Tài liệu đồ án môn học công nghệ cố định enzym và ứng dụng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC Bộ MÔN CÔNG NGHỆ THựC PHẨM C5S CQ ỈO ĐỒ ÁN MÔN HỌC CÔNG NGHỆ CỐ ĐỊNH ENZYM YÀ ỨNG DỤNG SVTH : NGUYỄN BẢO Dư MSSV : 60700443 GYHD : TS. TRẦN BÍCH LAM TP Hồ Chí Minh, 6/2011 Đồ án môn học NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Tp. Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2011 Chữ ký của giáo viên /V 11 ~ Đồ án môn học LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trần Bích Lam đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án. Cảm ơn quý thầy cô bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Kỹ thuật Hóa Học, trường Đại học Bách Khoa TpHCM đã giảng dạy nhiệt tình và truyền đạt những kiến thức quý báu của mình giúp tôi hoàn thành đồ án. Xin cảm ơn tất cả bạn bè, những người đã quan tâm, giúp đỡ tôi hoàn thành đồ án này. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6/2011 Nguyễn Bảo Dư /V iii ~ Đồ án môn học MỤC LỤC TRANG BÌA...................................................................................................................................i NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN .........................................................................ii LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................................. iii MỤC LỤC ....................................................................................................................................iv DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................................vi DANH MỤC BẢNG.....................................................................................................................vi Chương 1: TỒNG QUAN .........................................................................................................1 1.1. Lịch sử phát triển của enzym cố định.............................................................................1 1.2. Sơ lược về enzym cố định ..............................................................................................2 1.2.1. Định nghĩa ..............................................................................................................2 1.2.2. Đặc điểm của enzym cố định ..................................................................................2 1.2.3. Ưu nhược điểm của enzym cố định ........................................................................3 1.2.4. Các phương pháp cố định enzym ............................................................................3 1.2.5. Vật liệu cố định ..................................................................................................... 5 1.2.6. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định enzyme ..................................................7 Chương 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH .................................................................9 2.1. ứng dụng trong công nghệ thực phẩm............................................................................9 2.1.1. Enzym ß-galactosidase............................................................................................9 2.1.1.1. Giới thiệu về enzym ß-galactosidase ............................................................9 2.1.1.2. Nguồn thu nhận enzym ß-galactosidase ..........................................................9 2.1.1.3. Các phương pháp cố định enzym ß-galactosidase .........................................10 2.1.1.4. ứng dụng của enzym ß-galactosidase cố định................................................13 2.1.1.4.1. Thủy phân lactose trong sữa và lactoserum .............................................13 2.1.1.4.2. Tổng họp Galacto-Ohgosaccharides (GOSs)...........................................16 2.1.2. Enzym lipase .........................................................................................................17 2.L2.1. Giới thiệu về enzym hpase..................................................................................17 2.L2.2. Nguồn thu nhận enzym lipase.............................................................................17 2.1.2.3. Các phương pháp cố định enzym lipase ........................................................18 2.1.2.4. ứng dụng enzym lipase cố định trong công nghệ thực phẩm.........................20 2.1.2.4.1. ứng dụng lipase cố định tổng họp các ester có hương trái cây ................20 2.1.2.4.2. ứng dụng enzyme lipase cố định để sản xuất Mên tục monoacylglycerol từ olein dầu cọ .......................................................................................................... 