Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 156

  • Số trang: 65 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 64 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ NGUYỄN QUỲNH ANH GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪSTREPTOMYCES 156.11 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ NGUYỄN QUỲNH ANH GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪSTREPTOMYCES 156.11 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS. Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh và Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS TS Cao Văn Thu– bộ môn Vi sinh - Sinh học, người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy, công tác tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Bộ môn Công Nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa vật liệu - khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường. Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên , giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Do hạn chế về thời gian, điều kiện trang thiết bị và phương tiện nghiên cứu, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót . Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 5năm 2013. Sinh viên Ngô Nguyễn Quỳnh Anh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ...............................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................................2 1.1. Đại cương về kháng sinh ........................................................................................2 1.1.1.Lịch sử nghiên cứu kháng sinh .......................................................................2 1.1.2. Định nghĩa kháng sinh ...................................................................................2 1.1.3. Phân loại kháng sinh .......................................................................................2 1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh ......................................................................3 1.1.5. Ứng dụng của kháng sinh ................................................................................4 1.1.6. Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh ..................................................4 1.1.7. Kháng sinh chống ung thư .............................................................................4 1.1.8. Khái niệm về tính kháng kháng sinh ...............................................................5 1.2.Đại cương về xạ khuẩn .............................................................................................5 1.2.1. Xạ khuẩnvà sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn ................................6 1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces ........................................................6 1.2.3.Phương pháp phân loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces...............................7 1.3.Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn ....................................................8 1.3.1.Chọn chủng có HTKS cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên ............................8 1.3.2. Đột biến cải tạo giống ......................................................................................8 1.3.3. Bảo quản giống xạ khuẩn .................................................................................8 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh ..........................................................................9 1.4.1.Các phương pháp lên men .............................................................................10 1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ...........................................10 1.5.Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ................................................10 1.5.1.Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh ................................................11 1.5.2. Các phương pháp chiết tách ..........................................................................11 1.6.Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh .............................................................11 1.6.1.Phổ tử ngoại - khả kiến .................................................................................11 1.6.2.Phổ hồng ngoại .............................................................................................11 1.6.3. Phân tích khối phổ........................................................................................12 1.6.