Tài liệu Gt hstp chuong 2 protein doc

Chöông II PROTEIN KHAÙI NIEÄM CHUNG VEÀ PROTEIN Ñònh nghóa:  Protein laø nhöõng polymer sinh hoïc, chöùa nitô, ñöôïc caáu taïo töø caùc acid amin, coù troïng löôïng phaân töû lôùn hôn 5.000 danton vaø bò keát tuûa hoaøn toaøn bôûi acid tricloacetic 10% (TCA).  Protein cuûa moãi caù theå SV raát khaùc nhau veà chuûng loaïi, soá löôïng vaø söï phaân boá taïi caùc cô quan Ñoäng vaät: protein chieám 70 % ck, cô / 16-23% ck; gan / 18-19% ck; tim / 16-18% ck Thöïc vaät: protein chieám 5% ck; haït / 10-13% ck; laù, thaân / 1,2-3% ck; reã coù 0,5% ck Nguoàn Protein Protein ñoäng vaät: Protein thöïc vaät: Thòt caùc gia suùc, gia caàm, caù, toâm, tröùng, söõa,… Cua, caùy , teùp, caùc ñoäng vaät thaân meàm Pheá lieäu loø moå nhö tieát vaø xöông. Haït caùc loaïi ñaäu, ñaëc bieät laø ñaäu naønh. Beøo hoa daâu, taûo, naám Baûng thaønh phaàn protein moät soá loaïi thöïc phaåm Nguyeân lieäu Moâ cô thòt gia suùc Tröùng (gaø, vòt, chim cuùt) Söõa boø Caù Toâm Möïc Oác Soø Heán Ñaäu naønh Ñaäu phoäng vaø caùc loaïi ñaäu khaùc Baép Luùa Protein, % 16 – 22 13 – 15 3–5 17 – 21 19 – 23 17 – 20 11 – 12 8–9 4–5 34 – 40 23 – 27 8 – 10 7–8 CAÁU TAÏO PHAÂN TÖÛ CUÛA PROTEIN Thaønh phaàn nguyeân toá H : 6-7.5% O : 21-24% moät soá protein coøn chöùa moät löôïng raát nhoû caùc C : 50-55% nguyeân toá khaùc nhö P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca N : 15-18% S : 0 - 0.24% Trong ñoù Nitô laø thaønh phaàn oån ñònh nhaát (16%), ngöôøi ta thöôøng ñònh löôïng Nitô roài döïa vaøo ñoù ñeå tính haøm löôïng protein: % protein = 100/16 * %N = 6,25 * %N 1 Acid Amin Ñònh nghóa  Acid amin laø ñôn vò caáu truùc cô sôû cuûa protein. Caùc acid amin seõ lieân keát vôùi nhau thaønh moät phaân töû protein.  Acid amin laø daãn xuaát cuûa acid carboxylic trong ñoù hydro ñöôïc thay theá baèng nhoùm amin ôû vò trí  hay .  Coâng thöùc chung laø:   R CH COOH R NH2 CH COOH CH2 NH2  Coù hôn 100 loaïi acid amin khaùc nhau trong töï nhieân nhöng chæ coù 22 loaïi  -acid amin tham gia vaøo caáu truùc protein. Tuy chæ coù 22 loaïi, nhöng söï khaùc nhau veà thaønh phaàn vaø trình töï saüp xeáp cuûa caùc acid amin ñaõ daãn ñeán söï ña daïng veà caáu taïo cuûa protein.  Trong dung dòch pH = 7, acid amin toàn taïi chuû yeáu daïng ion löôõngRcöïc CH COONH3+ Phaân loaïi theo caáu taïo Nhoùm1: Acid monoamino monocarboxylic coù 7 acid amin maïch thaúng Glycin (R=H), alanin (R=CH3), valin (R=(CH3)2CH), leucin (R=(CH3)2CH2CH), Isoleucin (R=(CH3)(C2H5)CH), serin (R=(HO)CH2), threonin (R=(HO)(CH3)CH) Nhoùm 2: diamino monocarboxylic nhoùm naøy coù hai acid amin Lysin (R=(NH2)(CH2)4), Arginin ((R=(NH2)(NH)C-NH(CH2)3) Nhoùm 3: acid monoamin dicarboxylic nhoùm naøy coù 2 acid amin Aspatic (R=(COOH)CH2), Glutamic (R= (COOH)CH2CH2) Nhoùm : amid cuûa acid amin dicarboxylic Asparagin (R=(NH2)COCH2), Glutamin (R=(NH2)COCH2CH2) Nhoùm 5: acid amin chöùa S coù 3 acid amin Cystein (R=(SH)CH2), cystin (R=(alanin)-S-S-(alanin)), methionin (R=CH3S(CH2)2) Nhoùm 6: acid amin dò voøng coù 4 acid amin HO Prolin N COOH Oxyprolin N COOH Tryptophan H H Nhoùm 7: caùc acid amin nhaân thôm Phenylalanin N CH2 Histidin H N N CH2 coù 2 acid amin CH2 Tyrosin HO CH2 Phaân loaïi theo tính chaát dinh döôõng Acid amin thay theá: cô theå coù theå toång hôïp ñöôïc töø caùc aa khaùc Acid amin khoâng thay theá: cô theå khoâng töï toång hôïp ñöôïc, phaûi boå sung ñeàu ñaën. Val, Leu, Ileu, Met, Thr, Phe, Try, Lys, Arg, His Tính chaát cuûa acid amin Tính chaát vaät lyù:  Daïng tinh theå, maøu traéng, beàn ôû nhieät ñoä 20-250C  Ña soá caùc aa ñeàu coù vò ngoït, laøm chaát taïo vò (MSG, Asp, Lys)  Tan khaù toát trong nöôùc, möùc ñoä tan coù khaùc nhau, tan toát nhaát laø prolin (162g/100mL), tan keùm nhaát laø cystein (0,011g/100mL).  Ña soá acid amin coù vuøng haáp thu töû ngoaïi 240-280 nm. 2  Tröø glycin, caùc aa khaùc ñeàu coù C baát ñoái neân ñeàu coù hai daïng ñoàng phaân quang hoïc, daïng D vaø daïng L. COOH COOH C* H H2N C* NH2 H (L.a.acid) R R (D.a.acid)  Protein chæ chöùa aa daïng L, ñoäng vaät vaø thöïc vaät cuõng chæ haáp thu ñöôïc daïng L, daïng D ñoâi khi coøn coù aûnh höôûng xaáu ñeán quaù trình trao ñoåi chaát. Tính chaát hoùa lyù: Tính ñieän ly löôõng cöïc: vì aa coù caû hai nhoùm chöùc –COOH vaø –NH 2 neân trong dung dòch noù toàn taïi 2 daïng, daïng phaân töû vaø daïng ion löôõng cöïc R CH COOH R COO- CH NH3+ NH2 Moãi aa seõ toàn taïi moät pH ôû ñoù phaân töû aa seõ trung hoøa veà ñieän, ñöôïc goïi laø ñieåm ñaúng ñieän (pI), PA : pH taïi ñoù phaân töû acid amin baét ñaàu tích ñieän (+) PB : pH taïi ñoù phaân töû acid amin baét ñaàu tích ñieän (-) pI  pH A  pH B 2 Glycin pA = 2,34 , pB = 9,60 pI = 5,67 Ña soá aa trung tính coù pI ôû vuøng pH acid amin yeáu. pI (aspartic) = 2,77 pI (arginin) = 10,76 Tính chaát hoùa hoïc [1] Phaûn öùng vôùi caû acid vaø base R CH COO- NH3+ R CH COO- NH3+ + + R HCl CH COOH NH3Cl NaOH R CH COONa NH2 + H2O [2] Tính beàn vôùi acid , base  Acid-nhieät ñoä cao (HCl6N, 100-107 0C, 20-72g): ña soá aa khoâng bò phaân huûy, 1030% aa coù S bò oxy hoùa, try bò phaân huûy hoaøn toaøn, khoâng xaûy ra hieän töôïng racemic hoùa  Kieàm (NaOH 4-8N, Ba(OH)2 14%, ñun soâi, 18-29g) aa bò racemic hoùa, maát giaù trò dinh döôõng cuûa aa. [3] Phaûn öùng vôùi formaldehyd: R CH NH2 COOH + O HC H R CH N COOH CH2 + H2O Tính acid cuûa acid môùi maïnh hôn aa vaø coù theå ñònh phaân baèng NaOH. [4] Phaûn öùng vôùi ninhydrin: Taát caû aa taïo phöùc Ruheman maøu xanh tím vôùi ninhydrin  Prolin vaø oxyprolin seõ taïo hôïp chaát maøu vaøng vaø khoâng giaûi phoùng NH 3  3 [5] Taïo phöùc vôùi kim loaïi naëng: aa coù theå taùc duïng vôùi kim loaïi naëng , nhaát laø kim loaïi hoùa trò II taïo ra muoái noäi phöùc (Pb, Hg, Cu,…) coù maøu ñaëc tröng. [6] Söï taïo thaønh ester: aa coù theå taùc duïng vôùi röôïu taïo thaønh ester. Ester cuûa acid amin ñeàu laø nhöõng chaát loûng deã bay hôi, coù tính kieàm, deã ñieàu cheá baèng caùch caát ôû trong chaân khoâng. R + COOH CH R C2H5OH COOC2H 5 CH + H2O NH2 NH2 D. Caùc kieåu lieân keát hoùa hoïc cuûa acid amin : Lieân keát peptid: Moät trong nhöõng phaûn öùng quan troïng nhaát cuûa acid amin laø söï toång hôïp caùc peptid, khi ñoù goác –COOH cuûa acid amin naøy seõ keát hôïp vôùi goác -NH2 cuûa acid amin khaùc, loaïi ñi moät phaân töû nöôùc. Phöông trình bieåu dieãn nhö sau: R1 NH2 R1 CH COOH + HHN CH COOH NH2 CH CO NH