Tài liệu Dự án đầu tư nâng cao năng lực nghiên cứu và phát triển giống cây nguyên liệu giấy năm 2009

BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CẤP BỘ BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN DỰ ÁN ĐẦU TƯ NÂNG CAO NĂNG LỰC NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN GIỐNG CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY NĂM 2009 Chủ nhiệm đề tài: HÀ VĂN HUY 7881 15/4/2010 HÀ NỘI – 2009 BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY ____________ BÁO CÁO TIẾN ĐỘ KẾT QUẢ THỰC HIỆN DỰ ÁN ĐẦU TƯ NÂNG CAO NĂNG LỰC NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN GIỐNG CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY NĂM 2009 Chủ nhiệm dự án: ThS. Hà Văn Huy Những người thực hiện chính: ThS. Nguyễn Tuấn Anh ThS. Phạm Đức Huy ThS. Nguyễn Đức Thế ThS. Phạm Kim Thanh CN. Nguyễn Thanh Bình KS. Nguyễn Duy Sâm KS. Lữ Văn Thảo Phú Thọ - năm 2009 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................... 1  I. ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................... 1  II. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG THỰC HIỆN DỰ ÁN .................................... 3  2.1. Mục tiêu của dự án .......................................................................................... 3  2.1.1. Mục tiêu tổng quát ....................................................................................... 3  2.1.2. Mục tiêu năm 2009....................................................................................... 3  2.2. Nội dung của dự án ......................................................................................... 3  III. KẾT QUẢ THỰC HIỆN............................................................................... 5  3.1. Mua sắm trang thiết bị..................................................................................... 5  3.2. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi cây mô và giâm hom cho một số dòng bạch đàn và keo lai ................................................................................... 5  3.2.1. Hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi cấy mô.................................................. 6  3.2.1.1. Thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ các chất trong môi trường nuôi cấy đến hiệu quả của các giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi và tạo rễ ..................... 6  3.2.1.2. Thử nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng đến tạo chồi, nhân nhanh chồi và tạo rễ ..................................... 16  3.2.1.3. Thử nghiệm thời gian huấn luyện và cường độ ánh sáng trong quá trình huấn luyện đến tỷ lệ cây sống khi chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm ...... 25  3.2.2. Hoàn thiện kỹ thuật giâm hom ................................................................... 30  3.2.2.1. Thử nghiệm ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau đến tỷ lệ sống và tỷ lệ ra rễ của hom .................................................................................................... 30  3.2.2.2. Thử nghiệm ảnh hưởng của tuổi hom, vị trí lấy hom, kích thước hom và thời điểm lấy hom đến tỷ lệ sống và tỷ lệ ra rễ của hom ..................................... 40  3.3. Đào tạo và tập huấn kỹ thuật ......................................................................... 50  3.3.1. Phương pháp đào tạo .................................................................................. 50  3.3.2. Nội dung đào tạo dự án .............................................................................. 