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ........................................................................12 1.7. Sàng lọc gen hoạt hóa Streptomycesnâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh ........................................................................................................................................12 1.8. Quá trình tiến hoá của một Dps cảm ứng có tính thấm trong chi Streptomyces....13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................14 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị .....................................................................................14 2.1.1. Nguyên vật liệu ............................................................................................14 2.1.2. Máy móc thiết bị ..........................................................................................16 2.2. Nội dung nghiên cứu..............................................................................................17 2.2.1.Chọn lọc, cải tạo giống .................................................................................17 2.2.2.Lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu...........................................................17 2.2.3.Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được ...........................17 2.3. Phương pháp thực nghiệm .....................................................................................17 2.3.1.Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn....................................................................17 2.3.2.Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán.....................18 2.3.3.Chọn lọc ngẫu nhiên.....................................................................................18 2.3.4. Đột biến bằng UV ........................................................................................19 2.3.5.Phương pháp đột biến hóa học .....................................................................20 2.3.6. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh .............................................................21 2.3.7. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ...........................22 2.3.8. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng ....................22 2.3.9.Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay .........................................23 2.3.10.Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột ....................................................23 2.3.11. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được..........................................24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT .................................25 3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ..................................................................................25 3.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 .......................................................................25 3.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 .......................................................................26 3.4. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 3 .......................................................................27 3.5. Kết quả chọn môi trường lên men chìm .................................................................28 3.6. Kết quả chọn chủng lên men..................................................................................29 3.7. Kết quả chọn pH chiết.............................................................................................30 3.8. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi...........................................................31 3.9. Kết quả tách và tinh chế kháng sinh .......................................................................32 3.9.1. Kết quả sắc ký cột lần 1................................................................................32 3.9.2. Kết quả sắc ký cột lần 2 ................................................................................35 3.10. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy, đo phổ của kháng sinh tinh khiết......................39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ISP International Streptomyces Project (Chương trình Streptomyces quốc tế) B. subtilis Bacillus subtilis P. mirabilis Proteus mirabilis KS HTKS Kháng sinh Hoạt tính kháng sinh MT Môi trường MT2dt Môi trường dịch thể 2 ATCC American type culture collection (Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ) ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic VSV Vi sinh vật MC Mẫu chứng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên ĐB1 Đột biến lần 1 ĐB2 Đột biến lần 2 ĐBHH Đột biến hóa học Gr(+) Gram dương Gr(-) Gram âm DMHC Dung môi hữu cơ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Các kháng sinh tự nhiên và ứng dụng của chúng Bảng 2: Các vi khuẩn kiểm định. Bảng 3: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn. Bảng 4: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định. Bảng 5: Các dung môi đã sử dụng. Bảng 6: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên. Bảng 7: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1. Bảng 8: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2. Bảng 9: Kết quả thử HTKS đột biến lần 3. Bảng 10: Kết quả chọn môi trường lên men chìm. Bảng 11: Kết quả chọn chủng lên men. Bảng 12: Kết quả chọn pH chiết. Bảng 13: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký(VSV kiểm định P. mirabilis). Bảng 14: Kết quả chạy sắc ký cột lần 1. Bảng 15: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn 1, 2, 3 (VSV kiểm định P. mirabilis). Bảng 16: Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 – nhóm 2. Bảng 17: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột nhóm 2 (VSV kiểm định P. mirabilis). Bảng 18: Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 – nhóm 3. Bảng 19: Kết quả sắc ký lớp mỏng sau chạy cột nhóm 3. Bảng 20: Kết quả IR. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Kháng sinh được phát hiện qua các năm. Hình 1.2: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính. Hình 1.3: Sơ đồ tổng quát lên men sản xuất kháng sinh. Hình 1.4: Hình ảnh về VSV kháng kháng sinh. Hình 1.5: Phân loại bộ Actinomycetales. Hình 1.6: Cấu trúc khuẩn ty xạ khuẩn. Hình 1.7: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn. Hình 1.8: Bản đồ vị trí DPS trong số 17 nhiễm sắc thể Streptomycetales. Hình 3.9: Kết quả chọn chủng lên men chìm tốt nhất Hình 3.10: Biểu đồ kết quả chọn pH chiết với dung môi n - butanol. Hình 3.11: Sắc ký cột lần 1 Hình 3.12: Sắc ký cột lần 2 - nhóm 2. Hình 3.13: Sắc ký cột lần 2 - nhóm 3. Hình P.14: Khuẩn lạc xạ khuẩn sau 5 - 6 ngày. Hình P.15: Đĩa cấy zigzag sau 5 – 6 ngày. Hình P.16: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1 bằng phương pháp khối thạch (VSV kiểm định P. mirabilis). Hình P.17: Hình ảnh sau lên men chìm tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces156.11 Hình P.18: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh dịch lên men sau lên men chìm bằng phương pháp giếng thạch (VSV kiểm định P. mirabilis) Hình P.19: Kết quả hiện hình vi sinh vật (VSV kiểm định P. mirabilis). Hình P.20: Phổ UV của kháng sinh do Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp. Hình P.21: Phổ IR của kháng sinh do Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp. Hình P.22: Phổ MS của kháng sinh do Streptomyces 156.11 sinh tổng hợp. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là một nước nhiệt đới nóng ẩm với nền kinh tế đang phát triển, nằm trong khu vực có tỷ lệ bệnh nhiễm trùng cao nên nước ta có nhu cầu sử dụng kháng sinh rất lớn. Do nhiều nguyên nhân, tình trạng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh ngày càng diễn biến phức tạp và đang là mối lo ngại của cả xã hội, chúng ta đã và đang phải đối mặt với “kỉ nguyên hậu kháng sinh”. Tuy nhiên, hầu hết các kháng sinh trên thị trường dược phẩm trong nước vẫn còn được nhập ngoại dưới dạng nguyên liệu, bán thành phẩm hay thành phẩm. Chính vì vậy, nhiệm vụ đặt ra cho ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh nước ta là: một mặt cải tiến các chất kháng sinh cũ và phát triển công nghệ sản xuất kháng sinh, mặt khác phải thúc đẩy việc tìm ra kháng sinh mới. Đây là yêu cầu tất yếu và cấp thiết trong công cuộc bảo vệ và chăm sóc sức khỏe nhân dân. Trong các phương pháp sản xuất kháng sinh, bên cạnh tổng hợp và bán tổng hợp, phương pháp phân lập kháng sinh từ xạ khuẩn vẫn là con đường quan trọng để tìm được các chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh và từ đó phát hiện hoạt chất mới. Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 55% là từ Streptomyces. Bộ môn Vi sinh – Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu và bước đầu có kết quả với chi xạ khuẩn Streptomyces. Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờStreptomyces156.11” làm luận văn tốt nghiệp với các mục tiêu sau: 1. Nghiên cứu cải tạo giống nâng cao năng suất sinh tổng hợp kháng sinh. 2. Lựa chọn môi trường và biến chủng thích hợp cho quá trình lên men. 3. Tách chiết và tinh chế để thu được kháng sinh tinh khiết. 4. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh. 2 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Đại cương về kháng sinh 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu kháng sinh Chất kháng sinh (antibiotic) trước đây gọi là chất kháng khuẩn (antimicrobic) - là thuốc được con người dùng chủ yếu để chữa các bệnh nhiễm khuẩn [21]. Cho đến nửa sau thế kỷ XIX người ta đã xác định được vi sinh vật là nguyên nhân gây ra hàng loạt các bệnh này. Do đó liệu pháp hoá học nhằm vào vi sinh vật gây bệnh trở thành liệu pháp điều trị chính. Năm 1928, nhà vi khuẩn học người Anh Alexander Flemming đã tình cờ phát hiện hiện tượng nấm mọc trên đĩa và quanh tảng nấm đó là những vòng diệt khuẩn. Năm 1929, ông công bố penicillin trước công chúng.Năm 1938, Howara Walter Florey và Ernst Boris Chaen đã chiết xuất được penicillin.Năm 1942, penicillin được áp dụng vào điều trị.Ngay sau đó, penicillin đã trở thành một kháng sinh nổi tiếng vì đã cứu sống hàng triệu chiến binh trong chiến tranh thế giới II.Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960, nhiều kháng sinh mới được tìm ra và thời kỳ này được coi là một giai đoạn vàng son của việc nghiên cứu kháng sinh. Năm 1944, streptomycin được phát hiện từ vi khuẩn đất Streptomyces griseus[21].Sau đó đến chloramphenicol, tetracycline, các kháng sinh nhóm macrolid và glycopeptides ... được tìm ra (tham khảo phụ lục – hình 1.1). Việc cải tiến trong từng lớp kháng sinh tiếp tục thu được nhiều kháng sinh phổ rộng hơn, hoạt tính kháng vi sinh vật cao hơn, như các kháng sinh họ β – lactam... Cùng với việc tìm ra những kháng sinh mới, công nghệ lên men sản xuất kháng sinh cũng ra đời và dần hoàn thiện. Con đường tổng hợp và bán tổng hợp cũng dần phát triển. Việc phát hiện và phát triển kháng sinh của thế kỷ XX đã làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong do nhiễm khuẩn. Song từ những năm 1980, những kháng sinh mới được phát hiện và đưa vào điều trị giảm hẳn do chi phí quá lớn. Đồng thời, vi sinh vật nhanh kháng thuốc và tốc độ đó lại nhanh hơn tốc độ tìm ra thuốc mới của con người. Vì vậy, việc 3 áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, kỹ thuật dung hợp tế bào, tái tạo gen... là rất quan trọng để giúp con người tìm ra các chủng có HTKS cao và phát hiện các loại kháng sinh mới [10]. 1.1.2. Định nghĩa kháng sinh Theo quan niệm truyền thống, kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật, …) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp [3, 5]. Hiện nay, kháng sinh được định nghĩa là những chất có nguồn gốc vi sinh vật, được bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học. Với liều thấp có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt VSV gây bệnh [1] 1.1.3. Phân loại kháng sinh Kháng sinh có thể phân loại theo nhiều cách, theo nguồn gốc, theo cấu trúc hoá học, theo cơ chế tác dụng, theo đích tác dụng... Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học thường chia ra làm các nhóm chính sau đây [1]: 1. Các kháng sinh có cấu trúc β-lactam (penicillin, cephalosporin) 2. Các kháng sinh chứa nhân thơm (chloramphenicol) 3. Các kháng sinh có cấu trúc aminoglycosid (streptomycin, gentamicin) 4. Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin) 5. Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin) 6. Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin) 7. Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B) 8. Các kháng sinh nhóm antracyclin chống ung thư (daunorubicin) 9. Các kháng sinh nhóm actinomycin chống ung thư (actinomycin D). 1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 4 Kháng sinh có một hay nhiều đích tác dụng trong tế bào vi sinh vật mẫn cảm, tuy nhiên có thể khái quát thành 5 nhóm kháng sinh theo đích tác dụng chính (tham khảo phụ lục – hình 1.2) [1]. 1. Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn:β -lactam, vancomycin, bacitracin... 2. Thay đổi tính thấm màng tế bào chất: amphotericin, polymicin... 3. Ức chế tổng hợp acid nucleic: quinolon, rifampicin... 4. Ức chế hoặc thay đổi tổng hợp protein của vi khuẩn: chloramphenicol, tetracyclin, macrolid... 5. Ức chế chuyển hóa: co-trimoxazol. 1.1.5. Ứng dụng của kháng sinh  Trong lĩnh vực y học: - Kháng sinh được sử dụng rộng rãi, phổ biến để điều trị và phòng các bệnh nhiễm khuẩn, ngoài ra còn điều trị ung thư, chống nấm.  Lĩnh vực khác: - Trong chăn nuôi: Kháng sinh cũng được dùng để điều trị bệnh do vi sinh vật gây ra trên động vật. Ví dụ: Griseoviridin dung điều trị bệnh viêm phổi cấp, viêm vú của trâu bò... - Trong trồng trọt: Kháng sinh có thể diệt nấm, vi khuẩn, virus gây bệnh cho cây trồng; ví dụ: Blastincidin, Validamycin...[3], [12] 1.1.6. Sơ đồ tổng quát quy trình lên men sản xuất kháng sinh Các bước cơ bản trong quá trình lên men từ xạ khuẩn được thể hiện ở hình 1.3 phần phụ lục. [3], [4], [8]. 