Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Giáo dục - Đào tạo Cao đẳng - Đại học Giải trình tự thế hệ mới...

Tài liệu Giải trình tự thế hệ mới

.PDF
20
682
91

Mô tả:

Giải trình tự thế hệ mới Phạm Hùng Vân Trưởng Đơn Vị Kỹ Thuật Phân Tích Gene Hai giai đoạn trong giải trình tự Sanger Ứng dụng giải trình tự Sanger 1. Giải trình tự gene hay bộ gen cho các nghiên cứu có liên quan; 2. Phát hiện các đột biến gene (liên quan đến ung thư, đên kháng thuốc), các SNP (trong cá nhân hóa các liệu pháp điều trị), các kiểu gene (genotype của virus gây bệnh)…; 3. Định danh vi khuẩn hay vi nấm dựa trên giải trình tự DNA của gene qui định RNA của ribosome (16S của vi khuẩn và 28S của vi nấm) đặc biệt là các tác nhân khó định danh hay thất bại nuôi cấy từ mẫu thử; 4. Phân tích đoạn xét nghiệm dấu vân tay DNA (DNA finger printing) để nhận dạng cá nhân và mối quan hệ cá nhân (pháp y), trong chẩn đoán tiền sanh, trong phát hiện đa dạng loài… Pyrosequencing Nguyên tắc pyrosequencing 1. A, hay T, hay C, hay G được lập trình cho vào giếng phản ứng; và mỗi khi dung dịch nucleotide cho vào có nucleotide được bắt cặp vào sợi khuôn thì một pyrophosphate (PPi) sẽ được phóng thích ra để được enzyme sulfurylase tạo ra một ATP, ATP này sẽ giúp hệ thống phát quang luciferin-luciferase (luciferin thành oxyluciferin phát quang) 2. dATP-S được sử dụng để thay thế dATP vì dATP-S không có hoạt tính của ATP. 3. ATP và các nucleotide tự do còn thừa sau mỗi lần bổ sung nucleotide bị huỷ nhờ apyrase được cho vào giếng sau khi tín hiệu phát quang được ghi nhận Định lượng được đột biến Ứng dụng pyrosequencing Nhiều bộ thuốc thử đã được chấp nhận IVD (In-Vitro Diagnosis) trong phát hiện các đột biến gene ung thư liên quan đến chỉ định và theo dõi điều trị đích,  Epigenomic: Định lượng các CpG với C bị gắn methyl (Cytosine methylation) để tiên đoán ung thư,  Phát hiện đột biến gene trong chẩn đoán và sàng lọc bệnh di truyền,  Đặc biệt trong vi sinh lâm sàng: định danh các vi khuẩn.  Ba giai đoạn của giải trình tự thế hệ mới Giải trình tự bằng tổng hợp thế hệ mới vs pyrosequencing 1. Thuốc thử giải trình tự được thổi chảy vào chip nanowell hay vi bản theo chương trình và sau khi ghi nhận được tín hiệu thì thuốc thử củ sẽ được thổi chảy ra để thuốc thử mới lại được bơm vào. 2. Tổng hợp mạch bổ sung dựa trên mạch khuôn có thể là kéo dài đầu 3’ của mạch bổ sung bằng các nucleotide (A, T, C hay G) được ghi nhận, hay có thể là kéo dài đầu 3’ của mạch bổ sung mỗi lần 2 base nhờ sự kéo dài và nối probe dựa trên sợi khuôn 3. Tín hiệu tổng hợp có thể là tín hiệu phát quang dựa trên hệ thống luciferin-luciferase (454 của Roche), tín hiệu điện do thay đổi pH (Ion-Tolent hay IonProton của ABI), tín hiệu huỳnh quang được đánh dấu trên các nucleotide A, T, C hay G (Solexa của Illumina), hay cũng có thể là tín hiệu huỳnh quang được gắn lên probe (solid của ABI). Công nghệ Barcode