CH R2 COOH R2 lieân keát peptid Töông töï nhö vaäy neáu coù nhieàu acid amin hôn. R1 NH2 R3 CH COOH + HHN CH COOH + HHN CH COOH + HHN CH R2 R4 R1 NH2 COOH R3 CH CO NH CH CO NH CH CO NH CH R2 Nhöõng saûn phaåm naøy ñöôïc goïi peptid ngöôøi ta goïi teân nhö sau: 2 acid amin n=2 3 acid amin n=3 4 acid amin n=4 5 acid amin n=5 n acid amin n COOH R4 chung laø peptid. Tuøy theo soá löôïng acid amin coù trong dipeptid tripeptid tetrapeptid pentapeptid polypeptid soá lieân keát peptid = 1 soá lieân keát peptid = 2 soá lieân keát peptid = 3 soá lieân keát peptid = 4 soá lieân keát peptid = n -1 Soá löôïng peptid trong cô theå coù haøng traêm hay haøng nghìn. Hieän nay ngöôøi ta ñaõ phaân laäp vaø chieát xuaát hôn 120 loaïi peptid. Coù theå ñöa ra moät vaøi loaïi nhö sau : Glutation: laø peptid noäi baøo phoå bieán nhaát, tham gia trong quaù trình oxy hoùa khöû cuûa teá baøo. Glutation toàn taïi ôû hai daïng: Daïng khöû: HOOC CH CH2 CH2 CO NH CH CO NH CH2 COOH NH2 CH2 SH 4 Daïng oxihoùa: 2 phaân töû Glutation khöû lieân keát laïi taïo ra caàu disulphua. 2 Glutation-SH -2H +2H Glutation-S -S - Glutation Ophatalmic: loøa peptid ñoái khaùng vôùi glutation, coù taùc duïng kìm haõm caùc phaûn öùng coù glutation laøm chaát kích thích. Carnosin: peptid trong baép thòt ñoäng vaät, duy trì tính ñeäm cuûa dòch cô, xuùc tieán phaân giaûi glucid trong baép thòt, tham gia vaøo vieäc trao ñoåi naêng löôïng. Oxytosin vaø Vasopresin : laø peptid ôû naõo, coù taùc duïng trong söï co cô vaø ñieàu chænh caân baèng nöôùc ôû thaän Lieân keát peptid raát beàn ( > 400kj/mol) , vaø laø cô sôû taïo neân phaân töû protein. Lieân keát thöù caáp: laø caùc lieân keát noái lieàn giöõa caùc acid amin ôû caùc vò trí khaùc nhau trong cuøng moät chuoãi polypeptid hay lieân keát giöõa caùc acid amin cuûa caùc chuoãi khaùc nhau , ñöôïc goïi laø lieân keát ngang. Lieân keát ngang giöõ vai troø quan troïng trong vieäc hình thaønh caáu truùc khoâng gian cuûa phaân töû protein. Caùc lieân keát thöù caáp bao goàm: Lieân keát Hydro: Laø lieân keát ñöôïc taïo thaønh giöõa O thöøa ñieän (-) vaø nguyeân töû H + lk H2 H O thöøa ñieän (+) . Lieân keát naøy laø lieân keát yeáu, khoâng beàn (8-12 ( N ) kj/mol).Tuy vaäy soá löôïng lieân keát naøy raát lôùn neân ñoù laø moät lieân ( C ) keát quan troïng trong vieäc hình thaønh caáu truùc khoâng gian cuûa protein. Lieân keát di sulphua (caàu di sulphua) –S-SÑaây laø lieân keát ñoàng hoùa trò , raát beàn vöõng (300 kj/mol) Laøm cho phaân töû protein bò gaáp khuùc. lieân keát ion ( lieân keát muoái) coøn goïi laø lieân keát tónh ñieän , taïo bôûi caùc goác phaân cöïc, mang ñieän tích (+), (-) coù trong phaân töû protein : OH-, NH3+ , COO-, … lieân keát naøy khaù beàn (>160 kj/mol) Lieân keát lî nöôùc (löïc Valdervalse) Giöõa caùc nhoùm kî nöôùc cuõng coù theå coù moái lieân keát hoùa hoïc , lieân keát naøy khoâng beàn (48.5 kj/mol) ( -CH3, -C2H5 , -C6H5 ) Caáu truùc phaân töû cuûa Protein: phaân töû protein coù 4 caáu truùc khaùc nhau. caáu truùc baäc I: Ñaây laø caáu truùc cô sôû, veà baûn chaát ñoù laø chuoãi polypeptid taïo thaønh do caùc acid amin lieân keát vôùi nhau baèng lieân keát peptid. Caáu truùc baäc I laø caáu truùc maïch thaúng. Ñieåm caàn nhôù laø ôû caáu truùc baäc I chæ coù moät loaïi lieân keát ñoù laø lieân keát peptid. 5 Moät chuoãi polypeptid luoân coøn moät ñaàu –COOH vaø moät ñaàu –NH2 . Theo qui öôùc ta seõ vieát goác –COOH ôû ñaàu beân phaûi, caùc goác R 1, R2 ,… Rn ñöôïc phaân boá hai beân maët phaúng chöùa caùc lieân keát peptid. R1 NH2 R3 CH CO NH CH CO NH CH CO NH CH R2 COOH R4 Vì taát caû goác R1, R2 ,… Rn ñeàu ôû maïch beân neân chieàu daøi cuûa chuoãi protein khoâng phuï thuoäc tính chaát cuûa caùc acid amin maø phuï thuoäc vaøo soá löôïng acid amin . Protein caáu truùc baäc I laø baûn dòch maõ di truyeàn, ñöôïc toång hôïp trong cô theå soáng töø nhöõng ñoaïn gen trong ADN taïi Ribosome . Protein ñaëc tröng rieâng cho töøng caù theå. -Phaân töû protein ñöôïc caáu taïo töø 22 acid amin , do ñoù löôïng ñoàng phaân raát lôùn. Tuy vaäy soá ñoàng phaân trong thöïc teá ít hôn nhieàu. protein maïch ngaén nhaát coù töø 20-100 acid amin . Ña soá protein coù 100-500 acid amin , coù moät soá protein coù tôùi caû ngaøn goác acid amin . Ñeå nghieân cöùu caáu truùc baäc I cuûa protein ngöôøi ta coù theå söû duïng nhieàu phöông phaùp: Phöông phaùp saéc kyù, ñieän di : ta phaûi thuûy phaân toaøn boä protein thaønh caùc acid amin . Phöông phaùp naøy cho bieát thaønh phaàn protein . Phöông phaùp nhoùm –NH2 taän cuøng (caét ñöùt töøng acid amin töø ñaàu –NH 2 ) , hay phöông phaùp nhoùm –COOH taän cuøng ( thuûy phaân töøng acid amin töø ñaàu –COOH baèng caùc loaïi enzyme) . Phöông phaùp naøy cho bieát traät töï saép xeáp caùc acid amin . Caáu truùc baäc II: R1 NH2 C* H H C ... O H C O N N H CO NH C* R2 R3 CO NH C* COOH H Vì taát caû caùc acid amin töï nhieân ñeàu baát ñoái neân moät tính chaát quan troïng cuûa acid amin laø khaû naêng quay töï do cuûa chuùng quanh moái lieân keát cuûa C , do ñoù laøm maïch polypeptid coù khuynh höôùng hình thaønh caáu truùc xoaén. Caáu truùc xoaén naøy ñöôïc oån ñònh nhôø voâ soá caùc lieân keát hydro giöõa goác – C=O cuûa acid amin naøy vôùi goác –N-H cuûa acid amin thöù ba ñöùng sau noù. Soá löôïng lieân keát hydro raát lôùn. Do ñoù tuy laø lieân keát yeáu nhöng vaãn giuùp cho caáu truùc xoaén beàn vöõng. Vaäy vôùi caáu truùc baäc II coù hai loaïi lieân keát : peptid vaø lieân keát hydro. Coù hai loaïi caáu truùc baäc II: Caáu truùc xoaén oác : xoaén  ,  , ,… Caáu truùc gaáp neáp  , caáu truùc maët cong . Caáu truùc xoaén  : Laø xoaén ñöôïc taoï bôûi moät chuoãi polypeptid coù hình xoaén oác gioáng nhö loø xo . Moãi voøng xoaén coù 3.6 goác acid amin (18 goác taïo 5 voøng xoaén) . Moãi acid amin mhö moät baäc thang cao 1.5 A0 ( 1 A0 = 10 -10 m). Coù theå coù xoaén  phaûi vaø xoaén  traùi ( cuøng vaø ngöôïc chieàu kim ñoàng hoà) . 