Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 52

  • Số trang: 59 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 63 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THANH TÂM GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 52.13 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI-2013 BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THANH TÂM GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 52.13 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: DS Tạ Thu Lan Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh & Sinh học HÀ NỘI-2013 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời c ảm ơn sâu sắc nhất đến cô giáo DS -Tạ Thu Lan người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thiện khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo , các cán bộ , kỹ thuật viên giảng dạy , công tác tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Bộ môn Công nghiệp dược trườ ng Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa vật liệu- khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợ i cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường. Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên , giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thứ c của bản thân có hạn, khóa luận không thể tránh khỏi nhiều thiếu sót . Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô , bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18, tháng 5, năm 2013. Sinh viên Nguyễn Thanh Tâm Mục lục ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .................................................................................. 2 1.1.Đại cương về kháng sinh .................................................................................. 2 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh ............................................................................ 2 1.1.2.Tiêu chuẩn đối với một kháng sinh.......................................................... 2 1.1.3.Đánh giá tác dụng: ................................................................................... 3 1.1.4 Phân loại kháng sinh ................................................................................ 3 1.1.5. Cơ chế tác dụng của kháng sinh.............................................................. 4 1.1.6.Các ứng dụng của kháng sinh .................................................................. 5 1.2.Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces ....................................................... 6 1.2.1.Đặc điểm hình thái: .................................................................................. 6 1.2.2.Đặc điểm sinh lý: ..................................................................................... 7 1.2.3.Đặc điểm cấu tạo: .................................................................................... 7 1.2.4.Khả năng tạo sắc tố: ................................................................................. 7 1.3.Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn ............................................ 8 1.3.1.Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên ............................. 8 1.3.2.Đột biến cải tạo giống .............................................................................. 8 1.3.3.Bảo quản giống xạ khuẩn ......................................................................... 9 1.4.Sự sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn ......................................................... 9 1.4.1 Sự hình thành KS ở xạ khuẩn .................................................................. 9 1.4.2.Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp KS ..................... 10 1.4.3.Lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces ............................. 11 1.5.Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ........................................ 12 1.5.1.Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh ........................................ 12 1.5.2.Các phương pháp chiết tách ................................................................... 13 1.6.Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ..................................................... 14 1.6.1.Phổ tử ngoại - khả kiến ........................................................................ 144 1.6.2.Phổ hồng ngoại....................................................................................... 14 1.6.3.Khối phổ ................................................................................................. 14 1.7. Một số kết quả nghiên cứu về KS ................................................................. 15 1.7.1.Ảnh hưởng của Panamycin - 607 lên các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp sản xuất bởi Streptomyces spp. ................................................................................. 155 1.7.2. Các polyene macrolid mới họ hàng với nystatin có vùng polyol cải biến thông qua công nghệ sinh tổng hợp S. noursei .................................................... 