Góp phàn nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 183

  • Số trang: 132 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 29 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ THÚY GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 183.24 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THỊ THÚY GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 183.24 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Ths. Lê Thị Thu Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh và Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN ThS. Lê Thị Thu Hương – Bộ -S ọ ộ Tôi xin chân thà ộ H - S ộ ị ọ ộ Đ ọ ễ m. ị Đ ọ H ộ ọ ọ ộ ị H ộ ă 0 4 Sinh viên HOÀ G HỊ HÚY MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................................... 2 1.1. Đại cƣơng về kháng sinh .......................................................................................... 2 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh ......................................................................... 2 1.1.2. Định nghĩa kháng sinh ....................................................................................... 2 1.1.3. Ứng dụng của kháng sinh .................................................................................. 2 1.1.4. Nhu cầu phát triển kháng sinh mới .................................................................. 3 1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn.............................................................................................. 3 1.2.1. Xạ khuẩn và sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn .............................. 3 1.2.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn ..................................................................... 4 1.2.3. Phân loại xạ khuẩn............................................................................................. 4 1.2.4. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces ....................................................... 5 1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn .................................................. 5 1.3.1. Mục đích .............................................................................................................. 5 1.3.2. Chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên .......... 6 1.3.3. Đột biến cải tạo giống........................................................................................ 6 1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn .................................................................................. 6 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh .......................................................................... 7 1.4.1. Định nghĩa ........................................................................................................... 7 1.4.2. Các phương pháp lên men ................................................................................. 7 1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ............................................ 8 1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh ............................................................................ 8 1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh ................................................. 8 1.5.2. Các phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng ...................................... 9 1.6. Bƣớc đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh............................................................ 10 1.6.1. Phổ tử ngoại – nhìn thấy (phổ UV-VIS) ........................................................ 10 1.6.2. Phổ hồng ngoại (phổ IR) ................................................................................. 10 1.6.3. Phân tích khối phổ............................................................................................ 11 1.7. Sàng lọc gen hoạt hóa Streptomyces nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh 11 1.8. Nghiên cứu kháng sinh natamycin sản xuất bởi Streptomyces lydicus (quá trình lên men, chiết suất, tinh chế và một số tính chất) ........................................................... 12 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 13 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ...................................................................................... 13 2.1.1. Nguyên vật liệu ................................................................................................. 