Tài liệu Giám sát sự lưu hành của virus cúm a h5n6 trên đàn gia cầm sống tại một số chợ của tỉnh quảng ninh và ứng dụng phương pháp real time rt pcr trong chẩn đoán bệnh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦM THỊ THANH VÂN GIÁM SÁT SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM A/H5N6 TRÊN ĐÀN GIA CẦM SỐNG TẠI MỘT SỐ CHỢ CỦA TỈNH QUẢNG NINH VÀ ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP REAL TIME RT– PCR TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Thái Nguyên - 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦM THỊ THANH VÂN GIÁM SÁT SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM A/H5N6 TRÊN ĐÀN GIA CẦM SỐNG TẠI MỘT SỐ CHỢ CỦA TỈNH QUẢNG NINH VÀ ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP REAL TIME RT – PCR TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH Ngành: Thú y Mã ngành: 8.64.01.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Người hướng dẫn khoa học: TS. La Văn Công Thái Nguyên - 2020 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: Các kết quả nghiên cứu trong luận văn là do tôi trực tiếp nghiên cứu dưới sự hướng dẫn của TS. La Văn Công, và sự giúp đỡ chân tình của các, anh chị, em: phòng Dịch tễ, Chi cục Thú y vùng II Hải phòng, Chi cục Chăn nuôi và Thú y tỉnh Quảng Ninh... Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, khách quan, được rút ra từ tình hình thực tế tại tỉnh Quảng Ninh trong những năm qua và chưa hề được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, tháng 9 năm 2020 Tác giả luận văn Trầm Thị Thanh Vân ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt 2 năm học tập, với nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của nhiều cá nhân và tập thể, đến nay luận văn của tôi đã được hoàn thành. Nhân dịp này, cho phép tôi được tỏ lòng biết ơn và cảm ơn chân thành tới: TS. La Văn Công - Khoa chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Người thầy mẫu mực, tận tình và chu đáo đã luôn cổ vũ tinh thần, động viên, hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Bộ phận quản lý sau Đại học, khoa Chăn nuôi - Thú y, các thầy cô giáo đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi học tập, tiếp thu kiến thức của chương trình học. Các cán bộ thuộc phòng Dịch tễ, Chi cục Thú y vùng II Hải Phòng. Ban Lãnh đạo và toàn thể cán bộ Chi cục Chăn nuôi và Thú y, đồng nghiệp đang làm việc trong lĩnh vực Chăn nuôi - Thú y của tỉnh Quảng Ninh. Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân cùng bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu, thực hiện đề tài. Một lần nữa tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn, cảm ơn chân thành tới những tập thể, cá nhân đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học tập. Thái Nguyên, tháng 9 năm 2020 Tác giả luận văn Trầm Thị Thanh Vân iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. ii MỤC LỤC .................................................................................................................. iii DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ................................................................ vi DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ vii DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ viii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................. 1 2. Mục tiêu của đề tài .......................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ......................................................................... 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 1.1. Cơ sở khoa học của vấn đề nghiên cứu .......................................................... 3 1.1.1. Khái niệm bệnh cúm gia cầm .................................................................... 3 1.1.2. Lịch sử bệnh cúm gia cầm......................................................................... 3 1.1.3. Đặc điểm sinh học của virus cúm type A .................................................. 5 1.1.4. Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm .................................................................. 