15 1.7.3.Acid pivalic- đơn vị khởi đầu trong sinh tổng hợp acid béo và kháng sinh ở Alicyclobacillus, Rhodococcus và Streptomyces ............................................ 166 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 177 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị ........................................................................... 177 2.1.1Nguyên vật liệu ..................................................................................... 177 2.1.2Máy móc thiết bị ................................................................................... 199 2.2 Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 20 2.2.1. Sàng lọc, cải tạo giống .......................................................................... 20 2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh.............................................................. 20 2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh tinh khiết thu được .... 20 2.3 Phương pháp thực nghiệm ............................................................................. 20 2.3.1Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn ............................................................. 20 2.3.2.Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán .............. 21 2.3.3.Phương pháp cải tạo giống ................................................................... 222 2.3.4.Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ..................................................... 244 2.3.5.Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ................... 255 2.3.6. Sơ bộ xác định thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng . 255 2.3.7. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay ................................ 266 2.3.8. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột ............................................ 266 2.3.9.Kết tinh lại KS...................................................................................... 277 2.3.10. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được................................. 277 Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.............................. 278 3.1.Nâng cao khả năng sinh tổng hợp KS của chủng Streptomyces 52.13........ 288 3.1.1.Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ................................................................ 288 3.1.2.Kết quả đột biến nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 52.13 ............................................................................................ 299 3.1.2.1.Đột biến bằng ánh sáng UV ................................................................ 29 3.1.2.2.Đột biến bằng hóa chất: .................................................................... 311 3.2.Kết quả chọn dung môi hữu cơ và pH chiết KS từ dịch lọc ........................ 322 3.3. Lên men dịch thể sinh tổng hợp kháng sinh ............................................... 333 3.3.1. Chọn môi trường lên men tốt nhất ...................................................... 333 3.3.2.Chọn biến chủng lên men tốt nhất: ...................................................... 333 3.4.Chiết xuất và bước đầu tinh chế chất kháng sinh từ dịch lên men .............. 344 3.4.1.Kết quả sắc ký lớp mỏng...................................................................... 344 3.4.2.Kết quả tinh chế kháng sinh bằng sắc ký cột ....................................... 355 3.4.3.Kết quả kết tinh: ..................................................................................... 40 3.4.4.Kết quả đo phổ xác định cấu trúc của KS tinh khiết.............................. 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................ 411 1.Kết luận: .......................................................................................................... 411 2.Kiến nghị ......................................................................................................... 422 Tài liệu tham khảo Phụ lục DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid 2’- deoxyribonucleic B.subtilis Bacillus subtilis ATCC 6633 CLNN Chọn lọc ngẫu nhiên CW Thành tế bào- Cell wall DM Dung môi DMHC Dung môi hữu cơ ĐB Đột biến Gr Gram IR Hồng ngoại- Infrared KS Kháng sinh L-DAP L- diaminopimelat MTdt Môi trường dịch thể P.mirabilis Proteus mirabilis BV 108 SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên TB Tế bào TĐC Trao đổi chất VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật UV Tử ngoại ultra violet DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các VSV kiểm định Bảng 2.2: Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 2.4: Các dung môi đã sử dụng Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 52.13 Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS đột biến bằng UV lần 1 Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến bằng UV lần 2 Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học Bảng 3.5: Kết quả chọn dung môi và pH chiết Bảng 3.6: Kết quả chọn môi trường lên men chìm Bảng 3.7: Kết quả chọn biến chủng lên