21 2.1.3. Enzym a-galactosidase (raffinase).........................................................................23 /V IV ~ Đồ án môn học 2.2. 2.1.3.1. Giói thiệu về enzym a-galactosidase ............................................................. 23 2.L3.2. Nguồn thu nhận enzym a-galactosidase ......................................................... 23 2.L3.3. Cách phương pháp cố định enzym a-galactosidase........................................ 23 2.L3.4. ứng dụng của enzym riffinase cố định ........................................................... 26 ứng dụng trong phân tích........... ................................................................................27 2.2.1. Tổng quan về cảm biến sinh học (biosensor).......................................................27 2.2.1.1. Giới thiệu về cảm biến sinh học .................................................................... 27 2.2.1.2. Lịch sử phát triển cảm biến sinh học ............................................................. 27 2.2.1.3. Phân loại......................................................................................................... 28 2.2.1.4. Các yếu tố sinh học ........................................................................................ 29 2.2.1.4. L .......................................................................................................Enzym 29 2.2.1.4.2. Kháng thể ............................................................................................... 29 2.2.1.4.3. Vi sinh vật .............................................................................................. 30 2.2.1.5. Bộ chuyển đổi (transducer) ............................................................................ 30 2.2.1.5.1. Chuyển đổi điện hóa................................................................................ 30 2.2.1.5.2. Chuyển đổi quang.................................................................................... 30 2.2.1.5.3. Chuyển đổi nhiệt ..................................................................................... 30 2.2.1.5.4. Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric) ................................... 30 2.2.2. Cảm biến sinh học sử dụng L-glutamate oxidase và L-glutamate dehydrogenase cố định dùng để phân tích monosodium glutamate trong thực phẩm.................................. 31 2.2.2.1. Giới thiệu........................................................................................................ 31 2.2.2.2. Phương pháp thí nghiệm ................................................................................ 31 2.2.2.2.1. Các hóa chất sử dụng .............................................................................. 31 2.2.2.2.2. Sự cố định enzym .... .............................................................................. 31 2.2.2.23. Điện cực ................................................................................................. 32 2.2.2.2A Thử nghiệm ............................................................................................ 32 2.2.2.2.5. Quá trinh phản ứng ................................................................................. 33 2.2.2.2. Ó.Cấu hình nhiệt độ và pH 33 2.2.2.23. Xác định giá trị Km và Vmax................................................................... 34 2.2.2.2.8. Sự ổn định của màng cố định .................................................................. 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................................36 /V V~ Đồ án môn học DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Mô hình biosensor...................................................................................................... 27 Hình 2.2: Mô hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L-GLOD-L-GLDH cố định......... 32 Hình 2.3: Đường hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG của cặp L-GLOD-LGLDH cố định trong cảm biến sinh học .................................................................................... 33 Hình 2.4: pH ở nhiệt độ 25 ± 2 °c có mặt 2mM NADPH và lOmM ammonium với nồng độ MSG 1.2mg/L ....... ......’ ......................... .’ ............................................................................... 34 Hình 2.5: Nhiệt độ ở pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL ......................................................... 34 Hình 2.6: Hoạt túứi của enzym cố định trên cảm biến sinh học trong thời gian 60 ngày: LGLOD 25U-L-GLDH 143.2U; L-GLOD 25U-L-GLDH 35U; L-GLOD 25U .................... ..... 35 DANH MỤC BẢNG • Bảng 1.1: Ưu - Nhược điểm của các phưorng pháp cố định enzyme ........................................... 4 Bảng 2.1: Tóm tắt các phưcmg pháp cố định enzym P-galactosidase ........................................ 13 Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng các kỹ thuật cố định khác nhau....................................... 15 Bảng 2.3: Nguồn vsv thu nhận enzym lipase và tứứi chất enzyme lipase ................................. 18 Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học Chương 1: 1.1. TỔNG QUAN Lịch sử phát triển của enzym cố định [1] - Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và cho thấy rằng enzym invertase của nấm men (EC.3.2.1.2.6) khi hấp thụ vào than có khả năng thủy phân đường saccharose. Sau đó ữên thế giới xuất hiện nhiều báo cáo về khả năng cố định enzym bằng liên kết đồng hóa trị trên chất mang. Trước năm 1953 chưa có một nghiên cửu nào về enzym không hòa tan được ứng dụng vào thực tế. - Năm 1953, Grubhofer và Schleith đã cố định được một số enzym như carboxy peptidase, diastase, pepsin và ribonuclease trên polyaminostyrene bằng liên kết đồng hóa trị và các nghiên cửu trên mới bắt đầu thử nghiệm ứng dụng qui mô pilot. - Năm 1954, Chang đã tạo ra được các vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzym để chống lại dị ứng khi đưa enzym vào cơ thể. - Năm 1963, Bemfeld và Wan đã thí nghiệm thành công việc nhốt các enzym như amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào gel polyacrylamide. - Năm 1964, Quiociio và Richards đã mô tả phương pháp liên kết chéo cố định carboxy peptidase A với glutaraldehyde. Cũng trong năm này Chang đã triển khai phương pháp tạo vi nang để nhốt enzym carbonic anhydrase. - Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành công xưởng thực nghiệm để sản xuất glucose bằng glucoamylase cố định. - Năm 1969, Chibata và những người cộng tác ở công ty Tanabe Seiyaku - Nhật đã là những người đầu tiên thực hiện thành công việc áp dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp. Theo phương pháp cố định enzym của các tác giả người Nhật, enzym aminoacylase của nấm sợi đã được gắn vào DEAE-sephadex thông qua liên kết ion và sử dụng chúng cho các quá trình thủy phân. - Năm 1970, Mosbach đã tiến hành cố định ba loại enzym: P-galactosidase, hexokinase, glucophosphatase bằng hên kết cộng hóa trị với các hạt sephadex. - Năm 1971, Gregoriadis đã triển khai liposome có chứa amyloglucosidase. - Năm 1973, Chibata và các cộng tác viên cũng là những người đầu tiên thành công trong việc cố định tế bào vi sinh vật để sản xuất L-aspartate từ ammonium fumarate bằng gel acrylamid. Tế bào E.coli chứa trong gel có hoạt tính aspartate rất cao. - Đến năm 1987, bằng công nghệ ứng dụng enzym glucoisomerase cố định, đã tiến hành sản xuất sữo fructose từ glucose theo qui mô công nghiệp. Cho đến nay cổ khoảng 4,5 triệu tấn sừo fructose được sản xuất theo phưong pháp enzym cố định. - Ngoài sàn phẩm trên, enzym cố định còn được ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men, /V 1 Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học chống ô nhiễm môi trường và cả trong y học. 1.2. Sơ luợc về enzym cố định 1.2.1. Định nghĩa [1] Enzym cố định có thể hiểu theo 2 nghĩa: - Nghĩa hẹp: enzym không hòa tan là enzym được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này có thể tách riêng vói môi trường dung dịch phàn ứng. Pha enzym không hòa tan trong nước và được gắn với các polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn. - Nghĩa rộng: cắc chất xúc tác cố định là các enzym, tế bào, cơ thể sống ờ trạng thái cho phép sử dụng lại. Như vậy, theo nghĩa rộng, enzym không hòa tan bao gồm cả enzym được cố định vào một chất mang, cả enzym có trong tế bào sống, chúng được cố định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần. - Enzym không hòa tan hay enzym cố định thường là những enzym hòa tan được gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quấ trình gắn này mà enzym từ trạng thái hòa tan chuyển sang không hòa tan. 1.2.2. Đặc điểm của enzym cố định [1] Enzym cố định có đặc điểm như sau: - Hoạt tính của enzym cố định thường nhỏ hơn hoạt tính của enzym tự do cùng loại. Sở dĩ có sự thay đổi hoạt tính riêng của enzym cố định là do những nguyên nhân sau: • Do ảnh hưởng điện tích của chất mang: khi điện tích của chất mang có sự khác biệt với điện tích của enzym thì khi gắn enzym vào chất mang, cấu trúc không gian của enzym có sự thay đổi ở mức độ nhất định. Chính vì sự thay đổi cấu trúc này mà sự kết họp giữa enzym và cơ chất sẽ kém đi, dẫn đến hoạt tính của chứng cùng giảm. • Do enzym bị nhốt vào mạng lưới hoặc bị liên kết bởi chất mang khiến cho sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất bị kém đi. - Enzym cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis - Menten nhưng có một số sai khác nhất định: • Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzym và chất mang. • Xảy ra hiện tượng cản trở khuếch tán của cơ chất và sản phẩm làm giảm tốc độ phản ứng. - Enzym cố định thường có tính bền nhiệt hơn enzym tự do nhờ có tác dụng che chở của chất mang. - Enzym cố định thường có pH tối ưu không trùng với enzym tự do cùng loại. - Enzym cố định do có chất mang che chắn nên được bảo vệ tốt hơn enzym tự do. - Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần và dễ dàng tách ra khỏi cơ chất một cách dễ /V 2~ Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học dàng sau phản ứng và độ bền của enzym cố định cao hơn enzym tự do. 1.2.3. Ưu nhược điểm của enzym cố định [1] Ưu điểm: - Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài. - Enzym cố định không lẫn vào trong sàn phẩm cuối của phản ứng enzym, do đó nó không gây ảnh hường xấu đến chất lượng sản phẩm, hay nói cách khác chúng ta không tốn chi phí cho việc tách enzym ra khỏi sản phẩm - Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang - enzym ra khỏi dung dịch cơ chất. - Enzym cố định tương đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn enzym tự do. - Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phương pháp liên tục. Nhươc điểm: - Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzym. - Trong đa số trường họp, enzym có thể bị giảm hoạt mất hoạt tính sau quấ trình cố định. - Tuy nhiên, những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà enzym cố định mang lại. Do vậy, ngày càng có nhiều nghiên cứu về cố định enzym cũng như ứng dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp. 1.2.4. Các phương pháp cố định enzym [1] Các phương pháp cố định enzym được chia thành 2 nhóm: hóa học và vật lý. /V 3 Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học Bảng 1.1: Ưu - Nhược điểm của các phương pháp cổ định enzyme [1] Phương pháp hóa học Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Phương pháp gắn enzym lên Liên kết giữa enzym và chất mang là Hoạt tính enzym có thể bị giảm chất mang bằng liên kết Mên kết bền, do đó hạn chế tối đa sự do những biến đổi về cấu trúc cộng hóa trị mất mát enzym trong quá trình phản của enzym trong quá trình cố ứng. định. Phương pháp gắn các phân Tạo được Mên kết rất bền trước các Chi phí cao, thao tác thực hiên tử enzym lại với nhau bằng tấc nhân pH, nhiệt độ... tương đối phức tạp. liên kết cộng hóa trị Thường được dùng phối họp với các Hoạt tính enzym có thể bị giảm phương pháp khác. do những biến đổi về cấu trúc của enzym trong quấ trình cố định. Phương pháp vật lý Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm Phương pháp gắn enzym lên chất mang bằng tác nhân vật Thao tấc thực hiện đơn giản. Do lực tương tác giữa enzym và lý chất mang yếu nên dễ xảy ra Điều kiện tiến hành cố định enzym ôn hòa nên không làm mất hoạt tính của enzym trong quá trình cố định. Có khả năng tái sử dụng chất mang. Phương pháp nhốt enzym Thao tác đơn giản. hiện tượng nhả hấp phụ trong quá trình sử dụng enzym cố định do khuấy trộn hay do thay đổi nhiệt độ, pH của môi trường. Chỉ thích họp cho phản ứng với cơ chất có khối lượng phân tử Không đòi hỏi phải có các nhóm tạo Mên kết nên phù họp với nhiều loại enzym. Hiệu quả cố định enzym cao. Có thể cố định đồng thòi nhiều enzym. Phương pháp hóa hoc: /V 4~ nhỏ. Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học - Gắn enzym lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị. - Gắn các phân tử enzym lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị. Phương pháp vât lý: - Hấp phụ enzym lên chất mang bằng liên kết vật lý như sau: lực mao quản, liên kết ion, lực Van der Walls.... - Phương pháp nhốt enzym trong khuôn gel hoặc màng bao vi thể. 1.2.5. Vật liệu cố định [1] Vật liệu và phương pháp cố định là hai yếu tố có tính chất quyết định đến hiệu quả của quá trình cố định enzym Trong đó, không có đặc điểm, tính chất của vật liệu cố định nào thích họp cho tất cả các loại enzym và cũng không có enzym nào thích họp với tất cả các loại vật liệu cố định. Vật liệu cố định enzym và tế bào có thể chia làm hai loại: vật liệu vô cơ và vật liệu hữu cơ. Vât liêu vô cơ: - Đặc điểm: chất mang vô cơ bền với các tác động bên ngoài, không bị vi sinh vật ăn mòn, phân hủy, nhưng việc gắn với enzym thường khó khăn hơn. - Một số chất mang vô cơ thông dụng như: thủy tinh xốp, cấc oxid kim loại như oxid nhôm, oxid mangan, oxid magie, Silicagel... Vât liêu hữu cơ: - Đặc điểm: chất mang hữu cơ thường có các nhóm hoạt động hóa học như: -NH2, - COOH, -OH, -SH,... nên dễ kết gắn với enzym nhưng độ bền với tác động của môi trường không cao, đặc biệt các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấn công. • Các polymer tư nhiên: - Tinh bột là vật liệu phong phú rẻ tiền. Tinh bột dùng để đóng mạch, diethanolamin tinh bột đã được dùng làm chất mang cố định enzym như lipase, glucoisomerase, trypsin, amylase. Nhược điểm của tinh bột là độ trương kém, thiếu các nhóm chức năng nên khả năng cố định và hoạt tính enzym còn thấp. Tinh bột thường được ghép copolymer với các vinyl monomer ưa nước như acrylamide, acrylic acid để cải thiện tính chất cơ lý, độ trương nở và tạo các nhóm chức năng trên bề mặt. - Cellulose và dẫn xuất của Cellulose là CM-cellulose, DEAE-cellulose, nitrocellulose... là những vật liệu rẻ hơn so với agarose nhưng lại không đồng nhất, thường chỉ sử dụng ở dạng sợi, và dạng tinh thể (microcrystalline). Cellulose là vật liệu được nghiên cứu cố định enzym đầu tiên, các quy trình cố định trên vật liệu này được nghiên cứu khá hoàn chỉnh. Cellulose thường được dùng để hấp thụ, hên kết ion, Mên kết cộng hóa trị với enzym hoặc nhốt trong gel. - Chitin là họp chất được Braconnot phân lập từ năm 1811 và Odier đặt tên là chitin từ năm /V 5 Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học 1823. Chitin là một polymer sinh học có nhiều triển vọng trong nghiên cứu và ứng dụng làm vật liệu cố định enzym và tế bào. Chitin là một polymer sinh học rất phổ biến trong tự nhiên, chỉ đứng sau cellulose. - Chitin có cấu trúc tương tự cellulose, là một polymer của các gốc 2-acetoamide-2- deoxyß-D-glucoza, Mên kết với nhau bởi Mên kết ß-l,4-glycoside. Chitin có trong thành phần cấu trúc vỏ của côn trùng, vỏ tôm cua, sò, vách tế bào sinh vật,...Chitin là một vật Mệu có chứa nhóm chức -OH và cho Mên kết với enzym, có cấu trúc siêu lỗ, có khả năng hấp thụ tốt, dễ tạo màng. Chitin có cấu trúc mạng tinh thể chặt chẽ, không chỉ có các Mên kết hydro hình thành trong chuỗi mà còn có giữa cấc lóp với nhau trong mạng tinh thể. Chitin là một polymer kỵ nước, độ trương thấp, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ và bền về mặt hóa học. Gần đây có rất nhiều nghiên cứu cố định enzym trên chitin, chủ yếu bằng phương pháp hấp thụ và Mên kết công hóa trị qua cầu nối glutaraldehyde. Chitin được tìm thấy trong thành tế bào của nấm sợi. Nó là chất hữu cơ chiếm lượng lớn để hình thành nên lóp vỏ ngoài của động vật không xương sống (côn trùng, giáp xác...). về mặt cấu trúc, chitin có cấu trúc tương tự như cellulose, điểm khác biệt hóa học duy nhất là nhóm acetamido ở vị trí số 2 trên khung carbon của chitin được thay thế cho nhóm hydroxyl (-OH) ờ ceUulose. - Chitosan là dẫn xuất của chitin khi được deacetyl hóa trong kiềm mạnh. Chitosan dễ tạo màng, tạo hạt, có cấu trúc siêu lỗ, có nhóm - NH2. Chitosan có thể cố định enzym bằng phương pháp hấp phụ, phương pháp cộng hóa trị, hoặc nhốt enzym trong gel chitosan. Chitosan không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ như acid formic, acid dipic, acid acetic. Chitosan là một polymer sinh học có trọng lượng phân tử cao, có các nhóm amin hoạt động, cấc nhóm hydroxyl có thể tham gia phàn ứng hóa học. - Anginate, carrageenan, cả hai vật Mệu này tạo gel trong dung dịch CaCỈ2 dùng để nhốt tế bào, enzym. - Chất mang protein thường là gelatin, keratin, albumin,... thường có khả năng dễ tạo màng, tạo hạt, nhốt enzym trong khuôn gel với tác nhân đóng mạch là glutaraldehyde; nhược điểm của nhóm này là thường kém bền, dễ bị nhiễm khuẩn. /V 6~ Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học • Các polymer tone hơp: - Cấc polymer tổng họp được sử dụng làm chất mang cố định enzym như polyacrylamide, polyester, polyvinylalcohol, polyvinylacetate, polyacrylic, polyhydroxyethylacrylate, polystyrene,... - Ưu điểm chung của các polymer tổng họp này là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ với sự tấn công của vi khuẩn, độ trương tốt, một số polymer có thể điều chỉnh kích thước siêu lỗ. - Nhược điểm là một số polymer có giá thành cao, khả năng tương họp sinh học kém, không thể phân hủy trong môi trường tự nhiên nên gây ô nhiễm môi trường. 