6 Xoaén  raát beàn vì noù ñöôïc giöõ chaët bôûi soá toái ña lieân keát hydro, cöù moãi nhoùm -CO-NHtaïo ñöôïc 2 lieân keát hydro. Xoaén  laø caáu truùc phoå bieán nhaát ngoaøi ra coøn coù xoaén  (4.4 acid amin / voøng) , xoaén  (5.2 acid amin / voøng) hoaëc xoaén 310 ( 3 acid amin / voøng). Caùc loaïi xoaén naøy ít gaëp hôn . (2) Gaáp neáp  : Caáu truùc naøy do caáu truùc xoaén  taïo thaønh khi lieân keát hydro bò phaù vôõ( do nhieät). Caáu truùc  taïo ra töø nhieàu maïch polypeptid. Caùc maïch duoãi ra vaø taïo lieân keát hydro giöõa caùc nhoùm cuûa caùc chuoãi polypeptid khaùc nhau . Caáu truùc naøy coù daïng nhö moät tôø giaáy gaáp neáp. Caáu truùc baäc hai laø caáu truùc ñieån hình cuûa caùc protein hình sôïi : kerotin ( toùc ) , collagen ( da, xöông ) . C. Caáu truùc baäc III: Thöïc teá ña soá protein laïi coù caáu truùc hình caàu. Chöùng minh: kích thöôùc ño ñöôïc treân phaân töû protein so vôùi kích thöôùc lyù thuyeát khaùc nhau. Lyù thuyeát: chieàu daì voøng xoaén 900A0 Ñöôøng kính d = 15A0 Tæ leä truïc lôùn / truïc nhoû = 900 / 15 = 60 Thöïc teá: truïc lôùn / truïc nhoû = 4 . Ñieàu naøy chöùng toû protein coøn coù caáu truùc daïng caàu. Ñieàu naøy chöùng toû caùc chuoãi xoaén laïi tieáp tuïc gaáp khuùc taïo caáu truùc daïng caàu . Lieân keát caàu disulphua, lieân keát kî nöôùc Valderval laø nhöõng lieân keát chuû yeáu taïo ra caáu truùc baäc III daïng caàu. Ngoaøi ra coøn coù caùc lieân keát khaùc nhö lieân keát ester, lieân keát tónh ñieän, lieân keát hydro. Phaàn lôùn caùc protein coù caáu truùc baäc III ñeàu hoøa tan trong nöôùc . ÔÛ caùc protein naøy caùc goác acid amin kî nöôùc ñeàu cuoän vaøo trong coøn caùc goác acid amin öa nöôùc thì phaân boá ñeàu ñaën ôû maët caàu beân ngoaøi. coù moät soá protein khoâng tan trong nöôùc , maø tan trong dung moâi höõu cô, ôû caùc protein naøy seõ coù söï phaân boá ngöôïc laïi . Caùc goác acid amin kî nöôùc laïi phaân boá treân beà maët caàu . D> Caáu truùc baäc IV: Do treân beà maët caùc hình caàu cuûa caáu truùc baäc II coù chöùa caùc nhoùm chöùc , neân giöõa caùc hình caàu naøy coù theå hình thaønh nhöõng lieân keát ngang, keát hôïp caùc caáu truùc baäc III laïi thaønh moät caáu truùc lôùn hôn goïi laø caáu truùc baäc IV. Caùc caáu truùc baäc III ñöôïc goïi laø monome, keát hôïp laïi thaønh caáu truùc baäc IV goïi laø oligome. Caáu truùc baäc IV laïi cuõng deã phaân ly thaønh caùc tieåu phaàn monome. Caáu truùc baäc IV hình thaønh do caùc lieân keát ngang giöõa caùc quaû caáu truùc baäc III: ñoù laø lieân keát hydro, Van dervan, lieân keát tónh ñieän ,...nhöng khoâng coù lieân keát caàu disulfua. Moät trong nhöõng caáu truùc baäc IV cuûa protein ñöôïc nghieân cöùu kyõ laø caáu truùc baäc IV cuûa hemoglobin ( Hb). Phaân töû Hb ñöôïc caáu taïo töø 4 tieåu ñôn vò : 2 maïch  vaø 2 maïch . M= 64500. Trong phaân töû coù söï tham gia cuûa 1 nguyeân töû Fe. Hemoglobin ñoùng vai troø vaän chuyeån OØ trong maùu vaø laø saéc toá ñoû cuûa maùu. 7 Coøn moät soá protein coù caáu truùc baäc IV khaùc nhö : insulin( 2 tieåu ñôn vò), lactatdehydrogenaza ( 4 tieåu ñôn vò), catalaza (4 tieåu ñôn vò),pepsin, amilaza(2 tieåu ñôn vò). Hoaït tính sinh hoïc cuûa protein thöôøng chæ theå hieän ôû nhöõng caáu truùc baäc cao (III, IV). Tuøy theo chöùc naêng cuûa protein maø tæ leä vaø caùc daïng caáu truùc cuõng khaùc nhau. Khi bò thay ñoåi caáu truùc khoâng gian , laäp töùc chöùc naêng sinh hoïc bò aûnh höôûng. Baát kyø moät bieán ñoåi hoùa lyù naøo aûnh höôûng ñeán caáu truùc khoâng gian cuûa protein seõ laøm protein maát chöùc naêng sinh hoïc . Söï thoáng nhaát giöõa caáu truùc vaø chöùc naêng giuùp protein thöïc hieän ñöôïc vai troø ñieàu hoøa caùc phaûn öùng sinh hoïc baèng caùch töï thay ñoåi caáu truùc khoâng gian. Phaân loaïi Protein: Do caáu truùc phöùc taïp vaø ña daïng neân söï phaân loaïi protein thöôøng gaëp khoù khaên. Ngöôøi ta thöôøng döïa vaøo hình daïng , tính tan hoaëc chöùc naêng , thaønh phaàn hoùa hoïc ñeå phaân nhoùm protein. Protein theo thaønh phaàn hoùa hoïc chia laøm hai nhoùm lôùn : protein ñôn giaûn vaø protein phöùc taïp. Trong moãi nhoùm laïi phaân ra thaønh töøng nhoùm nhoû. Protein ñôn giaûn (homoprotein) : chæ coù acid amin trong thaønh phaàn caáu taïo: albumin, glubulin,prolamin, glutelin, protamin, histon Protein phöùc taïp (heteroprotein): caáu taïo goàm acid amin vaø caùc phaàn phi protein khaùc nhö glucid, lipid,...ngöôøi ta goïi caùc nhoùm naøy laø nhoùm ngoaïi: nucleoprotein, mucoprotein, lipoprotein, phosphoprotein, metalo-protein, cromoprotein. Protein ñôn giaûn : Coøn ñöôïc goïi laø homoprotein, laø caùc protein chæ chöùa acid amin. Döïa vaøo tính chaát hoøa tan ta chia ra nhöõng nhoùm nhoû: Albumin: Protein deã tan trong nöôùc , deã bieán tính bôæ nhieät, coù daïng caàu, deã keát tuûa baèng (NH 4)2SO4 ( 70-100% baõo hoøa). M khoâng lôùn laém. MAb loøng traéng tröùng = 45000 MAb huyeát thanh = 65000 Coù trong teá baøo ñoäng vaät , thöïc vaät, nhö Ab tröùng , lecosin cuûa luùa mì, legumelin cuûa ñaäu naønh, rixin haït thaàu daàu. Trong thöïc vaät chöùa 0.1 – 0.5% Ab. Globulin: Khoâng tan trong nöôùc vaø dung dòch acid loõang Tan trong dung dòch muoái loaõng NaCl – KCl 4 – 10% MGlobulin = 100000 – 300000 Eudestin haït boâng, Glysin ñaäu naønh, Archin ñaäu phoäng, Globulin huyeát thanh, Miozin cuûa cô. Prolamin: Khoâng tan trong nöôùc vaø dung dòch muoái loõang Tan trong etanol 70 – 80% MProlamin = 26000 – 40000 Haàu nhö coù trong noäi nhuõ haït hoøa thaûo: gliadin cuûa luùa mì, hordein cuûa ñaïi maïch, zein cuûa baép (30 – 60% toång protein ) Glutelin: Khoâng tan trong nöôùc , dung dòch muoái loaõng, röôïu. 8 Tan trong dung dòch kieàm loaõng (0.2 – 2%) M raát cao töø 50000 ñeán vaøi trieäu danton Coù trong noäi nhuõ haït: nhö glutelin luùa mì, orizenin luùa gaïo (80% protein toång) Protamin: Coù M nhoû, caáu taïo ñôn giaûn, coù tính kieàm maïnh do chöùa 60 – 80% Arg. Tan deã trong nöôùc, khoâng tan trong dung dòch NH3 loaõng, khoâng ñoâng tuï khi ñun noùng. M = 8000 – 10000 Coù trong phaán hoa, tinh dòch caù. Histon: Laø protein kieàm, tính chaát töông töï protamin. Coù trong nhaân teá baøo. Protein phöùc taïp: Nhö ñaõ noùi ôû treân, protein phöùc taïp goàm acid amin vaø nhoùm ngoaïi. Tuøy vaøo nhoùm ngoaïi ta chia protein phöùc taïp ra caùc nhoùm nhö sau: Nucleoprotein: Nhoùm ngoaïi laø acid nucleic, thöôøng gaén vaøo caùc acid amin kieàm tính, laø chaát ñieån hình cuûa nhaân vaø ribosome. Tuøy caáu taïo ta coù Ribonucleo-protein ; desoxy-ribonucleo-protein ,… Mucoprotein: Nhoùm ngoaïi laø glucid vaø moät soá acid: glucose, manose, galactose, hexozamin, a.gluconic, a.sulphuric, a.acetic. Coù hai nhoùm nhoû: glycoprotein: lieân keát P-Glucid laø lieân keát ñoàng hoùa trò coù trong moâ lieân keát, maùu, hormon. Mucoid(muxin): lieân keát P-Glucid laø lieân keát ion Coù trong nöôùc mieáng, quyeát ñònh