9 1.1.5. Triệu chứng, bệnh tích của bệnh cúm gia cầm........................................ 12 1.1.6. Chẩn đoán bệnh ....................................................................................... 13 1.1.7. Hoạt động giám sát cúm gia cầm tại Việt Nam ...................................... 14 1.1.8. Nguyên lí phản ứng Real time PCR ........................................................ 16 1.2. Tổng quan kết quả nghiên cứu trên thế giới ................................................. 18 1.3. Tổng quan kết quả nghiên cứu ở việt nam .................................................... 22 Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 25 2.1. Đối tượng, phạm vi ....................................................................................... 25 2.1.1. Đối tượng................................................................................................. 25 2.1.2. Phạm vi .................................................................................................... 25 2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 26 iv 2.2.1. Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ của bệnh cúm gia cầm ở tỉnh Quảng Ninh giai đoạn 2015 – 6/2020 ........................................................ 26 2.2.2. Tình hình tiêm vacxin cúm A/H5N1 của tỉnh Quảng Ninh .................... 26 2.2.3. Nghiên cứu lưu hành virus cúm A/H5N6 tại các chợ gia cầm sống ....... 26 2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 27 2.3.1. Phương pháp điều tra dịch tễ học ............................................................ 27 2.3.2. Phương pháp phân tích dịch tễ học ......................................................... 27 2.3.3. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản ......................................................... 27 2.3.4. Phương pháp nghiên cứu lưu hành virus cúm A/H5N6 tại các chợ gia cầm sống và kỹ thuật chẩn đoán bệnh cúm gia cầm trong phòng thí nghiệm bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ............................................ 28 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................. 30 3.1. Kết quả nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ của bệnh cúm gia cầm ở tỉnh Quảng Ninh giai đoạn 2015 – 6/2020. ................................................................. 30 3.1.1. Sự phân bố bệnh cúm gia cầm và type/subtype gây bệnh tại các huyện, thành, thị của tỉnh Quảng Ninh từ năm 2015 - 6/2020 .......................... 30 3.1.2. Tình hình dịch cúm gia cầm tại Quảng Ninh giai đoạn 2015 – 6/2020 .. 35 3.1.3. Tỷ lệ mắc bệnh cúm gia cầm theo mùa ................................................... 38 3.1.4. Tỷ lệ mắc bệnh cúm gia cầm theo loại gia cầm ...................................... 41 3.1.5. Tỷ lệ mắc bệnh cúm gia cầm theo phương thức chăn nuôi ..................... 43 3.2. Tình hình tiêm vacxin cúm A/H5N1 của tỉnh Quảng Ninh .......................... 48 3.2.1. Kết quả tiêm phòng vacxin cúm cho đàn gia cầm của tỉnh Quảng Ninh năm 2019 .................................................................................................. 48 3.2.2. Kết quả tiêm phòng vacxin cúm cho đàn gia cầm của tỉnh Quảng Ninh nửa đầu năm 2020 .................................................................................... 48 3.2.3. Tình hình tiêm vacxin cúm A/H5N1 tại một số huyện, thị, thành phố của tỉnh Quảng Ninh ......................................................................................... 50 3.3. Nghiên cứu lưu hành virus cúm A/H5N6 tại các chợ gia cầm sống............. 52 3.3.1. Kết quả lấy mẫu tại các chợ .................................................................... 52 3.3.2. Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A trong các mẫu giám sát ........................... 54 v 3.3.3. Tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype H5 trong các mẫu giám sát ................... 56 3.3.4. Tỷ lệ nhiễm virus cúm subtype N6 trong các mẫu giám sát ................... 