Tài liệu Dịch não tủy

Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau DÒCH NAÕO TUÛY Muïc tieâu · Laáy vaø chuyeân chôû dòch naõo tuyû vaø thaáy ñöôïc tính caáp thieát phaûi göûi gaáp dòch naõo tuyû ñeán phoøng thí nghieäm ñeå caáy ngay ñeå taêng cô hoäi baét ñöôïc vi khuaån gaây beänh. · Thöïc hieän ñöôïc ñaày ñuû caùc böôùc ñeå khoâng boû soùt caùc cô hoäi phaùt hieän caùc taùc nhaân vi khuaån gaây beänh nhôø bieát ñöôïc qui trình thöïc hieän vi sinh laâm saøng maãu dòch naõo tuyû, nhôø vaäy coù theå · Phaùt hieän ñöôïc caùc taùc nhaân thöôøng gaây vieâm maøng naõo muû duø caùc taùc nhaân naøy ña soá raát laø khoù moïc vì bieát duøng caùc phöông tieän caàn thieát vaø thích hôïp nhaát ñeå thöïc hieän ñöôïc xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng dòch naõo tuyû. Chæ ñònh choïc doø dòch naõo tuûy (DNT) khaûo saùt vi sinh laâm saøng ¦ DNT neân ñöôïc choïc doø ñeå khaûo saùt vi sinh laâm saøng tröôùc caùc beänh nhaân coù caùc trieäu chöùng nghi ngôø vieâm maøng naõo. ¦ Khoâng neân choïc doø DNT tröôùc caùc beänh nhaân coù daáu hieäu gia taêng aùp löïc noäi soï. Daáu hieäu naày ñöôïc khaùm phaù qua soi ñaùy maét thaáy gai thò bò phuø neà. Thôøi ñieåm choïc doø DNT ¦ Caøng sôùm caøng toát, ngay sau khi coù chaån ñoaùn laâm saøng. ¦ Tröôùc khi beänh nhaân duøng khaùng sinh ñieàu trò heä thoáng. Caùch laáy vaø chuyeân chôû ¦ DNT phaûi ñöôïc choïc doø bôûi moät baùc só chuyeân khoa, phöông phaùp voâ truøng. ¦ 5-10ml DNT ñöôïc laáy vaøo 2 loï voâ truøng naép chaët (coù theå duøng tube naép vaøng voâ truøng hay tube Eppendorf biopure) roài göûi ngay ñeán phoøng thí nghieäm, khoâng chaäm treã. Moät loï khaûo saùt vi khuaån hoïc vaø moät loï khaûo saùt sinh hoùa teá baøo. ¦ Coù theå caáy ngay taïi giöøông vôùi chai 2 maët thaïch caáy DNT vaø caùc dòch khoâng taïp nhieãm (xem höôùng daãn vaø qui trình söû duïng chai 2 maët thaïch caáy DNT vaø caùc dòch khoâng taïp nhieãm) 52 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Quan saùt ñaïi theå Ghi nhaän caùc tính chaát ñaïi theå cuûa DNT, nhö laø: ¦ Trong, keo ¦ Ñuïc, muû ¦ Vaøng, hay vaøng chanh ¦ Coù maùu, coù sôïi fibrin, coù caën Khaûo saùt vi khuaån hoïc Khaûo saùt vi khuaån hoïc theo caùc böôùc sau 1. Söûa soaïn beänh phaåm Ö Neáu DNT ñuïc, khoâng caàn ly taâm. Ö Caùc tröôøng hôïp khaùc, ly taâm DNT 10 ñeán 15 phuùt ôû toác ñoä cao nhaát cuûa maùy ly taâm baøn. Laáy phaàn caën khaûo saùt vi theå vaø nuoâi caáy, phaàn nöôùc laøm phaûn öùng hoùa mieãn dòch phaùt hieän khaùng nguyeân hoøa tan vaø laøm phaûn öùng sinh hoùa. 2. Khaûo saùt vi theå Ö Laøm pheát soi töôi Nhoû moät gioït caën ly taâm vaøo lame kính, ñaäy lamelle leân. Ñoïc döôùi quang tröôøng x400, ñoùng bôùt hay haï bôùt tuï quang ñeå thaáy roõ ñoä töông phaûn. Tìm: ­ Baïch caàu (ña nhaân hay lympho), hoàng caàu ­ Vi khuaån, naám men ­ Ñôn baøo (Naegleria fowleri) Neáu coù naám men nghi Cryptococcus neoformans, quan saùt dòch naõo tuûy döôùi gioït möïc taøu hay vôùi nigrosin 20% Ö Laøm pheát nhuoäm ­ Gram ­ Khaùng acid (neáu