1.1.7. Kháng sinh chống ung thư Ở sinh vật bậc cao, mỗi tế bào có chức năng nhất định được thực hiện trong mối tương tác/liên hệ với các tế bào khác. Khi gặp điều kiện bất thường, tế bào mất liên hệ với các tế bào xung quanh và phân chia không ngừng tạo thành cấu trúc khối u hay ung thư. Ung thư được điều trị bằng một trong ba liệu pháp hoặc kết hợp các liệu pháp cùng 5 phẫu thuật để loại bỏ khối u, chiếu xạ để phá huỷ chọn lọc các tế bào ung thư hoặc hoá trị. Nhiều chất hoá học dùng trong hoá trị liệu ung thư là sản phẩm bậc hai mà vi sinh vật sinh ra do đó được gọi là kháng sinh chống/ kháng ung thư. Một số nhóm kháng sinh đã được dùng trong điều trị ung thư là anthracycline, actinomycin, bleomycin... và đạt được những kết quả khả quan.[16], [23] 1.1.8. Khái niệm về tính kháng kháng sinh Kháng thuốc là hiện tượng vi sinh vật mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó trong một thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hóa trị liệu [22]. Hình 1.4: Vi khuẩn kháng kháng sinh Có 2 kiểu kháng thuốc: kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc mới nhận. Kháng thuốc tự nhiên là đặc trưng của từng nòi sinh vật nhất định đối với một số kháng sinh nhất định nào đó. Kháng thuốc mới nhận có thể do thay đổi tính thấm thành tế bào, do các enzyme vô hiệu hóa kháng sinh, thay đổi phân tử đích hoặc do hoạt hóa các con đường trao đổi chất thay thế khác mà hoạt chất không tác dụng. [5] 1.2. Đại cương về xạ khuẩn 1.2.1. Xạ khuẩn và sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria)có cấu tạo dạng sợi phân nhánh. Chúng phân bố rộng rãi và đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm. Tên xạ khuẩn bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp 6 “actys” (tia) và “mykes” (nấm).Đa số xạ khuẩn có nguồn gốc từ đất. Trong mỗi gam đất nói chung có tới hàng triệu xạ khuẩn [5]. Streptomyces là chủng phổ biến, chiếm tới 95% các chủng phân lập được.Xạ khuẩn có thể được phân lập từ nước ngọt nhưng mật độ hiện diện thấp hơn. Các giống phổ biến là Actinoplanes, Micromonospora... Nhiều giống xạ khuẩn đã được phân lập từ nước biển và trầm tích biển bao gồm Streptomyces, Mocrobispora...[22] Xạ khuẩn tổng hợp được nhiều chất có giá trị, đặc biệt là kháng sinh.Chúng sản sinh một lượng lớn chất kháng sinh với những cấu trúc hóa học đa dạng. [3] Kháng sinh là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa, được tích lũy bên trong tế bào (nội bào) hay phóng thích ra ngoài môi trường (ngoại bào).Các chủng xạ khuẩn cùng loài có thể sản sinh các kháng sinh khác nhau, mặt khác, các chủng thuộc các loài khác nhau có thể sản xuất cùng một loại kháng sinh. Bảng 1 phần phụ lục đưa ra một số kháng sinh do xạ khuẩn tổng hợp và ứng dụng của chúng.[13] Tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc.Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp toả ra theo hình phóng xạ, đồng tâm hay chia thuỳ. Với hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và đa số không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy (khoảng từ 0,3µm đến 2-3µm).Để hiểu rõ hiểu sự đa dạng của xạ khuẩn, hình 1.5 phần phụ lục giới thiệu phân loại bộ Actinomycetales.[5] 1.2.2. Đặc điểm của xạ khuẩn Streptomyces Streptomyces là một chi thuộc họ Streptomytaceae, bộ Actinomycetales. Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 55% là từ Streptomyces[8]. Dưới đây là các đặc điểm thường thấy ở xạ khuẩn Streptomyces: Đặc điểm hình thái:Streptomyces phát triển thành dạng sợi, sợi nhỏ, dài. Mạng lưới phân nhánh của thể sợi thường phát triển ở cả bề mặt cơ chất rắn (tạo thành hệ sợi khí 7 sinh) lẫn bên trong tạo thành hệ sợi cơ chất.Hệ sợi chia làm 2 loại là khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh [5]. Hình 1.6: Cấu trúc khuẩn ty của xạ khuẩn cp – tế bào chất; cm – màng tế bào chất; cw – thành tế bào; me – mezoxom; se – vách ngăn; ri – riboxom; re – chất dự trữ Đặc điểm cấu tạo: Cấu tạo của Streptomyces chia làm ba phần: thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất. Trong đó thành tế bào xạ khuẩn Streptomyces thuộc nhóm CW I, có chứa L – diaminopimelic acid ( L –ADP ) và glycin. Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là VSV dị dưỡng và hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ phát triển từ 20-40°C (thích hợp là 26-32°C), pH thích hợp là 6,8-7,5. Nguồn hydratcacbon như tinh bột, glucose... Nguồn nitơ như muối nitrat, amoni... Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia thành bốn loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh (màu sắc của bề mặt khuẩn lạc), sắc tố melanoid. 