57 3.3.5. Lưu hành virus cúm A/H5N6 qua các vòng lấy mẫu .............................. 57 3.3.6. Lưu hành virus cúm A/H5N6 tại các chợ lấy mẫu .................................. 60 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 66 1. Kết luận ............................................................................................................ 66 2. Đề nghị ............................................................................................................. 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 68 vi DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Từ viết tắt Dịch nghĩa AI : Avian Influenza BNNPTNT : Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn DNA : Acid Deoxyribo Nucleic GP : Glycoprotein HA : Hemagglutination HEF : Hemagglutinin Esterase Fusion HI : Hemagglutination Inhibition HPAI : Highly pathogenic avian influenza LPAI : Low pathogenic avian influenza M : Matrix NA : Neuraminidase OIE : Office International des Epizooties PB1 : Polymerase basic protein 1 PB2 : Polymerase basic protein 2 PBS : Phosphate Buffered Saline PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic Acid RNP : Ribonucleoprotein TP : Thành phố TT TP : Trung tâm Thành phố WHO : World Health Organization vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Tóm tắt các chủng virus cúm gia cầm tại Việt Nam, 2003 - 2019 .................. 15 Bảng 3.1. Sự phân bố bệnh cúm gia cầm và type/subtype gây bệnh tại Quảng Ninh giai đoạn 2015 – 6/2020 ......................................................... 32 Bảng 3.2. Tỷ lệ gia cầm mắc bệnh chết và tiêu hủy do cúm gia cầm từ tại Quảng Ninh giai đoạn 2015 – 6/2020 ......................................................... 36 Bảng 3.3. Tỷ lệ mắc bệnh cúm theo mùa .................................................................. 38 Bảng 3.4. Tỷ lệ mắc bệnh cúm theo loại gia cầm ..................................................... 41 Bảng 3.5. Tỷ lệ mắc bệnh cúm gia cầm theo phương thức chăn nuôi ...................... 44 Bảng 3.6. Tỷ lệ mắc bệnh cúm theo quy mô đàn gia cầm ........................................ 46 Bảng 3.7. Kết quả tiêm phòng vacxin cúm cho đàn gia cầm của tỉnh Quảng Ninh năm 2019 ................................................................................ 48 Bảng 3.8. Kết quả tiêm phòng vacxin cúm cho đàn gia cầm của tỉnh Quảng Ninh nửa đầu năm 2020 ................................................................... 49 Bảng 3.9. Kết quả tiêm phòng vacxin cúm A/H5N1 tại một số huyện của tỉnh Quảng Ninh .......................................................................................... 51 Bảng 3.10. Kết quả lấy mẫu tại các chợ .................................................................... 53 Bảng 3.11. Tỷ lệ nhiễm virus cúm type A trong các loại mẫu ................................. 54 Bảng 3.12. Tỷ lệ nhiễm virus cúm Subtype H5 trong các loại mẫu ......................... 56 Bảng 3.13. Lưu hành virus cúm A/H5N6 qua các tháng lấy mẫu ............................ 57 Bảng 3.14. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A giữa các chợ lấy mẫu ..................................... 61 Bảng 3.15. Tỷ lệ nhiễm virus cúm Subtype H5 giữa các chợ lấy mẫu ..................... 63 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc bên ngoài của virus cúm gia cầm ................................................. 6 Hình 2.1. Bản đồ thể hiện các chợ buôn bán gia cầm sống được lấy mẫu theo không gian ........................................................................................ 25 Hình 3.1. Bản đồ sự phân bố dịch cúm gia cầm và type/subtype gây bệnh tại Quảng Ninh 2015 - 6/2020 .................................................................. 31 Hình 3.2. Sự phân bố bệnh cúm gia cầm tại Quảng Ninh giai đoạn 2015 – 6/2020............... 34 Hình 3.3. Biểu đồ tỷ lệ mắc và tiêu hủy do bệnh cúm gia cầm ................................ 37 Hình 3.4. Biểu đồ tỷ lệ mắc bệnh cúm gia cầm theo mùa ........................................ 39 Hình 3.5. Biểu đồ tỷ lệ mắc bệnh cúm gia cầm theo loại gia cầm ............................ 43 Hình 3.6. Biểu đồ tỷ lệ mắc bệnh cúm gia cầm theo phương thức chăn nuôi................ 44 Hình 3.7. Biểu đồ tỷ lệ mắc bệnh cúm theo quy mô đàn gia cầm ............................ 47 Hình 3.8. Kết quả tiêm phòng vacxin cúm A/H5N1 tại 3 huyện,thị/TP có các chợ tiến hành lấy mẫu trong năm 2019 – 6/2020 ............................... 52 Hình 3.9. So sánh tỷ lệ mắc cúm A giữa các loại mẫu ............................................. 55 Hình 3.10. Lưu hành virus cúm A/H5N6 qua các tháng lấy mẫu ............................. 59 Hình 3.11. Lưu hành virus cúm A tại các chợ lấy mẫu ............................................ 62 Hình 3.12. Lưu hành virus cúm A/H5N6 tại các chợ lấy mẫu.................................. 64 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Quảng Ninh nằm trong dải hành lang biển lớn của Bắc Bộ, có mạng lưới đường bộ, đường sắt và cảng biển lớn đang được mở rộng và phát triển. Phía Đông Bắc giáp Trung Quốc, có đường biên giới dài khoảng 132,8 km, phía Nam giáp vịnh Bắc Bộ, có chiều dài bờ biển 250 km; phía Tây Nam giáp thành phố Hải Dương, phía Tây Bắc giáp các tỉnh Lạng Sơn và Bắc Giang. Do tiếp giáp với Trung Quốc nên việc vận chuyển động vật, sản phẩm động vật diễn ra khá sôi động và khó kiểm soát. Đặc biệt, hiện tượng nhập lậu gia cầm (gà mái đẻ loại thải) với giá rẻ vào Quảng Ninh để tiêu thụ. Mặt khác, Quảng Ninh là tỉnh có ngành du lịch phát triển, mật độ dân số khá đông, nhu cầu tiêu thụ thịt gia cầm ngày càng tăng, trong khi đó ngành chăn nuôi gia cầm chưa đáp ứng cho nhu cầu tiêu thụ của tỉnh. Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ thịt gia cầm tỉnh Quảng Ninh vẫn phải nhập từ tỉnh ngoài vào cho nên nguy cơ bùng phát dịch bệnh cúm gia cầm trên địa bàn tỉnh là rất cao. Ngày nay, bệnh cúm gia cầm đã và đang xảy ra khắp nơi trên thế giới, gây thiệt hại lớn về mặt kinh tế, chính trị, xã hội và là mối quan tâm đáng lo ngại của toàn cầu. Từ khi dịch xuất hiện đến nay đã có 75 quốc gia và vùng lãnh thổ thế giới xuất hiện dịch khiến hàng trăm triệu gia cầm ốm chết, phải tiêu hủy và đã có 455 người tại 16 quốc gia chết vì H5N1, 7/24 ca chết vì H5N6, 623/1625 ca chết vì H7N9 (bao gồm cả 3 trường hợp người Trung Quốc đến Ca-na-đa và Ma-lai-xi-a thì phát bệnh) (Cục thú y, 2019). Tháng 4 năm 2014, virus cúm H5N6 được phát gây bệnh trên gia cầm và gây chết người tại tỉnh Tứ Xuyên-Trung Quốc và đã có 6 người chết do H5N6 trong tổng số 10 ca mắc. Tháng 8 năm 2014, Cục Thú y cũng lần đầu tiên phát hiện cúm A/H5N6 trên lãnh thổ Việt Nam, cụ thể ở tỉnh Lạng Sơn và tỉnh Hà Tĩnh. Trước đó, chủng virus này đã được phát hiện ở vịt trời và chim hoang dã tại Thuỵ Điển, Đức, Mỹ, Trung Quốc. Đáng lo ngại là kết quả giải trình tự gen của các mẫu virus cúm A/H5N6 phát hiện ở Việt Nam cho thấy có sự tương đồng đến 99% về kiều gen với chủng virus cúm A/H5N6 gây tử vong đầu tiên trên người tại Trung Quốc (Cục thú 2 y 2014). Từ đó đến nay, virus cúm A/H5N6 tiếp tục được phát hiện tại nhiều tỉnh trong cả nước trong đó có các tỉnh Hải Phòng, Lạng Sơn, Quảng Ninh và các tỉnh khác như: Lào Cai, Ninh Bình, Quảng Trị, Quảng Nam, Tuyên Quang, ... Dịch cúm xảy ra trên địa bàn tỉnh Quảng Ninh trong những năm vừa qua mặc dù là những ổ dịch nhỏ lẻ, tuy nhiên năm nào cũng xảy ra gây ảnh hưởng không nhỏ đến tình hình phát triển kinh tế nông nghiệp và du lịch của địa phương. Ở nước ta chợ buôn bán gia cầm sống rất phổ biến, người dân có thói quen mua gia cầm sống và giết mổ tại chợ. Gia cầm đến từ nhiều nguồn khác nhau và có nhiều loài gia cầm khác nhau được bán tại chợ. Nơi bán và giết mổ cùng một chỗ, không được vệ sinh tiêu độc khử trùng thường xuyên, người buôn bán, người mua tiếp xúc trực tiếp với gia cầm do đó nguy cơ virus cúm gia cầm nói chung và virus cúm A/H5N6 nói riêng từ gia cầm xâm nhập và lây nhiễm cho người là rất cao. Nhận thấy, virus cúm A/H5N6 có độc lực cao, có khả năng lây lan nhanh và nguy hiểm có khả năng lây trực