coù yeâu caàu) Keát quaû pheát nhuoäm vaø keát quaû soi töôi phaûi thoâng baùo ngay cho Baùc só ñieàu trò. 53 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau 3. Caáy phaân laäp vi khuaån gaây beänh Ö Vì laø maãu beänh phaåm khoâng bò ngoaïi nhieãm neân coù theå caáy nhieàu maàm caáy. Ö Coù theå chæ caàn caáy vaøo thaïch naâu coù boå sung XV (CAXV), uû ôû nhieät ñoä 35-37oC trong bình neán. Ö Neáu khoâng coù ñieàu kieän maø DNT laø cuûa treû con, coù theå caáy vaøo hoäp BA coù vaïch moät vaïch S. aureus thaúng goùc vôùi ñöôøng caáy maàm caáy ñeå kích thích H. influenzae moïc ñöôïc, uû ôû nhieät ñoä 35-37oC trong bình neán. Ö Phaàn DNT coøn laïi coù theå caáy löu döï phoøng (back-up) vaøo dung dòch BHI. Ö Theo doõi lieân tieáp trong toái ña 3 ngaøy, baát cöù luùc naøo coù söï hieän dieän cuûa khuùm vi khuaån, tieán haønh ñònh danh vaø khaùng sinh ñoà. Neáu coù ñieàu kieän, ñònh type hay group huyeát thanh cuûa vi khuaån. Ö Vì vieâm maøng naõo muû (VMNM) laø moät beänh nguy hieåm, ñe doïa tính maïng, neân moät khi coù vi khuaån moïc thì phaûi tieán haønh nhuoäm Gram khuùm vi khuaån vaø keát hôïp vôùi tính chaát khuùm vi khuaån moïc treân moâi tröôøng phaân laäp, phaûi traû lôøi keát quaû taïm thôøi cho Baùc só laâm saøng ngay. Ö Neáu coù yeâu caàu tìm C. neoformans, caáy DNT treân thaïch Sabouraud, vaø treân BHI, uû ôû nhieät ñoä 35-37oC. Cuõng theo doõi lieân tuïc trong 3 ngaøy. Ö Neáu coù yeâu caàu tìm M. tuberculosis, caáy DNT vaøo moâi tröôøng Lowenstein-Jensen (neân caáy 3 oáng), uû ôû nhieät ñoä 35-37oC. Theo doõi lieân tuïc trong 2 thaùng. Tìm khaùng nguyeân hoøa tan caùc vi khuaån gaây beänh thöôøng gaëp trong DNT baèng caùc phöông phaùp hoùa mieãn dòch Coù theå phaùt hieän khaùng nguyeân hoøa tan caùc vi khuaån gaây beänh coù trong DNT baèng moät trong caùc phaûn öùng hoùa mieãn dòch nhö: ¦ Tuï latex vôùi boä thuoác thöû MENINGITEX, PASTOREX.. ¦ Ñieän di mieãn dòch ñoái löu (CCIE) ¦ ELISA 54 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Trong caùc phöông phaùp treân thì phöông phaùp tuï latex cho keát quaû nhanh nhaát (khoâng quaù 3 phuùt), ñôn giaûn nhaát (coù theå thöïc hieän ngay taïi giöôøng beänh), ít chòu aûnh höôûng cuûa caùc thoâng soá kyõ thuaät, vaø raát nhaïy caûm. Taùc nhaân vi khuaån gaây vieâm maøng naõo ¦ ¦ Treû sô sinh (cho ñeán 2 thaùng tuoåi) Ö Escherichia coli, Ö Caùc Enterobacteriaceae khaùc (Salmonella spp, Citrobacter spp), Ö Streptococcus agalactiae (nhoùm B), Ö Listeria monocytogenes, Caùc löùa tuoåi khaùc Ö Haemophilus influenzae type b(a), Ö Neisseria meningitidis, Ö Streptococcus pneumoniae, Ö Mycobacterium tuberculosis, Ö Listeria monocytogenes(b), Ö Cryptococcus neoformans(b), Ö Staphylococci(c). Baûng 1: Bieän luaän keát quaû sinh hoùa-teá baøo-vi theå-ñaïi theå dòch naõo tuyû ñeå töø ñoù coù theå suy ñoaùn ra ñöôïc taùc nhaân vi sinh vaät gaây vieâm maøng naõo muû Thoâng soá Baïch caàu Glucose Protein Vi theå Ñaïi theå (a) (b) (c) VMN vi khuaån Ña nhaân Raát thaáp 5-20mg/100ml Taêng VMN lao Ñôn nhaân