1.2.3. Phương pháp phân loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces - Qua đặc điểm hình thái: khóa phân loại ISP được sử dụng làm bảng phân loại chính để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces dựa trên các đặc điểm: màu khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất, hình dạng chuỗi bào tử và bề mặt bào tử, khả năng tạo sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan, khả năng tiêu thụ các nguồn đường. [5] - Bằng sinh học phân tử: tách chiết ADN; phản ứng PCR, giải trình tự 16S rADN và phân tích cây chủng loại phát sinh. [8] 8 1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 1.3.1.Chọn chủng có HTKS cao bằng chọn lọc ngẫu nhiên Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh tăng lên 20 - 40 % so với những cá thể khác. Chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp.[3] Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên cứu ban đầu, nó không có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo.[3], [15] 1.3.2. Đột biến cải tạo giống Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm: - Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO2), hydroxylamin, dimethylsulphat… - Tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia X, tia neutron hay electron. Tác nhân vật lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). - Tác nhân sinh học: Tác nhân sinh học biến đổi gen. Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết hầu hết các vi sinh vật. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến dương) [8, 15] Đặc biệt, hiệu quả của đột biến UV chịu tác động của các nhân tố: khoảng thời gian giữa lúc chiếu xạ và lần sao chép tiếp theo của ADN, mức độ tổn thương ADN, hoạt tính enzyme sửa chữa trong tế bào xạ khuẩn [15] Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp định hướng các gen, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần.[3] 1.3.3. Bảo quản giống xạ khuẩn 9 Bảo quản giữ giống VSV là công việc cần thiết do các giống rất dễ bị thoái hóa, nhầm lẫn, mất mát nếu không được lưu giữ một cách khoa học [3]. Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV: cấy chuyền (bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường ở 2°C, định kỳ cấy chuyền sang môi trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng), đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh), đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp) [8] Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh ở 2°C và định kỳ 3 – 6 tháng cấy lại 1 lần [3]. 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của vi sinh vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho chúng [3]. Kháng sinh là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúc quá trình sinh trưởng củavi sinh vật, thường vào gần hoặc vào chính pha cân bằng. Hình 1.7: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn. 1.4.1. Các phương pháp lên men 10 - Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn hay thể lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi không khí để hô hấp trên bề mặt MT. Phương pháp này tuy có ưu điểm là thao tác đơn giản, không đòi hỏi thiết bị quá tân tiến nhưng lại có nhược điểm là tốn mặt bằng, hiệu suất sử dụng môi trường thấp, khó tự động hóa. Do đó, ngày nay chỉ sử dụng phương pháp lên men bề mặt trong chọn giống và giữ giống.[3] - Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển cả 3 chiều nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt nhưng đòi hỏi đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn. [3], [7] 1.4.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men -pH môi trường: ảnh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực tiếp của các ion H+ hay OH- đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzyme hoặc là tác dụng gián tiếp. - Độ hòa tan oxy và sự thông khí: thiếu oxy nhất thời sẽ phá vỡ trao đổi chất trong tế bào. Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy bằng tốc độ sử dụng oxy của VSV. Đối với nhiều VSV, sự thông khí sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiếm phát. Bên cạnh đó, nhu cầu oxy của VSV trong các giai đoạn sinh trưởng cũng không giống nhau: trong thời kỳ đầu, sinh khối còn ít tốc độ hòa tan oxy lớn nên thông khí mạnh là tốt.[3] Như vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình lên men để có thể tối ưu hóa quá trình này nhằm tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sinh tổng hợp chất mong muốn.[3], [7] 1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 1.5.1. Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình lên men thường không bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường thấp.[3], [12]
- Xem thêm -