Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces

  • Số trang: 58 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 26 |
  • Lượt tải: 0
minhtuan

Đã đăng 15929 tài liệu

Mô tả:

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THU HIỀN GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 173.113 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THU HIỀN GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 173.113 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Giáo viên hướng dẫn: Ths.VÕ THỊ THU THỦY Nơi thực hiện: Bộ môn VI SINH – SINH HỌC Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2013 Lời cảm ơn Tôi xin gửu lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô giáo Ths. Võ Thị Thu Thủy – người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên đang giảng dạy và làm việc tại bộ môn Vi sinh - Sinh học trường đại học Dược Hà nội đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi làm khóa luận tại bộ môn. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường. Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình, bạn bè đã động viên,giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Do thời gian thực nghiệm hạn hẹp, điều kiện trang thiết bị, phương tiện nghiên cứu cũng như trình độ của bản thân còn hạn chế, khóa luận này không tránh khỏi còn nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô và bạn bè để khóa luận này có thể được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Lê Thị Thu Hiền MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ...........................................................................................................1 Chương 1: TỔNG QUAN..………………………………………………………..2 1.1 Đại cương về kháng sinh …..………………………………………………2 1.1.1 Lược sử phát triển của kháng sinh ……………….…………………..2 1.1.2 Định nghĩa, phân loại kháng sinh ……………………………………2 1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh …………………………………….4 1.1.4 Sơ đồ tổng quát quá trình sản xuất kháng sinh ……………….……...5 1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh ………………………………….……6 1.2 Đại cương về xạ khuẩn .…………………………………………….……...6 1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn ………………………………………...7 1.2.2 Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces………………………………7 1.3 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn …………………….….9 1.3.1 Mục đích ……………………………………………………………..9 1.3.2 Chọn chủng có hoạt tính kháng sinh cao bằng SLNN ………….……9 1.3.3 Đột biến cải tạo giống …………………………….………………….9 1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn …………………………….……………..10 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh ……………………………………..11 1.4.1 Khái niệm lên men ………………………………………………….11 1.4.2 Các phương pháp lên men ………………………………………….11 1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men …………………….12 1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men ...…………………..13 1.6 Phương pháp quang phổ xác định cấu trúc kháng sinh..………………14 1.6.1 Phổ tử ngoại – khả kiến..……………………………………………14 1.6.2 Phổ hồng ngoại………..…………………………………………….14 1.6.3 Khổi phổ (MS)………………………………………………………15 1.7 Một số kết quả nghiên cứu về kháng sinh …………………………….....15 1.7.1 Ảnh hưởng của mức độ oxy hòa tan trên sản xuất dạng viên Rapamycin từ Streptomyces hygroscopicus ……………………....15 1.7.2 Tối ứu hóa chuyển đổi của Streptomyces sp. ATCC 39.366 sản xuất Leptomycin bởi electroporation …………………………………….16 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……..………..17 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị ....…………………………………………….17 2.1.1 Nguyên vật liệu ………………………………………………………17 2.1.2 Máy móc và thiết bị ………………………………………………….19 2.2 Nội dung nghiên cứu …………………………………………..………….19 2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống ………………………………………………...19 2.2.2 Lên men, tách chiết kháng sinh ………………………………………..20 2.2.3 Sơ bộ xác định tính chất kháng sinh thu được …………………………20 2.3 Phương pháp thực nghiệm …………………………………………….….20 2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn ……………………………………….20 2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán ………...20 2.3.3 Sàng lọc ngẫu nhiên ……………………………………………………21 2.3.4 Phương pháp đột biến ………………………………………………….22 2.3.5 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh ……………………………………23 2.3.6 Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc kí lớp mỏng …………24 2.3.7 Thu kháng sinh thô bằng cất quay chân không ………………………...25 2.3.8 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc kí cột ……………………………….25 2.3.9 Sợ bộ xác định kháng sinh thô bằng sắc kí cột ………………………...26 Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT…………………….27 3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên ……………………………………….