Tài liệu Emzym amilase

 Lời giới thiệu: Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong k ỹ thuật và trong đời sống con người, đặc biệt là trong công nghiệp Thực ph ẩm. Để thuỷ phân tinh bột từ lâu người ta đã sử dụng acid vô cơ như HCl và H2SO4. Nhưng kết quả cho thấy, thuỷ phân bằng acid rất khó kiểm soát và th ường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Do vậy, việc thay thế và ứng dụng enzyme để thuỷ phân tinh bột là m ột k ết quả tất yếu của lịch sử phát triển. Enzyme amylase đã được tìm ra đã góp phần quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm. Amylase càng ngày càng được thay thế acid trong s ản xuất ở qui mô công nghiệp. Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khả năng chịu nhiệt cao mà không bị mất hoạt tính, ch ẳng h ạn amylase đ ược tách chiết từ VSV, cụ thể là các chủng vi khuẩn chịu nhiệt được phân l ập t ừ nh ững suối nước nóng. Ngoài ra, amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thuỷ phân tinh bột: Năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao v ề thiết b ị sử d ụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịch đường. I Định nghĩa: Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật . Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên k ết n ội phân t ử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước: R-R’ + H-OH  R-H + R’-OH Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase ( enzyme nội bào ) Exoamylase ( enzyme ngoại bào ).  Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: Kh ử tr ực ti ếp là Pullulanase ( hay α-dextrin 6-glucosidase); khử gián tiếp là Transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) và maylo-1,6-glucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide.  Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase. Đây là nh ững enzyme th ủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. II Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzyme amylase: Tùy vào mỗi loại và vào các nguồn khác nhau sẽ có thành ph ần amino acid khác nhau. Xét đặc tính và cơ chế tác dụng của enzyme -amylase. II.1 Đặc tính của enzyme amylase:  Tính chất vật lý:  Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc: 45.000-50.000 D  Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng.  Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính ch ất của globuline.  Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2-5,7 ( Bernfeld P, 1951 ).  Cấu tạo: Mỗi loại -amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. -amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân t ử enzyme. α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine. -amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử -amylase đều có chứa từ 1 đến 30 nguyên tử gam Ca/1 mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì ho ạt đ ộng c ủa enzyme. Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động b ởi các tác nhân gây biến tính và của các enzyme phân giải protein. N ếu phân t ử amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn mất hết khả năng th ủy phân c ơ ch ất. Do có hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg 2+ cao nên -amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác. Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng nh ư Cu 2+, Ag+, Hg2+. Một số kim loại như Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+ ,Sn2+, không có ảnh hưởng mấy đến enzyme -amylase. Riêng -amylase của Asp. Oryzae (thuộc chủng nấm mốc Aspergillus Oryzae) có chứa phần phi protein là poly saccharide, nhưng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt động và nằm ở phía trong phân t ử enzyme. -amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công vào những hạt tinh bột bị thương tổn. Sản phẩm cuối cùng của thủy phân -amylase nấm mốc là glucose và maltose. -amylase của nấm sợi không tấn công vào liên kết -1,6 glucoside của amilopectin, nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới h ạn phân nhánh. Đây là một cấu trúc phân tử tinh bột do enzyme -amylase phân cắt tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh.Sản phẩm thủy phân cuối cùng của th ủy phân amylase nấm sợi là maltose và maltotriose. II.2 Cơ chế tác dụng của enzyme -amylase: -amylase (1,4--glucan-glucanhydrolase) có khả năng phân cách các liên k ết -1,4 glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hay glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. Quá trình thủy phân tinh bột bởi -amylase là một quá trình đa giai đoạn: Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo một lượng lớn phân tử -dextrin. Độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh chóng. Sang giai đoạn hai (giai đoạn đường hóa): các phân tử -dextrin tiếp tục bị thủy phân tạo ra các tetra-trimaltose không màu với thuốc thử iodine. Các chất này b ị thủy phân rất chậm bởi -amylase cho đến khi tạo thành các disaccharide và cuối cùng là monosaccharide. Maltotetrose Amylose  oligosaccharide  Maltotriose  Malto 13% glucose 87% maltose 19% glucose Amylopectin  72% maltose 8% isomaltose Dextrin phân tử thấp Tóm lại, dưới tác dụng của -amylase, tinh bột có thể chuyển thành glucose, maltose, maltotetrose, dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường -amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân t ử thấp,và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao là một đặc trưng cơ bản của -amylase, do vậy người ta còn gọi -amylase là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. III. Ứng dụng Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm enzyme các loại đã và đang phát triễn m ạnh trên qui mô công nghiệp. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán trên th ị trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có m ức độ tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Chế phẩm enzyme không ch ỉ được ứng dụng trong y học mà còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, trong hóa h ọc… "ý nghĩa của việc sử dụng enzyme trong các lĩnh vực thực tế không kém so với ý nghĩa của việc sử dụng năng lượng nguyên tử". Theo thời gian, enzyme công nghiệp ngày càng được ứng dụng vào nhi ều lĩnh vực khác nhau, trong đó những enzyme ứng dụng nhiều nh ất là protease, cellulose, ligase, amylase,… và một số enzyme đặc biêt khác đã thu được rất nhi ều lợi nhuận từ ngành này. Dưới đây là một vài ứng dụng thực tế:  Ứng dụng amylase trong sản xuất bia Trong công nghệ sản xuất bia truyền thống, các nước phương Tây chủ yếu sử dụng enzyme amylase của malt để thủy phân tinh bột trong malt, sau đó đến giai đoạn rượu hóa bởi nấm men Saccharomyces sp. Cơ sở khoa học của việc sử dụng amylase của malt ở chỗ, khi đại mạch chuyển từ trạng thái hạt sang trạng thái nảy mầm (malt), enzyme amylase sẽ được tổng hợp và khi đó enzyme này sẽ thủy phân tinh bột có trong hạt tạo ra năng lượng và vật chất cho sự tạo thành m ầm. Như v ậy việc đường hóa tinh bột trong hạt nhờ enzyme của chính nó. Khi đó h ạt chỉ t ổng h ợp ra lượng enzyme amylase vừa đủ để phân hủy lượng tinh bột có trong h ạt. Nh ư th ế cần rất nhiều mầm đại mạch để sản xuất bia ở qui mô lớn, dẫn đến chi phí cao cho sản xuất và sản phẩm. Để khắc phục điều này, trong quá trình lên men t ạo bia thì nhà sản xu ất không sử dụng hoàn tòan 100% nguyên liệu là malt đại mạch mà có sự pha trộn theo một công thức nào đó để thay thế malt và còn bổ sung nguồn tinh bột cho quá trịnh lên men. Lý do là một phần để tạo hương vị cho bia, màu sắc, độ cồn phù hợp cho người tiêu dùng và một phần là làm giảm giá thành cho sản ph ẩm bia nhưng vẫn giữ được đặc trưng cho bia. Chính vì điều này, các nhà sản xuất bia quan tâm đến việc sử dụng chế phẩm enzyme amylase cung cấp cho quá trình thủy phân tinh bột .Enzyme này có ý nghĩa rất l ớn trong việc làm bia, giúp s ản xu ất bia ở qui mô công nghiệp. Ngoài ra, trong sản xuất bia, người ta còn sử dụng chế phẩm enzyme cellulose có tác dụng phá vỡ thành tế bào, tạo điều kiện để các thành ph ần có trong t ế bào hạt thóat ra phía ngoài nhờ đó chất lượng bia được nâng cao hơn. Một loại enzyme khác cũng được sử dụng khá rộng rãi đó là gluco amylase, enzyme này đ ược s ử dụng để loại trừ O2 có trong bia, giúp quá trình bảo quản bia kéo dài hơn rất nhiều.  Ứng dụng amylase trong sản xuất rượu: Để sản xuất cồn từ nguồn nguyên liệu tinh bột, mỗi nước sử dụng các loại nguyên liệu khác nhau.Ví dụ, ở Mỹ người ta sử dụng nguyên liệu từ bột ngô để sản xuất cồn, còn ở Brazin lại sử dụng khoai mì, các nước khác sử dụng gạo hoặc tấm từ gạo. Qúa trình sản xuất cồn trải qua hai giai đọan: giai đọan đường hóa và giai đọan rượu hóa. Giai đoạn đường hóa: Người ta bắt buộc phải sử dụng enzyme amylase (không thể sử dụng phương pháp thủy phân tinh bột bằng acid ). Ng ười Nh ật đã biết sử dụng enzyme của nấm mốc trong quá trình đường hóa để sản xuất rượu Sake từ cách đây hơn 1700 năm. Người Trung Quốc thì đã sử dụng nhiều loại n ấm mốc để đường hóa rượu trong sản xuất rượu cách đây 4000 năm. Còn người Việt Nam đã biết sản xuất rượu từ gạo cách đây hàng ngàn năm. Riêng ở Mỹ, mãi đến thế kỷ XIX khi Takamine người Nhật đưa nấm m ốc Aspergillus sang mới