ñoä nhôùt cuûa nöôùc mieáng, khoâng bò thuûy phaân bôûi proteaza. Lipoprotein: Nhoùm ngoaïi laø lipid: triglycerid, phosphatid Ñoùng vai troø quan troïng trong vieäc vaän chuyeån lipid Coù trong huyeát töông, maøng teá baøo, haït dieäp luïc, oùc, söõa,… Phosphoprotein: Nhoùm ngoaïi laø goác acid phosphoric, lieân keát vôùi protein baèng lieân keát ester vôùi nhoùm – OH cuûa Ser hay Thr. Giöõ vai troø quan troïng trong vieäc trao ñoåi goác photphat Coù casein söõa, vitelin cuûa loøng ñoû tröùng, vitelinin, photvitin tröùng. Metalo-protein: Nhoùm ngoaïi laø kim loaïi: Fe, Mg, Cu, Zn, Mn, Mo,… Giöõ nhieàu chöùc naêng : Vaän chuyeån, döï tröõ kim loaïi Tham gia thaønh phaàn enzim xuùc taùc sinh hoïc: catalaza, peroxydaza, itocrom(Fe), Ascorbat oxydaza, polyphenploxydaz (Cu),… Ñaëc tröng laø Hemoglobin: coù nhoùm ngoaïi laø Fe. Cromo-protein: Nhoùm ngoaïi coù maøu, coù theå bao goàm caû moät soá metalo-protein 9 Hemoglobin vöøa coù maøu ñoû vöøa chöùa Fe. Flavon maøu vaøng cuûa nhoùm ngoaïi Riboflavin Rodopsin coù maøu vaøng nhoùm ngoaïi laø tieàn Vitamin A (Retinen) Nhoùm Metalo vaø Cromoprotein giöõ vai troø quan troïng trong vieäc quang hôïp, hoâ haáp, phaûn öùng oxyhoùa khöû. TÍNH CHAÁT CUÛA PROTEIN: Tính chaát Vaät lyù: Protein ñöôïc caáu taïo chuû yeáu töø caùc acid amin, do ñoù tính chaát cuûa protein coù nhöõng ñieåm gioáng vôùi tính chaát cuûa caùc acid amin , ví duï phaûn öùng maøu ñaëc tröng , hay tính ñieän ly löôõng cöïc. Tuy vaäy protein cuõng coù nhöõng tính chaát hoøan toaøn khaùc vôùi acid amin . Hình daïng: Coù 3 loaïi: sôïi, caàu vaø trung gian: Sôïi: Tæ leä daøi / roäng = haøng traêm, haøng nghìn Thöôøng laø protein caáu truùc nhö keratin loâng, toùc, fibroin cuûa cô, miozin cuûa cô. Thöôøng khoâng tan trong nöôùc, beàn vôùi caùc taùc nhaân hoùa hoïc. Thöôøng laø do caùc sôïi  ,  saép xeáp quanh moät truïc lieân keát vôùi nhau baèng lieân keát hydro, disulfua laøm cho caáu truùc raát beàn chaët. Caàu: Tæ leä truïc lôùn / truïc nhoû = 4.5  20 kích thöôùc phaân töû trung bình. Thöôøng laø protein chöùc naêng : enzim, hormon,… Deã tan trong nöôùc vaø dung dòch muoái loaõng, nhaïy caûm vôùi caùc phaûn öùng hoùa hoïc Trung gian: Caáu truùc sôïi, khoâng daøi laém Töông ñoái deã tan Goàm fibroin (tô), miofibrin (cô) B. Kích thöôùc troïng löôïng phaân töû Moät protein coù kích thöôùc trung bình coù 100 – 500 acid amin Khoái löôïng phaân töû naèm trong khoaûng 17000 – 68000 dalton (nhôø phöông phaùp ly taâm sieâu toác) coù moät soá protein coù kích thöôùc lôùn hôn , do ñoù khoái löôïng phaân töû cuõng lôùn hôn . Protein cuûa VR daøi nhaát, khoái löôïng phaân töû leân ñeán haøng trieäu dalton. Citocrom Ribonucl Liozin Mioglobi Tripxin Bromelin Pepsin Albumin C ea n tröùng 11600 12700 14400 17800 24000 25000 36000 44000 Hemoglo Albumin Hexokin Lactac Catalaza Ureaza Miozin Virus bin huyeát aza dehydrog thuoác laù thanh enaza 64500 69000 96000 150000 250000 483000 620000 4059000 0 Ñeå xaùc ñònh kích thöôùc M cuûa protein ta coù caùc bieän phaùp ñaëc bieät nhö : ly taâm sieâu toác, ño aùp suaát thaåm thaáu , duøng raây phaân töû (loïc gel) – sephadex laø loaïi gel thöôøng ñöôïc duøng. Phöông phaùp hoøan thieän hôn caû ñoù laø : ly taâm sieâu toác 10 Phöông phaùp loïc gel duøng ñeå xaùc ñònh M cuûa protein ñaëc bieät cuûa E. Do coù hình daïng vaø phaân töû löôïng khaùc nhau, caùc protein ñöôïc chieát ra khoûi coät gel sephadex coù kích thöôùc loã thích hôïp bôûi dung dòch KCN noàng ñoä thích hôïp vôùi toác ñoä khaùc nhau . Xaùc ñònh theå tích chieát Vp cuûa protein nghieân cöùu , duøng ñöôøng chuaån V c _ M ñöôïc xaây döïng vôùi caùc protein chuaån ñaõ bieát tröôùc khoái löôïng phaân töû , ta suy ra M cuûa protein nghieân cöùu. Tuy vaäy toác ñoä laéng hay toác ñoä chieát coøn phuï thuoäc vaøo nhieàu yeáu toá khaùc. Do ñoù taát caû caùc phöông phaùp noùi treân chæ cho giaù trò töông ñoái. Muoán coù ñöôïc keát quaû chính xaùc hôn phaûi keát hôïp ñoàng thôøi nhieàu phöông phaùp. Caùc phöông phaùp khaùc : Hoùa hoïc : xaùc ñònh thaønh phaàn acid amin, töø M cuûa acid amin suy ra M cuûa protein . Vaät lyù : Phöông phaùp thaåm thaáu : C: noàng ñoä dung dòch g / l RT : aùp suaát thaå Mmthaá C u  R: haèng soá khí T: nhieät ñoä tuyeät ñoái (T = t + 2730C) Ño ñoä nhôùt: moãi dung dòch coù noàng ñoä khaùc nhau seõ coù ñoä nhôùt khaùc nhau. C. Tính khueách taùn: So vôùi caùc chaát coù phaân töû löôïng nhoû, protein khueách taùn chaäm hôn raát nhieàu. Döïa vaøo tính chaát naøy, coù theå laøm saïch protein baèng phöông phaùp thaåm tích (dyalise) + Chöùa hoãn hôïp (protein vaø taïp chaát phaân töû löôïng nhoû) trong bao bì coù maøng baùn thaám. + Ptrong > Pngoøai neân taïp chaát coù khuynh höôùng ñi ra ngoøai + Ñeå taêng toác ñoä khueách taùn ta duøng maùy khuaáy vaø thay nöôùc lieân tuïc Tính chaát quang hoïc: Khueách taùn aùnh saùng: Ña soá dung dòch protein raát trong suoát vaø ñoàng nhaát. Thaät ra trong caùc dung dòch ñoù coù chöùa caùc haït protein raát beù laø nguyeân nhaân gaây ra hieän töôïng khueách taùn aùnh saùng. Caùc haït protein beù hôn ½ böôùc soùng aùnh saùng tôùi neân khoâng coù hieän töôïng phaûn xaï maø laø hieän töôïng khueách taùn aùnh saùng. Neáu caùc haït protein nhoû ñeán möùc chæ khueách taùn ñöôïc nhöõng aùnh saùng coù böôùc soùng ngaén (tím, luïc) coøn caùc aùnh saùng coù böôùc soùng daøi (ñoû, vaøng) ñi voøng qua caùc haït protein , khi ñoù coù hieän töôïng phaùt huøynh quang. Aùnh saùng tôùi coù maøu ñoû, trong aùnh saùng phaûn chieáu laïi coù maøu xanh. Neáu taát caû tia tôùi ñeàu bò khueách taùn ta seõ thaáy hieän töôïng vaàn ñuïc. Khuùc xaï aùnh saùng: Dung dòch protein coù khaû naêng khuùc xaï aùnh saùng. Chæ soá khuùc xaï (chieát xuaát) phuï thuoäc noàng ñoä protein trong dung dòch vaø taêng tæ leä thuaän vôùi söï taêng löôïng protein trong dung dòch . Chieát suaát cuûa dung dòch protein luoân lôùn hôn chieát suaát cuûa nöôùc . Hieäu soá giöõa chieát suaát dung dòch 1% protein vaø chieát suaát nöôùc goïi laø ñoä taêng chieát suaát rieâng. Ñoä taêng chieát suaát rieâng khoâng phuï thuoäc loïai dung dòch protein, noàng ñoä muoái, nhieät ñoä cuûa dung dòch . do ñoù coù theå ño haøm löôïng protein baèng caùch ño ñoä taêng chieát suaát rieâng cuûa dung dòch . Haáp thu aùnh saùng: 11 dung dòch protein coù khaû naêng haáp thuï aùnh saùng vuøng töû ngoïai. Tuy vaäy quang phoå haáp thu quan saùt ñöôïc