13 2.1.2. Máy móc thiết bị ............................................................................................... 14 2.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 15 2.2.1. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được .......................... 16 2.2.2. Chủng giống, cải tạo giống ............................................................................. 16 2.2.3. Lên men, chiết tách kháng sinh....................................................................... 16 2.3. Phƣơng pháp thực nghiệm ...................................................................................... 17 2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn ..................................................................... 17 2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán .................. 17 2.3.3. Phân loại xạ khuẩn theo ISP ........................................................................... 18 2.3.4. Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp ....................................................... 19 2.3.5. Sàng lọc ngẫu nhiên ......................................................................................... 20 2.3.6. Đột biến bằng ánh sáng UV ............................................................................ 20 2.3.7. Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lọc............................................ 21 2.3.8. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ................................................................ 22 2.3.9. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ........................... 22 2.3.10. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng………..22 2.3.11. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột và sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được ........................................................................................ 23 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ................................................................. 25 3.1. Xác định tên khoa học của Streptomyces 183.24................................................. 25 3.2. Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh...................................................... 26 3.2.1. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy thích hợp................................................ 26 3.2.2. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ........................................................................... 27 3.2.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 .............................................................. 28 3.2.4. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2…………………………………….29 3.2.5. Kết quả chọn môi trường lên men chìm......................................................... 30 3.2.6. Kết quả chọn chủng lên men ........................................................................... 30 3.2.7. Độ bền với pH, nhiệt ........................................................................................ 31 3.3. Chiết suất và tinh chế kháng sinh từ dịch lọc ....................................................... 32 3.3.1. Kết quả chọn pH chiết...................................................................................... 33 3.3.2. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi.................................................. 34 3.3.3. Kết quả tách và tinh chế kháng sinh .............................................................. 34 3.3.4. Kết quả chạy sắc ký cột lần 1.......................................................................... 34 3.3.5. Kết quả chạy sắc ký cột lần 2.......................................................................... 35 3.4. Kết quả độ nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết .................... 38 3.4.1. Nhiệt độ nóng chảy........................................................................................... 38 3.4.2. Phổ tử ngoại ...................................................................................................... 38 3.4.3. Phổ hồng ngoại................................................................................................. 39 3.4.4. Phổ khối ............................................................................................................. 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.................................................................................................. 