Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 155

  • Số trang: 56 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 32 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ HỮU NGHỊ GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 155.29 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ HỮU NGHỊ GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 155.29 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS. Bùi Quang Phúc ThS. Lê Thị Thu Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh& Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội Viện sốt rét -KST-CT TW HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Thạc sĩ Lê Thị Thu Hương và Tiến sĩ Bùi Quang Phúc đã tận t ình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thiện khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo , các cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy, công tác tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Bộ môn Công nghiệp dược trường Đại học Dược Hà Nội, Viện sốt rét KST-CT TW đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm. Cũng nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà N ội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường. Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên , giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn , khóa luận này còn có nhiều thiếu sót . Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô , bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15, tháng 5, năm 2013 Sinh viên Lê Hữu Nghị MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN ........................................................................... 2 1.1. Đại cương về kháng sinh ................................................................... 2 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh .............................................................. 2 1.1.2. Phân loại kháng sinh ................................................................. 2 1.1.3. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh .............................. 3 1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh ............................................... 4 1.1.5. Khái niệm về tính kháng kháng sinh ....................................... 5 1.1.6. Các ứng dụng của kháng sinh .................................................. 5 1.2. Đại cương về xạ khuẩn ..................................................................... 6 1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn ............................................ 6 1.2.2. Phân loại xạ khuẩn .................................................................... 6 1.2.3. Đặc điểm của xạ khuẩn chi streptomyces ................................. 7 1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn .......................... 8 1.3.1. Mục đích ..................................................................................... 8 1.3.2. Chọn chủng có HTKS cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên .. 8 1.3.3. Đột biến cải tạo giống ................................................................ 8 1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn ......................................................... 9 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh .................................................. 9 1.4.1. Khái niệm lên men ...................................................................... 9 1.4.2. Các phương pháp lên men ...................................................... 10 1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men................... 11 1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ...................... 11 1.5.1. Mục đích ................................................................................... 11 1.5.2. Các phương pháp chiết tách ................................................... 12 1.6. Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ................................. 13 1.6.1. Phổ hồng ngoại .......................................................................... 13 1.6.2. Phổ tử ngoại ............................................................................... 13 1.6.2. Phổ khối...................................................................................... 13 1.7. Một số nghiên cứu liên quan .......................................................... 14 1.7.1. Quy định phân tử của sinh tổng hợp kháng sinh trong Streptomyces ........................................................................................... 14 1.7.2. Một chủng đầy hứa hẹn của streptomyces sp. với những đặc điểm thúc đẩy tăng trưởng và quản lý dịch bệnh trong nông nghiệp .................................................................................................................14 1.7.3. Nghiên cứu mới trong sản xuất kháng sinh từ S. hygroscopius D1.5 ....... ................................................................................................. 