tiếp sang người, vì vậy tôi tiến hành thực hiện đề tài:“Giám sát sự lưu hành virus cúm A/H5N6 trên đàn gia cầm sống tại một số chợ của tỉnh Quảng Ninh và ứng dụng phương pháp Real time RT – PCR trong chẩn đoán bệnh” 2. Mục tiêu của đề tài - Xác định sự lưu hành của virus cúm A/H5N6 ở tỉnh Quảng Ninh - Ứng dụng phương pháp Real time RT – PCR trong chẩn đoán bệnh 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn * Ý nghĩa khoa học Các kết quả nghiên cứu tại tỉnh Quảng Ninh nhằm cung cấp, bổ sung và hoàn thiện các thông tin về bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam. * Ý nghĩa thực tiễn - Là cơ sở để biết thêm về dịch tễ học của bệnh, đồng thời đánh giá công tác kiểm soát giết mổ và vệ sinh phòng bệnh. - Đưa ra khuyến cáo hợp lý trong phương pháp lấy mẫu xét nghiệm, hỗ trợ chẩn đoán bệnh nhanh và chính xác về bệnh cúm gia cầm H5N6. 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cơ sở khoa học của vấn đề nghiên cứu 1.1.1. Khái niệm bệnh cúm gia cầm Cúm gia cầm (Avian Influenza – AI) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính ở gia cầm, do nhóm virus cúm typ A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Đây là nhóm virus có biên độ vật chủ rộng, được phân chia thành nhiều subtype khác nhau dựa trên hai kháng nguyên bề mặt capsid của hạt virus là HA và NA (De Wit, 2008). Nhóm virus cúm A có 16 subtype HA (từ H1 đến H16) và 9 subtyp NA (từ N1 đến N9). Sự tổ hợp giữa các subtype HA và NA sẽ tạo ra nhiều subtyp khác nhau. Mặt khác, virus cúm A có đặc tính quan trọng là dễ dàng đột biến trong gen/hệ gen (đặc biệt ở gen NA và HA) hoặc trao đổi các gen với nhau, trong quá trình xâm nhiễm và tồn tại lây truyền giữa các loài vật chủ, dẫn đến việc tạo nên nhiều subtype có độc tính và khả năng gây bệnh khác nhau (Nguyễn Bá Hiên và cs, 2014). Trong những năm gần đây, dịch cúm gia cầm chủng độc lực cao (HPAI – Highly Pathogenic Avian Influenza) xuất hiện và đã giết chết hàng chục triệu gia cầm trên thế giới, đồng thời khiến hàng tỷ gia cầm khác phải tiêu hủy bắt buộc để tránh lây lan, gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi. Bệnh cúm gia cầm HPAI là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, có tốc độ lây lan rất nhanh với tỷ lệ chết cao trong đàn gia cầm nhiễm bệnh. Virus gây bệnh cúm gia cầm chủ yếu là loại H5, H7 và H9, gây bệnh cho gà, vịt, ngan, ngỗng, đà điểu, các loại chim. Virus còn gây bệnh cho cả người và có thể gây thành đại dịch, vì thế bệnh cúm gia cầm đang ngày càng trở nên nguy hiểm hơn bao giờ hết (Lê Văn Năm, 2004), (Cục Thú y, 2005). 1.1.2. Lịch sử bệnh cúm gia cầm Năm 412 trước công nguyên, Hippocrate đã mô tả về bệnh cúm. Năm 1680 một vụ đại dịch cúm đã được mô tả kỹ và từ đó đến nay đã xảy ra 31 vụ đại dịch. Trong hơn 100 năm qua đã xảy ra 4 vụ đại dịch cúm vào các năm 1889, 1918, 1957 và 1968 (Cục Thú y, 2004). 4 Năm 1878, ở Italy đã xảy ra một bệnh gây tử vong rất cao ở đàn gia cầm và được gọi là bệnh dịch tả gia cầm (Fowl plague), bệnh lần đầu tiên được Porroncito mô tả và ông nhìn nhận một cách sáng suốt rằng tương lai sẽ là một bệnh quan trọng và nguy hiểm. Năm1901, Centanni và Savunozzi đã đề cập đến ổ dịch này và xác định được căn nguyên siêu nhỏ qua lọc (Filterable agent) là yếu tố gây bệnh. Đến năm 1955, Achafer đã xác định được căn nguyên gây bệnh thuộc nhóm virus cúm type A thông qua kháng nguyên bề mặt là H7N1 và H7N7 gây chết nhiều gà, gà tây và chim hoang ở Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Châu Phi, Trung Cận Đông (Lê Văn Năm, 2004). Năm 1963, virus cúm type A được phân lập từ gà tây ở Bắc Mỹ do loài thuỷ cầm di trú dẫn nhập virus vào đàn gà. Cuối thập kỷ 60, phân type H1N1 thấy ở lợn và có liên quan đến những ổ dịch ở gà tây. Mối liên hệ giữa lợn và gà tây là những dấu hiệu đầu tiên về virus cúm ở động vật có vú có thể lây nhiễm và gây bệnh cho gia cầm. Những nghiên cứu đều cho rằng virus cúm typ A phân type H1N1 đã ở lợn và truyền cho gà tây, ngoài ra phân type H1N1 ở vịt còn truyền cho lợn. Sự lây nhiễm từ chim hoang dã sang gia cầm