40 - Kết luận .......................................................................................................................... 40 - Đề xuất ........................................................................................................................... 41 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Tên đầy đủ 1 16S rADN 2 ADN Acid deoxyribonucleic 3 ATCC American type culture collection 16S Ribosomal acid deoxyribonucleic (Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ) 4 B.pumilus Bacillus pumilus 5 DM 6 DMHC 7 ĐB1 Đột biến lần 1 8 ĐB2 Đột biến lần 2 9 Gr(+) Gram dương 10 Gr(-) Gram âm 11 ISP Dung môi Dung môi hữu cơ International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế) 12 IR Investor relations 13 KS Kháng sinh 14 HTKS 15 MS Mass Spectometry 16 MT Môi trường 17 MTdt 18 S.flexneri Hoạt tính kháng sinh Môi trường dịch thể Shighella flexneri 19 UV-VIS Ultraviloet- Visible 20 SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên 21 VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG STT Ký hiệu Nội dung 1 Bảng 2.1 Các vi khuẩn kiểm định 13 2 Bảng 2.2 Các dung môi đã sử dụng 15 3 Bảng 3.1 Các đặc điểm phân loại ISP của Streptomyces 183.24 25 Trang và Streptomyces lydicus 4 Bảng 3.2 Hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 183.24 trên 26 MT1, MT2, MT6 5 Bảng 3.3 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của sàng lọc ngẫu 27 nhiên 6 Bảng 3.4 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của đột biến lần 1 28 7 Bảng 3.5 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh của đột biến lần 2 29 8 Bảng 3.6 Kết quả chọn môi trường lên men chìm 30 9 Bảng 3.7 Kết quả chọn chủng lên men 30 10 Bảng 3.8 Độ bền của kháng sinh với nhiệt 31 11 Bảng 3.9 Độ bền của kháng sinh với pH 31 12 Bảng 3.10 Kết quả chọn pH chiết 32 13 Bảng 3.11 Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký 33 14 Bảng 3.12 Kết quả chạy sắc ký cột lần 1 34 15 Bảng 3.13 Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn của chạy cột 35 lần 1 16 Bảng 3.14 Màu sắc từ phân đoạn 7 đến 14 của sắc ký cột lần 1 35 17 Bảng 3.15 Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 36 18 Bảng 3.16 Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn của chạy cột 37 lần 2 19 Bảng 3.17 Kết quả của các chất kháng sinh tách được 37 20 Bảng 3.18 Kết quả IR 38 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng sinh ra đời là một bước ngoặt quan trọng của y-dược học. Nhờ đó mà nhân loại đã chống lại được các dịch bệnh nguy hiểm như dịch hạch, tả, viêm phổi… Hiện nay, kháng sinh trở thành 1 nhóm thuốc thiết yếu. Với nền khoa học ngày càng phát triển, nhóm thuốc kháng sinh không chỉ dừng lại ở chỉ định điều trị nhiễm khuẩn, nhiễm nấm mà còn đang được mở rộng trong cả điều trị ung thư và HIV/AIDS với nhiều kết quả khả quan. Tuy nhiên, việc nghiên cứu kháng sinh mới đang có xu hướng giảm dần theo thời gian do chi phí, nhân lực còn hạn chế. Đó chính là nguyên nhân các hãng dược phẩm đang có xu hướng từ bỏ cam kết triển khai nghiên cứu thuốc kháng sinh mới. Trong khi đó, việc sử dụng kháng sinh chưa hợp lý gây ra tình trạng kháng thuốc ngày càng nghiêm trọng và xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật kháng chéo với các kháng sinh có cấu trúc tương tự. Do vậy, đẩy mạnh nghiên cứu kháng sinh mới có hiệu quả điều trị cao, độc tính thấp, ít bị kháng đang là một nhu cầu cấp thiết. Trong khoảng 15.000 chất kháng sinh được biết đến hiện nay thì có 55% có nguồn gốc từ xạ khuẩn và 75% số đó thuộc chi Streptomyces. Đây là cơ sở để tôi chọn đề tài: ”Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 183.24” làm khóa luận tốt nghiệp với các mục tiêu sau đây: - Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.24. - Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh. - Xác định các điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh, sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được. 