15 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 16 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị ....................................................................... 16 2.1.1. Nguyên vật liệu ........................................................................... 16 2.1.2. Máy móc thiết bị ......................................................................... 18 2.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................... 19 2.2.1. Chọn lọc, cải tạo giống ............................................................... 19 2.2.2. Lên men, chiết tách kháng sinh tối thích ................................. 19 2.2.3. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được .... 20 2.3. Phương pháp thực nghiệm ............................................................... 20 2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn ................................................ 20 2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán ................................................................................................................. 20 2.3.3. Sàng lọc ngẫu nhiên .................................................................. 21 2.3.4. Đột biến ...................................................................................... 22 2.3.5. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh........................................ 23 2.3.6. Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men ............ 24 2.3.7. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ .... 24 2.3.8. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng ....................................................................................................25 2.3.9. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay ................ 26 2.3.10. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột .............................. 26 2.3.11. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được ................... 26 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT ................ 27 3.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ............................................................ 27 3.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 ................................................ 27 3.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 ................................................ 28 3.4. Kết quả đột biến cải tạo giống bằng phương pháp hóa học.......... 29 3.5. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh .................................... 30 3.5.1. Kết quả chọn môi trường lên men chìm ................................... 30 3.5.2. Kết quả chọn chủng lên men ..................................................... 31 3.6. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc ......................................................................... 32 3.7. Kết quả chọn dung môi và pH chiết ................................................ 33 3.8. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi ................................... 34 3.9. Kết quả sắc ký cột ............................................................................. 34 3.10. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy và biện giải phổ xác định sơ bộ các nhóm chức đặc trưng của kháng sinh thu được .............................. 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 37 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid 2’- deoxyribonucleic CW Thành tế bào- Cell wall DMHC Dung môi hữu cơ ĐB1 Đột biến 1 ĐB2 Đột biến 2 Gr Gram IR Hồng ngoại- Infrared ISP Chương trình Streptomyces quốc tế- International Streptomyces Project KS Kháng sinh MS Phổ khối- Mass Spectrometry MT Môi trường MT2dt Môi trường dịch thể 2 SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên TB Tế bào TĐC Trao đổi chất VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật UV Tử ngoại- Ultraviolet DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Phân loại các chất kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học. Bảng 2.1: Các vi khuẩn kiểm định. Bảng 2.2: Các MT nuôi cấy xạ khuẩn. Bảng 2.3: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định. Bảng 2.4: Các dung môi đã sử dụng. Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên. Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1. Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2 Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS đột biến hóa học. Bảng 3.5: Kết quả chọn môi trường lên men (trên P.mirabilis). Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men chìm. Bảng 3.7: Ảnh hưởng của pH đến độ bền kháng sinh (trên P.mirabilis). Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền kháng sinh (trên P.mirabilis). Bảng 3.9: Kết quả chọn dung môi và pH chiết (trên P.mirabilis ). Bảng 3.10: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký. Bảng 3.11: Kết quả chạy sắc kí cột lần 1 (trên P.mirabilis ). Bảng 3.12: Kết quả chạy sắc kí cột lần 2 (trên P.mirabilis ). Bảng 3.13: Phổ IR. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp sản xuất kháng sinh. Hình 2: Khuẩn lạc xạ khuẩn. Hình 3: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn. Hình 4: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn. Hình P1: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch. Hình P2: Thử HTKS bằng phương pháp giếng thạch. Hình P3: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Hình P4: Phát hiện vết sắc ký bằng phương pháp hiện hình VSV. Hình P5: Tinh chế kháng sinh bằng sắc ký cột. Hình P6: Phổ tử ngoại của kháng sinh. Hình P7: Phổ hồng ngoại của kháng sinh. Hình P8: Phổ khối (MS). 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Lượng thuốc kháng sinh mà các quốc gia trên thế giới sử dụng trong thời gian qua đã tăng mạnh. Dù Bộ Y tế của nhiều quốc gia đã ban hành những quy định cụ thể nhằm hạn chế việc lạm dụng thuốc kháng sinh nhưng thị trường thuốc kháng sinh của thế giới vẫn liên tục phát triển. Thị trường thuốc kháng sinh của Việt Nam không nằm ngoài quy luật này. Nhu cầu sử dụng cao dẫn đến việc sử dụng kháng sinh tràn lan, khó kiểm soát đã dẫn đến tình trạng kháng thuốc của các vi sinh vật gây bệnh, thuốc kháng sinh mất dần tác dụng đang ngày trở nên nghiêm trọng, trong khi lại có quá ít các loại thuốc thay thế. Vì vậy việc nghiên cứu tìm ra kháng sinh mới, các kháng sinh có hoạt tính cao, độc tính thấp, ít bị kháng khuốc là vấn đề được các nhà khoa học trên thế giới và trong nước quan tâm. Hiện nay xu hướng trên thế giới là tìm kiếm kháng sinh mới có nguồn gốc từ vi sinh vật, như tìm kiếm kháng sinh mới dưới lòng đại dương của các nhà khoa học Scotland, hay từ các loài nấm rừng của các nhà khoa học Mỹ và Hà Lan,…hay là từ chi xạ khuẩn Streptomyces loài vi sinh vật thường sống ở đất, chúng cũng sản xuất hơn một nửa số thuốc kháng sinh của thế giới và đó là những sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế (như : thuốc kháng sinh, thuốc chống nấm, thuốc chống ung thư, thuốc ức chế miễn dịch,…) . Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 155.29” làm khóa luận tốt nghiệp. Khóa luận mong muốn đạt được các mục tiêu sau đây: - Nghiên cứu các biện pháp nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh thu được. - Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, lên men, chiết tách kháng sinh tối thích. - Nghiên cứu một vài đặc tính của kháng sinh đã sinh tổng hợp được. 2 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1. Đại cương về kháng sinh 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh [18], [21], [22] Có nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh. Theo nghĩa hẹp: Kháng sinh là những hợp chất hóa học do vi sinh vật tiết ra có tác dụng ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chọn lọc một nhóm vi sinh v ật xác định (vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, protozoa, virus…) hay cả tế bào ung thư, ở nồng độ thấp. Theo nghĩa rộng: Kháng sinh phải bao hàm cả các chất tổng hợp bằng hóa học có tác dụng diệt khuẩn như các dẫn chất quinolon (pefloxacin, norfloxacin…). Cần phân biệt một số chất cũng do vi sinh vật tạo ra nhưng không được gọi là kháng sinh (rượu ethylic, các acid hữu cơ, …) vì chúng tác dụng lên vi sinh vật khác không mang tính chọn lọc và ở nồng độ cao. 1.1.2. Phân loại kháng sinh [2], [3], [4], [8] Có nhiều cách khác nhau để phân loại các kháng sinh : Phân loại theo nguồn gốc (kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên , kháng sinh bán tổng hợp ), theo phổ tác dụng (phổ rộng hay chọn lọc), theo cơ chế tác dụng (ức chế tổng hợp vách t ế bào, tác dụng lên quá trình tổng hợp protein, ức chế tổng hợp acid nhân, thay đổi tính thấm màng tế bào, ức chế tổng hợp acid folic), theo cấu trúc hóa học… Song cách phân loại KS theo cấu trúc hóa học là khoa h ọc nhất vì nó giúp cho các nhà nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện khi biết được công thức hóa học của nó. Các chất kháng sinh được phân loại theo cấu trúc hóa học (bảng 1). 3 Bảng 1: Phân loại các chất kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học Phân loại Nhóm kháng sinh Kháng sinh cụ thể Aminoglycosid Streptomycin, neomycin 1. KS có chứa đường trong Orthosomycin Everninomycin phân tử N-glycosid Streptothrinin C-glycosid Vancomycin Glycolipid Moenomycin KS macrolid Erythromycin 2. KS chứa vòng lacton lớn KS polyen Candicidin, nystatin (macrocyclic lacton) Asamycin Rifamycin Macrotetrolid Tetralactin Anthracyclin Adriamycin 3. Quinon và các KS cùng Naphthoquinon Actinortidin họ Benzoquinon Mitomycin Các tetracyclin Tetracyclin, terramycin Dẫn xuất aminoacid Cycloserin KS β-lactam Penicilin, cephalosporin 4. Các KS amino acid và KS peptid Bacitracin, polymycin peptid Chromopeptid Actinomycin Depsipeptid Valinomycin 5. KS dị vòng chứa N Các KS nucleotid Polyoxin 6. KS dị vòng chứa O Các KS polyether Mononsin 7. Các KS nhân thơm Dẫn xuất benzen Chloramphenicol Các ether thơm Novobiocin 1.1.3. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh [3], [8], [21] Các bước cơ bản trong quá trình lên men sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn được thể hiện trong hình 1 dưới đây. 4 Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm Nhân giống trong phòng thí nghiệm Nhân giống trên thiết bị nhân giống Lên men tạo kháng sinh Dịch lên men Lọc, ly tâm Sinh khối Dịch lọc Chiết bằng dung môi hữu cơ Dùng cột trao đổi ion… Dịch chiết sinh khối Dịch chiết Cô, tinh chế Sản phẩm tinh chế Kiểm nghiệm Sản phẩm đã được kiểm nghiệm Đóng gói Sản phẩm đóng gói Hình 1: Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp sản xuất kháng sinh 1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh [16], [22] Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh bằng cách gắn vào các vị trí chính xác hay các phân 5 tử đích của tế bào vi sinh vật, làm biến đổi các phản ứng đó. Mỗi nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau. Có 6 kiểu chủ yếu: • Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào • Tác dụng lên màng nguyên sinh chất • Tác dụng lên sự tổng hợp ADN • Tác dụng lên sự tổng hợp protein • Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp • Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian 1.1.5. Khái niệm về tính kháng kháng sinh [22] Kháng thuốc là hiện tượng vi sinh vật mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó trong một thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hóa trị liệu. Có 2 kiểu kháng thuốc: kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc mới nhận. Kháng thuốc tự nhiên là đặc trưng của từng nòi sinh vật nhất định đối với một số kháng sinh nhất định nào đó. Kháng thuốc mới nhận có thể do thay đổi tính thấm thành tế bào, do các enzyme vô hiệu hóa kháng sinh, thay đổi phân tử đích hoặc do hoạt hóa các con đường trao đổi chất thay thế khác mà hoạt chất không tác dụng. 1.1.6. Các ứng dụng của kháng sinh [8], [21] • Trong lĩnh vực y học : Kháng sinh dùng để điều trị các bệnh do vi khuẩn , nấm gây ra. Ngày nay, một số kháng sinh còn được dùng trong điều trị bệnh ung thư. • Ngoài lĩnh vực y học, kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau: - Trong chăn nuôi: Bác sĩ thú y dùng kháng sinh để chữa bệnh cho động vật: Griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh còn được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn, tăng sản lượng trứng ở gà, vịt. - Trong trồng trọt: Kháng sinh được sử dụng để diệt nấm, vi khuẩn, virus gây bệnh cho cây trồng: Validamycin dùng để diệt nấm Rhizostonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa rất hiệu quả. 6 - Trong công nghiệp thực phẩm: Kháng sinh được dùng để bảo quản thực phẩm nhờ tác dụng tiêu diệt vi sinh vật có trong thực phẩm: kháng sinh subtilin (do Bacillus subtilis tạo ra), nisin (do Bacillus licheniformis tạo ra). 1.2. Đại cương về xạ khuẩn [4], [5], [9], [22] Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong tự nhiên, là các vi khuẩn Gram dương, có tỷ lệ G+C>55%. Trong mỗi gam đất nói chung thường có chứa hàng triệu xạ khuẩn. Đại đa số các xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo sợi dạng phân nhánh. Do có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng nên các xạ khuẩn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu rất nhiều. Trong số hơn 16.000 kháng sinh hiện đã được biết trên thế giới thì khảng 60% là do xạ khuẩn tạo ra. Xạ khuẩn còn được sử dụng để sản xuất nhiều loại enzyme (amylase, celllulase, protease…), cũng như các hợp chất khác. 1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn [22] Xạ khuẩn thuộc nhóm các vi khuẩn thật nhưng phát triển thành dạng sợi, hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ. (Hình 2) Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong Hình 2: Khuẩn lạc xạ khuẩn khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3 μm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết sức phong phú: da cam, đen, đỏ, nâu, trắng, vàng, xám… 1.2.2. Phân loại xạ khuẩn [6], [22] Có nhiều khóa phân loại xạ khuẩn đ ã được các nhà KH nghiên cứu phát triển để phân loại xạ khuẩn , phải kể đến khóa phân loại của Waksman , khóa phân loại Krassilnhikov, khóa phân loại của Gauze…Các khóa phân loại chia lớp xạ khuẩn (Actinomycetes) thành bộ Actinomycetales và các VSV giống xạ khuẩn . Bộ 7 Actinomycetales được chia thành các họ : Actinoplanaceae, Actinomycetaceae, Streptomycetaceae, Mocromonosporaceae, Nocardiaceae… Xạ khuẩn được phân loại sơ bộ theo hình 3. Actinomycetes Actinomycetales Actinoplanaceae Streptomycetaceae Streptoverticulum Streptomyces VSV giống xạ khuẩn Actinomycetaceae Themostreptomyces … … Hình 3: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn Khóa phân loại Streptomyces thuộc chương trình Streptomyces quốc tế (ISP) do Shirling và Gotlieb đề xuất năm 1970 được sử dụng rộng rãi để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces trong họ Streptomycetaceae. Trong khóa phân loại nà y, các đặc trưng phân loại được sử dụng bao gồm : màu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ chất , sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan , hình dạng chuỗi bào tử , bề mặt bào tử , khả năng tiêu thụ các nguồn carbon. 