Tài liệu đánh giá sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở vùng nước lợ tỉnh trà vinh và bến tre

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN DUY PHƯƠNG ĐÁNH GIÁ SỰ KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI Ở VÙNG NƯỚC LỢ TỈNH TRÀ VINH - BẾN TRE LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Xin bài tỏ long biết ơn sâu sắc và chân thành đến Cô Từ Thanh Dung đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, đóng gớp nhiều ý kiến quý báu và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Thầy cô và các anh chị bộ môn Sinh Học và Bệnh Học Thủy Sản-Khoa Thủy Sản-trường Đại Học Cần Thơ đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện đề tài. Thầy cô và các bạn khoa Nông Nghiệp – Thủy Sản, trường Đại Học Trà Vinh đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện đề tài. Tập thể lớp bệnh học thủy sản K31 đã giúp đỡ tận tình. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC Trang Mục lục ................................................................................................................. i Danh sách bảng ................................................................................................... iii Danh sách hình .................................................................................................... iv PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................1 PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................................3 2.1. Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản ............................................3 2.2. Các bệnh thường xuất hiện trên cá tra .........................................................3 2.3. Đặc điểm của vi khuẩn Edwardsiella và Aeromonas ................................. 4 2.4. Các nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn .........................................5 2.5. Thuốc kháng sinh dùng trong nuôi trồng thủy sản. ......................................7 2.6. Các nhóm kháng sinh thường sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ................9 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................11 3.1. Vật liệu nghiên cứu......................................................................................11 3.1.1 Đối tượng..................................................................................................11 3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm...................................................................................11 3.2. Hóa chất và môi trường ...............................................................................11 3.2.1 Hóa chất....................................................................................................11 3.2.2 Môi trường................................................................................................11 3.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................11 3.3.1 Phương pháp điều tra ................................................................................11 3.3.2 Phương pháp thu mẫu ...............................................................................12 3.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn ..............................................................12 3.3.4 Phương pháp lập kháng sinh đồ ................................................................12 3.3.5 Phương pháp xác định MIC ......................................................................13 PHẦN IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ..................................................................15 4.1 Kết quả điều tra ...........................................................................................15 4.1.1 Thông tin chung ........................................................................................15 4.1.2 Thông tin về kỹ thuật nuôi: .......................................................................16 4.1.3 Tình hình bệnh và sử dụng thuốc-hóa chất ................................................17 4.2 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn ......................................................19 4.2.1 Kết quả phân lập và chỉ tiêu sinh hóa ........................................................19 i PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 4.2.2 Kết quả định danh vi khuẩn E. ictaluri và Aeromonas sp bằng bộ kit API 20E ....................................................................................................21 4.3 Kết quả kháng sinh đồ .................................................................................21 4.3.1 Kết quả làm kháng sinh đồ Aeromonas sp ................................................. 23 4.3.2 Kết quả làm kháng sinh đồ E. ictaluri ...................................................... 25 4.4 Kết quả giá trị MIC......................................................................................26 4.4.1 Giá trị MIC của vi khuẩn Aeromonas sp ..................................................27 4.4.2 Giá trị MIC của vi khuẩn E. ictaluri .........................................................27 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ...............................................................29 5.1 Kết luận .......................................................................................................29 5.2 Đề xuất ........................................................................................................29 PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................30 PHỤ LỤC............................................................................................................34 ii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Diện tích mặt nước trung bình của các hộ nuôi .................................... 