cho phép xác định nguồn gốc trình tự được giải Ứng dụng giải trình tự thế hệ mới  Giải trình tự bộ gene, thậm chí 24h cho bộ gene người  Lôi ra ánh sáng bất cứ một trình tự nucleic acid của bất cứ tác nhân gì có mặt trong mẫu thử lấy từ vật chủ hay bệnh nhân  Công cụ nhạy cảm nhất để có thể phát hiện các đột biến cho dù tỷ lệ đột biến hiện diện trong mẫu thử là rất thấp  Chẩn đoán tiền sanh phát hiện dị bội của thai nhi bằng phân tích DNA của bào thai hiện diện trong máu mẹ dựa trên ưu điểm độ nhạy cao của kỹ thuật Giải trình tự bộ gene (Crag Venter) Ứng dụng giải trình tự thế hệ mới  Giải trình tự bộ gene, thậm chí 24h cho bộ gene người  Lôi ra ánh sáng bất cứ một trình tự nucleic acid của bất cứ tác nhân gì có mặt trong mẫu thử lấy từ vật chủ hay bệnh nhân  Công cụ nhạy cảm nhất để có thể phát hiện các đột biến cho dù tỷ lệ đột biến hiện diện trong mẫu thử là rất thấp  Chẩn đoán tiền sanh phát hiện dị bội của thai nhi bằng phân tích DNA của bào thai hiện diện trong máu mẹ dựa trên ưu điểm độ nhạy cao của kỹ thuật ABL1 AKT1 ALK APC ATM BRAF CDH1 CDKN2A CSF1R EGFR ERBB2 ERBB4 FBXW7 FGFR1 FGFR2 FGFR3 FLT3 GNA11 GNAS HNF1A HRAS IDH1 JAK2 JAK3 KDR KIT KRAS MLH1 MPL NOTCH1 NPM1 NRAS PDGFRA PIK3CA PTEN PTPN11 CTNNB1 GNAQ MET RB1 RET SMAD4 SMARCB1 SMO SRC STK11 TP53 VHL FFPE Sample  Quality Control Prepare  Amplicons Sequence on  MiSeq Automated  analysis • qPCR‐based  sample quality  control • Ensure  samples will be  successful in  assay • Prepare  libraries w/  TruSeq Amplicon  assay • Index up to 96  samples • Built‐in sample  normalization • Simple sample  sheet creation  with Illumina Experiment  Manager • Bidirectional  amplicon  sequencing  with 2x150 bp reads (2x250 soon) • >75% bases @  >Q30 (>99.9%  accuracy) • Align reads  with MiSeq  Reporter • Call low  frequency  variants (<5%) • Analyze data  with Amplicon  Viewer New! Kết quả giải trình tự bộ gene virus trên máy MiSeq ‐ Illumina Các bước tiến hành:  Bảo quản mẫu và bất hoạt chủng virut Rubella      bằng dung dịch RNA Shield™ của hãng Zymo Research – Mỹ. Tách chiết mẫu Virut Rubella bằng Direct-zol™ RNA MiniPrep Kit. (P/N: R2050) của hãng Zymo Research . Chuẩn bị thư viện với bộ kit TruSeq RNA LT của Illumina. Chạy giải trình tự với bộ kít MiSeq 300 cycle V2 trên MiSeq. Phân tích kết quả sử dụng phần mềm SeqMan và Blast trên NCBI Tổng thời gian chuẩn bị mẫu và chạy giải trình tự, phân tích kết quả: 3 ngày. Kết quả  Phân tích kế quả bằng phần mềm SeqMan thu được toàn bộ genome của virut Rubella (9.762bp) So sánh trình tự thu được trên ngân hàng gene NCBI  Trình tự thu được giống với: Rubella virus strain RVi/LA.CA.USA/45.08/2B CRS, complete genome  Các vùng giàu GC vủa virut đều có thể đọc trình tự được (việc này rất khó khi thực hiện bằng máy giải trình tự thế hệ cũ)  Độ chính xác cao: 51782 coverage với Q >30.
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan