Mô tả:
Giải trình tự thế hệ mới
Phạm Hùng Vân
Trưởng Đơn Vị Kỹ Thuật Phân Tích Gene
Hai
giai đoạn
trong
giải
trình tự
Sanger
Ứng dụng giải trình tự Sanger
1. Giải trình tự gene hay bộ gen cho các nghiên cứu có
liên quan;
2. Phát hiện các đột biến gene (liên quan đến ung thư,
đên kháng thuốc), các SNP (trong cá nhân hóa các
liệu pháp điều trị), các kiểu gene (genotype của
virus gây bệnh)…;
3. Định danh vi khuẩn hay vi nấm dựa trên giải trình tự
DNA của gene qui định RNA của ribosome (16S của
vi khuẩn và 28S của vi nấm) đặc biệt là các tác nhân
khó định danh hay thất bại nuôi cấy từ mẫu thử;
4. Phân tích đoạn xét nghiệm dấu vân tay DNA (DNA
finger printing) để nhận dạng cá nhân và mối quan
hệ cá nhân (pháp y), trong chẩn đoán tiền sanh,
trong phát hiện đa dạng loài…
Pyrosequencing
Nguyên tắc pyrosequencing
1. A, hay T, hay C, hay G được lập trình cho vào giếng
phản ứng; và mỗi khi dung dịch nucleotide cho vào có
nucleotide được bắt cặp vào sợi khuôn thì một
pyrophosphate (PPi) sẽ được phóng thích ra để được
enzyme sulfurylase tạo ra một ATP, ATP này sẽ giúp hệ
thống phát quang luciferin-luciferase (luciferin thành
oxyluciferin phát quang)
2. dATP-S được sử dụng để thay thế dATP vì dATP-S
không có hoạt tính của ATP.
3. ATP và các nucleotide tự do còn thừa sau mỗi lần bổ
sung nucleotide bị huỷ nhờ apyrase được cho vào
giếng sau khi tín hiệu phát quang được ghi nhận
Định lượng được đột biến
Ứng dụng pyrosequencing
Nhiều bộ thuốc thử đã được chấp nhận IVD
(In-Vitro Diagnosis) trong phát hiện các đột
biến gene ung thư liên quan đến chỉ định và
theo dõi điều trị đích,
Epigenomic: Định lượng các CpG với C bị
gắn methyl (Cytosine methylation) để tiên
đoán ung thư,
Phát hiện đột biến gene trong chẩn đoán và
sàng lọc bệnh di truyền,
Đặc biệt trong vi sinh lâm sàng: định danh
các vi khuẩn.
Ba giai đoạn
của
giải trình tự
thế hệ mới
Giải trình tự bằng tổng hợp
thế hệ mới vs pyrosequencing
1. Thuốc thử giải trình tự được thổi chảy vào chip nanowell hay vi bản theo chương trình và sau khi ghi
nhận được tín hiệu thì thuốc thử củ sẽ được thổi chảy
ra để thuốc thử mới lại được bơm vào.
2. Tổng hợp mạch bổ sung dựa trên mạch khuôn có thể
là kéo dài đầu 3’ của mạch bổ sung bằng các
nucleotide (A, T, C hay G) được ghi nhận, hay có
thể là kéo dài đầu 3’ của mạch bổ sung mỗi lần 2
base nhờ sự kéo dài và nối probe dựa trên sợi khuôn
3. Tín hiệu tổng hợp có thể là tín hiệu phát quang dựa
trên hệ thống luciferin-luciferase (454 của Roche),
tín hiệu điện do thay đổi pH (Ion-Tolent hay IonProton của ABI), tín hiệu huỳnh quang được đánh
dấu trên các nucleotide A, T, C hay G (Solexa của
Illumina), hay cũng có thể là tín hiệu huỳnh quang
được gắn lên probe (solid của ABI).
Công nghệ Barcode
cho phép xác định nguồn gốc trình tự được giải
Ứng dụng giải trình tự thế hệ mới
Giải trình tự bộ gene, thậm chí 24h cho bộ gene
người
Lôi ra ánh sáng bất cứ một trình tự nucleic acid
của bất cứ tác nhân gì có mặt trong mẫu thử lấy
từ vật chủ hay bệnh nhân
Công cụ nhạy cảm nhất để có thể phát hiện các
đột biến cho dù tỷ lệ đột biến hiện diện trong
mẫu thử là rất thấp
Chẩn đoán tiền sanh phát hiện dị bội của thai
nhi bằng phân tích DNA của bào thai hiện diện
trong máu mẹ dựa trên ưu điểm độ nhạy cao
của kỹ thuật
Giải trình tự
bộ gene
(Crag Venter)
Ứng dụng giải trình tự thế hệ mới
Giải trình tự bộ gene, thậm chí 24h cho bộ gene
người
Lôi ra ánh sáng bất cứ một trình tự nucleic acid
của bất cứ tác nhân gì có mặt trong mẫu thử lấy
từ vật chủ hay bệnh nhân
Công cụ nhạy cảm nhất để có thể phát hiện các
đột biến cho dù tỷ lệ đột biến hiện diện trong
mẫu thử là rất thấp
Chẩn đoán tiền sanh phát hiện dị bội của thai
nhi bằng phân tích DNA của bào thai hiện diện
trong máu mẹ dựa trên ưu điểm độ nhạy cao
của kỹ thuật
ABL1
AKT1
ALK
APC
ATM
BRAF
CDH1
CDKN2A
CSF1R
EGFR
ERBB2
ERBB4
FBXW7
FGFR1
FGFR2
FGFR3
FLT3
GNA11
GNAS
HNF1A
HRAS
IDH1
JAK2
JAK3
KDR
KIT
KRAS
MLH1
MPL
NOTCH1
NPM1
NRAS
PDGFRA
PIK3CA
PTEN
PTPN11
CTNNB1
GNAQ
MET
RB1
RET
SMAD4
SMARCB1
SMO
SRC
STK11
TP53
VHL
FFPE Sample
Quality Control
Prepare
Amplicons
Sequence on
MiSeq
Automated
analysis
• qPCR‐based
sample quality
control
• Ensure
samples will be
successful in
assay
• Prepare
libraries w/
TruSeq
Amplicon
assay
• Index up to 96
samples
• Built‐in sample
normalization
• Simple sample
sheet creation
with Illumina
Experiment
Manager
• Bidirectional
amplicon
sequencing
with 2x150 bp
reads (2x250
soon)
• >75% bases @
>Q30 (>99.9%
accuracy)
• Align reads
with MiSeq
Reporter
• Call low
frequency
variants (<5%)
• Analyze data
with Amplicon
Viewer
New!
Kết quả giải trình tự bộ gene virus trên
máy MiSeq ‐ Illumina
Các bước tiến hành:
Bảo quản mẫu và bất hoạt chủng virut Rubella
bằng dung dịch RNA Shield™ của hãng Zymo
Research – Mỹ.
Tách chiết mẫu Virut Rubella bằng Direct-zol™
RNA MiniPrep Kit. (P/N: R2050) của hãng Zymo
Research .
Chuẩn bị thư viện với bộ kit TruSeq RNA LT của
Illumina.
Chạy giải trình tự với bộ kít MiSeq 300 cycle V2
trên MiSeq.
Phân tích kết quả sử dụng phần mềm SeqMan và
Blast trên NCBI
Tổng thời gian chuẩn bị mẫu và chạy giải trình
tự, phân tích kết quả: 3 ngày.
Kết quả
Phân tích kế quả bằng phần mềm SeqMan thu
được toàn bộ genome của virut Rubella
(9.762bp)
So sánh trình tự thu được trên
ngân hàng gene NCBI
Trình tự thu được giống với: Rubella virus strain
RVi/LA.CA.USA/45.08/2B CRS, complete genome
Các vùng giàu GC vủa virut đều có thể đọc trình
tự được (việc này rất khó khi thực hiện bằng
máy giải trình tự thế hệ cũ)
Độ chính xác cao: 51782 coverage với Q >30.
- Xem thêm -