50  3.3.3. Đối tượng đào tạo ....................................................................................... 50  3.3.4. Kết quả đào tạo........................................................................................... 50  IV. KẾT LUẬN................................................................................................... 51  VI. KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 53  PHỤ BIỂU ...............................................................................................................   1 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VNCCNLG Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy PN Phù Ninh TLCHH Tỷ lệ chồi hữu hiệu ĐC Đối chứng HSNC Hệ số nhân chồi MS Murashige và Skoog Hchồi Chiều cao trung bình chồi hữu hiệu GA3 Giberellin TLRR Tỷ lệ ra rễ SLR Số lượng rễ Lrế Chiều dài trung bình rễ TLS Tỷ lệ sống IR Cường độ ánh sáng I. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay nhu cầu giống tốt cho trồng rừng nguyên liệu giấy là rất lớn. Dự án mở rộng nhà máy giấy Bãi Bằng giai đoạn II đã được Chính phủ phê duyệt và đang tổ chức thực thi, khi đi vào hoạt động công suất nhà máy sẽ nâng lên 318.000 tấn giấy và bột giấy/năm. Để đáp ứng đủ nguyên liệu cho nhà máy, diện tích trồng rừng được quy hoạch là 164.440 ha. Thực tế sản xuất 1 tấn bột giấy tẩy trắng phải cần 4.7 m3 gỗ keo hoặc bạch đàn, như vậy sau khi nhà máy giấy Bãi Bằng giai đoạn II đi vào hoạt động, hàng năm phải khai thác và trồng lại khoảng 20.000-21.000 ha rừng, nếu mật độ trồng rừng là 1333 cây/ha, thì hàng năm nhu cầu cây giống cho trồng rừng nguyên liệu giấy cần đến 28-30 triệu cây các loại, đây là một nhu cầu lớn và thực sự cần thiết nhưng với công xuất và quy mô nhà xưởng, trang thiết bị của Viện chỉ đáp ứng được 1/10 nhu cầu về giống của các đơn vị trồng rừng trong Tổng công ty gíây Việt Nam chưa kể các cá nhân, đơn vị trong vùng và cả nước. Qua 35 năm nghiên cứu và thử nghiệm Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy (VNCCNLG) đã lựa chọn được các loài, giống, dòng cây bạch đàn, keo tai tượng, keo lai và thông có khả năng sinh trưởng tốt, năng xuất rừng tăng từ 20 30% so với rừng sản xuất đại trà. Cho đến nay, ngoài 16 loài, dòng, giống cây được công nhận là giống Quốc gia, giống tiến bộ kỹ thuật thì Viện còn tuyển chọn và lưu giữ hàng trăm các dòng cây trội có triển vọng thuộc các loài trên, đây là nguồn vật liệu, nguồn gen quý để sản xuất giống vô tính có chất lượng cao bằng công nghệ mô - hom. Sản xuất giống bằng kỹ thuật nhân vô tính (mô - hom) sẽ tạo được giống cây trồng có những đặc tính di truyền quý của giống gốc. Mặt khác công nghệ này còn cho phép nhân nhanh để sản xuất cây giống theo quy mô công nghiệp với số lượng lớn và chất lượng tốt. Sau 14 năm nghiên cứu và thử nghiệm, VNCCNLG có một đội ngũ cán bộ nghiên cứu giàu kinh nghiệm, đội ngũ kỹ 1 thuật viên và công nhân lành nghề trong lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất giống vô tính bằng công nghệ mô - hom. Về cơ sở vật chất, Viện có một nhà nuôi cấy mô diện tích 320 m2 vừa nghiên cứu, vừa sản xuất được trên 2.5 triệu cây/năm, ngoài nhà nuôi cấy mô Viện còn có một nhà giâm hom với diện tích 1,400 m2 sản xuất được 0.5 triệu cây/năm. Như vậy có thể nói VNCCNLG là đơn vị đi đầu về nghiên cứu và sản xuất cây giống lâm nghiệp vô tính ở vùng Trung tâm cũng như trong ngành giấy. Với nhu cầu về số lượng và chất lượng cây giống như hiện nay của ngành giấy nói chung và của địa phương trong vùng nói riêng, thì việc nâng cao năng lực nghiên cứu và phát triển giống cây nguyên liệu giấy có năng suất cao bằng công nghệ mô - hom phục vụ trồng rừng sản xuất kinh doanh gỗ nguyên liệu giấy là vô cùng cần thiết, góp phần giải quyết sự thiếu hụt nguyên liệu cho ngành giấy hiện nay và trong tương lai. 2 II. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG THỰC HIỆN DỰ ÁN 2.1. Mục tiêu của dự án 2.1.1. Mục tiêu tổng quát Tăng cường tiềm lực (cơ sở vật chất, trang thiết bị, nguyên vật liệu, nhân lực...) và hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân giống một số dòng cây nguyên liệu giấy có năng suất cao, chất lượng tốt phục vụ nhu cầu trồng rừng nguyên liệu cho ngành giấy Việt Nam giai đoạn 2011-2015. 2.1.2. Mục tiêu năm 2009 1) Mua sắm trang thiết bị cho nghiên cứu và sản xuất giống. - Mua sắm trang thiết bị, nguyên vật liệu cho phòng thí nghiệm để phục vụ nghiên cứu và sản xuất cây giống. 2) Hoàn thiện được công nghệ nuôi cấy mô và giâm hom cho các giống bạch đàn (U6, PN10) keo lai (KL2) để áp dụng vào sản xuất. 3) Đào tạo tập huấn được 05 lớp (01 lớp kỹ thuật thu hái và chế biến hạt giống; 01 lớp kiểm nghiệm và bảo quản hạt giống; 01 lớp kỹ thuật xử lý cây mẹ tạo chồi và khảo nghiệm giống; 01 lớp Kỹ thuật thu chồi và xử lý chồi; 01 lớp kỹ thuật nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô và giâm hom) 2.2. Nội dung của dự án - Mua sắm trang thiết bị phục vụ nghiên cứu và sản xuất giống ở quy mô thí nghiệm, thực nghiệm (có danh mục trang thiết bị đính kèm). - Thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ các chất trong môi trường nuôi cấy đến hiệu quả của các giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi và tạo rễ (dòng U6). 3 - Thử nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng đến tạo chồi, nhân nhanh chồi và tạo rễ (dòng U6). - Thử nghiệm thời gian huấn luyện và cường độ ánh sáng trong quá trình huấn luyện đến tỷ lệ cây sống khi chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm. - Thử nghiệm ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau đến tỷ lệ sống và tỷ lệ ra rễ của hom (dòng PN10, Kl2). - Thử nghiệm ảnh hưởng của tuổi hom, vị trí lấy hom, kích thước hom và thời điểm lấy hom đến tỷ lệ sống và tỷ lệ ra rễ của hom (dòng PN10, KL2). - Tổ chức tập huấn, Đào tạo 05 lớp về kỹ thuật thu hái, bảo quản, kiểm nghiệm hạt giống, kỹ thuật xử lý cây mẹ tạo chồi, thu chồi, nhân giống bằng phương pháp nuôi cây mô và giâm hom (theo tài liệu giáo trình và đối tượng, thời gian đào tạo). 4 III. KẾT QUẢ THỰC HIỆN 3.1. Mua sắm trang thiết bị Theo đề cương kỹ thuật và dự toán kinh phí đã được Bộ Công Thương phê duyệt năm 2009 cho việc mua sắm các thiết bị máy móc phục vụ dự án. Viện đã tiến hành tổ chức thực hiện việc mua sắm hàng hoá trang thiết bị theo đúng các thủ tục quy định. Kết quả năm 2009 Viện ký hợp đồng với Công ty cổ phần BIOLAB Bình Nguyên để cung cấp các máy móc trang thiết bị như sau: 1. Nồi hấp vô trùng (Model: SA–600 HÃNG SẢN XUẤT: STURDY - Đài Loan): Số lượng 01 cái. 2. Cân kỹ thuật điện tử (Model: CPA2202S nhà sản xuất SARTORIUS): Số lượng 01 cái. 3. Tủ sấy (Model: UNB 400 hãng sản xuất Memmert -Đức): Số lượng 01 cái. 4. Máy cất nước một lần (Model: Merit W4000 hãng sản xuất Bibby Scientific-Anh): Số lượng 01 cái. 5. Tủ cấy vô trùng (Model SW-CJ-1B hãng sản xuất AirTech - Trung Quốc): Số lượng 08 cái. Đơn giá và các thông số kỹ thuật của từng loại máy móc, thiết bị, xuất xứ nguồn gốc (được thể hiện bảng biểu đính kèm). 3.2. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi cây mô và giâm hom cho một số dòng bạch đàn và keo lai Sau nhiều năm liên tục, Viện đã nghiên cứu thành công và tạo được nhiều giống cây nguyên liệu giấy có năng xuất, chất lượng tốt được Bộ Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn công nhận các giống, xuất xứ quốc gia và tiến bộ kỹ thuật 5 đưa vào trồng rừng công nghiệp năng xuất cao. Bao gồm: 11 giống bạch đàn Eucalyptus urophylla (PN2, PN14, PN3d, PN10, PN46, PN47, PN54, PN116, PN21, PN24, PN108) và 3 dòng keo lai (KL2, KL20, KLTA3). Tuy nhiên để đưa giống mới trên vào sản xuất đại trà và hạ giá thành sản phẩm đòi hỏi phải có quy trình kỹ thuật nhân giống cho từng dòng đảm bảo cho tỷ lệ ra rễ và hệ số nhân trong nuôi cấy mô phải cao. Chính vì vậy việc nghiên cứu hoàn thiện kỹ thuật nuôi cây mô và giâm hom cho một số dòng bạch đàn và keo lai cần phải thực hiện. 3.2.1. Hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi cấy mô Một trong những điều kiện quan trọng đảm bảo sự thành công cho quá trình nhân giống bạch đàn bằng nuôi cấy mô là môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, độ ẩm, cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng, thời gian huấn luyện đến giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi và tạo rễ, tỷ lệ cây sống khi chuyển từ ống nghiệm ra vườn ươm. 3.2.1.1. Thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ các chất trong môi trường nuôi cấy đến hiệu quả của các giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi và tạo rễ Năm 1993, Trung tâm nghiên cứu cây nguyên liệu giấy thực hiện dự án nhập công nghệ mô - hom của Trung quốc. Sau khi tiếp nhận và triển khai công nghệ, Trung tâm đã trở thành đơn vị đầu tiên trong ngành Lâm nghiệp ở Việt Nam ứng dụng thành công công nghệ nuôi cấy mô tế bào để sản xuất cây con phục vụ trồng rừng nguyên liệu giấy. Đến nay, trung tâm có quy mô sản xuất hơn 3 triệu cây bạch đàn mô mỗi năm các dòng bạch đàn như U6, PN2, PN54…. Tuy nhiên, sau nhiều năm nghiên cứu ứng dụng và triển khai cho thấy: Công nghệ nuôi cấy, sản xuất còn nhiều mặt tồn tại; hệ số nhân chồi với dòng U6 còn hạn chế, khoảng 1.8 - 2.0 lần so với hệ số nhân chồi của dòng PN14 có 6 thể đạt tới 2.5 lần; chi phí về nguyên vật liệu sản xuất ra 1 cây mầm mô dòng U6 cao, hơn 20-30% so với chi phí sản xuất dòng PN14. Vì vậy, việc tiến hành các nghiên cứu sâu hơn góp phần đánh giá cụ thể và tổng hợp của các yếu tố, thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy đến hiệu quả của các giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi và tạo rễ dòng U6 là hết sức cần thiết. a. Đối tượng nghiên cứu Cây bạch đàn Eucalyptus urophylla dòng U6 xuất xứ Trung Quốc đã được Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn cho trồng đại trà từ năm 1998. b. Nội dung nghiên cứu - Ảnh hưởng của nồng độ các chất đa lượng đến hiệu quả của các giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi dòng bạch đàn U6; - Ảnh hưởng của nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng GA3 cho từng giai đoạn nuôi cấy dòng bạch đàn U6; - Ảnh hưởng của nồng độ các chất vitamin đến hiệu quả của các giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi cho từng giai đoạn nuôi cấy dòng bạch đàn U6; c. Phương pháp nghiên cứu Năm 2009, dự án tiến hành tập chung nghiên cứu vào hai giai đoạn chính trong quá trình tạo cây con trên là giai đoạn tạo chồi và nhân nhanh chồi đối với dòng U6 nhằm mục đích tăng chất lượng chồi trong giai đoạn này. - Điều kiện thí nghiệm: Các mẫu được nuôi cấy trên các môi trường thí nghiệm bổ sung 30g/l đường sucrose, 5g/l agar và được khử trùng ở 1210C, 1.4 kg/cm2 trong 20 phút, pH sau khử trùng là 5.8. Mẫu được nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 270C (  20C), độ ẩm 55% (  5%). Cường độ ánh sáng 1000-3000 lux tùy từng giai đoạn nuôi cấy, sử dụng ánh sáng đèn huỳnh quang neon. Thời gian chiếu sáng từ 10-11h/ngày. 7 - Bố trí thí nghiệm: Tất cả các thử nghiệm đều đối chứng (ĐC) với môi trường sản xuất MU6. Các công thức thí nghiệm được bố trí dựa trên nguyên tắc chỉ thay đổi hàm lượng các nhân tố thí nghiệm (tỷ lệ thay đổi tùy từng nhân tố cụ thể), giữ nguyên các thành phần khác như môi trường MU6. Mỗi công thức bao gồm 30 bình, 10 mẫu/1 bình, mỗi công thức lặp lại 3 lần. Thiết kế thí nghiệm bao gồm: 5 thử nghiệm ảnh hưởng của CaCl2; 12 thử nghiệm ảnh hưởng của NH4NO3, KH2PO4, KNO3 và GA3; 3 thử nghiệm ảnh hưởng của Glycine và B6; 2 thử nghiệm ảnh hưởng của vitamin C và B2; 3 thử nghiệm ảnh hưởng của Inositol, nicotinic và B1. - Các chỉ tiêu theo dõi và đánh giá: Số liệu được thu thập sau thời gian nuôi cấy định kỳ 3 tuần đối với quá trình nhân chồi và 2 tuần đối với quá trình tạo rễ. Đếm tất cả số mẫu khi đưa vào không bị nấm, khuẩn. Đếm tất cả số chồi tạo thành và phân ra chồi hữu hiệu, chồi không hữu hiệu. Chồi hữu hiệu là chồi có cấu trúc thân đỉnh rõ ràng, cứng cáp, đạt chiều cao từ 1.5 cm trở lên (đủ tiêu chuẩn để chuyển sang giai đoạn tạo rễ). Quan sát hình thái chồi (màu sắc, thân, lá). - Dự án tiến hành thu thập các chỉ tiêu: Hệ số nhân chồi (HSNC);Tỷ lệ chồi hữu hiệu (TLCHH); Chiều cao chồi hữu hiệu (Hchồi); Quan sát hình thái thân, lá. - Xử lý thống kê các số liệu theo phương pháp thông dụng, sử dụng các chương trình Excel 2007 và SPSS 16.0 để phân tích, đánh giá. d. Kết quả nghiên cứu * Ảnh hưởng của CaCl2 Ca là thành phần quan trọng của thành tế bào và màng tế bào, giúp củng cố vững chắc thành tế bào, điều hòa cấu trúc màng. Ca có vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của tế bào và rễ. Dự án nghiên cứu thử nghiệm 5 công 8 thức khác nhau, chỉ thay đổi hàm lượng các chất CaCl2; giữ nguyên thành phần NH4NO3, KH2PO4, KNO3, MgSO4, vi lượng, vitamin, hormone. Kết quả nghiên cứu thử nghiệm sự thay đổi hàm lượng Ca ảnh hưởng lên HSNC, TLCHH và chiều cao chồi được thể hiện ở bảng 01. Bảng 01. HSNC, TLCHH và Hchồi của E. urophylla dòng U6 sau 21 ngày nuôi cấy. STT Công thức thí nghiệm 1 CT1 (ĐC) 2 CT2 3 CT3 4 CT4 5 CT5 ANOVA CaCl2 HSNC 2.03ac 2.17b 1.93acd 1.86cde 1.8de * Các chỉ tiêu theo dõi TLCHH (%) Hchồi (cm) Hình thái ab 90 2.93 Xanh đỏ, khỏe mạnh ab 90 2,87 Xanh đỏ, khỏe mạnh cde 86 2.91 Xanh, khỏe mạnh 85cde 2.89 Xanh, khỏe mạnh cde 85 2.86 Xanh, khỏe mạnh * NS Ghi chú: CT1 (ĐC): công thức đối chứng không thay đổi nồng độ, CT2: giảm nồng độ CaCl2 10%, CT3: giảm nồng độ CaCl2 20%, CT4: tăng nồng độ CaCl2 10%, CT5: tăng nồng độ CaCl2 20%. NS: Sự sai khác không có ý nghĩa về mặt thống kê với p ≤ 0.05. *:Khác biệt có ý nghĩa ở mức độ p ≤ 0.05. a,b,c,d,e: Kết quả phân nhóm theo tiêu chuẩn Ducan. Từ bảng số liệu 01 cho thấy: HSNC cao nhất ở công thức CT2 (2.17 lần), công thức đối chứng CT1 cho HSNC cao thứ 2 (2.03 lần), sau đó lần lượt là các công thức CT3 (1.93 lần), CT4 (1.86 lần), CT5 (1.8 lần).TLCHH ở công thức CT2 bằng so với công thức đối chứng (90%) và cao hơn so với các công thức còn lại CT3 (86%), CT4 (85%) và CT5 (85%).Hchồi đạt cao nhất là ở công thức đối chứng CT1, tuy nhiên biến động sai khác là không lớn. Sử dụng phương pháp phân tích phương sai và phân nhóm theo tiêu chuẩn Ducan cho thấy: Công thức thí nghiệm CT2 giảm 10% CaCl2 trong môi trường nuôi cấy cho kết quả tốt nhất, đạt HSNC 2.17 lần và TLCHH đạt 90%, Hchồi đạt 2.87cm. * Ảnh hưởng tổng hợp của nhóm các đa lượng NPK và GA3 Trong nuôi cấy mô thực vật, nitơ, kali và photpho (NPK) là 3 nguyên tố đa lượng chính, ảnh hưởng rõ rệt đến sự sinh trưởng của mô tế bào thực vật. K tham 9 gia vào hoạt động của rất nhiều enzyme, giữ cân bằng điện thế, điều hòa tính thẩm thấu của tế bào. P tham gia vào thành phần cấu tạo của acid nucleic, phospholipid của màng và chuyển hóa năng lượng. N là 1 nguyên tố không thể thiếu, tham gia vào sinh tổng hợp các protein, acid nucleic, diệp lục .... Cây đồng hóa N chủ yếu dưới dạng NO3- , NH4+ và P dưới dạng PO43-. Bên cạnh đó, GA3 có tác dụng tăng cường phân bào, kéo dài tế bào. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của sự thay đổi nhóm chất đa lượng NPK (gồm 3 nồng độ nghiên cứu được ký hiệu là i, ii và iii) và GA3 (gồm 4 nồng độ nghiên cứu được ký hiệu là a, b, c, d) được thể hiện trong bảng 02. Bảng 02. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng tổng hợp của nhóm chất NPK và GA3 đến giai đoạn tạo chồi và nhân nhanh chồi dòng U6. NPK Hormone A B C D i ii iii CT6 (ĐC) CT7 CT8 CT9 CT10 CT11 CT12 CT13 CT14 CT15 CT16 CT17 Ghi chú: Ba nồng độ nhóm chất NPK được thử nghiệm là: i) đối chứng, giữ nguyên nồng độ NH4NO3, KH2PO4, KNO3; ii) giảm nồng độ NH4NO3, KH2PO4, KNO3 đi 10%; iii) giảm nồng độ NH4NO3, KH2PO4, KNO3 đi 20%. Bốn nồng độ GA3 được nghiên cứu bổ sung vào môi trường là: a) đối chứng không bổ sung GA3; b) bổ sung GA3 nồng độ 0.4 mg/l; c) bổ sung GA3 nồng độ 0.8 mg/l; d) bổ sung GA3 nồng độ 1.2 mg/l. Ký hiệu CT6 (ĐC) là công thức 6 (đối chứng), điều kiện thí nghiệm là kết hợp của nhóm chất NPK theo nồng độ i (giữ nguyên nồng độ) và hoocmon nồng độ a (không bổ sung). Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của nhóm chất NPK và GA3 lên HSNC, TLCHH và Hchồi trong nuôi cấy mô dòng U6 được tổng hợp trong bảng 03. Từ các kết quả thu thập được, chúng tôi tiến hành tổ hợp từng nhóm số liệu theo từng nhân tố nghiên cứu là nhân tố NPK và GA3. Kết quả được biểu hiện trong hình 01. 10 Hình 01. Biểu đồ biểu thị HSNC, TLCHH và chiều cao chồi theo nhóm chất NPK và GA3. Bảng 03. HSNC, TLCHH và Hchồi của E. urophylla sau 21 ngày nuôi cấy. STT Công thức thí nghiệm HSNC 1 2.03 CT6 (ĐC) 2 CT7 1.83 3 CT8 1.77 4 CT9 1.77 5 CT10 2.07 6 CT11 1.67 7 CT12 1.77 8 CT13 1.67 9 CT14 1.77 10 CT15 1.83 11 CT16 1.63 12 CT17 1.73 ANOVA NPK NS GA3 * NPK x GA3 NS Các chỉ tiêu theo dõi TLCHH (%) Hchồi (cm) Hình thái 90% 2.93 Xanh đỏ, khỏe mạnh 82% 3.19 Xanh, non, gầy, callus 80% 3.21 Xanh, non, gầy, callus 77% 3.46 Xanh, non, gầy, callus 90% 2.89 Xanh đỏ, khỏe mạnh 82% 3.17 Xanh, non, gầy, callus 82% 3.24 Xanh, non, gầy, callus 79% 3.31 Xanh, non, gầy, callus 70% 2.26 Thấp lùn, lá bé 78% 2.62 Xanh, non, gầy, callus 75% 2.73 Xanh, non, gầy, callus 72% 2.81 Xanh, non, gầy, callus * * * * * NS Ghi chú: NS: Sự sai khác không có ý nghĩa về mặt thống kê với p ≤ 0.05. *:Khác biệt có ý nghĩa ở mức độ p ≤ 0.05. Số liệu trong bảng 03 cho thấy: HSNC của các thí nghiệm dao dộng trong khoảng 1.63 lần đến 2.07 lần. Trong đó, HSNC cao nhất là ở công thức thí nghiệm CT10 đạt 2.07 lần, công thức đối chứng CT6 đứng thứ 2 đạt 2.03 lần, thấp nhất là công thức CT15 đạt 1.63 lần. TLCHH chồi hữu hiệu dao động trong khoảng 70-90%, cao nhất là công thức CT10 và CT6 (ĐC) đạt 90%, thấp nhất là công thức CT14 đạt 70%. 11 Hchồi dao động trong khoảng 2.26cm đến 3.46cm, cao nhất là công thức CT9 đạt 3.46cm, thấp nhất là công thức CT14 đạt 2.26cm. Dựa trên những quan sát hình thái (hình 02) cho thấy: GA3 ảnh hưởng rõ rệt lên sự phát triển chiều cao chồi, có tác dụng kéo dài chồi, tuy nhiên GA3 lại làm giảm HSNC. Hơn nữa, môi trường có bổ sung GA3 cây có hiện tượng non gầy, sùi callus và đặc biệt là thân chồi không được thẳng, không phù hợp cho việc tạo rễ. Như vậy, sự bổ sung GA3 vào môi trường nuôi cấy trong trường hợp này là không đạt hiệu quả. Hình 02. Một số hình ảnh chồi của E. urophylla dòng U6 sau 21 ngày nuôi cấy. Sử dụng chương trình Excel và SPSS phân tích phương sai và xác định rõ sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm về các chỉ tiêu so sánh cho thấy: Về 2 chỉ tiêu quan trọng nhất về mặt lượng là HSNC và TLCHH (bảng 03), kết hợp với chỉ tiêu về mặt hình thái (hình 02) công thức thí nghiệm CT6 (ĐC) và CT10 cho kết quả tốt nhất. Công thức CT10 cho HSNC đạt 2.07 lần, TLCHH đạt 90%, chiều cao chồi đạt 2.89cm; công thức CT6 (ĐC) cho HSNC đạt 2.03 lần, TLCHH đạt 90%, chiều cao chồi đạt 2.93cm. 12 Như vậy, công thức thí nghiệm CT10 với việc giảm lượng nhóm chất NPK đi 10% không làm thay đổi các chỉ tiêu phát triển chồi. Tuy nhiên, việc xem xét ứng dụng kết quả giảm nhóm chất trên lại có ý nghĩa về mặt kinh tế. * Ảnh hưởng của nồng độ các chất vitamin Các chất vitamin chính được bổ sung trong nuôi cấy mô dòng bạch đàn U6 gồm có Inositol, nicotinic, B6, B1, glycine và C, B2. Trong đó, B1 được biết đến là 1 chất không thể thiếu trong nuôi cấy mô thực vật. Inositol là một vitamin kích thích tích cực đối với sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, mặc dù không cần thiết trong tất cả các trường hợp. Nicotinic và B5 giúp nâng cao sức sinh trưởng của cây. Dự án tiến hành nghiên cứu thay đổi nồng độ các vitamin được đánh giá và chia làm 3 nhóm là Inositol, nicotinic và B1; C và B2; glycine và B6. - Thử nghiệm Glycine và B6 Bảng 04. HSNC, TLCHH và Hchồi của E. urophylla sau 21 ngày nuôi cấy. STT Công thức thí nghiệm 1 CT18 (ĐC) 2 CT19 3 CT20 ANOVA Glycine + B6 HSNC 2.03ac 1.83b 2.07ac Các chỉ tiêu theo dõi TLCHH (%) Hchồi (cm) Hình thái 90 2.93 Xanh đỏ, khỏe mạnh 86 2.77 Xanh, khỏe mạnh 89 2.92 Xanh đỏ, khỏe mạnh * NS NS Ghi chú: NS: Sự sai khác không có ý nghĩa về mặt thống kê với p ≤ 0.05. *:Khác biệt có ý nghĩa ở mức độ p ≤ 0.05. a,b,c: Kết quả phân nhóm theo tiêu chuẩn Ducan. CT18: giữ nguyên nồng độ glycine và B6. CT19: không bổ sung glycine và B6 vào môi trường. CT20: giảm nồng độ glycine và B6 đi 50%. Theo dõi các chỉ tiêu của chồi cho kết quả như bảng 04 cho thấy: - Về HSNC: HSNC ở công thức thí nghiệm CT20 đạt 2.07 lần là cao nhất, công thức CT18 (đối chứng) đạt 2.03 lần đứng thứ 2, thấp nhất là công thức CT19 đạt 1.83 lần. - Về TLCHH: TLCHH giữa các công thức sai khác không nhiều, công thức CT18 đạt 90%, CT20 đạt 89% và CT19 đạt 86%. 13 - Về chiều cao chồi: giữa các công thức không có sự sai khác cũng như sự biến động lớn về chiều cao. Hchồi được sắp xếp theo thứ tự từ cao xuống thấp là CT18 đạt 2.93cm, CT20 đạt 2.92cm, CT19 đạt 2.77cm. Kết quả phân tích phương sai cho thấy: sự thay đổi về nồng độ Glycine và B6 giữa các công thức thí nghiệm chỉ ảnh hưởng đến HSNC, không ảnh hưởng đến TLCHH cũng như chiều cao chồi. Tuy nhiên, kết quả phân nhóm theo tiêu chuẩn Ducan cho thấy: giữa các công thức thí nghiệm CT18 (đối chứng) và CT20 (giảm nồng độ) không có sự sai khác (ở cùng 1 nhóm theoo tiêu chuẩn Ducan). Như vậy, sự giảm nồng độ ở công thức CT20 có thể được xem xét về hiệu quả kinh tế. - Thử nghiệm vitamin C và B2 Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của vitamin C và B2 đến khả năng tạo chồi dòng U6 được thể hiện trong bảng 05. Bảng 05. HSNC, TLCHH và Hchồi của E. urophylla sau 21 ngày nuôi cấy. STT Công thức thí nghiệm 1 CT21(ĐC) 2 CT22 ANOVA C + B2 HSNC 2.03 2.17 Các chỉ tiêu theo dõi TLCHH (%) Hchồi (cm) Hình thái 90 2.93 Xanh đỏ, khỏe mạnh 91 3.14 Xanh đỏ, khỏe mạnh NS NS NS Ghi chú: NS: Sự sai khác không có ý nghĩa về mặt thống kê với p ≤ 0.05. CT21: giữ nguyên nồng độ C và B2. CT22: không bổ sung C và B2 vào môi trường. Số liệu chỉ ra trên bảng 05 cho thấy, không có sự biến động lớn về khả năng phát sinh