1.2.6. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự cố định enzyme [1] Ảnh hưởne của chất mans - Cấc tính chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền cơ hóa, diện tích, tính háo nước và kỵ nước,.. .đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng enzym được liên kết, đến tính bền và hoạt tính sinh học của các chất dẫn xuất enzym không tan. - Bản chất hóa học của chất mang cũng ảnh hưởng đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzym và tới khả năng chất mang hấp phụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng. - Sự định vị enzym giúp cho dẫn xuất enzym không tan có tính bền nhiệt cao hơn enzym tan. - Chất mang có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzym trong các dung môi, làm đứt nối liên kết hydro và liên kết kỵ nước Ảnh hưởns của vH - Khi lực ion thấp thì nồng độ H+ gần chất mang tích điện âm cao hơn, còn gần chất mang tích điện dương cao hơn trong dung dịch. Kết quả là pH tối ưu của enzym liên kết đồng hóa trị với chất mang tích điện âm sẽ chuyển dịch sang pH kiềm so với enzym hòa tan, trái lại nếu enzym liên kết đồng hóa trị với chất mang tích điện dương thì pH tối ưu sẽ chuyển dịch sang phía pH acid. - Khi lực ion lớn thì điện tích của chất mang được trung hòa bởi các ion trái dấu và pH tối ưu của enzym cố định gần giống enzym hòa tan. Ảnh hưởne của enzyme Theo Poltorak, một trong những nguyên nhân làm giảm hoạt độ của enzym cố định là sự tương tác protein-protein giữa các phân tử enzym đã được liên kết. Trong mọi trường họp đều thấy hoạt độ riêng của chế phẩm bị giảm đi cùng với sự tăng lượng enzym được kết họp trên một đơn vị diện tích chất mang. 'J /N/ /%/ Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học Ảnh hưởne của phươns pháp cố đinh - Khi cố định bằng phương pháp hấp phụ vật lí, các enzym ít bị thay đổi cấu trúc không gian do đó ft ảnh hường đến hoạt tính. Nhưng do phương pháp này sử dụng các liên kết yếu như liên kết kị nước, liên kết hydro,... nên enzym dễ bị giải hấp phụ. - Khi cố định bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị sẽ có độ ổn định cao khi sử dụng dưói các điều kiện như nhiệt độ, pH, có khả năng chống chịu cao đối với sự ảnh hường của các dung môi hữu cơ và các tác nhân vật lí khác. Tuy nhiên, liên kết cộng hổa trị sẽ làm thay đổi mạnh mẽ cấu trúc không gian của enzym nên hoạt tính của enzym cố định thường bị giảm đi đáng kể. - Khi cố định bằng phương pháp bao gói, quá trình hoạt động của enzym phụ thuộc vào hai yếu tố chính là kích thước chất mang polyme và trọng lượng của phân tử cơ chất. Hai yếu tố này sẽ làm giảm tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác. Hơn nữa, cùng với hoạt tính xúc tác cao của enzym sẽ làm xuất hiện gradient nồng độ của cơ chất và sản phẩm của dung dịch và chất mang chứa enzym cố định. Điều này làm cho các thông số công nghệ thay đổi, đó là điều cần để ý khi thiết lập quy mô của quá trình. Chương 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH 2.1. ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 2.1.1. Enzym p-galactosidase 2.1.1.1. Giói thiệu về enzym Ịỉ-galactosỉdase [2] Enzym P-galactosidase (EC.3.2.1.23) là một lactase thủy phân đường lactose thành các monomer là glucose và galactose. Việc sử dụng P-galactosidase để thủy phân lactose trong sữa và whey là một trong những ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và các sàn phẩm từ sữa. Enzym này có thể được sử dụng dưới dạng hòa tan hoặc dạng cố định nhưng dạng hòa tan chỉ có thể sử dụng trong qui trình sản xuất gián đoạn, còn dạng cố định có lợi thế hon là có thể sử dụng tốt cho cả hai qui trình sản xuất gián đoạn và liên tục. Mặc dù hầu hết các ngành công nghiệp vẫn thủy phân lactose với enzym tự do, nhưng việc sử dụng enzym P-galactosidase cố định là một lĩnh vực đáng quan tâm vì những tiềm năng của nó. 2.1.1.2. Nguồn thu nhận enzym p-galactosỉdase [2] Enzym P-galactosidase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như vi sinh vật, thực vật, và động vật. Tuy nhiên, tính chất của enzym được thu nhận từ các nguồn khấc nhau có sự khác nhau rõ rệt. Enzym thu nhận từ nguồn thực vật và động vật có giá trị kinh tế thấp, nhưng thu nhận từ nguồn vi sinh vật lại có nhiều ưu thế như dễ dàng xử lí thu nhận, tốc độ nhân giống vi sinh vật cao, năng suất thu nhận sản phẩm cao. Một số vi sinh vật được xem là nguồn thu nhận tiềm năng của loại enzym này. /V 8 Chương 2: ửng dụng Đồ án môn học Bacteria: Alicyclobacỉllus acidocaldarìus subsp, Rittmannii Arthrobacter sp,_Bacittus acidocaldarỉus, B. circulans, B. coagulans, B. subtilis, B. megaterum, B. stearothermophỉlus, Bacteriodes polypragmatus, Bifidobacterium bifidum, B. infantis, Clostridium acetobutylicum, c.thermosulfurogens, Corynebacterium murisepticum, Enterobacter agglomerans,E. cloaceae, Escherichia coll, Klebsiella pneumonia, Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus,L. helviticus, L. kefiranofaciens, L. lactis, L. sporogenes, L. themophilus, L. delbrueckii, Leuconostoc citrovorum, Pediococcus acidilactỉ, p. pento, Propioionibacterium shermanii, Pseudomonas fluorescens, Pseudoalteromonas haloplanktis Streptococcus cremoris, s. lactis, s. thermophius, Sulfolobus solfatarius, Thermoanaerobacter sp.,Thermus rubus, T. aquaticus, Trichoderma reesei, Vibrio cholera, Xanthomonas campestris. Fungí: Alternaría alternate, A. palmi, Aspergillus foelidis, A. fonsecaeus, A. fonsecaeus, A. Carbonarius, A. Oryzae, Auerobasidium pullulans, Curvularia inaequalis, Fusarium monilliforme, F. oxysporum, Mucor meihei, M. pusillus, Neurospora crassa, Penicillum canescens, p. chrysogenum, p. expansum, Saccharopolyspora rectivergula, Scopulariapsis sp, Streptomyces violaceus. Yeast: Bullera singularis, Candida pseudotropicalis, Saccharomyces anamensis, s. lactis, S.fragilis, Kluyveromyces bulgaricus, K.fragüis, K. lactis, K.marxianus. 2.1.1.3. Các phương pháp cố định enzym ß-galactosidase [2] Phươns pháp hấữ phu vât lý Cấc chất vô cơ như nhôm, silic, thủy tinh xốp, đất sét, bentonite,... chất hữu cơ như cellulose, tinh bột, than hoạt tính, nhựa trao đổi ion,... được sử dụng làm chất mang hấp phụ trong cố định enzym. Hơn nữa có thể xử lí thêm với glutaraldehyde để tăng sự ổn định. Enzym ß-galactosidase từ K. fragilis và K. lactis được cố định trên chitosan có hoạt độ riêng 0.9-2.2 u/mg trọng lượng khô của tế bào. Hoạt tính của enzym được cố định từ K. fragilis thì cao hơn nhưng độ ổn định của enzym cố định từ A. oryzae thì cao hơn 5-14 lần tùy thuộc vào phương pháp cố định. Khi dùng phương pháp hấp phụ người ta nhận thấy hoạt tính cao nhất thu được khi dùng enzym từ nấm men với chất mang là Ostsorb-DEAE. Hơn nữa, sự cố định tối đa đạt được ở pH 5.5 và kết quả tối ưu thu được khi có mặt dung dịch đệm citrate/phosphate trong suốt quá trình cố định /?-galactosidase từ E. coli bằng phương pháp hấp phụ vật lí trên chromosorb-W. Một thiết bị phản ứng mới chứa /?-galactosidase từ B. circulans được cố định trên màng có gờ làm từ PVC và silica được sử dụng để thủy phân lactose trong sữa gầy. Việc cố định yổ-galactosidase từ Bullera singularis trên hạt Chitopearl BCW 3510 (970 GƯ/g nhựa) bằng phương pháp hấp phụ đơn giản cũng được thực hiện. Các nghiên cứu về động học của enzym ß-galactosidase từ Kluyveromces marxianus /V 9~ Chương 2: ửngdụng Đồ án môn học (Saccharomyces) lactis được cố định trên những chất mang khác nhau như nhôm và silica đã cho thấy rằng hoạt tính của enzym cố định phụ vào bản chất hóa học tự nhiên và cấu trúc vật lí của chất mang. Khi kích thước lỗ của các hạt chất mang tăng thì hoạt tính của enzym giảm mạnh. Sự cố định ß- galactosidase từ Thermus sp. diễn ra rất nhanh trên PEI-Sepabeads và DEAE-Agarose. Tuy nhiên, độ mạnh hấp phụ thì cao hơn trong trường họp của PEI- Sepabeads. Enzym ß-galactosidase từ B. stearothermophilus chịu nhiệt được cố định trên chitosan sử dụng Tris (hydroxymethyl) phosphine (THP) và glutaraldehyde dùng để thủy phân đường lactose trong sữa. Khả năng chịu nhiệt và hoạt tính của enzym ß-galactosidase được cố định /V 10 ~ Chương 2: ửng dụng Đồ án môn học trên THP thì vượt trội hơn so với enzym tự do và enzym được cố định bằng glutaraldehyde. Enzym ß-galactosidase được cố định trên THP cho thấy hoạt tính cao hơn enzym tự do khi có mặt ion Ca2+ và ổn định trong suốt thời gian bảo quản ờ 4°c trong 6 tuần, trong khi enzym tự do bị mất 31% hoạt tính trong cùng điều kiện. Hai phương pháp quy hoạch thực nghiệm là phương pháp “Response surfacemethodology” (RSM) và “Centre