Thaáp 20-40mg/100ml Taêng VMN vi naám Ñôn nhaân Thaáp 20-40mg/100ml Taêng Thöôøng phaùt hieän ñöôïc vi khuaån Ñuïc Hieám khi thaáy ñöôïc AFB Vaøng chanh Thöôøng phaùt hieän ñöôïc vi naám Ñuïc nheï VMN virus Ñôn nhaân Bình thöôøng 65-70mg/100ml Hôi taêng trong giai ñoaïn ñaàu AÂm tính Trong Laø taùc nhaân gaây VMNM thöôøng gaëp nhaát ôû tuoåi töø 6th. ñeán 2t. Hieám ôû tuoåi treân 5t. Gaëp ôû ngöôøi bò suy giaûm mieãn dòch (vd AIDS) Gaëp ôû ngöôøi chòu phaåu thuaät soï naõo hay sau daãn löu 55 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Caâu hoûi oân taäp 1. Cho bieát caùc chæ ñònh laâm saøng ñeå caáy dòch naõo tuûy, vaø thôøi ñieåm toát nhaát ñeå laáy dòch naõo tuûy. 2. Haõy cho bieát caùc caùch laáy vaø chuyeân chôû dòch naõo tuyû ñeán phoøng thí nghieäm ñeå laøm xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng. 3. Haõy cho bieát phöông tieän laáy vaø chuyeân chôû dòch naõo tuyû thích hôïp nhaát cho caùc beänh vieän hieän nay, vaø phaân tích caùc öu khuyeát ñieåm cuûa caùc phöông tieän naøy. 4. Haõy cho bieát qui trình xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng thöïc hieän taïi phoøng thí nghieäm ñoái vôùi beänh phaåm dòch naõo tuûy. 5. Haõy cho bieát caùc vi khuaån gaây beänh coù theå gaëp ñöôïc trong caáy dòch naõo tuûy. 6. Haõy cho bieát caùc phöông phaùp hoaù mieãn dòch phaùt hieän khaùng nguyeân hoøa tan caùc vi khuaån gaây beänh vieâm maøng naõo muû coù trong dòch naõo tuyû. Phaân tích caùc öu khuyeát ñieåm cuûa caùc phöông phaùp naøy. 7. Bieän luaän keát quaû sinh hoùa teá baøo xeùt nghieäm dòch naõo tuûy. Naegleria fowleri soi töôi döôùi KHV C. neoformans soi döôùi KHV ñaûo phase C. neoformans soi töôi döôùi KHV Hình 15: Moät soá hình aûnh quan saùt tröïc tieáp pheát soi töôi hay pheát nhuoäm Gram caùc maãu dòch naõo tuyû beänh nhaân VMNM Neisseria meningitidis qua pheát Gram dòch naõo tuûy Streptococcus pneumoniae qua pheát Gram dòch naõo tuûy 56 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Saûn phaåm lieân quan: Chai hai maët thaïch CAXV ñeå caáy dòch naõo tuyû hay caùc chaát dòch khoâng taïp nhieãm khaùc Muïc ñích söû duïng Chai caáy hai maët thaïch CAXV ñaõ ñöôïc nghieân cöùu saûn xuaát ra ñeå thöïc hieän ñöôïc kyõ thuaät caáy taïi giöôøng hay caáy trong phieân tröïc caùc maãu dòch naõo tuyû; hay caùc dòch khoâng taïp nhieãm khaùc nhö dòch maøng phoåi, muû abcess, dòch maøng buïng, dòch maøng tim, dòch khôùp... Ñoùng goùi Chai caáy hai maët thaïch CAXV laø chai baèng polystyrene coù ñoå hai maët thaïch CAXV treân hai maët hoâng cuûa chai. Chai coù naép vaën chaët vôùi maët naép baèng cao su deã daøng ñaâm kim bôm maàm caáy vaøo. Chai coøn coù moät naép ngoaøi boïc baûo veä lôùp naép trong. Taát caû ñöôïc boïc kín baèng maøng co. Naép ngoaøi Caùch söû duïng ¦ Xeù raùch maøng co, ruùt naép ngoaøi khoûi naép trong. ¦ Naép cao su Môû naép trong ñeå cho beänh phaåm traùng leân Naép trong hai maët thaïch, sau ñoù vaën chaët laïi naép Thaïch CAXV trong. Coù theå khoâng môû naép trong maø Thaân chai polystyrene