đã có bằng chứng từ trước năm 1970, nhưng chỉ được công nhận khi xác định được tỷ lệ nhiễm virus cúm cao ở một số loài thuỷ cầm di trú. Sau khi phát hiện ra virus cúm type A, các nhà khoa học thấy rằng virus cúm có ở nhiều loài chim hoang dã và gia cầm nuôi ở những vùng khác nhau trên thế giới. Bệnh xảy ra nghiêm trọng nhất với gia cầm thuộc phân type H5 và H7 như ở Scotland năm 1959 là H5N1, ở Mỹ năm 1983 - 1984 là H5N2 (Cục Thú y, 2004). Năm 1971, Beard đã mô tả khá kỹ virus gây bệnh và đặc điểm bệnh lý lâm sàng của gà trong các ổ dịch cúm gà, gà tây khá lớn xảy ra ở Mỹ mà chủng gây bệnh là H7N1. Từ năm 1960 - 1979 bệnh được phát hiện ở Canada, Mehico, Achentina, Braxin, Nam Phi, ý, Pháp, Anh, Hà Lan, Australia, Hồng Kông, Nhật Bản, các nước vùng Trung Cận Đông, các nước thuộc liên hiệp Anh và Liên Xô. Các công trình nghiên cứu có hệ thống về bệnh cúm gia cầm lần lượt được công bố ở Australia (1975), ở Anh (1979), ở Mỹ (1983-1984), ở Ailen (1983-1984) về đặc điểm sinh học, bệnh học và dịch tễ học, các phương pháp chẩn đoán miễn dịch và biện pháp phòng chống bệnh (Đào Yến Khanh, 2005). 5 Đến nay, dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở khắp các châu lục với mức độ ngày càng nguy hiểm hơn đối với các loài gia cầm và sức khoẻ của cộng đồng, đã thôi thúc Hiệp hội các nhà chăn nuôi gia cầm tổ chức hội thảo chuyên đề về bệnh cúm gà. Hội thảo lần đầu tiên tổ chức vào năm 1981, lần thứ 2 tại Ailen năm 1987, lần thứ 3 cũng tại Ailen năm 1992. Từ đó đến nay trong các hội nghị về dịch tễ trên thế giới, bệnh cúm gia cầm luôn là một trong những nội dung được coi trọng. 1.1.3. Đặc điểm sinh học của virus cúm type A 1.1.3.1. Đặc điểm cấu trúc chung của virus thuộc họ Orthomyxoviridae Virus thuộc họ Orthomyxoviridae có đặc tính cấu trúc chung là hệ gen chứa axit ribonucleic (ARN) một sợi, có cấu trúc là sợi âm được ký hiệu là ss (-) ARN (Negative Single Stranded RNA). Sợi âm ARN của hệ gen có độ dài từ 10.000 15.000 nucleotit (tùy theo loại virus), mặc dù nối với nhau thành 1 sợi ARN liên tục, nhưng hệ gen lại chia thành 6 - 8 phân đoạn (segment), mỗi phân đoạn là một gen chịu trách nhiệm mã hóa cho mỗi loại protein của virus. Hạt virus (virion) có cấu trúc hình khối, đôi khi có dạng hình khối kéo dài, đường kính khoảng 80 - 120 nm. Vỏ virus có bản chất protein, có nguồn gốc từ nguồn tế bào mà virus đã gây nhiễm, bao gồm một số protein được glycosyl hóa (glycoprotein) và một số Protein dạng trần không được glycosyl hóa (non glycosylated protein). Protein bề mặt có cấu trúc từ các loại glycoprotein, đó là những gai, mấu có độ dài 10 - 14 nm, đường kính 4 - 6 nm. Nucleocapsid bao bọc lấy nhân virus là tập hợp của nhiều protein phân đoạn, cấu trúc đối xứng xoắn, kích thước 130 - 150 nm, tạo vòm (loop) ở giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và liên kết với nhau qua cầu nối các peptit. Phân tử lượng của hạt virus vào khoảng 250 triệu dalton (Muphy, 1996; Lê Thanh Hòa, 2004). 1.1.3.2. Đặc điểm sinh học phân tử của virus cúm gia cầm Hình thái và cấu trúc của virus cúm gia cầm type A được Kawaoka và Murphy (1988) mô tả khá chi tiết. Qua kính hiển vi điện tử, virus có dạng hình khối tròn, hình trứng hoặc dạng khối dài, đường kính khoảng 80 – 120 nm. Nhiều khi virus có dạng hình sợi dài tới vài µm. Phân tử lượng của hạt virus vào khoảng 250 triệu Dalton Vỏ virus có chức năng bao bọc và bảo vệ vật chất di truyền RNA củavirus, bản chất cấu tạo là màng lipit kép, có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được đặc 6 hiệu hóa gắn vào các protein màng của virus. Trên bề mặt có khoảng 500 “gai mấu” nhô ra và phân bố dày đặc, mỗi gai mấu dài khoảng 10-14 nm có đường glycoprotein gồm: HA, NA, MA (matrix) và các dấu ấn khác của virus (Bender và cs., 1999; Zhao và cs., 2008). Có sự phân bố không đồng đều giữa các phân tử NA và HA (tỷ lệ khoảng 1NA/4HA), đây là 2 loại protein kháng nguyên có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus ở tế bào cảm nhiễm (Murphy và Webster, 1996; Uiprasertkul và cs., 2007). Hình 1.1. Cấu