composite design” (CCD) được dùng để tối ưu sự cố định enzym ß-galactosidase từ Pisum sativum trên hai vật liệu khung mạng: Sephadex G-75 và hạt chitosan. Hiệu suất cố định đạt được 75.66% và 75.19% tương ứng với Sephadex G-75 và chitosan. Enzym ß-galactosidase từ A. oryzae được cố định trên một chất mang rẻ tiền concanavalin Acellulose. Chế phẩm ß-galactosidase được hấp phụ và hên kết chéo bằng Concanavalin A-cellulose, giúp giữ lại 78% hoạt tính ban đầu. Nhiệt độ tối ưu của enzym cố định tăng từ 50°c lên 60°c. Enzym cố định bằng phương pháp hấp phụ và liên kết chéo giữ được 93% hoạt tính sau 1 tháng bảo quản trong khi enzym tự nhiên chỉ giữ được 63% hoạt tính. Phươns pháp bao eói Khung mạng sử dựng để cố định thường được làm từ các nguyên liệu như Ca-alginate, agar, k-carragenin, polyacrylamide và collagen. Tuy nhiên, một vài khung mạng rắn như than hoạt tính, ceramic,... cũng có thể dùng để cố định. Các loại màng dùng để nhốt enzym được sử dụng phổ biến là nylon, cellulose, polysulfone, và polyacrylmide. Enzym ß-galactosidase từ nấm sợi được cố định trong gel polyvinyl alcohol có tính chịu nhiệt cao hơn enzym tự do, giữ được 70% hoạt tính sau 24h ở 50°c. Các tế bào K. bulgarìcus có chứa enzym ß-galactosidase được xử lí với glutaraldehyde được nhốt trong alginate sử dụng dung dịch BaCỈ2. Cấc hạt alginate thu được sau khi xử lí tiếp theo với polyethyleneimine thì đạt được độ ổn định cao. Enzym ß-galactosidase của E. coli cũng được cố định trong gel polyacrylamide thông qua việc chuẩn bị các dẫn xuất hên kết chéo của enzym với bisimidoesters. Tế bào K. marxianus có chứa lactase hoạt động được nhốt toong gel calcium pectate (CPG) và toong gel calcium alginate (CAG) được làm cứng bằng polyethyleneimine và glutaraldehyde. Các tế bào được cố định trong CPG đã thủy phân hơn 80% lactose trong quá trình liên tục và bán hên tục. So sánh các phương pháp cố định enzym ß-galactosidase từ Thermus aquaticus cho thấy rằng việc cố định bằng hên kết chéo sau đó nhốt enzym toong hạt agarose có thể cho hiệu suất hoạt động tốt hơn. Việc nhốt enzym ß-galactosidase từ A. oryzae trong gel polyvinyl alcohol lạnh xốp sẽ tăng cường độ ổn định với nhiệt độ, pH, lực ion hơn so với enzym tự do. Khung dạng sợi được làm từ alginate và gelatin được bổ sung chất làm cứng là glutaraldehyde cổ thể giữ được 56% hoạt tính của enzym trong 35 ngày mà không có bất kì sự giảm hoạt tính. Người ta nhận thấy rằng chế phẩm ß-galactosidase được liên kết chéo bằng canavalin A có ~ 11 Chương 2: ửng dụng Đồ án môn học thể thủy phân lactose vượt trội trong hàng loạt quá trình so với các chế phẩm khác vì chúng vẫn giữ được hoạt tính cao, cụ thể là giữ được 95% hoạt tính sau 7 lần sử dụng, và giữ được 93% hoạt tính sau 2 ngày bảo quản ở 4°c. Phương pháp liên kấ cone hóa tri Các phân tử enzym liên kết với chất mang thông qua cấc nhóm chức năng không nằm trong trung tâm hoạt động của enzym như amino, carboxyl, hydroxyl, và sulfydryl. Các nhóm chức năng trên chất mang thường được hoạt hóa bằng cách sử dụng các chất hóa học như cyanogen bromide, carbodimide, và glutaraldehyde. Enzym từ A. oryzae được cố định trên bột nylon-6 và zeolite. Zeolite thì không lý tưởng vì lượng liên kết tạo thành ft trong khi đó nylon-6 tạo ra được khung mạng ổn định. Các dẫn xuất thu được hoạt hóa bằng diazo hoặc bằng carbodiimide cho thấy hoạt tính cao nhất trong suốt quá trình cố định enzym trên thủy tinh xốp có phủ lóp glycophase. Enzym ß-galactosidase từ E. coli được cố định trên gelatin sử dụng chất hoạt hóa là chromium (III) acetate và glutaraldehyde vẫn giữ được tương ứng 25% và 22% hoạt tính. Enzym được cố định trên silica-alumina ổn định hơn enzym tự do ở pH acid. Các dẫn xuất ß-galactosidase cố định cho thấy nhiều sự cải thiện nhưng hoạt tính khấc nhau sau khi được tạo điều kiện cho liên kết cộng hóa trị đa điểm bằng cách ủ trong dung dịch kiềm một thời gian dài, enzym được cố định trên Sepabeads-epoxy-boronic được xem là ổn định nhất. Dan xuất tốt nhất rất hoạt động trong việc thủy phân lactose thậm chí ờ 70°c. Gần đây sự liên kết ngang của ß-galactosidase trên các hạt từ tính có nguồn gốc khác nhau được thực hiện với sự có mặt của glutaraldehyde. Ket quả là hoạt tính của enzym cố định được tăng lên. Khi cố định ß-galactosidase chịu nhiệt trên Sepabeads để thủy phân lactose người ta nhận thấy sự ức chế enzym do sản phẩm tạo ra giảm, điều này hữu dụng trong việc cải thiện hiệu suất hoạt động của enzym trong công nghiệp. /V 12 ~