... 8 1.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo mô sẹo ............................... 9 1.3.4 Sự tái sinh mẫu cấy ...................................................................... 10 1.3.5 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tái sinh chồi ............................. 11 1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY MÔ TRÊN CÂY CÀ CHUA . 12 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................... 13 2.1 PHƯƠNG TIỆN ................................................................................... 13 2.1.1 Vật liệu thí nghiệm ...................................................................... 13 2.1.2 Thiết bị và dụng cụ ...................................................................... 13 vi 2.1.3 Địa điểm và thời gian thí nghiệm ................................................ 13 2.1.4 Điều kiện thí nghiệm ................................................................... 13 2.2 PHƯƠNG PHÁP ................................................................................. 14 2.2.1 Môi trường nuôi cấy .................................................................... 14 2.2.2 Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy ........................................................... 14 2.2.3 Bố trí thí nghiệm .......................................................................... 15 2.3 XỬ LÝ SỐ LIỆU ................................................................................. 16 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 17 3.1 HIỆU QUẢ CỦA BA VÀ NAA LÊN SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ TÁI SINH CHỒI TỪ ĐỈNH SINH TRƯỞNG CÂY CÀ CHUA ..................... 17 3.1.1 Tỷ lệ tạo mô sẹo (%).................................................................... 17 3.1.2 Đường kính mô sẹo (mm) ............................................................ 18 3.1.3 Tỷ lệ mô sẹo tái sinh chồi (%) ..................................................... 20 3.1.4 Số chồi ......................................................................................... 21 3.1.5 Chiều cao chồi (mm) ................................................................... 21 3.1.6 Số lá ............................................................................................. 23 3.1.7 Tỷ lệ tái sinh chồi trực tiếp (%) ................................................... 23 3.2 HIỆU QUẢ CỦA BA VÀ NAA LÊN SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ TÁI SINH CHỒI TỪ LÁ NON CÂY CÀ CHUA ............................................. 25 3.2.1 Tỷ lệ tạo mô sẹo (%).................................................................... 25 3.2.2 Đường kính mô sẹo (mm) ............................................................ 26 3.2.3 Tỷ lệ mô sẹo tái sinh chồi (%) ..................................................... 28 3.2.4 Số chồi ......................................................................................... 28 3.2.5 Chiều cao chồi (mm) ................................................................... 29 3.2.6 Số lá. ............................................................................................ 30 3.1.7 Tỷ lệ tạo rễ (%) ............................................................................ 31 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................... 33 4.1 KẾT LUẬN .......................................................................................... 33 4.2 ĐỀ NGHỊ.............................................................................................. 