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. Đại cƣơng về kháng sinh 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh Năm 1929 thuật ngữ "chất kháng sinh" được Alexander Fleming mô tả một cách đầy đủ và đã mở ra kỷ nguyên mới trong ngành y dược học, khai sinh ra ngành công nghệ sản xuất kháng sinh và ứng dụng thuốc kháng sinh vào điều trị cho con người [9],[15]. Thập niên 40 và 50 của thế kỷ XX đã ghi nhận những bước tiến vượt bậc của ngành công nghệ sản xuất kháng sinh non trẻ, với hàng loạt sự kiện như: Khám phá ra hàng loạt kháng sinh, như penicillin (1928), griseofulvin (1939), gramicidin S (1942), streptomycin (1943)… Áp dụng phối hợp các kỹ thuật tuyển chọn và tạo giống tiên tiến (đặc biệt là các kỹ thuật gây đột biến, dung hợp tế bào, tái tổ hợp gen...) đã tạo ra những chủng có khả năng tổng hợp kháng sinh cao gấp nhiều lần so với ban đầu. Bên cạnh đó, tổng hợp và bán tổng hợp kháng sinh từ các khung hóa học sẵn có cũng đạt được những thành tựu đáng kể với sự xuất hiện của chloramphenicol, cephalosporin bán tổng hợp, macrolid,… [9],[12],[19],[35]. 1.1.2. Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn gốc tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, protozoa…) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp [4],[7],[8],[9],[15],[19]. Phụ lục 1.1 trình bày một số kháng sinh do Streptomyces tạo ra. 1.1.3. Ứng dụng của kháng sinh - Lĩnh vực y học: Kháng sinh được sử dụng rộng rãi, phổ biến để điều trị và phòng các bệnh nhiễm khuẩn, ngoài ra còn điều trị ung thư, chống nấm [8]. 3 - Lĩnh vực khác  Trong chăn nuôi: kháng sinh được dùng để chữa bệnh cho động vật. Ví dụ: griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú ở trâu bò… Ngoài ra kháng sinh còn được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn, ăng sản lượng trứng cho gà, vịt…  Trong trồng trọt: hiện nay có khoảng 30 chất kháng sinh có thể diệt nấm, vi khuẩn, virus gây bệnh cho cây trồng. Ví dụ: Blastincidin S (kháng sinh chiết từ S. griseochromogenes), ở Nhật dùng để trị bệnh vàng lụi gây ra bởi Piricularia oryzae, Herbicidin A và B là kháng sinh diệt cỏ do S.saganonensis tạo ra, nó kìm hãm sự phát triển của Xanthomonas oryzae gây bệnh ở lúa…  Trong công nghiệp thực phẩm: kháng sinh được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để bảo quản thực phẩm đóng hộp, cho thêm kháng sinh vào nhằm giảm thời gian khử trùng bằng nhiệt. Ví dụ: kháng sinh subtilin (do Bacillus subtilis tạo ra), nisin (do Bacillus licheniformis tạo ra) [7]. 1.1.4. Nhu cầu phát triển kháng sinh mới Một trong các thành tựu của y học hiện đại là phát triển các chất kháng sinh và các chất kháng VSV. Tuy nhiên, các VSV đã và đang phát triển tính kháng với các kháng sinh hiện có bằng các đột biến mới hoặc thay đổi thông tin di truyền. Do vậy, cần phải có các kháng sinh mới có tác dụng hiệu quả lên các vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt là các hợp chất chống khối u và vật ký sinh. Ngoài ra, cần có các kháng sinh mới cho nông nghiệp để làm thuốc chữa bệnh cho cây trồng và vật nuôi vì các bệnh đó sẽ ảnh hưởng đến con người thông qua chuỗi thức ăn [19],[32]. 1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn 1.2.1. Xạ khuẩn và sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật có cấu tạo dạng sợi phân nhánh, là các vi khuẩn gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có tỷ lệ G+C > 55%. Chúng phân 4 bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Do có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như kháng sinh, vitamin, acid hữu cơ, các enzym… nên các xạ khuẩn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu rất nhiều [8]. Kháng sinh là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa, được tích lũy bên trong tế bào (nội bào) hay phóng thích ra ngoài môi trường (ngoại bào). Các chủng xạ khuẩn cùng loài có thể sản sinh các kháng sinh khác nhau, mặt khác, các chủng thuộc các loài khác nhau cũng có thể sản xuất cùng một loại kháng sinh [8],[43]. Bảng 1 phụ lục giới thiệu một số kháng sinh do xạ khuẩn tổng hợp và ứng dụng. 1.2.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp hoặc dạng phấn, có dạng nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ. Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0µm đến 2-3µm, đa số không có vách ngăn, và có màu sắc phong phú: vàng, xám, da cam, đen đỏ, trắng…[8]. 1.2.3. Phân loại xạ khuẩn Chi xạ khuẩn được biết đến nhiều nhất là Streptomyces, khoảng 500 loài, tất cả đều có tỷ lệ G+C cao (69-73%) trong ADN. Có nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đã được nghiên cứu như khóa phân loại của Waksman, của Gauze… Ngày nay, để phân loại xạ khuẩn người ta sử dụng các tiêu chuẩn như trình tự 16S rADN, lai ADN, hình thái, sinh lý sinh hóa, hóa phân loại [13]. Đối với xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces thì có thể phân loại: - Bằng đặc điểm hình thái: khóa phân loại ISP được sử dụng làm bảng phân loại chính để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces dựa trên các đặc điểm: màu khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, hình dạng chuỗi bào tử và bề mặt bào tử, khả năng tạo sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan, khả năng tiêu thụ các nguồn đường [7],[28]. - Bằng sinh học phân tử: tách chiết ADN, giải trình tự 16S rADN để định tên khoa học [1],[33]. 