men chìm tốt nhất Bảng 3.8: Kết quả chạy sắc kí lớp mỏng Bảng 3.9: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy sắc kí cột lần 1 Bảng 3.10: Kết quả sắc kí lớp mỏng các phân đoạn sau chạy sắc kí cột lần 1 Bảng 3.11: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 2 Bảng 3.12: Kết quả sắc kí các phân đoạn sau chạy sắc kí cột lần 2 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ KS chính Hình 1.2: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn Hình 1.3: Đường cong biểu diễn sự sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Sự phát hiện ra tác dụng của kháng sinh lần đầu tiên của nhà bác sĩ người Anh Alexander Flaming vào tháng 10 năm 1928 là một thành tựu vĩ đại của y học. Sự xuất hiện của kháng sinh đã giúp con người chống lại sự tấn công của các loài vi khuẩn nguy hiểm và làm giảm tỉ lệ tử vong cho người bệnh. Song, do bản năng sinh tồn, vi khuẩn luôn tìm mọi cách biến đổi để trở nên kháng thuốc. Một ví dụ điển hình có thể kể đến là việc vi khuẩn có thể tạo ra β- lactamase một loại enzym do vi khuẩn tiết ra có thể phá hủy cấu trúc của penicillin và vô hiệu hóa tác dụng kháng khuẩn của các kháng sinh có cấu trúc vòng β-lactam. Tốc độ biến đổi như vũ bão hiện nay của vi khuẩn có thể tạo ra hàng loạt các loại siêu vi khuẩn đa kháng thuốc khiến cho thế giới lâm vào tình trạng không có phương pháp cứu chữa cho nhiều loại bệnh.Chính vì vậy việc tìm ra, phát triển các loại kháng sinh mới có hoạt tính kháng khuẩn và hiệu quả điều trị cao đang là một vấn đề hết sức bức thiết của ngành công nghiệp kháng sinh hiện nay. Như chúng ta đã biết trong số các kháng sinh được biết đến hiện nay một tỉ lệ lớn đều có nguồn gốc từ xạ khuẩn. Bên cạnh đó theo các kết quả điều tra 65% kháng sinh nguồn gốc xạ khuẩn là do chi Streptomyces sản xuất ra. Đó là cơ sở để các nhà khoa học nước ta hiện nay tập trung nghiên cứu vào chi xạ khuẩn này. Tại bộ môn Vi sinh – sinh học trường đại học Dược Hà Nội chúng tôi đã chọn đề tài : “Góp phần vào nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 52.13”. Nội dung của khóa luận mong muốn đạt được các mục tiêu sau đây: - Nghiên cứu các biện pháp cải tạo giống Streptomyces 52.13 nhằm làm tăng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh. - Nghiên cứu điều kiện lên men, nuôi cấy và chiết xuất thích hợp. - Tìm điều kiện tinh chế KS thích hợp, bước đầu nghiên cứu cấu trúc của KS 2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1.Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của Penicillin notatum mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh. Năm 1938, Florey và Chain đã thực nghiệm penicillin trong điều trị. [6] Năm 1942, Waksman đưa ra định nghĩa: “Kháng sinh hay một chất có tính kháng sinh là một chất do các vi sinh vật sản xuất ra, có khả năng ức chế sự phát triển hoặc thậm chí tiêu diệt các vi khuẩn khác”. Năm 1950, Baron bổ sung giới hạn định nghĩa như sau: “Kháng sinh là những chất được tạo ra bởi cơ thể sống, có khả năng ức chế sự phát triển hay sự tồn tai của một hay nhiều chủng vi sinh vật ở nồng độ thấp”. [8] Nghiên cứu, sản xuất, sử dụng kháng sinh đã phát triển mạnh do tác dụng hơn hẳn trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn so với các thuốc kháng khuẩn khác. Hiện nay, giới khoa học quan niệm rằng: “Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật, …) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp”.[15] Cần phân biệt một số chất cũng do vi sinh vật tạo ra nhưng không được gọi là kháng sinh (rượu ethylic, các acid hữu cơ, …) vì chúng tác dụng lên vi sinh vật khác không mang tính chọn lọc và ở nồng độ cao. 1.1.2.Tiêu chuẩn đối với một kháng sinh Những yêu cầu của y học đối với 1 kháng sinh là: - Kháng sinh phải không độc hoặc rất ít độc với cơ thể. 3 Hoạt tính kháng khuẩn phải nhanh và mạnh đối với VSV gây bệnh. - Dễ hòa tan trong nước và bền vững khi bảo quản lâu dài. - Hoạt tính kháng khuẩn không bị giảm khi tiếp xúc với dịch cơ thể. [11] 1.1.3.Đánh giá tác dụng: Theo đơn vị tác dụng (IU) :thường dùng cho cá sản phẩm thiên nhiên và không tinh khiết. - Theo khối lượng chất chuẩn (g,mg..): thường dùng cho các chế phẩm bán tổng hợp và tinh khiết. [8] 1.1.4 Phân loại kháng sinh Có nhiều cách phân loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hóa học… Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì nó giúp cho người nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện khi biết được cấu trúc hóa học của nó, tránh lãng phí thời gian để nghiên cứu về các đặc điểm khác.