khoâng phaûi laø taùc duïng cuûa toøan phaân töû protein maø chæ taùc duïng cuûa caùc acid amin coù voøng thôm : phenylalanin, tyrosin, tryptophan. Do ñoù döïa vaøo phoå haáp thu ôû vuøng töû ngoïai(280nm) maø ta bieát ñöôïc toång löôïng nhöõng acid amin ñoù trong protein . (ñaây laø nguyeân taéc cuûa baøi thí nghieäm soá 8). dung dòch protein coù khaû naêng haáp thuï aùnh saùng töû ngoïai ôû 2 vuøng böôùc soùng khaùc nhau : 180 – 220nm vaø 250 – 300nm. 180 – 220nm: laø vuøng haáp thuï cuûa lieân keát peptid trong phaân töû protein, cöïc ñaïi haáp thuï ôû 290nm. Do lieân keát peptid coù nhieàu neân ñoä haáp thuï cao, do ñoù coù theå ñònh löôïng protein ôû noàng ñoä thaáp. Neáu trong dung dòch protein coù laãn moät soá taïp chaát thì vuøng haáp thuï naøy seõ dòch veà phía phaûi. Maët khaùc coù moät soá taïp chaát cuõng haáp thuï aùnh saùng ôû 180 – 220nm. Thöïc teá thöôøng ño töø 220 – 240nm. 250 – 300nm: ñaây laø vuøng haáp thuï acid amin thôm (his, try, tyr) cöïc ñaïi haáp thuï laø 280nm. Ôû böôùc soùng naøy Try coù ñoä haáp thuï lôùn nhaát, roài ñeán Tyr. Duøng phöông phaùp ño ñoä haáp thuï cuûa dung dòch protein ôû böôùc soùng 280nm ñeå ñònh tính vaø ñònh löôïng caùc protein coù chöùa acid amin thôm. Keát quaû tính toùan coøn phuï thuoäc nhieàu yeáu toá nhö nhöõng taïp chaát, caùc loaïi acid amin trong nhöõng protein khaùc nhau, …Vì vaäy phöông phaùp naøy chæ aùp duïng ñeå ñònh löôïng protein ñaõ tinh saïch hoaëc ñeå xaùc ñònh protein sau khi qua coät saéc kyù. Protein cuõng coù khaû naêng haáp thu caùc tia trong vuøng hoàng ngoaïi. Nguyeân nhaân laø do söï coù maët cuûa nhoùm CO vaø NH trong moái lieân keát peptid. Vì nöôùc cuõng coù tính chaát haáp thu aùnh saùng vuøng hoàng ngoaïi neân khoâng nghieân cöùu dung dòch protein + nöôùc trong vuøng hoàng ngoaïi, maø phaûi loaïi nöôùc, tieán haønh nghieân cöùu treân nhöõng maøng protein khoâ. Tính chaát Hoùa lyù: Noùi ñeán tính chaát hoùa lyù laø noùi ñeán tính naêng coâng ngheä. Ñaây laø tính chaát quan troïng nhaát cuûa protein vì noù quyeát ñònh tính naêng coâng ngheä cuûa protein . tính naêng coâng ngheä: laø taäp hôïp taát caû nhöõng tính chaát hoùa lyù cuûa protein gaây ra nhöõng bieán ñoåi trong quaù trình cheá bieán vaø baûo quaûn. Trong thöïc teá, dung dòch protein laø dung dòch keo vaø toàn taïi 3 kieåu töông taùc: protein – nöôùc; protein -protein ; caùc töông taùc beà maët. Caùc kieåu töông taùc naøy taïo ra tính chaát hoùa lyù cuûa protein : protein –nöôùc: tính hydrat hoùa, tính tan, ñoä nhôùt, tính khueách taùn. protein -protein : tính keát tuûa. Taïo sôïi, taïo gel. protein –chaát kî nöôùc (töông taùc beà maët): tính hoaït ñoäng beà maët, taïo boït, taïo nhuõ, haáp phuï, … Tính hydrat hoùa : Laø khaû naêng keát hôïp vôùi nöôùc Nhôø caùc nhoùm aùi nöôùc coù treân beà maët phaân töû protein (-COOH, NH 2 , -OH,…) maø protein coù khaû naêng hydrat hoùa raát cao, coù khaû naêng keát hôïp vôùi 1 löôïng lôùn caùc phaân töû nöôùc löôõng cöïc. Löôïng nöôùc ôû daïng hydrat trong cô theå sinh vaät coù theå chieám 20 – 50%. Khaû naêng lieân keát nöôùc cuûa caùc nhoùm aùi nöôùc khoâng gioáng nhau. Vaø cô cheá keát hôïp nöôùc cuûa protein cuõng conø laø vaán ñeà ñang baøn caõi. Baèng phöông phaùp phaân tích Rônghen, moät soá taùc giaû giaû thieát raèng nöôùc keát hôïp raát chaët vôùi protein bôûi caùc nhoùm coù cöïc, baèng löïc 12 huùt tónh ñieän, taïo ra xung quanh phaân töû protein moät maømg hydrat daøy 3 A 0, giuùp phaân töû protein beàn vöõng trong dung dòch . Thöôøng ta söû duïng daïng protein ñaõ hydrat hoùa neân tính chaát naøy laø raát quan troïng. Khi keát hôïp vôùi nöôùc, phaân töû protein seõ tröông nôû. Khaû naêng ngaäm nöôùc vaø tröông nôû raát lôùn . Protein bieán tính seõ giöõ nöôùc nhieàu hôn protein töï nhieân. Nöôùc hydrat hoùa khoâng bò ñoùng baêng ngay caû ôû nhieät ñoä laïnh saâu (-100 0C). Tính hoøa tan – taïo tuûa: Tính hoøa tan vaø tính hydrat hoùa laø 2 tính chaát hoaøn toaøn khaùc nhau. Caùc protein coù tính hoøa tan toát thì tính hydrat hoùa khoâng cao vaø ngöôïc laïi coù protein coù khaû naêng hydrat hoùa raát cao nhöng laïi khoâng hoøa tan toát. Tính hydrat: laø khaû naêng ngaäm nöôùc vaø tröông nôû. Thí duï: collagen, tröông nôû raát toát, ngaäm nöôùc raát toát(300 – 500%) nhöng laïi khoâng coù khaû naêng hoøa tan. Tính hoøa tan: laø sau khi bò hydrat hoùa, seõ phaân taùn trong dung moâi thaønh dung dòch . protein naøo deã tan thì roõ raøng tính hydrat hoùa khoâng cao, vì khi vöøa hydrat hoùa xong laø seõ phaân taùn ngay ñöa veà traïng thaùi hoøa tan (albumin loøng traéng tröùng). Protein tan trong nhieàu dung moâi khaùc nhau (ñaõ ñeà caäp ôû phaàn phaân loaïi protein ) : nöôùc, muoái loõang, kieàm, röôïu,… Cô cheá cuûa tính tan: Töông töï nhö hydrat hoùa . treân beà maët phaân töû protein coù caùc goác tích ñieän (+) , (-) , nhöõng nhoùm haùo nöôùc, taïo ra moät lôùp voû nöôùc laøm caùc phaân töû protein tröôït khoûi nhau vaø phaân taùn trong dung moâi (coù nghóa laø hoøa tan). -Thöôøng thì caùc nhoùm kî nöôùc seõ taäp trung beân trong, neáu vì lyù do naøo ñoù caùc nhoùm naøy loä ra ngoaøi thì seõ laøm phaù vôõ lôùp voû hydrat, laøm tính hoøa tan protein bò aûnh höôûng. -tính chaát hoøa tan protein phuï thuoäc nhieàu yeáu toá: pH, nhieät ñoä, dung moâi,… pH: -tính hoøa tan chòu aûnh höôûng cuûa pH theo giaûn ñoà sau: töông töï acid amin, protein chöùa nhieàu goác acid amin neân cuõng tích ñieän. Neáu coù nhieàu acid amin (-) thì tích ñieän (-), neáu coù nhieàu acid amin (+) thì tích ñieän döông. Khi ta thay ñoåi pH cuûa dung dòch thì söï tích ñieän seõ thay ñoåi laøm aûnh höôûng ñeán tính tan cuûa protein . Taïi pI: goïi laø pH ñaúng ñieän, laø pH taïi ñoù tính tan cuûa protein thaáp nhaát. Taïi ñoù caùc phaân töû trung hoøa veà ñieän, khoâng coù löïc ñaåy giöõa caùc phaân töû protein neân chuùng deã daøng keát dính (hình thaønh caùc lieân keát ngang), taïo ra nhöõng khoái phaân töû lôùn, laéng xuoáng thaønh keát tuûa. Taïi caùc pH khaùc pI , khi ñoù caùc phaân töû protein tích ñieän cuøng daáu, xuaát hieän löïc ñaåy giöõa caùc phaân töû . Do ñoù caùc phaân töû protein phaân taùn ñeàu trong dung dòch vaø khoâng bò keát tuûa, tính tan taêng. Ôû pH acid, H+ nhoùm COO- bò trung hoøa NH3+ (+) + ÔÛ pH bazô, OH nhoùm NH3 bò trung hoøa COO (-) 13 Ngöôøi ta lôïi duïng tính chaát naøy trong quaù trình thu nhaän protein , enzyme trong dung dòch , hoaëc trích ly moät loaïi protein naøo ñoù ra khoûi hoãn hôïp. Ñöa pH pI protein tuûa thu tuaû hoaø tan laò tinh saïch (*) (*) Quaù trình (*) phaûi ñöôïc thöïc hieän nhanh, ôû nhieät ñoä thaáp neáu khoâng seõ ñöa ñeán traïng thaùi bieán tính thuaän nghòch. + ñöa pH khaùc pI : trích ly protein ra khoûi hoãn hôïp. Thí duï protein ñaäu naønh coù pI = 4,6 (acid amin (-) > acid amin (+) ) Muoán laøm söõa ñaäu naønh thì phaûi laøm sao cho protein hoøa tan ñöa veà pH kieàm ñoä hoøa tan taêng trích ly thaønh söõa ñaäu naønh. Muoán laøm ñaäu huõ thì phaûi ngöôïc laïi, töùc laø phaûi ñöa veà pI ñeå protein ñoâng tuï laïi. Saûn xuaát boät soyaprotein coù 2 loaïi: concentrate vaø Isolate. Boät concentrate: 65%protein , chæ qua 1 coâng ñoïan taùch protein . Boät Isolate: 90%protein , phaûi qua 2 coâng ñoïan taùch protein . Concentrate Isolate Ñaäu naønh Xay boät Ñaäu naønh Xay boät Taùch beùo baèng hexan Taùch beùo Ñöa veà pI= 4.6 Ñöa veà pH=10 Loïc laáy keát tuûa Loïc baõ Saáy Dòch söõa Boät Concentrate Ñöa veà pI= 4.6 Loïc keát tuûa Saáy Boät Isolate 14 *nhieät ñoä: Nhieät ñoä laø taùc nhaân nhaïy caûm nhaát. Moãi protein ñeàu coù 1 nhieät ñoä giôùi haïn. Neáu t 0 < t0tôùi 0 0 haïn thì khi nheät ñoä taêng , tính tan cuûa protein cuõng taêng . Nhöng neáu gia taêng t > t tôùi haïn thì tính chaát naøy maát ñi. +Protein laø nhöõng phaân töû coù caáu truùc baäc cao ñöôïc oån ñònh bôûi caùc lieân keát ngang vaø lieân keát thöù caáp. Khi nhieät ñoä taêng cao, nhieät löôïng seõ laøm beû gaõy caùc lieân keát ngang trong phaân töû protein . Protein seõ bò bieán tính vaø tuûa xuoáng. +Ta caàn löu yù trong vieäc baûo quaûn, neân giöõ nhieät ñoä thaáp ñeå protein khoâng bò maát tính chaát hoøa tan. *Tính ñieän moâi cuûa dung moâi: Tính tan cuûa protein coøn phuï thuoäc vaøo baûn chaát cuûa dung moâi. Khi theâm chaát laøm taêng haèng soá ñieän moâi (glicin) seõ laøm protein tan nhieàu hôn. Khi theâm chaát laøm giaûm haèng soá ñieän moâi (röôïu, aceton,…) thì tính tan cuûa protein giaûm. . Caùc dung moâi höõu cô nhö aceton, etanol, butylic,…deã tan trong nöôùc. Khi cho vaøo dung dòch protein , chuùng seõ caïng tranh nöôùc vôùi protein (do hình thaønh söï töông taùc vôùi nöôùc). Luùc ñoù protein bò maát lôùp maøng hydrat, tính tan giaûm. . Quaù trình naøy cuõng coù thuaän nghòch vaø khoâng thuaän nghòch. + Neáu tieán haønh nhanh ôû nhieät ñoä thaáp, khi tuûa protein xong ta taùch tuûa ra khoûi dung dòch , hoøa tan laïi vaøo nöôùc saïch, protein seõ khoâi phuïc laïi traïng thaùi ban ñaàu : thuaän nghòch. + Neáu xöû lyù dung moâi ôû nhieät ñoä cao, thôøi gian daøi, thì söï keát tuûa protein seõ khoâng thuaän nghòch. Ngöôøi ta söû duïng tính chaát naøy ñeå trích ly vaø laøm saïch protein töø dung dòch thí duï: saûn xuaát bromelin töø coài thôm. *Noàng ñoä muoái trung tính: söï phuï thuoäc tính tan vôùi noàng ñoä muoái cuõng ñöôïc bieåu dieãn ôû daïng ñoà thò. Ta thaáy ôû ñaây coù moät ñieåm cöïc ñaïi, taïi noàng ñoä muoái NaCl khoûang 0.5M. . Neáu noàng ñoä muoái thaáp, ñoä tan cuûa protein taêng leân raát nhieàu. Thaäm chí moät soá protein khoù tan cuõng trôû neân tan deã daøng. Hieän töôïng naøy goïi laø “salting in”. Muoái coù hoùa trò II coù taùc duïng toát hôn muoái hoùa trò I : NH 4SO4, MgCl2 > NH4Cl, NaCl, KCl, … Nguyeân nhaân hieän töôïng naøy laø caùc muoái noàng ñoä loaõng phaân ly trong dung dòch thaønh caùc ion, caùc ion naøy trung hoøa bôùt caùc ñieän tích traùi daáu cuûa protein , giaûm löïc huùt giöõa caùc phaân töû protein, taêng tính tan. Söï hoøa tan naøy tæ leä vôùi löïc ion (do söï phaân ly caùc phaân töû muoái) 15 Vôùi CI : noàng ñoä ion i  = ½ CiZi2 ZI : ñieän tích cuûa ion i Nhö vaäy khi taêng daàn noàng ñoä muoái thì löïc ion taêng daàn, tính tan cuõng taêng daàn (chuù yù ñaây laø noùi trong khoûang noàng ñoä < noàng ñoä tan cöïc ñaïi). Ñieåm A: goïi laø ñieåm muoái tích laø ñieåm protein tan cöïc ñaïi do taùc duïng cuûa muoái. Neáu noàng ñoä muoái tieáp tuïc taêng vöôït qua ñieåm muoái tích, ñoä tan cuûa protein giaûm daàn, protein seõ tuûa xuoáng. Nguyeân nhaân laø do khi muoái taêng, chuùng seõ caïnh tranh dung moâi nöôùc vôùi protein , laøm phaù vôõ caùc lôùp voû nöôùc, laøm caùc phaân töû protein laïi gaàn nhau, keát hôïp laïi vaø tuûa xuoáng. Hieän töôïng naøy goïi laø “salting out” Ngöôøi ta öùng duïng hieän töôïng “salting in” vaø “ salting out” ñeå ñeà ra phöông phaùp dieäm tích ñeå taùch protein ra khoûi dung dòch . Theo ñoù moãi loaïi protein coù moät ñieåm muoái tích khaùc nhau. Noàng ñoä muoái vöôït qua ñieåm ñoù seõ laøm protein tuûa hoaøn toaøn. Tuyø thuoäc vaøo loaïi muoái, ta coù theå taïo tuûa thuaän nghòch hay baát thuaän nghòch. +Muoái trung tính cuûa kim loaïi lieàm, kieàm thoå nhö: NaCl. Na 2SO4, MgSO4, (NH4)2SO4 thöôøng ñöôïc laøm taùc nhaân tuûa thuaän nghòch. Vaø phaûi tieán haønh ôû t 0 < O0C, ñeå thu nhaän cheá phaåm protein . thí duï töø loøng traéng tröùng duøng dung dòch (NH 4)2SO4 baõo hoøa seõ keát tuûa ñöôïc albumin, coøn neáu duøng dung dòch baùn baõo haøo seõ thu ñöôïc tuûa cuûa globulin. +muoái cuûa kim loaïi naëng seõ laøm protein tuûa khoâng thuaän nghòch (muoái Pb, Hg, Cu, Fe,…) . Neáu tieán haønh taùch protein baèng phöông phaùp naøy, trong tuûa seõ coù laãn muoái vôùi noàng ñoä cao. Muoán xöû lyù ta phaûi duøng phöông phaùp thaåm tích ñeå loaïi boû caùc phaân töû muoái khaùc. Toùm laïi: Coù 2 yeáu toá ñaûm baûo ñoä beàn cuûa dung dòch keo protein laø: -söï tích ñieän cuøng daáu cuûa caùc phaân töû protein (pH khaùc pI) -lôùp voû hydrat bao quanh phaân töû protein . loaïi boû 2 yeáu toá naøy protein seõ bò keát tuûa. *Tính tan cuûa protein tröôùc heát phuï thuoäc vaøo thaønh phaàn vaø traät töï phaân boá acid amin trong phaân töû protein . Tæ leä nhoùm öa nöôùc vaø kî nöôùc, söï phaân boá cuûa chuùng treân beà maët phaân töû protein quyeát ñònh tính tan khaùc nhau cuûa protein . B.Söï bieán tính: (denaturation) Khaùi nieäm: Bieán tính laø moät tính chaát ñaëc bieät chæ coù ôû protein . Söï bieán tính protein laø cô sôû cuûa nhieàu quy trình saûn xuaát, hoaëc laø cô sôû giaûi thích nhieàu hieän töôïng trong ñôøi soáng. Ñònh nghóa: bieán tính laø söï thay ñoåi caáu truùc khoâng gian cuûa protein döôùi taùc ñoäng cuûa moâi tröôøng, daãn ñeán söï thay ñoåi cuûa caùc tính chaát ban ñaàu cuûa protein . Bieán tính chæ laøm thay ñoåi caáu truùc baäc II, III, IV maø khoâng laøm thay ñoåi