…...27 3.2 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 ………………………….………...27 3.3 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 ………………………….………...28 3.4 Kết quả đột biến cải tạo giống lần 3 ……………………………………29 3.5 Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh ……………..…….……….30 3.6 Kết quả chọn chủng lên men ……………………………………….…...31 3.7 Kết quả sắc kí lớp mỏng chọn hệ dung môi ………………………..…32 3.8 Kết quả sắc kí cột …………………………………………….…………32 3.9 Kết quả đo phổ của kháng sinh tinh khiết …………………………….38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1 Kết luận ………………………………………………………………….…...40 2 Kiến nghị …………………………………………………..…………………40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT S.A Staphylococcus aureus P. mirabilis Proteus mirabilis ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic DMHC Dung môi hữu cơ ĐB1 Đột biến lần 1 ĐB2 Đột biến lần 2 G (-) Gram âm G (+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh IR Hồng ngoại - Infrared KS Kháng sinh MC Mẫu chứng MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên TB Tế bào TĐC Trao đổi chất UV Tử ngoại – Ultraviolet VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học .................................... 3 Bảng 2.1: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn ........................................................ 17 Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định ............................................. 18 Bảng 2.3: Các dung môi đã sử dụng ...................................................................... 18 Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên ................................................ 27 Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1 .......................................................... 28 Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2 .......................................................... 28 Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS đột biến lần 3 .......................................................... 29 Bảng 3.5: Kết quả chọn môi trường lên men ......................................................... 30 Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men .................................................................31 Bảng 3.7: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký ................................................. 32 Bảng 3.8: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1..................... 33 Bảng 3.9: Kết quả SKLM các phân đoạn lần1 (hiện hình bằng P. mirabilis) ....... 34 Bảng 3.10: Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 2................... 35 Bảng 3.11: Kết quả SKLM các phân đoạn lần 2 (hiện hình bằng P. mirabilis) .... 36 Bảng 3.12: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau chạy cột lần 3 ......... 37 Bảng 3.13: Kết quả SKLM các phân đoạn lần 3 (hiện hình bằng P. mirabilis) .... 38 Bảng 3.14: Biện giải các nhóm chức của phổ IR ................................................... 39 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Kháng sinh được phát hiện qua các năm (Hopwood,2007) .................... 2 Hình 1.2: Vị trí tác dụng của một số chất kháng sinh ............................................. 4 Hình 1.3: Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh ....................................................... 6 Hình 1.4: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn ....................................................................... 8 Hình 1.5: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn ……………………..13 Hình 3.1: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 1 trên P.mirabilis…………..34 Hình 3.2: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 2 trên P.mirabilis ………….35 Hình 3.3: Đường biểu diễn HTKS của chạy cột lần 3 trên P.mirabilis ………….36 Hình P1: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch. Hình P2: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Hình P3: Phát hiện viết sắc ký bằng phương pháp hiện hình VSV. Hình P4: Sắc kí lớp mỏng. Hình P5: Sắc kí cột. Hình P6: Phổ hồng ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được. Hình P7: Phổ khối của kháng sinh tinh khiết thu được. Hình P8 : Phổ tử ngoại của kháng sinh tinh khiết thu được. ĐẶT VẤN ĐỀ Tác dụng của kháng sinh được phát hiện năm 1928 và Penicillin được sử dụng vào năm 1943, từ khi ra đời, kháng sinh đã mở ra một kỷ nguyên mới trong lịch sử ngành y – dược. Nhờ có nhóm thuốc này mà con người đã dự phòng và điều trị được các bệnh nhiệm khuẩn, nhiễm nấm ,ung thư … Không dừng lại ở đó, ngày nay phạm vi điều trị của kháng sinh còn đang được mở rộng trong cả điều trị ung thư và HIV/AIDS cũng cho nhiều kết quả khả quan. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh tràn lan và không đúng cách làm cho tình trạng kháng kháng sinh xuất hiện và ngày càng trở nên nghiêm trọng. Vì vậy, việc tìm ra kháng sinh mới là điều cần thiết và được cả thế giới quan tâm. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của nhiều ngành khoa học khác giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng kháng sinh đạt được nhiều thành tựu. Do đó, việc nghiên cứu để phát hiện ra kháng sinh mới có nguồn gốc từ vi sinh vật vẫn là đề tài thu hút các nhà khoa học Trong khoảng 15.000 chất kháng sinh được biết đến hiện nay thì có 55% có nguồn gốc từ xạ khuẩn và 75% số đó thuộc chi Streptomyces. Đây là cơ sở để tôi lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 173.113” làm khóa luận tốt nghiệp. Bởi vậy, trong khóa luận này tôi mong muốn đạt được các mục tiêu sau đây: - Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh - Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tốt nhất. - Sơ bộ xác định một số tính chất lý, hóa của kháng sinh thu được. Chương 1 : TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu kháng sinh Tháng 10 – 1928 bác sỹ, nhà sinh vật học người Scotland – Alexander Fleming lần đầu tiên phát hiện ra vòng vô khuẩn kháng sinh và kháng sinh Penicillin được dùng điều trị và thử nghiệm đầu tiên vào những năm 1940. Ngay sau đó, penillin trở thành một kháng sinh nổi tiếng vì đã cứu sống nhiều chiến binh trong chiến tranh thế giới thứ II. Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960, nhiều KS mới được xác định hầu hết từ các xạ khuẩn, và đó là thời kỳ “ vàng son” của hóa liệu pháp KS( Hình 1.1) Hình 1.1: Kháng sinh được phát hiện qua các năm (Hopwood, 2007) Việc phát hiện, phát triển và sử dụng KS trong điều trị ở thế kỷ 20 đã làm giảm đáng kể tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn. Tuy nhiên từ những từ 1980 số kháng sinh mới được đưa vào điều trị giảm hẳn do chi phí cho việc phát triển và thử nghiệm thuốc mới ngày càng lớn. Bên cạnh đó, một hiện trang đáng báo động là ngày càng tăng số lượng VSV gây bệnh kháng với các kháng sinh hiện có. Hiện nay, việc kháng của VK phải được khắc phục bằng việc phát hiện ra thuốc mới. Bên cạnh con đường nghiên cứu tìm kiếm các kháng sinh mới có nguồn gốc tự nhiên thì công nghệ lên men sản xuất kháng sinh cũng ra đời và dần hoàn thiện. Đồng thời, việc tổng hợp, bán tổng hợp kháng sinh từ những khung hóa học sẵn có cũng đạt được những thành tựu đáng kể với sự xuất hiện của cloramphenicol và cephalosporin… 1.1.2 Định nghĩa, phân loại kháng sinh  Định nghĩa Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ VSV hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật …) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp. [11]  Phân loại kháng sinh Có nhiều cách phân loại KS: Theo nguồn gốc, theo cơ chế tác dụng…Tuy nhiên phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì người nghiên cứu có thể nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện khi biết được cấu trúc hóa học của nó. [11]  Phân loại KS theo cấu trúc hóa học thường chia ra các nhóm cấu trúc được trình bày trong bảng 1 Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa học [11, 18] NHÓM KS KS cụ thể β-lactam Penicillin, Cephalexin… Phenicol Cholaramphenicol... Aminosid Steptomycin, Tobramycin… Macrolid Erythromycin, Clarithromycin… Lincosamid Lincomycin, Lindamycin… Tetracyclin Tetracyclin, Doxycyclin Peptid Vancomycin, Polymycin… Quinolon Floxacin, Levofroxacin… Cotrimoxazol Cotrimoxazol… 1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh Cơ chế tác dụng lên VSV gây bệnh của mỗi chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc bản chất của kháng sinh đó. (Hình 1.2) Hình 1.2 : Vị trí tác dụng chính của một số chất kháng sinh Các kháng sinh tác dụng chủ yếu qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp khác nhau của tế bào VSV gây bệnh bằng cách gắn vào receptor trên tế bào VSV, làm biến đổi phản ứng sinh hóa trong tế bào VSV đó. Mỗi nhóm kháng