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 34 vii DANH SÁCH HÌNH Tựa bảng Hình Trang 2.1 Vật liệu thí nghiệm: (A) Đỉnh sinh trưởng chụp dưới kính nhìn nổi vật độ phóng đại gấp 10 lần, (B) Lá cà chua 15 2.2 Cách đo chiều cao chồi 16 3.1 Sự phát sinh hình thái từ đỉnh sinh trưởng: (A) và (B) mô sẹo, (C) chồi trực tiếp 18 Sự phát sinh hình thái của đỉnh sinh trưởng trên môi trường MS có bổ sung BA kết hợp NAA với các nồng độ khác nhau sau 7 tuần cấy 24 Sự phát triển của mẫu lá cà chua trên môi trường MS có bổ sung BA kết hợp NAA với các nồng độ khác nhau sau 7 tuần cấy 32 3.2 3.3 viii DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 Tên bảng Trang Các nồng độ BA và NAA được bố trí trong từng nghiệm thức (NT). 15 Hiệu quả của BA và NAA lên tỷ lệ tạo mô sẹo (%) trưởng ở 4, 5 và 7 tuần sau khi cấy. 17 Hiệu quả của BA và NAA lên đường kính mô sẹo (mm) ở khi 4, 5 và 7 tuần sau cấy. 19 Hiệu quả của BA và NAA lên tỷ lệ mô sẹo tái sinh chồi (%) ở 5 và 7 tuần sau khi cấy. 20 Hiệu quả của BA và NAA lên số chồi ở 5 và 7 tuần sau khi cấy. 21 Hiệu quả của BA và NAA lên chiều cao chồi (mm) ở 5 và 7 tuần sau khi cấy. 22 Hiệu quả của BA và NAA lên số lá ở 5 và 7 tuần sau khi cấy. 23 Hiệu quả của BA và NAA lên tỷ lệ tạo mô sẹo (%) ở 3, 5 và 7 tuần sau khi cấy. 26 Hiệu quả của BA và NAA lên đường kinh mô sẹo (mm) 3, 5 và 7 tuần sau khi cấy. 27 Hiệu quả của BA và NAA lên tỷ lệ mô sẹo tái sinh chồi (%) ở 5 tuần sau khi cấy. 28 Hiệu quả của BA và NAA lên số chồi ở 5 và 7 tuần sau khi cấy. 29 Hiệu quả của BA và NAA lên chiều cao chồi (mm) ở 5 và 7 tuần sau khi cấy. 30 Hiệu quả của BA và NAA lên số lá ở 5 và 7 tuần sau khi cấy. 31 ix DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT BA Benzyl adenine ctv Cộng tác viên MS Môi trường Murashige và Skoog NAA Naphthalenacetic Acid NT Nghiệm thức TSKC Tuần sau khi cấy x ĐẶNG THỊ THÚY VÂN, 2013. “Hiệu quả của Benzyl adenine và Naphthalene acetic acid lên sự tạo mô sẹo và tái sinh chồi cây cà chua (Lycopersicon esculentum L.)”. Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư ngành Nông nghiệp sạch, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ. Cán bộ hướng dẫn: Th.S Lê Hồng Giang. TÓM LƯỢC Đề tài “Hiệu quả của benzyl adenine và naphthalene acetic acid lên sự tạo mô sẹo và tái sinh chồi cây cà chua (Lycopersicon esculentum L.)” được thực hiện nhằm mục tiêu xác định nồng độ thích hợp của hai chất này cho sự tạo mô sẹo và tái sinh chồi từ hai nguồn mẫu cấy là đỉnh sinh trưởng và lá non để giúp cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu tiếp theo về chọn lọc dòng biến dị mới trên cây cà chua, làm cơ sở cho công tác cải thiện giống. Hai thí nghiệm bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố, gồm 8 nghiệm thức là các nồng độ BA từ 0-2 mg/l + NAA 0 và 0,25 mg/l được thực hiện trên hai nguồn vật liệu khác nhau là đỉnh sinh trưởng và lá non. Kết quả thí nghiệm cho thấy ở mẫu cấy đỉnh sinh trưởng, mô sẹo có khả năng tái sinh chồi trên môi trường chỉ sử dụng BA đơn, trong đó nồng độ BA 1 mg/l cho tỷ lệ mô sẹo tái sinh chồi cao nhất với 95% ở 7 tuần sau khi cấy. Đối với mẫu cấy lá non, môi trường bổ sung BA 0,5-2 mg/l đơn có khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo với tỷ lệ 77,7 đến 88,9%. Từ khóa: Benzyl adenine, naphthalene acetic acid, mô sẹo, tái sinh chồi, cây cà chua. xi MỞ ĐẦU Cà chua là loại rau ăn quả phổ biến và rất được ưa thích từ lâu ở nhiều nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam vì có phẩm chất ngon, giá trị dinh dưỡng cao, chế biến được nhiều cách và có nhiều công dụng trong y học. Ở nước ta, cà chua được xếp vào loại rau có giá trị dinh dưỡng cao. Tuy nhiên việc trồng cà chua ở nước ta chưa được phát triển mạnh mẽ và theo mong muốn do điều kiện khí hậu nóng ẩm dễ phát sinh nhiều bệnh gây hại đáng kể, khó phòng trị như nấm, vi khuẩn, virus,…thêm vào đó, công tác chọn giống chưa được phát triển, đa phần lượng hạt giống phát triển hàng năm được nhập khẩu từ nước ngoài, làm hạn chế nguồn giống cũng như giá thành sản xuất của nông dân (Tạ Thu Cúc, 2005). Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô hay còn gọi là vi nhân giống đã có hiệu quả rất lớn trong việc nhân nhanh nhiều giống cây trồng với chất lượng cây giống đồng nhất, nhờ đó có thể đáp ứng được nhu cầu của thị trường. Trên thế giới, các nghiên cứu về nuôi cấy mô trên cà chua đã phát triển, trong đó có công tác cải thiện di truyền và nhân nhanh số lượng lớn các giống thương mại cùng nhiều công trình nghiên cứu cơ bản khác trên cây cà chua (Osman và ctv., 2010, Arrillaga và ctv., 2001, Compton và Veilleux, 1991). Trong vi nhân giống, phương pháp biến đổi thành cây thông qua sự tạo mô sẹo và tái sinh cây đã rất có hiệu quả, cho hệ số nhân giống rất cao. Ở nước ta hiện nay, kỹ thuật này cũng được phát triển ở rất nhiều loài thực vật, tuy nhiên trên cây cà chua thì vẫn chưa được nghiên cứu nhiều. Vì thế, đề tài: “Hiệu quả của Benzyl adenine và Naphthalene acetic acid lên sự tạo mô sẹo và tái sinh chồi cây cà chua (Lycopersicon esculentum L.)” được thực hiện nhằm mục tiêu xác định nồng độ thích hợp của hai chất này cho sự tạo mô sẹo và tái sinh chồi từ hai nguồn mẫu cấy là đỉnh sinh trưởng và lá non để cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu tiếp theo về chọn lọc dòng biến dị mới trên cây cà chua, làm cơ sở cho công tác cải thiện giống. 1 CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CÀ CHUA 1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố Cà chua có tên khoa học là Lycppersicon esculentum L. thuộc họ cà (Solanaceae), tên tiếng anh “tomato”, có nguồn gốc ở vùng Trung và Nam Châu Mỹ (Phạm Hồng Cúc, 1999). Theo Tạ Thu Cúc (2002), cà chua có nguồn gốc ở Pêru Và Ecuado trước khi Crixtop Colong tìm ra Châu Mỹ thì cà chua được trồng ở Pêru và Mêhico. Cuối thế kỷ 19, có trên 200 dòng, giống cà chua đã được phổ biến rộng rãi. 1.1.2 Đặc điểm thực vật Rễ: Cà chua có rễ chùm ăn sâu và phân nhánh mạnh, khả năng phát triển rễ phụ rất lớn. Trong điều kiện tối hảo, những giống tăng trưởng mạnh có rễ ăn sâu 1-1,5 m và rộng 1,5-2,5 m vì vậy cà chua là cây chịu hạn tốt (Trần Thị Ba và ctv., 1999). Thân: Thân bụi, phân nhánh mạnh trong điều kiện vườn ươm. Thân mềm nhiều nước, giòn dễ gãy, xung quanh thân có phủ một lớp lông dày có màu sắc khác nhau. Trên thân có nhiều đốt và có khả năng ra rễ bất định, chiều cao thân từ 0,25-2 m, số lượng cành dao động từ 3-19 cành (Mai Thị Phương Anh, 1996). Theo Trần Thị Ba và ctv., (1999) và Tạ Thu Cúc (2002), có thể chia cà chua thành 3 dạng dựa vào đặc điểm sinh trưởng và chiều cao cây: + Dạng sinh trưởng hữu hạn: Cây thấp hơn 65 cm và ngừng tăng trưởng khi có chùm hoa tận cùng ở ngọn. + Dạng sinh trưởng vô hạn: Sự sinh trưởng vẫn tiếp tục khi cây ra hoa nhờ vào sự tăng trưởng của chồi nách lá trên cùng và có chiều cao từ 120-200 cm thân lá sinh trưởng mạnh cần tỉa cành tạo lá. + Dạng sinh trưởng bán hữu hạn: Cây cho nhiều chùm hoa ở tận ngọn, lúc này cây mới ngừng tăng trưởng mạnh, cần tỉa cành tạo tán. Lá: Là đặc trưng hình thái để phân biệt giống này với giống khác (Tạ Thị Thu Cúc, 2002). Lá thuộc lá kép lông chim lẻ, mỗi lá có 3-4 đôi lá chét, ngọn lá có 1 lá riêng gọi là đỉnh. Rìa lá chét đều có răng cưa cạn hay sâu tùy giống, phiến lá thường phủ lông tơ (Trần Thị Ba và ctv., 1999). Hoa: Mọc thành chùm, lưỡng tính tự thụ phấn là chính, khó thụ phấn chéo vì hoa không hấp dẫn được côn trùng (do có alkalaid) và hạt phấn nặng không bay xa được (Trần Thị Ba và ctv., 1999). Số chùm hoa trên cây từ 4-20, 2 số lượng hoa trên chùm dao động từ 2-26 hoa, có nhiều giống số hoa trên chùm lên đến hàng trăm hoa (Trần Thị Ba và ctv., 1999). Trái: Trái cà chua thuộc loại mọng nước, có hình dáng thay đổi từ tròn, bầu dục đến dài, màu sắc trái thay đổi tùy giống và điều kiện thời tiết (Trần Thị Ba và ctv., 1999). Theo Tạ Thu Cúc (2002), quả cà chua cấu tạo từ 2 đến nhiều ngăn, hầu hết có từ 3 ngăn trở lên. Trọng lượng trái thay đổi từ 20g ở cherry đến 300g ở những giống trái lớn. Hạt: Nhỏ dẹt, nhiều lông, màu vàng sáng hoặc hơi tối, một trái chứa từ 50-350 hạt, hạt vẫn có thể tồn tại sau 3-4 năm tồn trữ. Trọng lượng ngàn hạt từ 2,5-3,5g (Mai Thị Phương Anh, 1996). 1.2 SƠ LƯỢC VỀ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 1.2.1 Giới thiệu về nuôi cấy mô thực vật Trong nhiều năm qua, các phương pháp nhân giống vô tính truyền thống giữ một vai trò quan trọng trong ngành trồng trọt và đã có ý nghĩa to lớn trong nhân giống thực vật. Tuy nhiên, phương pháp này còn có một số giới hạn phụ thuộc vào mùa vụ, hệ số nhân thấp,… Chính vì thế mà trong nhiều năm trở lại đây một phương pháp mới là nhân giống in vitro (nuôi cấy mô thực vật) đã được áp dụng. Với phương pháp này người ta có thể nhân dòng thực vật một cách nhanh chóng và có thể nhân rất nhiều loại cây từ các vùng khí hậu khác nhau trên thế giới mà các phương pháp nhân giống vô tính không thực hiện được (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Vi nhân giống là việc nhân đúng kiểu cây (true-to-type) của một kiểu gen được tuyển chọn bằng cách sử dụng kỹ thuật in vitro. Vi nhân giống thông thường là phương pháp nhân nhanh và giảm giá thành (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). 1.2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy mô thực vật Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài, bộ phận nuôi cấy và tuỳ theo mục đích thí nghiệm mà mô cấy được duy trì ở trạng thái mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ hay muốn tái sinh thành cây hoàn chỉnh (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) Có nhiều môi trường được sử dụng trong nuôi cấy mô, trong đó có môi trường Murashige & Skoog (MS) (1962), là môi trường giàu và cân bằng về chất dinh dưỡng và thích hợp cho nhiều loại cây nên được sử dụng rộng rãi (Nguyễn Văn Uyển và ctv., 1993). 3 Thành phần của môi trường nuôi cấy bao gồm rất nhiều chất. Nguyễn Bảo Toàn (2010), phân các chất thành 2 thành phần: Thành phần cơ bản và thành phần tự chọn. Thành phần cơ bản là thành phần luôn luôn có trong môi trường như: Nước, các nguyên tố khoáng, nguồn carbohydrat, vitamin, chất tạo gel và chất điều hòa sinh trưởng. Thành phần tự chọn là thành phần có thể thêm hoặc không thêm vào môi trường: Chelates, chất thẩm thấu, than, amino acid, đạm hữu cơ.  Các nguyên tố khoáng Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010), các nguyên tố khoáng được chia thành 2 nhóm: Nguyên tố khoáng đa lượng và nguyên tố khoáng vi lượng. - Nhóm nguyên tố khoáng đa lượng: Nitrogen (N) (dạng ammonium và nitrat), phosphoros (P), Potassium (K), Magnesium (Mg), Calcium (Ca), Sulfur (S), Sodium (Na) và Cloride (Cl). Khoáng đa lượng rất cần thiết cho cây (Lê Văn Hoà và Nguyền Bảo Toàn, 2004) và được sử dụng với nồng độ trên 30 ppm (tức trên 30 mg/1) (Lê Trần Bình và ctv., 1997). - Nhóm nguyên tố khoáng vi lượng: Iodin (I), Bo (B), Mangna (Mn), kẽm (Zn), Molybdenum (Mo), Cuprum (Cu), Cobalt (Co), Aluminium (Al), Nickel (Ni), Sắt (Fe). Khoáng vi lượng hiện diện trong cây với nồng độ rất thấp nhưng rất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng (Lê Văn Bé, 2007).  Nguồn carbohydrat Theo Bùi Bá Bổng (1995), mô cấy trong môi trường không có khả năng tự dưỡng, do đó cần phải cung cấp nguồn carbohydrat. Nguồn carbohydrat được bổ sung vào môi trường nuôi cấy thường là đường. Hai loại đường thường được sử dụng là sucrose và glucose, nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn (Nguyễn Đức Thành, 2000). Đường sucrose thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ 2-5% (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Trong môi trường tạo rễ, nồng độ đường sucrose có thể giảm bớt khoảng 1% (20 g/1) (Bùi Bá Bổng, 1995).  