[8] Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học thường chia ra các nhóm chất sau đây: - Các kháng sinh có cấu trúc β-lactamase + Penicillin: oxacillin, ampicillin.. + Cephalosporin: cephalexin, cefotaxim… + Các β-lactamase khác: carbapenem, chất ức chế β-lactamase - Các kháng sinh nhóm phenicol (chloramphenicol..) - Các kháng sinh có cấu trúc aminosid (streptomycin, gentamicin…) - Các KS nhóm lincosamid (lincomycin, clindamycin…) 4 - Các KS nhóm quinolon (acid nalidixic…) - Các KS nhóm Co – trimoxazol (co-trimoxazol..) - Các kháng sinh nhóm tetracycline (tetracycline…) - Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin…) - Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin…) - Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B…) - Các kháng sinh khác (rifapicin…) [8], [18] 1.1.5. Cơ chế tác dụng của kháng sinh Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh bằng cách gắn vào các vị trí chính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật, làm biến đổi các phản ứng đó. Mỗi nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau. Các kiểu chủ yếu: - Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào : ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn làm VK bị tiêu diệt. Một số KS như vancomcin, β- lactamase… tác dụng theo cơ chế này. - Tác dụng lên màng nguyên sinh chất: KS làm thay đổi tính thấm của màng dẫn đến làm rối loạn quá trình trao đổi chất giữa tế bào VK với môi trường làm VK bị tiêu diệt. - Tác dụng lên sự tổng hợp ADN: ức chế sự tổng hợp ADN từ quá trình sao chép và phiên mã. VD: actinomycin, rifampicin.. - Tác dụng lên sự tổng hợp protein: + Gắn vào tiểu đơn vị 30S hoặc 50S, làm gián đoạn quá trình tổng hợp protein có khả năng kìm hãm vi khuẩn. VD: Cloramphenicol, tetracycline macrolid và lincosamid… + Gắn vào tiểu đơn vị 30S của ribosom làm sai lệch quá trình tổng hợp protein có khả năng tiêu diệt VK. VD: các aminosid, spectinomycin… 5 - Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian: ức chế tổng hợp acid folic. VD: Co-trimoxazol. - Tác dụng lên hệ hô hấp [18] Hình sau đây giới thiệu sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính.[18] Hình 1.1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính 1.1.6.Các ứng dụng của kháng sinh - Trong y học: Kháng sinh được sử dụng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, nhiễm nấm và một số bệnh ung thư. - Trong chăn nuôi: Điều trị các bệnh nhiễm trùng ở động vật như dùng griseofulvin để điều trị viêm phổi cấp, viêm vú của trâu bò ; dùng cloramphenicol để điều trị các bệnh do Brucella gây ra. 6 - Trong nông nghiệp: Kháng sinh được sử dụng để diệt nấm, vi khuẩn, virus gây bệnh cho cây trồng: Validamycin dùng để diệt nấm Rhizostonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa rất hiệu quả. - Trong công nghiệp thực phẩm: Kháng sinh được dùng để bảo quản thực phẩm nhờ tác dụng tiêu diệt vi sinh vật có trong thực phẩm: kháng sinh subtilin (do Bacillus subtilis tạo ra), nisin (do Bacillus licheniformis tạo ra).[4], [7] 1.2.Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces 1.2.1.Đặc điểm hình thái: Streptmyces là 1 chi thuộc lớp phụ Actinomycetales, phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Nơi sống của các loài thuộc chi Streptomyces rất đa dạng (đất, thủy vực…). Chúng thuộc VK thật phát triển dạng sợi phân nhánh là các VK Gr(+), có tỉ lệ G+C>55% .[17] Hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khí sinh. + Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ. + Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí. Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện chuỗi bào tử. + Chuỗi bào tử (sợi bào tử) có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, sóng, móc câu, xoắn… Chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (ha).Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính.[7], [17] Hình 4 dưới đây thể hiện các loại khuẩn ty ở xạ khuẩn. [17] 7 `Hình 1.2: Các khuẩn ty ở xạ khuẩn 1.2.2.Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit. Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích của chúng là 2530°C, pH tối ưu thường là 6,8-7,5. [4], [7] 1.2.3.Đặc điểm cấu tạo: Cấu tạo của Streptomyces chia làm 3 phần: thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất. - Thành tế bào: dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10 – 20nm. Thành tế bào thuộc nhóm CW I, có chứa L – DAP và glycin. - Màng tế bào chất: dày 7,5 – 10 nm, không chứa cellulose và kitin. - Meosome: nằm phía trong tế bào chất hình phiến,bọng hay hình ống.[16] 1.2.4.Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid. [7] 8 1.3.Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 1.3.1.Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên VSV có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể có hoạt tính KS tăng 20 - 30 % so với những cá thể khác. Cần phải chọn cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp. [11] Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên cứu ban đầu, nó không có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo. 1.3.2.Đột biến cải tạo giống Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm: hóa học (ethylamine, acid nitrơ…), vật lí (UV, tia X…) và sinh học. Trong đó, các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết hầu hết các VSV. Những cá thể còn sống sót sẽ có sự ĐB gen, làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất khả năng tạo KS (đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên mạnh (ĐB dương). [4] - Đột biến bằng UV: Ánh sáng UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với các tế bào VSV có kích thước nhỏ thì tia UV có thể xuyên thấu tới vùng nhân. Tia UV có thể làm cho các base pyrimidin trên cùng 1 mạch của ADN hình thành các cấu trúc dimer T-T, C-C, T-C. Các dimer ảnh hưởng tới sự ghép đôi bổ sung trong sao chép để lại 1 vết khuyết trên mạch bổ sung gây ra ĐB gen.[14] - Đột biến bằng HNO2: Axit nitrơ là chất gây ĐB mạnh. Nó có tính oxy hóa mạnh làm loại nhóm amin (NH2) ra khỏi A, G và C. Phản ứng này làm thay đổi amino thành keto và làm thay đổi liên kết hydro của các base này. A sau loại amin có xu hướng liên kết 9 với C; C sau khi chuyển thành U có xu hướng liên kết với A; G chuyển thành xanthin nhưng xanthin vẫn liên kết với C nên trường hợp này không gây ĐB.[16] Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp với các phương pháp di truyền phân tử. 1.3.3.Bảo quản giống xạ khuẩn Mục đích: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ. Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV: cấy chuyền (bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường, định kỳ cấy chuyền sang môi trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng), đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh), đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp). Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh và định kỳ 6 tháng cấy lại 1 lần.[13] 1.4.Sự sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn 1.4.1 Sự hình thành KS ở xạ khuẩn Các nhà nghiên cứu hình thành lên nhiều quan điểm khác nhau về sự sinh tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn. Một số cho rằng sự hình thành KS là do sự cạnh tranh trong môi trường dinh dưỡng. Một số khác lại cho rằng việc hình thành KS giúp cho sự tồn tại của VK trong điều kiện sống khắc nghiệt. Tuy nhiên hầu hết đều đồng ý công nhận KS là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp, được hình thành vào cuối pha sinh trưởng đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng. Mặc dù KS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng nhưng quá trình tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định: 10 - KS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi phản ứng enzyme. - KS được hình thành từ 2 hoặc 3 chất chuyển hóa khác nhau. - KS được hình thành bằng con đường polymer hóa các chất chuyển hóa sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác. Hình dưới giới thiệu đường cong sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật trải qua 4 giai đoạn nối tiếp: pha tiềm tàng, pha lũy thừa, pha cân bằng và pha suy tàn.[11]. Hình 1.3: Đường cong biểu diễn sự sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn Một số chủng xạ khuẩn có thể tổng hợp được nhiều loại kháng sinh có cấu trúc và tác dụng tương tự nhau. Việc tổng hợp này do các cơ chế điều khiển đa gen, ngoài gen và các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzyme, cofactor qui định.[13], [15] 1.4.2.Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp KS a) Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy và chủng giống sử dụng[11], [24] - Nhiệt độ: nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp KS là 22 – 28ºC - pH môi trường: thường pH thích hợp nhất là pH trung tính. - Độ thông khí: xạ khuẩn là loài hiếu khí, cần đảm bảo thong khí tốt đặc biệt là ở giai đoạn nhân giống tức 6 – 12 giờ đầu của quá trình nuôi cấy. Nồng độ O2 thích hợp cho sinh tổng hợp KS là 2 – 8 ml O2 / 100ml. 11 - Tuổi giống: tuổi giống cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất sinh tổng hợp cao nhất là 36 – 72 giờ tuổi. Lượng giống 2 – 10 % b) Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men:[11] , [24] - Nguồn Carbon: có ý nghĩa hàng đầu trong sinh trưởng và hình thành KS. Nguồn carbon thường được sử dụng nhất là tinh bột. Tuy nhiên, tùy từng chủng khác nhau mà sử dụng các loại khác nhau. Có thể là: glucose, fructose…hoặc 1 số các loại acid hữu cơ hay chất béo khác. - Nguồn nitơ: gồm nitơ hữu cơ và vô cơ. Nguồn nitơ hữu cơ có thể là các hợp chất từ thực vật như bột đậu tương, cao ngô. Nguồn vô cơ thường là muối amoni. - Nguồn phosphate vô cơ : đóng vai trò là tác nhân điều hòa sự tổng hợp KS. Nồng độ thích hợp: 10mg/ml. - Các yếu tố vi lượng: Nếu môi trường lên men có nguồn gốc dinh dưỡng tự nhiên thì hầu hết các yếu tố vi lượng đều đã có sẵn không cần bổ sung thêm. Việc bổ sung thêm các hợp chất giàu yếu tố vi lượng vào môi trường sẽ làm thay đổi đáng kể khả năng sinh tổng hợp của KS của nhiều loại xạ khuẩn. 1.4.3.Lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces a.Định nghĩa: Lên men là quá trình phân giải hydratcarbon được tiến hành do hoạt động sống của VSV nhờ xúc tác của enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cần cho chúng.[5] , [12] b.Các phương pháp lên men - Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn hay thể lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi không khí để hô hấp trên bề mặt MT. + Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư trang thiết bị thấp. + Nhược điểm: diện tích sử dụng lớn, khó tự động hóa quy trình sản xuất, hiệu suất sử dụng thấp. - Phương pháp lên men chìm: VSV nuôi trong MT lỏng, phát triển 3 chiều.
- Xem thêm -