1.2.3. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces [5], [7], [22] Các loại xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 55% là từ Streptomyces. Đặc điểm hình thái: Hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh: Khuẩn ty cơ chất: Mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ. 8 Khuẩn ty khí sinh: Do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí. Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào từ. Chuỗi bào tử (sợi bào tử) có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, sóng, móc câu, xoắn… Chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (ha). Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit. Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích của chúng là 25-30°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5. Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid. 1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 1.3.1. Mục đích [8], [13] Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên (bùn, đất, nước, mô thực vật…) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp thấp. Do đó, để thu được các chủng có HTKS cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp. 1.3.2. Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên [13], [21] Các vi sinh vật có sự biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh tăng lên 20-30 % so với những cá thể khác. Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp. Trong thực tế, việc chọn lọc tự nhiên các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên cứu ban đầu, nó không có giá trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo. 1.3.3. Đột biến cải tạo giống [8], [10] Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm: 9 Tác nhân hóa học: 5-bromouracil, ethylenimin, 2-aminopurin, dimethylsulfat, hydroxylamin… Tác nhân vật lý: Ánh sáng UV, tia X, tia α hay tia β. Tác nhân vật lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ. Tác nhân sinh học: Tác nhân sinh học các Tn, bacteriophage Mu,… Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết hầu hết các vi sinh vật. Những cá thể nào còn sống sót sẽ có sự đột biến gen, làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất khả năng tạo kháng sinh (đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến dương). Để tạo ra các chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp giả hữu tính, kỹ thuật tách dòng gen, kỹ thuật tạo và dung hợp tế bào trần. 1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn [8], [12], [15] Bảo quản giữ giống VSV là một việc cần thiết do các giống rất dễ bị thoái hóa, nhầm lẫn, mất mát nếu không được lưu giữ một cách khoa học. Mục đích cụ thể là: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ. Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV: bảo quản lạnh - cấy chuyền (bảo quản lạnh trong lọ hoặc ống môi trường, định kỳ cấy chuyền sang môi trường mới), làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng), đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh), đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp). Để giữ giống xạ khuẩn trong phňng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh và định kỳ 2-3 tháng cấy lại 1 lần. 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1. Khái niệm lên men [8], [22] 10 Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của vi sinh vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho chúng. Kháng sinh là một trong những sản phẩm của quá trình lên men xạ khuẩn. Cụ thể hơn, kháng sinh là sản phẩm trao đổi bâc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn, thường vào gần hoặc vào chính pha cân bằng. Hình 4 : Giới thiệu đường cong sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật trải qua 4 giai đoạn nối tiếp: pha tiềm tàng, pha lũy thừa, pha cân bằng và pha suy tàn. Hình 4: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn 1.4.2. Các phương pháp lên men [3], [8] Phương pháp lên men bề mặt: MT dùng trong phương pháp này ở thể rắn hay thể lỏng tùy loài VSV. VSV hấp thu dinh dưỡng từ MT và sử dụng oxi không khí để hô hấp trên bề mặt MT. Phương pháp này tuy có ưu điểm là thao tác đơn giản, không đòi hỏi thiết bị quá tân tiến nhưng lại có nhược điểm là tốn mặt bằng, hiệu suất sử dụng môi trường thấp, khó tự động hóa. Do đó, ngày nay chỉ sử dụng phương pháp lên men bề mặt trong chọn giống và giữ giống. Phương pháp lên men chìm: VSV được nuôi trong MT lỏng, phát triển cả 3 chiều nên khắc phục được tất cả các nhược điểm kể trên của lên men bề mặt nhưng đòi hỏi đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn.
- Xem thêm -