5 1.2.4. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces Streptomyces là một chi thuộc họ Streptomytaceae, bộ Actinomycetales [13]. Một số đặc điểm thường thấy ở xạ khuẩn Streptomyces: Đặc điểm hình thái: - Khuẩn lạc tạo thành cụm trên bề mặt khô, xù xì, được bao phủ bởi một lớp bột mịn hoặc bởi những sợi nhỏ như lông tơ, khuẩn lạc có chân khá vững chắc. - Hệ sợi của khuẩn lạc: khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh.  Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào trong môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi.  Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí. Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử. Chuỗi bào tử là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn, phân cắt thành các bào tử trần. Đặc điểm sinh lý: streptomyces là VSV dị dưỡng và hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ phát triển từ 20-40°C, pH tối ưu thường là 6,8-7,5. Để phát triển chúng phân giải các hydratcacbon như tinh bột, glucose... làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit. Khả năng tạo sắc tố: được chia thành 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh (màu sắc của bề mặt), sắc tố melanoid [8]. 1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 1.3.1. Mục đích Xạ khuẩn thuần chủng phân lập từ tự nhiên thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp. Do đó, để thu được kháng sinh có hoạt tính và hiệu suất sinh tổng hợp cao đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp [7],[9]. 6 1.3.2. Chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên Các VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể có HTKS tăng mạnh gấp 20-30% so với những cá thể khác. Chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp [7]. 1.3.3. Đột biến cải tạo giống Để chọn được các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao, tiến hành gây đột biến liên tiếp kết hợp sàng lọc ngẫu nhiên các chủng sống sót [20] và kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần... đã đem lại nhiều kết quả, không những nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp mà còn rút ngắn được thời gian cải tạo giống mới [7]. Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 2 nhóm: - Tác nhân hóa học: có khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, đồng thời gây thay đổi trạng thái của ADN nên làm thay đổi cấu trúc gen. Một số tác nhân hóa học: acid nitrơ (HNO2), các hợp chất gây alkyl hóa (ethylmethan sunfonat, ethylenimin, nitromethylure…), các chất gây đột biến nhóm acridin,…[20],[21]. - Tác nhân vật lý: ánh sáng UV, tia X, tia neutron hay electron. Tác nhân vật lý thông dụng là ánh sáng (UV). Ánh sáng có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào VSV có kích thước nhỏ thì nó có khả năng xuyên thấu đến nhân. Khả năng đột biến phụ thuộc vào thời gian chiếu, cường độ bức xạ, khoảng thời gian giữa lúc chiếu xạ và lần sao chép tiếp theo của ADN, mức độ tổn thương ADN, hoạt tính enzym sửa chữa trong tế bào xạ khuẩn [21]. Những cá thể nào sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất khả năng sinh tổng hợp kháng sinh (đột biến âm) hoặc tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh (đột biến dương) [20],[21]. 1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn - Mục đích: giữ VSV có tỷ lệ sống sót cao, ổn định các trạng thái thu được, các đặc tính di truyền không bị biến đổi, không bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ, tránh bị thoái hóa, nhầm lẫn. 7 - Thông thường có 4 phương pháp:  Bảo quản trên môi trường thạch, định kỳ cấy chuyền.  Giữ giống trong cát hoặc đất vô trùng: do cấu trúc lý hóa nên đất là những cơ chất mang các tế bào VSV, đặc biệt là các bào tử [22]. Làm khô: trộn tế bào với giá mang (đất, cát, đĩa giấy, đĩa gelatin…) ở nhiệt độ phòng [20].  Giữ giống bằng phương pháp đông lạnh: ức chế sự phát triển của VSV bằng cách đưa chúng vào điều kiện lạnh sâu -25 đến -70 oC.  Giữ giống bằng phương pháp đông khô [7],[22],[20]. - Thực tế, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, bảo quản trong tủ lạnh ở 2°C, định kỳ 3 – 6 tháng cấy lại 1 lần [7],[22]. 