duøng bôm tieâm huùt laáy beänh phaåm roài bôm beänh phaåm qua naép cao su (sau khi Thaïch CAXV saùt truøng baèng coàn vaø ñeå khoâ) ñeå traùng leân hai maët thaïch. Ñeå chai naèm leân maët beân (khoaûng vaøi phuùt cho moãi maët beân) ñeå beänh phaåm ñöôïc traùng ñeàu leân 2 maët thaïch. Sau ñoù döïng ñöùng chai leân, nôùi Hình 16: Caáu truùc cuûa chai 2 maët thaïch CAXV duøng caáy dòch naûo tuyû vaø caùc dòch khoâng taïp nhieãm khaùc. loûng naép trong, ñaäy naép ngoaøi leân, cho 57 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau vaøo bình neán vaø ñeå vaøo tuû aám 35-37oC. Neáu laø tuû aám CO2 thì khoâng caàn cho vaøo bình neán. ¦ Quan saùt khuùm vi khuaån moïc treân hai maët thaïch moãi ngaøy trong 2 ngaøy. ¦ Do maët thaïch caáy beänh phaåm laø thaïch CAXV giaøu boå döôõng vaø giaøu XV, do vaäy taát caû caùc vi khuaån duø khoù moïc nhö H. influenzae, N. meningitidis, S. pneumoniae ñeàu coù theå moïc ñöôïc. Khi thaáy coù söï hieän dieän cuûa baát kyø khuùm vi khuaån naøo moïc treân maët thaïch thì phaûi laøm pheát nhuoäm Gram ñeå quan saùt hình thaùi vi khuaån vaø tieán haønh ñònh danh, khaùng sinh ñoà theo höôùng maø hình aûnh Gram vi khuaån gôïi yù. MENINGITEX – phaùt hieän nhanh khaùng nguyeân hoøa tan caùc vi khuaån thöôøng gaây vieâm maøng naõo muû Nguyeân taéc thöû nghieäm Thöû nghieäm thöïc hieän döïa theo nguyeân taéc cuûa phaûn öùng tuï latex, caùc khaùng theå ñaëc hieäu ñöôïc gaén treân haït latex seõ bò tuï laïi khi gaëp caùc khaùng nguyeân töông öùng, vaø hieän töôïng tuï naày seõ thaáy ñöôïc baèng maét thöôøng. Thaønh phaàn thuoác thöû Moät boä thuoác thöû goàm 5 tube naép chaët chöùa thuoác thöû laø 1 ml huyeàn dòch caùc haït latex ñaõ ñöôïc gaén khaùng theå ñaëc hieäu Neisseria meningitidis group A (loï NMA), Neisseria meningitidis group B (loï NMB), Neisseria meningitidis group C (loï NMC), Haemophilus influenzae (loï Hib) vaø Streptococcus pneumoniae (1 loï PNE). Ngoaøi ra coøn coù loï chöùa 200ml khaùng nguyeân chöùng (loï C[+]). Hoäp thuoác thöû phaûi ñöôïc baûo quaûn taïi nhieät ñoä 4oC, coù haïn duøng 2 naêm töø sau ngaøy saûn xuaát. Phöông phaùp thöïc hieän thöû nghieäm Chuaån bò moät lame soi kính hieån vi môùi, lau saïch baèng coàn, roài sau ñoù lau khoâ. Nhôù khi caàm lame phaûi caàm treân caïnh lame chöù khoâng caàm treân maët lame. Duøng buùt acetone hay buùt môõ keû 5 oâ treân lame. Nhoû leân moãi oâ moät gioït (khoaûng 10ml) dòch naõo tuûy (DNT). Laéc maïnh caùc tube thuoác thöû MENINGITEX ñeå thaønh huyeàn dòch ñuïc ñeàu nhö söõa. Sau ñoù nhoû treân oâ ñaàu 58 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau tieân moät gioït (khoaûng 10ml) NMA, oâ thöù 2 moät gioït (khoaûng 10ml) NMB, oâ thöù 3 moät gioït (khoaûng 10ml) NMC, oâ thöù 4 moät gioït (khoaûng 10ml) Hib, oâ thöù 5 moät gioït (khoaûng 10ml) PNE. Thay ñaàu coâne sau moãi laàn laáy vaø nhoû thuoác thöû treân lame. Duøng que taêm troän ñeàu gioït thuoác thöû vaøo gioït dòch naõo tuûy, vöøa troän vöøa traûi roäng hoãn hôïp ra cho gaàn ñaày maët oâ, nhôù