biết sử dụng enzyme này thay amylase của malt để sản xu ất cồn. Chính vì thế mới có phương pháp Micomalt ( mầm m ốc) trong s ản xu ất c ồn và rượu. Nhờ sự du nhập kỹ thuật này từ Nhật mà người Mỹ tiết kiệm được một khối lượng malt khổng lồ trong sản xuất rượu. Giai đoạn rượu hóa: Nhờ nấm men Saccharomyces cerevisiae, cũng có thể xem đây là một quá trình áp dụng enzyme. Qúa trình rượu hóa là quá trình h ết s ức phức tạp, trải qua rất nhiều giai đoạn chuyển hóa từ đường thành cồn nh ờ s ự tham gia của nhiều enzyme khác nhau. Điểm khác với enzyme amylase là ở chổ các enzyme tham gia quá trình rượu hóa nằm trong t ế bào nấm men. Việc điều khi ển các quá trình chuyển hóa bởi enzyme trong t ế bào thực chất là quá trình trao đ ổi chất của nấm men trong môi trường chứa đường.  Ứng dụng amylase trong sản xuất bánh mì: Một trong những yêu cầu cơ bản của bánh mì là độ xốp nở.Độ xốp nở của bánh phụ thuộc vào sự tạo khí CO2 trong quá trình lên men bột nhào và khả năng giữ khí của bột, hàm lượng đường, hoạt độ của amylase, hàm lượng và tính ch ất của gluten trong bột cũng như hoạt tính của nấm men. Trước đây, người ta sử dụng nguồn amylase của malt, nhưng đến những năm đầu thế kỉ 20, người ta bắt đầu nghiên cứu sử dụng amylase của nấm mốc. Các chế phẩm enzyme amylase dung trong công nghiệp sản xuất bánh mì được sản xuất từ canh trường nấm mốc như Asp.Oryzae,Asp.Awamori hoặc từ vi khuẩn, trong đó chế phẩm amylase từ nấm mốc được sử dụng phổ biến nhất. -amylase của nấm mốc rất nhạy nhiệt nên dễ bị vô hoạt khi ta nâng nhi ệt độ lên 65 -800C, và chịu được trong môi trường acid tốt nên phù hợp với điều kiện hoạt động của nấm men trong bột nhào. Nhờ hoạt tính mạnh nên trong thời gian ngắn, amylase của n ấm m ốc nhanh chóng tạo đủ lượng đường cần thiết trong khối bột nhào, sau đó thì b ị vô ho ạt ở nhiệt độ nướng bánh nên có thể dùng lượng lớn mà không có hiện t ượng dextrin hóa khi nướng. Việc sử dụng chế phẩm enzyme amylase còn cho phép ta dùng bột mì kém phẩm chất để làm bánh và có thể giảm bớt được 50% lượng đường thêm vào bánh trong sản xuất bánh mì ngọt.  Ứng dụng amylase trong sản xuất glucose và các loại mật tinh bột: Đang được ứng dụng có hiệu quả trong công nghiệp sản xuất glucose th ực phẩm, glucose tinh thể, mật maltose và mật glucose… Phương pháp này không tạo ra các sản phẩm phụ không mong muốn giúp ch ất lượng đường tốt hơn.  Ứng dụng amylase trong chế biến thực phẩm gia súc Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm m ột kh ối l ượng r ất lớn. Trong khối lượng này, thành phần tinh bột rất cao. Để tăng hiệu suất sử d ụng năng lượng từ nguồn tinh bột, người ta thường cho thêm enzyme amylase vào. Enzyme amylase sẽ tham gia phân giải tinh bột t ạo thành đường, giúp cho quá trình chuyển hóa tinh bột tốt hơn. Ngoài ra, enzyme amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường bột, sản xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose, sản xuất tương và nước chấm …ở quy mô công nghiệp. IV Nguồn thu nhận: Muốn thu nhận enzyme thì chỉ có con đường duy nhất là thu nhận chúng t ừ cơ thể sinh vật (con đường sinh tổng hợp). Mọi vi sinh vật đều chứa enzyme nh ưng mức độ enzyme ở từng loại khác nhau.Đễ khai thác enzyme cần chú ý các đi ều kiện cơ bản sau:  Mức độ tập trung của loại enzyme nào đó trong tế bào, trong cơ th ể  Khả năng sản xuất hàng loạt  Khả năng thu nhận và tinh chế Phương pháp thu nhận enzyme trong công nghiệp: Nuôi cấy vi sinh v ật, tách chiết và tinh chế enzyme. 1. Nuôi cấy vi sinh vật: Về nguyên tắc có 2 phương pháp: nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy bề sâu  Nuôi cấy bề mặt Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường dinh dưỡng dạng rắn, xốp, ẩm Nguyên liệu chính : cám mì, cám gạo Môi trường được bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng khác và làm ẩm bằng nước sau đó được hấp chín, thanh trùng bằng hơi nóng (100 – 110 0C, 1-1,5 atm/45-60 phút), làm nguội, vô trùng có độ ẩm không khí 80-90%  Nuôi cấy bề sâu Môi trường dạng lỏng Nguyên liệu : dịch thủy phân, xenlulose, tế bào có nồng độ thích hợp Tiến hành 2-4 ngày (25-300C), chọn pH phù hợp với chủng vi sinh vật và sự sinh tổng hợp enzyme theo mong muốn 2. Tinh chế và tách chiết vi sinh vật : Dịch trích enzyme được làm sạch sau đó cô đặc hoặc sấy, sản phẩm thu được dưới dạng bột hoặc dung dịch đậm đặc Mức độ tinh sạch vừa phải : enzyme trong dịch trích được kết tủa bằng muối hoặc dung môi hữu cơ sau đó tủa được tách, sấy khô, nghiền nhỏ và được đóng gói. Mức độ tinh sạch cao : dùng phương pháp sắc kí, lọc gel …