caáu truùc baäc I. Söï bieán tính cuõng coù theå tieán haønh thuaän nghòch hay baát thuaän nghòch. Thí duï: bieán tính laøm thay ñoåi caáu truùc baäc II, III, IV 16 .Bieán tính thuaän nghòch: +Neáu loaïi boû taùc nhaân gaây bieán tính, phaân töû protein khoâi phuïc laïi caáu hình khoâng gian ban ñaàu, khoâi phuïc laïi nhöõng tính chaát ñaàu. +Khi bieán tính thuaän nghòch, caùc taùc nhaân chæ taùc ñoäng ôû möùc naêng löôïng thaáp, moät soá lieân keát yeáu nhö hydro, lieân keát ion, lieân keát kî nöôùc bò phaù vôõ. Chæ caàn lieân keát disulfua khoâng bò beû gaõy laø ñöôïc. +thí duï: trypsin(enzyme tieâu hoùa trong daï daøy), ñun noùng ñeán 90 0C, ôû pH = 3 seõ maát hoïat tính. Neáu ñöa veà nhieät ñoä thöôøng vaø pH trung tính, phuïc hoài laïi chöùc naêng sinh hoïc. Bieán tính baát thuaän nghòch: + Khoâng bao giôø trôû laïi ñöôïc tính chaát ban ñaàu. + Lieân keát caàu disulfua bò ñöùt do taùc ñoäng ôû möùc naêng löôïng cao hôn. Thí duï: luoäc tröùng : protein bò bieán tính khoâng trôû laïi traïng thaùi loûng ñöôïc. Ñeå nghieân cöùu caáu truùc protein phaûi giöõ cho protein khong bò bieán tính, baèng caùch thöïc hieän ôû nhieät ñoä thaáp, cho moät soá chaát vaøo dung dòch protein (ñöôøng saccarose, hôïp chaát amin) ñeå caùc chaát naøy haáp phuï leân beà maët protein laøm cho protein khoâng bò bieán tính. Tính chaát cuûa protein sau khi bieán tính coù theå neâu ra döôùi ñaây: ñoä hoøa tan giaûm: do duoãi maïch, caùc nhoùm kî nöôùc loä roõ ra ngoaøi khaû naêng giöõ nöôùc giaûm maát hoaït tính sinh hoïc: enzyme maát khaû naêng xuùc taùc(do maát caáu truùc khoâng gian baäc II, III, IV) hem maát khaû naêng vaän chuyeån O2 deã bò thuûy phaân bôûi enzyme proteaza hôn, keùm beàn hôn protein ban ñaàu daãn ñeán deã tieâu hoùa hôn. Nguyeân nhaân laø laøm xuaát hieän caùc lieân keát peptid töông öùng vôùi vuøng taùc duïng cuûa enzyme. -(5) Taêng ñoä nhôùt -(6) Maát khaû naêng keát tinh *Taùc nhaân gaây bieán tính: -(1)Nhieät ñoä : ñaây laø taùc nhaân raát deã gaây bieán tính, vaø la taùc nhaân gaây bieán tính thöôøng gaëp nhaát. -Do taùc duïng cuûa nhieät ñoä protein seõ bò giaõn maïch. Thí duï : Abbumin cuûa huyeát thanh ñaàu daøi/roäng = 3,sau khi bieán tính daøi/roäng = 5.5 -Vaän toác bieán tính do nhieät raát lôùn.Neáu so saùnh vôùi phaûn öùng hoaù hoïc thöôøng, khi nhieät ñoä taêng leân 10o C,toác ñoä phaûn öùng hoaù hoïc thöôøng taêng 2 laàn, trong luùc ñoù toác ñoä bieán tính seõ taêng 600 laàn (söï bieán tính cuûa caùc protein khaùc nhau thì khaùc nhau). Nhieät ñoä gaây bieán tính caùc protein khaùc nhau thì khaùc nhau.Söï bieántính naøy coøn phuï thuoäc baûn chaát, nhieät ñoä aùp suaát protein, hoaït ñoä H2O, pH, muoái,… Khi gia taêng nhieät ñoä, caùc lieân keát hydro bò beû gaõy tröôùc, maïch duoãi daøi ra, caùc goác kî nöôùc loä ra laøm giaûm tính hoaø tan cuûa protein. Caùc protein khaùc nhau seõ coù nhieät ñoä bieán tính khaùc nhau. . Bieán tính do nhieät ñoä cao: ña soá protein khi naâng nhieät ñoä > 60 oC baét ñaàu xaûy ra söï bieán tính. . Bieán tính do nhieät ñoä thaáp: coù moät soá Enzym beàn ôû nhieät ñoä thöôøng nhöng laïi bò voâ hoaït ôû 0oC.Protein ñaäu naønh, protein tröùng söõa seõ bò keát tuûa ôû nhieät ñoä laïnh ñoâng.Nhieät ñoä thaáp cuõng coù theå gaây ra söï pha huyû caáu truùc baäc 4 cuûa protit. Moät caùch töông ñoái ta thaáy protein 17 naøo coù tæ soá giöõa axit amin kî nöôùc/ axit amin haùo nöôùc caøng cao thì caøng deã bò bieán tính ôû nhieät ñoä thaáp. Khi ôû daïng dung dòch thì dung dòch protein thì protein caøng deã bieán tính. Do ñoù protein ôû daïng ñoâng khoâ(Lyophilisation) döôïc duøng ñeå baûo quaûn. (2)Böùc xaï: caùc tia böùc xaï alpha, beta, UV, sieâu aâm. . Tia cöïc tím bò haáp thuï bôûi a xít amin thôm, neáu naêng löôïng caøng cao seõ laøm ñöùt ñöôïc caàu _S_S_ . . Böùc xaï gamma, tia ion hoaù seõ laøm bieán ñoåi hình theå vaø o xy hoaù moät soá goác axit amin, phaù huyû lieân keát ñoàng hoaù trò taïo caùc goác protein töï do, gaây phaûn öùng taùi toå hôïp vaø truøng hôïp protein. (3)Cô hoïc: nhaøo (boät), ñaùnh (tröùng),… . Nhaøo troän caùn boät mì, taïo caùc löïc caét gaây bieán tính protein. Ñoäng taùc ñöôïc laëp ñi laëp laïi nhieàu laàn (nhö ñaùnh tröùng) cuõng laøm bieán tính protein do phaù huyû daïnh xoaén alpha. (4) pH : ña soá protein bò bieán tính khi pH quaù cao hay quaù thaáp. Luùc ñoù, löïc ñaåy tónh ñieän giöõa caùc nhoùm ion hoaù cuûa protein seõ laøm giaõn daøi maïch protein. (5) Muoái kim loaïi: muoái kim loaïi kieàm (Na,K) ít aûnh höôûng, muoái kim loaïi kieàm thoå hoaït ñoäng toát hôn. Caùc kim loaïi chuyeån tieáp Cu,Fe, Hg,Ag phaûn öùng raát nhanh vôùi protein. (6) Dung moâi höõu cô: phaån lôùn dung moâi höõu cô ñeàu laø taùc nhaân gaây bieán tính vì chuùng laøm thay ñoåi haèng soá ñieän moâi cuûa moâi tröôøng. Caùc dung moâi höõu cô khoâng cöïc coù theå xaâm nhaäp vuøng kî nöôùc, phaù huyû töông taùc kî nöôùc. (7) Hôïp chaát höõu cô: nhö ureâ, guanidin coù theå phaù huyû lieân keát hydro gaây bieán tính. Caùc chaát hoaït ñoäng beà maët coù taùc duïng phaù huyû lieân keát hydro laøm giaõn maïch. Caùc chaát khöû (sisterin, vitamin C) phaù huyû caàu ñi sunfur. *Söï bieán tính beà maët: -Khi coù beà maët phaân chia pha: caùc phaân töû H 2O treân beà maët dung dòch protein laø caùc phaân töû coù möùc naêng löôïng cao (Khaùc vôùi H 2O trong dung dòch), seõ lieân keát vôùi phaân töû protein laøm phaù vôõ caùc lieân keát hydro, protein treân beà maët duoãi maïch vaø deã daøng polyme hoaù vôùi nhau taïo moät maøng protein treân beà maët phaân chia pha goïi laø söï bieán tính beà maët (ñaây laø söï bieán tính baát thuaän nghòch). *Toùm laïi: Söï bieán tính protein thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå loaïi boû protein ra khoûi dung dòch, vaø cuõng ñöôïc öùng duïng trong coâng ngheä cheá bieán thöïc phaåm.Ñôn giaûn nhaát laø laø ñun soâi dung dòch protein, sau ñoù môùi duøng hoaù chaát acid, kieàm ôû nhieät ñoä cao: acid tricloacetic, acid wonframic, acid picric, acid sulfosalisilic, coøn coù theå duøng muoái cuûa kim loaïi naëng: Pb, Hg, Cu, Fe,… Neáu muoán taùch chieát protein, ta phaûi traùnh hieän töôïng bieán tính protein, baèng caùch duøng dung dòch ñeäm coù noàng ñoä vaø pH thích hôïp, theâm caùc chaát höõu cô nhö ñöôøng glucoza, saccaroza, röôïu ña chöùc. Saûn phaåm thu ñöôïc phaûi ñöôïc saáy thaêng hoa, giöõ traïng thaùi khoâ, nhieät ñoä thaáp. 4.Khaû naêng taïo gel: Caùc loaïi thöïc phaåm nhö gioø luïa, gioø caù, phomat, baùnh mì,… laø nhöõng saûn phaåm coù keát caáu gel protein. Gel laø gì ? 18 Khi protein bò bieán tính, caùc maïch polypeptid bò duoãi ra vaø lieân keát vôùi nhau taïo thaønh moät maïng löôùi khoâng gian ba chieàu. Moãi choã tieáp xuùc laø moät nuùt maïng. Maïng löôùi protein naøy coù khaû naêng giöõ nöôùc trong maïng cöû chuùng, traïng thaùi naøy ñöôïc goïi laø traïng thaùi gel cuûa protein. Caùc nuùt maïng coù theå ñöôïc taïo thaønh do: + Töông taùc cuûa caùc nhoùm kî nöôùc (hydrophobe). Töông taùc öa beùo naøy seõ ñöôïc taêng cöôøng khi nhieät ñoä taêng laøm cho caùc maïch polypeptid sít nhau hôn, laøm khoái gel trôû neân cöùng hôn. + Lieân keát hydro: lieân keát giöõa nhoùm –OH vaø nhoùm –COOH. Lieân keát hydro raát yeáu, taïo ra söï linh ñoäng giöõa caùc phaàn töû, vaø do ñoù laøm cho gel coù ñöôïc ñoä deûo nhaát ñònh. Khi gia nhieät lieân keát hydro bò ñöùt, gel bò noùng chaûy, khi ñeå nguoäi (gaàn 0 oC) caàu hydro ñöôïc taùi laäp vaø taêng cöôøng. *Ñieàu kieïn taïo gel: -Nhieät ñoä laø yeáu toá caàn thieát ñaàu tieân. Sau khi gia nhieät, ngöôøi ta thöôøng laøm laïnh ñeå taïo ñieàu kieän coù nhieàu lieân keát hydro, keát caáu gel beàn. -Acid hoaù, kieàm hoaù nheï ñöa veà pI laøm gel taïo thaønh chaéc hôn. -Theâm caùc chaát ñoàng taïo gel (polysaccarit) ñeå laøm caàu noái giöõa caùc haït, taïo ñoä cöùng, taêng ñoä ñaøn hoài. 5.Khaû naêng taïo nhuõ: Khaû naêng taïo nhuõ cuûa protein lieân quan ñeán tính chaát beà maët cuûa phaân töû protein. Nhuõ töông laø heä phaân taùn cuûa hai chaát loûng khoâng troän laãn vôùi nhau ñöôïc. Trong ñoù coù moät chaát ôû daïng nhöõng gioït nhoû goïi laø pha phaân taùn, coøn chaát kia chieám ña soá goïi laø pha lieân tuïc. Hai pha khoâng tan vaøo nhau thöôøng gaëp laø nöôùc vaø daàu. Trong phaàn lôùn nhuõ töông thöïc phaåm ta gaëp laø nhuõ töông D/N hay NID. Nhieàu saûn phaåm thöïc phaåm laø nhöõng nhuõ töông: söõa (D/N), kem, phoù maùt, xuùc xích (N/D). Nhuõ töông laø heä khoâng beàn. Caùc gioït nhoû coù khuynh höôùng hoïp laïi vôùi nhau taïo thaønh gioït to hôn, cuoái cuøng taùch laøm hai lôùp. Muoán cho nhuõ töông beàn, ta phaûi laøm sao cho caùc gioït nhoû phaân taùn ñeàu vaø khoù keát hôïp laïi vôùi nhau. -Coù caùc caùch taïo nhuõ beàn nhö: (1)Cho caùc chaát ñieän ly voâ cô ñeå caùc gioït tích ñieän, ñaåy nhau. Ngöôøi ta thöôøng duøng K2CO3 ,Na2CO3,… (2)Theâm caùc chaát hoaït ñoäng beà maët coù caáu truùc löôõng cöïc ñeå lieân keát caùc haït haùo nöôùc vaø kî nöôùc,… Khaû naêng taïo nhuõ cuûa protein lieân quan ñeán tính chaát naøy.Trong phaân töû protein coù nhöõng nhoùm aùi nöôùc vaù nhöõng nhoùm kî nöôùc, do ñoù noù coù khaû naêng vöøa keát hôïp vôùi H 2O vaø vöøa keát hôïp vôùi caùc haït daàu, laøm giaûm söùc caêng beà maët phaân pha. (3)Theâm caùc chaát cao phaân töû coù khaû naêng hoaø tan ñöôïc trong pha lieân tuïc nhö polysaccarit ñeå taêng ñoä nhôùt pha lieân tuïc, hoaëc protein haáp phuï vaø beà maët phaân chia pha. Khi ñoù do söï taïo thaønh ñoä nhôùt, ñoä ñaøn hoài, ñoä cöùng cuûa pha lieân tuïc, neân caùc gioït khoâng hôïp laïi ñöôïc vôùi nhau. Khi ôû pH thích hôïp söï coù maët cuûa protein cuõng coù taùc duïng oån ñònh nhuõ. Söï ion hoaù cuûa maïch beân seõ taïo löïc ñaåy tónh ñieän cho caùc gioït khoâng ñeán gaàn nhau. 6.Khaû naêng taïo boït: 19 Boït thöïc phaåm laø heä phaân taùn caùc boùng khí trong pha lieân tuïc laø chaát loûng hay chaát baùn raén, coù chöùa chaát hoaït ñoäng hoøa tan. Saûn phaåm thöôøng gaëp nhö kem, boït bia baùnh mì,… Boït thöïc phaåm thöôøng chöùa khoâng khí hay CO 2, eùp saùt vaøo nhau coù hình ña dieän.Lôùp maøng loûng bao quanh boùng boät raát moûng.Tuyø theo ñoä beàn cuûa maøng, ta seõ coù heä beàn boït hay khoâng? Muoán heä beàn boït, thì maøng bao quanh phaûi khoâng deã vôõ, phaûi ñaøn hoài vaø khoâng thaám khí. Protein ôû beà maët phaân pha seõ taïo ñöôïc cho maøng tính chaát ñoù vì coù söï bieán tính protein ôû beà maët. Vì vaäy caùc chaát taïo boït thöïc phaåm thöôøng laø protein (loøng traéng tröùng,soyaprotein, …).Ngöôøi ta thöôøng gia nhieät sau khi taïo boït ñeå coá ñònh heä boït (protein bò bieán tính). 7.Haáp phuï: Do coù beà maët phaân töû lôùn,neân protein coù tröôøng löïc phaân töû lôùn vaø coù khaû naêng haáp phuï caùc chaát K,L,R khaùc nhau. Thí duï:Albumin (huyeát thanh) haáp phuï chaát beùo. Hoàng huyeát caàu (maùu) haáp phuï O2,CO2. Tính chaát naøy ñöôïc öùng duïng trong thöïc teá saûn xuaát thöïc phaåm: Thí duï:-Laøm trong dung dòch siro baèng caùch cho loøng traéng tröùng hay gelatin vaøo ñoàng thôøi gia nhieät. -Ñöôïc duøng khi boå sung muøi, maøu cho saûn phaåm. Caùc chaát naøy thöôøng coù phaân töû löôïng thaáp, deã boác hôi, nhôø coù aùp suaát haáp phuï neân chuùng môùi oån ñònh ñöôïc trong saûn phaåm. 8.Khaû naêng taïo sôïi: Khi caùc protein bò bieán tính duoãi maïch lieân keát theo moät truïc coá ñònh, noù seõ taïo sôïi. Ñeå taêng ñoä beàn vöõng cho sôïi protein coù theå oån ñònh ôû pI nhöng thöôøng boå sung theâm caùc polysaccarit aùi nöôùc ñeå taêng lieân keát . Khaû naêng taïo sôïi cuûa protein ñöôïc öùng duïng trong thöïc phaåm, ñeå bieán caùc loaïi protein coù giaù trò thöông phaåm thaáp thaønh protein coù giaù trò thöông phaåm cao. Tính chaát Hoùa hoïc: 1.Tính ñieän ly löôõng cöïc: Gioáng acid amin, vì trong phaân töû protein chöùa acid amin. Vì vaäy neáu acid amin tích ñieän thì protein cuõng tích ñieän. Vaø cuõng tuøy thuoäc pH maø söï tích ñieän thay ñoåi. Toàn taïi pI ôû ñoù ñieän tích cuûa protein baèng khoâng goïi laø pH ñaúng ñieän cuûa protein. Tuyø thuoäc cuûa acid amin maø pI ôû vuøng acid, trung tính hay kieàm. ÖÙng duïng phöông phaùp ñieän di: taùch protein gioáng taùch acid amin. ÖÙng duïng phöông phaùp saéc kyù trao ñoåi ion: nhoài vaøo coät caùc ionit. Protein tích ñieän khaùc nhau seõ haáp phuï vaøo caùc nhöïa ionit vôùi aùi löïc khaùc nhau. Sau ñoù duøng dung dòch coù löïc ion thay ñoåi ñeå röûa giaûi. Ví duï: dung dòch NaCl coù noàng ñoä thaáp  taêng daàn noàng ñoä (phöông phaùp röûa giaûi baèng gradien noàng ñoä ). Coù theå duøng phöông phaùp röûa giaûi baèng gradien pH. pI cuûa moät soá protein khac nhau: Pepxin 1.0 Gelatin 4.9 Tripxin 10.5 Albumin tröùng 4.6 Globulin 5.2 Citocrom 10.6 Cazein 4.7 Hemoglobin 6.8 Prolamin 12.0 Blb.huyeát thanh 4.9 Ribonucleaza 7.8 ÔÛ pH < pI : protein tích ñieän döông. 20