thay que taêm sau khi troän hoãn hôïp trong moãi oâ. Sau khi troän xong, giöõ caïnh lame giöõa hai ngoùn troû vaø caùi vaø laéc nghieâng tôùi roài nghieâng lui trong voøng 3 phuùt, vöøa laéc vöøa quan saùt xem oâ naøo tuï laïi ñeå ghi nhaän keát quaû [+] khaùng nguyeân hoøa tan cuûa vi khuaån gaây beänh coù trong dòch naõo tuûy töông öùng vôùi khaùng theå ñaëc hieäu coù trong gioït thuoác thöû. Coù hieän töôïng tuï trong oâ khi caùc haït latex khoâng coøn ôû daïng huyeàn dòch ñuïc ñeàu nhö söõa maø tuï laïi thaønh haït lôïn côïn traéng treân neàn dung dòch trong daàn ñi. Haït lôïn côïn traéng caøng lôùn khi phaûn öùng tuï caøng maïnh, caøng nhoû khi phaûn öùng tuï caøng yeáu. Neáu sau 3 phuùt phaûn öùng tuï chöa thaáy roõ, coù theå quan saùt qua moät göông loõm aûnh phaûn chieáu cuûa caùc oâ qua göông loõm ñeå phaùt hieän hieän töôïng tuï. Kieåm tra thuoác thöû Cöù moãi vaøi thaùng kieåm tra thuoác thöû xem coù coøn ñuû nhaïy khoâng vôùi chöùng [+] vaø vôùi nöôùc muoái sinh lyù. Thöïc hieän treân 2 lame soi kính hieån vi, moãi lame cuõng keû 5 oâ. Thöïc hieän nhö treân nhöng treân moät lame, thay vì nhoû vaøo moãi oâ 1 gioït DNT, cho vaøo moãi oâ moät gioït 10 ml chöùng [+] (töø loï C[+]), vaø treân lame kia cuõng thay vì nhoû vaøo moãi oâ 1 gioït DNT thì nhoû vaøo moãi oâ moät gioït 10 ml nöôùc muoái sinh lyù. Thuoác thöû coøn hieäu löïc khi caû 5 oâ nhoû chöùng [+] ñeàu coù hieän töôïng tuï so vôùi caû 5 oâ nhoû nöôùc muoái sinh lyù ñeàu khoâng coù hieän töôïng tuï. DNT Ñoïc keát quaû: Hib NMA NMB NMC Hib PNE Chöùng [+] Chöùng aâm (nöôùc muoái SL) Hình 17: Moâ taû caùch laøm xeùt nghieäm phaùt hieän caùc vi khuaån gaây beänh coù trong dòch naõo tuûy baèng boä thuoác thöû MENINGITEX 59 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau Hình 18: Chai 2 maët thaïch CAXV caáy dòch naõo tuyû vaø caùc dòch khoâng taïp nhieãm khaùc, raát thích hôïp trong caùc phieân tröïc khi phoøng thí nghieäm khoâng coù nhaân vieân tröïc chuyeân khoa vi sinh. A B C D Hình 19: Caùc phöông tieän thích hôïp ñeå laáy dòch naõo tuyû coù theå laø: (A) Tube ly taâm voâ truøng 15ml naép vaën (traùi), (B) tube voâ truøng 5ml, tube voâ truøng 1.8ml, vaø (D) tube naép baät kieåu Eppendorf biopure. 60 Kyõ thuaät xeùt nghieäm vi sinh laâm saøng caùc beänh phaåm khaùc nhau DNT ñuïc D0 Ly taâm 3000 rpm/10 min. DNT trong Nhoû 3-5 gioït DNT leân CAXV Caáy traûi ñeàu KSTT qua nhuoäm GRAM UÛ 37oC/CO2/qua ñeâm Neáu coù hieän dieän VK MENINGITEX phaùt hieän KN hoøa tan KSTT qua nhuoäm GRAM Neáu khoâng coù VK Laøm KSÑ tröïc tieáp Nhoû 3-5 gioït DNT leân CAXV Caáy traûi ñeàu Neáu coù hieän dieän VK KQ sô boä hình daïng vaø Gram vi khuaån Chôø KQ caáy D1 Neáu khoâng coù VK UÛ 37oC/ CO2/qua ñeâm KQ sô boä cuûa MENINGITEX KQ sô boä hình daïng vaø Gram vi khuaån Chôø KQ caáy KQ sô boä KSÑ tröïc tieáp Ñònh danh, khaùng sinh ñoà Coù VK moïc Khoâng coù VK moïc KQ chung cuoäc aâm nghieäm Sô ñoà 5: QUI TRÌNH VI SINH LAÂM SAØNG MAÃU DÒCH NAÕO TUÛY D2 Keát quaû chung cuoäc: Ñònh danh VK vaø KSÑ 61