Vitamin Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: Thiamine (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxin (B6) và myo-inositol (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). 4  Chất tạo gel Agar là chất thường được sử dụng nhiều nhất để tạo môi trường đặc hay môi trường bán lỏng để nuôi cấy mô thực vật (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010) agar được bào chế từ rong biển, dùng làm chất nền cho môi trường nuôi cấy vì nó có nguồn gốc thực vật tự nhiên, agar không độc cho môi trường, lượng dùng là 0,6-0,8%. Nồng độ agar sử dụng sẽ ảnh hưởng đến thế năng nước trong môi trường nuôi cấy, độ cứng của môi trường, sự sinh trưởng của mẫu cấy, các vấn đề sinh lý của mẫu cấy như thừa nước và sự hoạt động của cytokinin trong môi trường có agar (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Nồng độ agar cao môi trường trở nên cứng, sự khuếch tán các chất dinh dưỡng cũng như sự hấp thụ của mô sẽ gặp khó khăn (Bùi Bá Bổng, 1995).  Chất điều hòa sinh trưởng + Auxin Nhóm auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006). Các auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô: Indole-3-acetic acid (IAA) (0,1-10 mg/1), Napthaleneacetic acid (NAA) (0,05-1 mg/1), Indole-3-butyricacid (IBA) (0,5-3 mg/1) (Lê Trần Bình, 1997). Theo Bonga và Durzan (1986) auxin nhân tạo NAA và IBA thường được sử dụng cho sự tạo rễ và có hiệu quả hơn IAA và 2,4-D. Sự hình thành rễ còn phụ thuộc vào loài thực vật (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Theo Lê Trần Bình và ctv. (1997), auxin được gọi là hormon sinh trưởng do Went và Thimann (1937) phát hiện ra. Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật auxin được sử dụng cho sự phân chia tế bào, phân hóa rễ và ức chế sự thành lập chồi bên (Bùi Bá Bổng, 1995). Ngoài ra khi kết hợp với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy đặc biệt là cytokinin có tác dụng kích thích tạo mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hoà sự phát sinh hình thái. Khi sử dụng auxin với nồng độ cao lại kích thích sự tạo mô sẹo nhưng ảnh hưởng không tốt đến sự tạo lập rễ nhưng ở hàm lượng thấp thì sẽ gia tăng sự hình thành rễ phụ (Vũ Văn Vụ, 1999). Hơn nữa, auxin có tác dụng kích thích quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi (Vũ Văn Vụ, 1999). 5 Ngoài ra auxin còn có vai trò thúc đẩy sự sinh trưởng của tế bào, cụ thể là nới lỏng vách tế bào thông qua sự hoạt hoá các emzym tổng hợp vách và làm giãn nở tế bào (Đặng Phương Trâm, 1997). Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên (2002), việc bổ sung auxin vào môi trường nuôi cấy là rất cần thiết vì chúng rất cần cho phân chia tế bào và quá trình phân biệt hoá tế bào. Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là IAA (3-indolyl-acetic acid) (George, 1993). Các auxin thường dùng nhất trong nuôi cấy mô là 2,4-D (Dichlophenoxy acetic acid), NAA (Naphthalene acetic acid), IBA (Indole butyric acid), IAA (Indole acetic acid). NAA và IBA thường dùng để cho ra rễ và dùng để phối hợp với cytokinin trong sự nhân chồi. Tuỳ theo mục đích thí nghiệm mà người ta có thể dùng loại và nồng độ auxin khác nhau. Theo Nguyễn Đức Thành (2000), thì chất này có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzym và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường. NAA là một auxin nhân tạo, hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA, NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào. Nồng độ auxin thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy từ 0,l-2,0 mg/1 vì chúng có hiệu quả ở nồng độ thấp (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006). + Cytokinin Cytokinin là những hợp chất adenin được thay thế, có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào và những chức năng điều hòa sinh trưởng khác giống như kinetin (Nguyễn Minh Chơn, 2005). Cytokinin đầu tiên được phân lập từ AND của tinh trùng cá trích sau khi hấp thanh trùng đã kích thích mạnh mẽ hoạt động giảm phân và sự phân chia tế bào trong một mẫu nuôi cấy mô sẹo của cây thuốc lá, nó được gọi là kinetin (Lê Vân Hòa và ctv., 1999). Cytokinin có nguồn gốc thực vật được phân lập đầu tiên từ hạt bắp non là zeatin. Ngày nay có nhiều cytokinin tổng hợp được biết tới, trong đó có ba chất thông dụng nhất trong nuôi cấy mô là kinetin (6-furfuryl-aminopurin), BA (benzyl adenin), BAP (Benzyl amino purin). Cytokinin là một nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật riêng lẻ. Hiệu lực chủ yếu của cytokinin khi ứng dụng trong nuôi cấy mô là cùng với auxin kích thích sự phân chia tế bào và điều khiển sự phát sinh hình thái. Tác động kích thích của cytokinin trên cả hai bước phân chia tế bào: phân nhân và phân bào. Cytokinin giúp tạo sự gia tăng kích thước tế bào. Trong thân và rễ, cytokinin cản trở sự kéo dài, nhưng kích thích sự tăng rộng tế bào (tăng rộng củ). 6 Trong nuôi cấy mô, cytokinin được bổ sung vào môi trường nhằm kích thích sự hoạt động của chồi bên và giảm hiện tượng ưu thế ngọn. Việc bổ sung cytokinin vào môi trường nuôi cấy có thể cảm ứng được sự tăng trưởng của vài chồi nhỏ từ mẫu cấy 4-6 tuần, nếu nồng độ cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi và những chồi này không thể kéo dài, làm cho quá trình biến dạng hoặc làm cho chồi chứa nhiều nước (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). + Tương tác giữa auxin/cytokinin Việc sử dụng tỷ lệ auxin/cytokinin trong môi trường nuôi cấy quyết định sự phân hóa của tế bào theo hướng tạo mô sẹo, tạo chồi tạo rễ hay tạo phôi soma (Nguyễn Xuân Linh, 1998). Theo Bonga và Durzan (1986) cytokinin kết hợp với auxin với nồng độ thích hợp có thể cảm ứng tái sinh chồi từ sẹo. Những nghiên cứu của Skoog (1962) cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao thích hợp cho sự hình thành rễ, nếu tỷ lệ thấp sẽ kích thích quá trình phát sinh chồi. Nếu tỷ lệ ở mức cân bằng thì hình thành sẹo (callus) (trích từ Nguyễn Đức Thành, 2000). Tuy nhiên sử dụng cytokinin cao có thể gây ra một số vấn đề như sự thừa nước, tạo thành cụm chồi, biến dị vô tính và các vấn đề cấu trúc bất thường (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). + Một số nghiêm cứu sự ảnh hưởng của BA và NAA lên sự hình thành mô sẹo và tái sinh chồi Theo Nguyễn Phạm Hồng Hạnh (2012), môi trường MS bổ sung NAA 4 mg/l + BA 0,1 mg/l hoặc NAA 5 mg/l + BA 0,1 mg/l có hiệu quả tối ưu (100%) trong việc cảm ứng tạo mô sẹo ở mẫu lá non cây bằng lăng nhiều hoa in vitro, đường kính mô sẹo gia tăng cao nhất sau 9 tuần nuôi cấy. Theo Nguyễn Đức Thuận (2012), môi trường MS bổ sung NAA 2-4 mg/l hoặc NAA 2-4 mg/l + BA 0,1 mg/l có hiệu quả tối ưu trong việc cảm ứng tạo mô sẹo ở mẫu lá non cây Cẩm tú cầu in vitro (đạt 100% sau 10 tuần nuôi cấy). Trong thí nghiệm nhân chồi cây cẩm tú cầu in vitro, sử dụng môi trường MS bổ sung BA 3 mg/l để nuôi cấy, cho số chồi cao (3,53 chồi sau 4 tuần cấy) (Trịnh Thanh Cao, 2012). Theo Nguyễn Hồng Ái (2011), kết quả nghiêm cứu “Hiệu quả của NAA, BA và TDZ trên sự tạo chồi và nhân chồi cây Phú quý in vitro” cho thấy: Giai đoạn khởi đầu, môi trường có bổ sung BA 1 cho chiều cao chồi gia tăng, 9 cm sau 8 tuần nuôi cấy. Giai đoạn nhân chồi mô trường MS có bổ sung BA 3 mg/l + TDZ 0,5 mg/l đạt 0,7 chồi sau 4 tuần nuôi cấy. 7