trúc bên ngoài của virus cúm gia cầm (Nguồn: http://micro.magnet.fsu.edu/cells/viruses/influenzavirus.html) 1.1.3.3. Kháng nguyên của virus cúm gia cầm Virus cúm type A được xác định subtype dựa trên cơ sở kháng nguyên (protein) bề mặt là HA (Hemagglutinin – viết tắt là H) và NA (Neuraminidase – viết tắt là N) có vai trò quan trọng trong miễn dịch bảo hộ. Hemagglutinin được coi là yếu tố vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus cúm A. Các loại protein kháng nguyên: Protein nhân (NP), protein đệm (matrix protein - M1), protein bề mặt (HA), protein enzyme cắt thụ thể (NA) là những protein kháng nguyên được nghiên cứu nhiều nhất. Một trong những đặc tính kháng nguyên quan trọng của virus cúm là khả năng gây ngưng kết hồng cầu của nhiều loài động vật mà thực chất là sự kết hợp giữa 7 mấu lồi kháng nguyên HA trên bề mặt của virus với thụ thể có trên bề mặt hồng cầu làm cho hồng cầu ngưng kết với nhau tạo mạng ngưng kết qua các cầu nối virus. Từ đặc tính kháng nguyên này có thể sử dụng các phản ứng ngưng kết hồng cầu HA và phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu HI trong chẩn đoán cúm gia cầm. Theo Ito T. and Kawaoka Y. (1998): Sự phức tạp trong diễn biến kháng nguyên mà virus cúm có được là do sự biến đổi và trao đổi kháng nguyên trong nội bộ gene và giữa gene hemagglutinin (HA) và gene neutraminidase (NA). 1.1.3.4. Thành phần hóa học của virus ARN của virus cúm type A chiếm từ 0,8 - 1,1%; protein chiếm 70 - 75%; lipit chiếm 20 - 24%; hydratcacbon chiếm 5 - 8% khối lượng hạt virus. Lipit tập trung ở màng virus và chủ yếu là lipit có gốc phospho, số còn lại là cholesterol, glucolipit và một ít hydratcacbon gồm các loại men galactose, ribose, fructose, glucosamin. Thành phần protein chính của virus chủ yếu là glycoprotein (Lê Văn Năm, 2004). 1.1.3.5. Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ Virus cúm A/H5N1 kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhânlên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm (Murphy và Webster, 1996; Nicholson và cs., 2003), có những nét đặc trưng như sau: - Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp của HA và thị thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, và cuối cùng là giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm. - Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trong nguyên sinh chất), và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzyme neuraminidae. Thời gian một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus mới của virus cúm chỉ khoảng và giờ (trung bình 6h). Sự tạo thành các hạt virus mời không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quá trình chết theo chương trình (apopyosis) làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ (Wanasawaeng và cs., 2009; Tumpey và cs., 2002). 8 - Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen củavirus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các RNA vận chuyển phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA transcription). Phức hợp protein – RNA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào (Beard, 1998). Hình 1.2. Mô hình cơ chế xâm nhiễm và nhân lên virus cúm A ở tế bào chủ (Nguồn: Beard, 1998) Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp các sợi dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-poymerase. Các sợi này không được Adenine hóa (gắn thêm các Adenine – gắn mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp vớinucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bao tường tế bào. Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10 – 20 nucleotide Adenin ở đầu 5’-, sau đó được vận chuyển ra bào tương và dich mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các proteincủa virus. - Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, goi là hiện tượng “nảy chồi” của virus. NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân lên tế bào để kết hợp với RNA thành RNP của virus. Sau cùng các RNP của virus được hợp nhất với cùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi liên 9 kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid. Các NA phân cắt các liên kết này và giải phòng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác (Murphy và Webster, 1996; Nayak và cs., 2004). 