sinh tác dụng lên các đích khác nhau. [18]  Có 6 kiểu chủ yếu: [18] - Tác dụng lên việc tổng hợp thành tế bào. - Tác dụng lên màng nguyên sinh chất. - Tác dụng lên sự tổng hợp AND. - Tác dụng lên sự tổng hợp protein. - Tác dụng lên sự trao đổi hô hấp. - Tác dụng lên sự trao đổi chất trung gian. 1.1.4 Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh Giới thiệu tổng quát sơ đồ tổng hợp lên men sản xuất kháng sinh trong hình 1.3. [11] Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm Bình nhân giống quy mô phòng thí nghiệm Bình nhân giống trên thiết bị nhân giống Bình lên men tạo kháng sinh Dịch lên men Sinh khối Dịch lọc Sinh khối thô Dịch chiết kháng sinh Dịch chiết sinh khối Dịch chiết đậm đặc Sản phẩm tinh chế Sản phẩm tinh chế Sản phẩm đã kiểm nghiệm Sản phẩm được đóng gói Hình 1.3: Sơ đồ quá trình sản xuất kháng sinh 1.1.5 Các ứng dụng của kháng sinh Ngoài lĩnh vực y học, kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau [11]:  Trong lĩnh vực y học: Kháng sinh dùng để chữa các bệnh do vi khuẩn, vi nấm gây ra. Ngày nay, một số kháng sinh còn dùng chữa bệnh trong ung thư.  Ngoài lĩnh vực y học: kháng sinh còn được sử dụng trong các lĩnh vực khác. Trong chăn nuôi: Bác sĩ thú y dùng kháng sinh dùng để chữa bệnh cho động vật: Griseoviridin điều trị viêm phổi cấp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh còn được sử dụng như chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn, tăng sản lượng trứng ở gà, vịt[11]. Trong trồng trọt: Kháng sinh đã được sử dụng để tiêu diệt các bệnh của cây trồng do vi khuẩn, virus, nấm gây ra.Ví dụ: Vandamycin dùng để diệt nấm Rhidoctonia solani gây bệnh khô vằn hại lúa rất hiệu quả [11].… Trong công nghiệp thực phẩm: KS cũng được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm để bảo quản thực phẩm đóng hộp giúp giảm thời gian khử trùng bằng nhiệt, nhiệt độ khử trừng giảm xuống là cho chất lượng sản phẩm tốt hơn, các vitamin không bị phá hủy, hương vị ít bị biến đổi. Ví dụ: kháng sinh subtilin (do Bacillus subtilis tạo ra), nisin (từ Bacillus licheniformis). [11]. 1.2 Đại cương về xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomcetes) là những VK thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh có G + C > 55%. [4, 18] Xạ khuẩn có thể sinh tổng hợp được nhiều sản phẩm TĐC quan trọng như KS, vitamin, acid hữu cơ, các enzym....nên được các nhà khoa học nghiên cứu rất nhiều. [7, 19] 1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Xạ khuẩn thuộc nhóm các vi khuẩn thật nhưng phát triển thành dạng sợi, hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn lạc xạ khuẩn khá đặc biệt: không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà thường có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ. [7, 19] Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng 0,3-1,0 μm đến 2-3 μm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết sức phong phú: vàng, xám, da cam, đen đỏ, nâu, trắng … [7] Actinomycetes Actinomycetales Actinoplanaceae Streptoverticulum Streptomycetaceae Streptomyces VSV giống xạ khuẩn Actinomycetaceae … Themostreptomyces … Hình 1.4: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn 1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces Các loại xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có hơn 55% là do Streptomyces. Bên cạnh những đặc điểm chung của xạ khuẩn, Streptomyces cũng có những đặc điểm riêng:  Đặc điểm hình thái: Khuẩn lạc xạ khuẩn là tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ. Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ. Hệ sợi khuẩn lạc có cả khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty cơ chất: Mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi. Khuẩn ty khí sinh: Do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí. Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử. [7] Chuỗi bảo tử (sợi bào tử ) có rất nhiều hình dạng khác nhau : thẳng, sóng, móc câu, xoắn…chuỗi bào tử phân cắt tạo thành các bào tử trần, là sơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn, nhẵn, xù xì da cóc, có gai hoặc có tóc. [7, 12]  Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột, khử nitrat thành nitrit. Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích của chúng là 2530°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5.[7, 12]  Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid. [7, 12]  Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces Có khá nhiều khóa phân loại Streptomyces: Khóa phân loại của Waksman, khóa phân loại của Gauze,…Khóa phân loại Streptomyces thuộc chương trình Streptomyces quốc tế (ISP) do Shirling và Gottlieb đề xuất năm 1970 đã được sử dụng rộng rãi để phân loại các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Khóa phân loại này dựa trên các đặc điểm sau: - Màu của khuẩn lạc. - Màu của khuẩn ty cơ chất. - Sắc tố melanoid, sắc tố hòa tan. - Hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử. - Khả năng tiêu thụ nguồn hydratcarbon. 1.3 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 1.3.1 Mục đích Các VSV thuần chủng được phân lập từ các nguồn tự nhiên ( bùn, đất, nước, mô thực vật…) thường có HTKS không cao, hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh thấp . Do đó, để thu được các chủng có HTKS và hiệu suất sinh tổng hợp cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn lọc giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy, bảo quản thích hợp.[11,15] 1.3.2 Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên Các VSV có sự đột biến tự nhiên với tần số khoảng 10-10 -10-5 trong ống giống thuần khiết tạo ra các biến chủng khác nhau . Trong đó có biến chủng có HTKS mạnh hơn 20-30 % những cá thể khác. Cần phải chọn lấy cá thể có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp. [11,15] 1.3.3 Đột biến cải tạo giống Trong thực tế, việc sàng ngẫu nhiện các cá thể có HTKS cao chỉ để nghiên cứu ban đầu, nó không có giả trị áp dụng vào sản xuất. Để thu được những chủng có khả năng siêu tổng hợp kháng sinh, người ta áp dụng các phương pháp đột biến nhân tạo.[ 11 ]  Phương pháp: Các tác nhân gây đột biến có thể được chia làm 3 nhóm: • Tác nhân hóa học: ethylenimin, acid nitrơ (HNO2), hydroxylamin, dimethylsulphat… • Tác nhân vật lý: - Ánh sáng UV, tia X, tia hay electron. - Tác nhân vật lý hay được dùng nhất là ánh sáng tử ngoại (UV). Ánh sáng UV có khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào VSV có kích thước nhỏ thì nó có thể xuyên thấu tới màng nhân. - Khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ. - Một đặc điểm trong tác động của tia UV là hiện tượng quang phục hoạt (photoreactivation): Sau khi chiếu tia UV lên tế bào nếu để ngoài ánh sáng thường thì các tổn thương do tia UV gây ra phần lớn được phục hồi. • Tác nhân sinh học: Các transposons, phage Mu. Sau khi chịu tác động của các tác nhân đột biến , phần lớn các VSV ch ết. Trong số các biến chủng sống sót có biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp KS tăng (đột biến dương ), có biến chủng có hiệu suất giảm (đột biến âm ). Cần chọn lọc ra những biến chủng có hiệu suất sinh KS tăng để nghiên cứu tiếp.[ 11 ] 1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn Bảo quản giữ giống VSV là một việc cần thiết do các giống rất dễ bị thoái hóa, nhầm lẫn, mất mát nếu không được lưu giữ một cách khoa học. Mục đích cụ thể là: giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ. [14, 16] Thông thường, có thể sử dụng 4 phương pháp sau để bảo quản các chủng VSV: - Cấy chuyền (bảo quản trong lọ hoặc ống môi trường, định kỳ cấy chuyền sang môi trường mới), - Làm khô (trộn tế bào VSV với giá mang và làm khô ở nhiệt độ phòng) - Đông khô (phân tán tế bào VSV trong MT chất bảo quản rồi đông lạnh, làm khô mẫu đông lạnh) - Đông lạnh (huyền dịch tế bào trong chất bảo quản được đông lạnh nhanh và bảo quản ở nhiệt độ thấp).[14, 16] Để giữ giống xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm, cách đơn giản nhất là nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 20C và định kỳ 3 - 6 tháng cấy lại 1 lần.[14, 16] 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1 Khái niệm lên men Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của vi sinh vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho chúng [4,7,11] Nuôi cấy VSV để tĩnh hoặc lắc sinh học hay trong bình lên men trong môi trường dịch thể ( lên men chìm ) là các hệ thống đảm bảo sinh trưởng, phát triển của VSV phát triển theo 4 pha đặc thù là pha lag ( pha tiềm tang ), pha log ( pha lũy thừa ), pha cân bằng và pha suy tàn. Kháng sinh là sản phẩm bặc 2, tạo ra lúc kết thúc quá trình sinh trưởng, vào pha cân bằng [11, 7] Hình 1.5: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn 1.4.2 Các phương pháp lên men  Lên men bề mặt : Trong phương pháp này , vi sinh vật được nuôi cấy trên bề mặt cơ chất rắn, bán rắn hoặc lỏng.  Ưu điểm: Thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, không đòi hỏi thiết bị phức tạp.
- Xem thêm -