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1. Định nghĩa Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của VSV (trong điều kiện yếm khí hay kỵ khí) [20] nhờ sự xúc tác của các enzym với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho chúng [7]. Lên men là giai đoạn nuôi VSV để chúng tạo sản phẩm hoặc là sinh khối VSV, hoặc là các sản phẩm trao đổi chất bậc 1,2,…[22]. Kháng sinh là một trong những sản phẩm của quá trình lên men xạ khuẩn. Cụ thể, là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn, thường vào gần hoặc vào pha cân bằng [6],[7],[15]. Hình P1 phụ lục, trình bày các bước cơ bản trong quá trình lên men từ xạ khuẩn. 1.4.2. Các phương pháp lên men - Phương pháp lên men bề mặt: môi trường dùng trong phương pháp này ở thể rắn hay thể lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ môi trường và sử dụng oxy không khí để hô hấp trên bề mặt môi trường. Phương pháp này có nhược điểm là tốn mặt bằng, hiệu suất sử dụng môi trường thấp, khó tự động hóa. Do đó, ngày nay chỉ sử dụng phương pháp này trong chọn giống và giữ giống [7]. 8 Phương pháp lên men chìm: vi sinh vật được nuôi trong môi trường lỏng, phát triển - cả 3 chiều nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt, nhưng đòi hỏi đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn. Có 4 kiểu lên men chìm là: lên men mẻ, lên men bổ sung, lên men liên tục, lên men bán liên tục [7],[9],[10],[20],[22]. 1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men Nhiệt độ: là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của VSV và hiệu - quả lên men. Quá trình lên men thường tỏa nhiệt rất lớn nên nhiệt độ trong các thiết bị lên men thường tăng vượt quá ngưỡng nhiệt độ thích hợp, vì vậy cần phải giám sát và điều chỉnh nhệt độ theo yêu cầu của quá trình lên men [22]. - pH môi trường: có thể các ion H+ hay OH- tác dụng trực tiếp đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzym [7]. Trong quá trình lên men, VSV tạo ra những sản phẩm trao đổi chất có tính acid hoặc base, khiến pH không còn phù hợp, nên phải chủ động điều chỉnh pH luôn ở giá trị thích hợp toàn bộ quá trình [20],[22]. - Độ hòa tan oxy và sự thông khí: thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất trong tế bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử dụng oxy của VSV. Đối với nhiều VSV, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiềm phát [7],[20],[22]. Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sinh tổng hợp chất mong muốn [9]. 1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh 1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, tùy theo đặc tính của loài mà sản phẩm thứ cấp đó được tiết vào môi trường nuôi cấy hay giữ lại trong tế bào. Để thu được các hoạt chất có độ tinh khiết cao cần tìm phương pháp chiết thích hợp. 9 Mục đích: - Không những làm cho sản phẩm đạt chất lượng cao, bảo quản được lâu hơn, mà còn làm tăng tỷ lệ thu hồi và hạ giá thành sản phẩm [7]. - Sở dĩ cần có các phương pháp chiết tách và tinh chế vì lượng kháng sinh trong dịch lên men thường rất nhỏ [2]. 1.5.2. Các phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng - Lọc: là quá trình phân riêng hỗn hợp không đồng nhất qua lớp lọc, bã được giữ lại trên lớp lọc, dung dịch chảy qua do chênh lệch áp suất trên và dưới lớp lọc. - Chiết bằng dung môi hữu cơ: là quá trình chuyển kháng sinh cần tách sang pha DMHC không đồng tan. Khi chọn DMHC cần thỏa mãn các yêu cầu sau:  Dung môi dễ kiếm, rẻ tiền, không độc, khó cháy.  Có tính chọn lọc cao, hòa tan tốt hoạt chất ít hòa tan tạp chất.  Dễ cất thu hồi [7]. - Phương pháp sắc ký: là phương pháp phân tách các chất trong hỗn hợp bằng cách dùng môi trường động (pha động) đưa hỗn hợp dung môi qua môi trường cố định trên bề mặt (pha tĩnh). Các chất được tách ra nhờ sự khác biệt của tương tác giữa chúng với pha tĩnh. Được ứng dụng trong kỹ thuật phân tách, làm giàu, tinh chế, phân tích định tính, định lượng [5],[16].  Sắc ký lớp mỏng: là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả năng bị hấp phụ khác nhau của chúng trên các bề mặt một chất rắn. Chất hấp phụ được tráng đều thành một lớp mỏng trên giá đỡ. Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số Rf [5],[16].  Sắc ký lỏng trên cột: là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành tấm phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn (chất mang có cỡ hạt nhỏ) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh [5]. - Tinh chế bằng nhựa trao đổi ion hoặc bằng phức chất.
- Xem thêm -