chồi giữa công thức đối chứng CT21 và công thức thí nghiệm CT22 không bổ sung vitamin C và B2. Kết quả phân tích phương sai và dựa trên quan sát hình thái cho thấy: vitamin C và B2 có mặt không có tác động thay đổi các chỉ tiêu sinh trưởng, phát 14 triển của chồi. C và B2 chỉ có tác dụng là chất chống oxi hóa, tăng khả năng sống (thích nghi) của chồi. Như vậy, sự bổ sung C và B2 là cần thiết đối với những cây có khả năng thích nghi kém, khó nhân giống. Công thức thí nghiệm CT22 không bổ sung C và B2 vào môi trường nhân giống cây E. urophylla không làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển chồi. - Thử nghiệm Inositol, nicotinic và B1 Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của Inositol, nicotinic và B1 đến khả năng tạo chồi dòng U6 được thể hiện trong bảng 06. Bảng 06. HSNC, TLCHH và H chồi của E. urophylla sau 21 ngày nuôi cấy. STT Công thức thí nghiệm 1 CT23 (ĐC) 2 CT24 3 CT25 ANOVA Inositol + nicotinic + B1 Các chỉ tiêu theo dõi HSNC TLCHH (%) Hchồi (cm) Hình thái ac 2.03 90 2.93 Xanh đỏ, khỏe mạnh b 1.8 89 2.74 Xanh đỏ, khỏe mạnh ac 92 3.05 Xanh đỏ, khỏe mạnh 2.07 * NS NS Ghi chú: NS: Sự sai khác không có ý nghĩa về mặt thống kê với p ≤ 0.05. *:Khác biệt có ý nghĩa ở mức độ p ≤ 0.05. CT23: giữ nguyên nồng độ Inositol, nicotinic và B1. CT24: giảm nồng độ Inositol, nicotinic và B1 đi 50%. CT25: tăng nồng độ Inositol, nicotinic và B1 lên 50%. Kết quả phân tích phương sai và dựa trên quan sát hình thái cho thấy: vitamin Inositol, nicotinic và B1 ảnh hưởng rõ rệt lên HSNC và không ảnh hưởng đến TLCHH cũng như chiều cao chồi. Công thức CT24 giảm nồng độ các vitamin Inositol, nicotinic và B1 đi 50% có HSNC, TLCHH cũng như chiều cao chồi là thấp nhất do sự giảm đột ngột hàm lượng lớn các vitamin quan trọng Inositol, nicotinic và B1. Sự sai khác giữa công thức đối chứng CT23 (ĐC) và CT25 (tăng nồng độ 50%) không có ý nghĩa về mặt thống kê. Như vậy, sự thay đổi (hay tăng nồng độ) các vitamin Inositol, nicotinic và B1 trong trường hợp này là không hiệu quả. 15 * Thử nghiệm nhân giống và tạo bình giống gốc Dự án đã tạo được 300 bình giống gốc cây bạch đàn E. urophylla dòng U6 để lưu giữ trong phòng thí nghiệm. e. Kết luận Từ những nghiên cứu thực nghiệm về ảnh hưởng của nồng độ các chất trong môi trường nuôi cấy đến hiệu quả của giai đoạn tạo chồi, nhân nhanh chồi và tạo rễ dòng U6 năm 2009, chúng tôi đi đến một số kết luận sau: - Thử nghiệm giảm 10% hàm lượng CaCl2 so với môi trường sản xuất giúp tăng hệ số nhân chồi lên 2.17 (vượt đối chứng có hệ số nhân chồi là 2.03), tỷ lệ chồi hữu hiệu đạt 90% (bằng đối chứng); - Thử nghiệm giảm hàm lượng nhóm chất NPK (NH4NO3, KH2PO4, KNO3) đi 10% cho hệ số nhân chồi đạt 2.07 lần, tỷ lệ chồi hữu hiệu đạt 90%, chiều cao chồi đạt 2.89cm; - GA3 có tác dụng kéo dài chồi, làm tăng chiều cao của chồi; gây hiện tượng sùi callus, cây non mảnh và không thẳng; - Nhóm vitamin C và B2 không có tác dụng kích thích phát triển chồi, có tác dụng chống oxi hóa, tăng khả năng thích nghi; - Thử nghiệm giảm hàm lượng nhóm vitamin Glycine và B6 50% so với đối chứng không gây ảnh hưởng đến sự phát triển của chồi; - Dự án đã tạo đủ 300 bình giống gốc dòng U6. 3.2.1.2. Thử nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ, độ ẩm cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng đến tạo chồi, nhân nhanh chồi và tạo rễ Công nghệ nuôi cấy mô dòng bạch đàn U6 được ứng dụng và chuyển giao thành công tại VNCCNLG từ năm 1993. Tuy nhiên, công nghệ cũng như quy trình kỹ thuật chuyển giao mới chỉ chú trọng đến các yếu tố thành phần dinh dưỡng, vitamin và hoocmon; mà chưa có báo cáo, nghiên cứu đầy đủ về ảnh 16