1.1.3.6. Độc lực và khả năng gây bệnh của virus cúm gia cầm Theo quy định của tổ chức y tế thế giới (WHO), tổ chức thú y thế giới (OIE), virus cúm gia cầm chia thành 3 loại: - Loại virus có độc lực cao: Nếu 10 ngày sau tiêm tĩnh mạch cho gà phải làm chết 75 - 100% gà thực nghiệm và phát triển tốt trên tế bào sơ phôi gà và tế bào thận trong môi trường nuôi cấy không có trypsin (Alexander D. J., 1996). - Loại virus có độc lực trung bình: Là những chủng virus gây bệnh trên gà thực nghiệm có triệu chứng lâm sàng rõ rệt nhưng gây chết không quá 20%. - Loại virus có độc lực thấp (nhược độc): Là những virus phát triển tốt trong cơ thể gà, có thể gây ra dịch cúm nhưng không có triệu chứng lâm sàng rõ rệt và không gây ra bệnh tích đại thể, không làm chết gà (Seo S. và Webter R. G., 2001). 1.1.3.7. Danh pháp quốc tế Để ký hiệu và lưu trữ một cách khoa học và đầy đủ các chủng virus cúm phân lập được, từ năm 1980 Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã đưa ra một hệ thống phân loại mới, được quy định ký hiệu theo trình tự: Serotype/loài nhiễm/nơi phân lập/số hiệu chủng/thời gian phân lập/loại hình Subtype HA (H) và NA (N). Ví dụ: Virus cúm có ký hiệu A/GS/HK/437/4/99/H5N1, có nguồn thông tin là: Cúm nhóm A; loài nhiễm là ngỗng (GS = goose); nơi phân lập là Hồng Kông (HK); số hiệu 437; thời gian phân lập tháng 4/1999; Subtype H5N1 (Đào Yến Khanh, 2005). 1.1.4. Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 1.1.4.1. Phân bố dịch Virus cúm gia cầm phân bố khắp thế giới trong các loài gia cầm, dã cầm, động vật có vú. Sự phân bố và lưu hành của virus cúm khó xác định chính xác và chịu ảnh hưởng bởi các loài vật nuôi, thú hoang dã, tập quán chăn nuôi gia cầm, đường di trú của dã cầm, mùa vụ và hệ thống báo cáo dịch bệnh, phương pháp nghiên cứu (Cục Thú y, 2004). 10 1.1.4.2. Động vật cảm nhiễm Tất cả các loài gia cầm (gà, vịt, ngan, chim cút, vẹt, bồ câu), chim hoang dã (đặc biệt thủy cầm di trú) đều mẫn cảm với virus. Phần lớn các loài gia cầm non đều mẫn cảm với virus cúm type A. Ngoài ra, virus cúm type A còn gây bệnh cho nhiều loài động vật có vú như lợn, ngựa, chồn, hải cẩu, thú hoang dã và cả con người. Lợn mắc bệnh cúm thường do phân type H1N1 và H3N2 gây nên. Vịt nuôi bị nhiễm virus nhưng ít phát thành bệnh do vịt có sức đề kháng với virus gây bệnh. Tuy nhiên, năm 1961, ở Nam Phi đã phân lập được virus cúm type A (H5N1) gây bệnh cho cả gà và vịt (Bùi Quang Anh và Văn Đăng Kỳ, 2004; Cục Thú y, 2004). 1.1.4.3. Động vật mang virus Virus cúm đã phân lập được ở hầu hết các loài chim hoang dã như vịt trời, thiên nga, hải âu, mòng biển, vẹt, vẹt đuôi dài, vẹt mào, chim thuộc họ sẻ, diều hâu. Tần suất và số lượng virus phân lập được ở thủy cầm, đặc biệt vịt trời đều cao hơn các loài khác (Bùi Quang Anh và Văn Đăng Kỳ, 2004). Kết quả điều tra thủy cầm ở Bắc Mỹ cho thấy, trên 60% chim non bị nhiễm virus do tập hợp đàn trước khi di trú. Sự kết hợp các kháng nguyên bề mặt H và N của các phân type virus cúm A diễn ra ở chim hoang dã, virus không gây độc đối với vật chủ, được nhân lên ở đường ruột của chim khiến cho các loài này mang virus và là nguồn gieo rắc virus cho các loài khác, đặc biệt là gia cầm (Alexander D.J., 2000). Đã có nhiều nghiên cứu phát hiện virus cúm từ những loài vịt đi đầu trong mùa di trú, sau khi xuất hiện đã gây ra dịch ở gà tây. Vịt từ khi bị nhiễm đến khi bắt đầu thải virus trong vòng 30 ngày. Dường như virus được duy trì trong số đông vịt trời cho tới mùa sinh sản tiếp theo lại truyền cho các con non theo đường tiêu hóa, do virus bài thải theo phân, gây ô nhiễm ao, hồ (Bùi Quang Anh và Văn Đăng Kỳ, 2004; Cục Thú y, 2004). 1.1.4.4. Sự truyền lây virus cúm gia cầm Khi gia cầm nhiễm virus cúm, virus được nhân lên trong đường hô hấp và đường tiêu hóa. Sự truyền lây của bệnh được thực hiện theo 2 phương thức.