16 Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra các đặc điểm hình thái, sinh hóa của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas sp............................................................... 19 Bảng 4.3. Giá trị MIC của vi khuẩn Aeromonas sp ............................................ 27 Bảng 4.4. Giá trị MIC của vi khuẩn E. ictaluri................................................... 28 iii PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Các con đường trao đổi sự kháng thuốc của vi khuẩn giữa động vật và con người (Prescott ., 2000). .............................................................................8 Bảng 4.1 Bản đồ địa chính tỉnh Bến Tre và Trà Vinh ...........................................15 Hình 4.2 Các loại kháng sinh thường được sử dụng ở Trà Vinh và Bến Tre .........18 Hình 4.3 Cá tra bị bệnh mủ gan. ..........................................................................20 Hình 4.4 Cá tra bị bệnh xuất huyết. ......................................................................20 Hình 4.5 Khuẩn lạc Aeromonas spp phát triển trên môi trường TSA....................20 Hình 4.6 Khuẩn lạc E. ictaluri phát triển trên môi trường TSA ............................20 Hình 4.7 Vi khuẩn E. ictaluri gram âm, que ngắn ................................................21 Hình 4.8 Vi khuẩn Aeromonas sp gram âm, que ngắn ..........................................21 Hình 4.9 Kết quả định danh Aeromonas spp bằng bộ kit API 20E .......................22 Hình 4.10 Kết quả kháng sinh đồ chủng Aeromonas sp ....................................... 22 Hình 4.11 Tỷ lệ phần trăm kháng thuốc kháng sinh của các chủng vi khuẩn Aeromonas sp ...................................................................................................... 23 Hình 4.12 Tỷ lệ phần trăm kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ..........................................................................................25 Hình 4.13 Kết quả MIC của Aeromonas sp ở nồng độ 2 µg/ml ............................28 iv PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá sự kháng thuốc của hai loại vi khuẩn Aeromonas spp và Edwardsiella ictaluri bệnh trên cá tra (pangasianodon hypophthamus) nuôi ở vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh và Bến Tre. Kết quả khảo sát ban đầu cho thấy 100% số hộ nuôi được phỏng vấn đều sử dụng thuốc kháng sinh để phòng và trị bệnh. Kết quả phân lập, kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản và định danh bằng bộ kit API 20E xác định được 20 chủng vi khuẩn gây bệnh trên cá tra trong đó có 12 chủng E. ictaluri và 8 chủng Aeromonas spp. Để đạt được mục tiêu đề ra, phương pháp lập kháng sinh đồ với 7 loại thuốc kháng sinh được thực hiện trên 20 chủng vi khuẩn đã tìm được. Kết quả cho thấy đa số chủng E. ictaluri đã kháng với florfenicol (50%), chloramphenicol (58%) và tetracycline (42%), nhưng với ampicillin và cefazoline đều nhạy với 100% số vi khuẩn E. ictaluri phân lập được. Kết quả không tìm thấy vi khuẩn Aeromonas spp kháng với florfenicol và chloramphenicol, trong khi đó có tới 50% vi khuẩn Aeromonas spp kháng với streptomycine và 100% kháng với cefazoline. Phương pháp pha loãng thuốc kháng sinh trên môi trường lỏng dựa theo tài liệu Clinical and Laboratory Standards Institure (CLSI), (2006b) được sử dụng làm MIC trên ba loại kháng sinh chloramphenicol, oxytetracycline và streptomycine. Kết quả đã tìm thấy E. ictaluri kháng với chloramphenicol ở mức cao (6/8 chủng). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1. Giới thiệu Thủy sản được xem là một trong những ngành kinh tế quan trọng của Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Những năm gần đây đã phát triển rất nhanh, góp phần tích cực vào việc nâng cao nguồn thu nhập của cộng đồng và tăng kim ngạch xuất khẩu. Trong vòng 10 năm từ 1995 đến 2005, diện tích nuôi trồng thủy sản vùng ĐBSCL đã tăng hơn 2,37 lần và sản lượng tăng vọt hơn 3,68 lần (Lê Tuấn Anh, 2008). Cùng với sự phát triển khá nhanh về sản lượng, diện tích nuôi và mô hình nuôi thủy sản, nghề nuôi cá tra có tốc độ phát triển cao nhất. Theo thống kê của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn cho thấy sự phát triển khá nhanh về diện tích nuôi cá tra. Sáu tháng đầu năm 2007 tổng diện tích nuôi gần 5.000 ha và đến sáu tháng đầu năm 2008, diện tích đã tăng lên đạt gần 6.000 ha, và sản lượng cá cũng tăng theo rất nhanh từ 1 triệu tấn của năm 2007 có thể tăng lên 1,2 triệu tấn trong năm 2008. Ngoài những tỉnh có truyền thống nuôi cá tra như Đồng Tháp, An Giang, gần đây những tỉnh như Sóc Trăng, Trà Vinh và Bến Tre cũng đầu tư phát triển. Năm 2007, ngành thủy sản Bến Tre tập trung nuôi các đối tương: tôm sú, tôm càng xanh, nghêu và cá da trơn. Tổng diện tích nuôi thủy sản năm 2007 là 43.000 ha. Trong đó, diện tích nuôi cá da trơn 230 ha, với năng suất 35.000 tấn. (http://www.fistenet.gov.vn, cập nhật ngày 28/11/2008). Nuôi trồng thủy sản đang phát triển mạnh trên nhiều khía cạnh về diện tích nuôi, mức độ thâm canh, loại hình nuôi, đầu tư cơ sở hạ tầng và chế biến sau thu hoạch. Việc sử dụng thuốc, hóa chất đóng góp không nhỏ cho sự phát triển của ngành trong việc cải tạo, duy trì chất lượng môi trường nuôi và trong các trường hợp bệnh bộc phát cần đến sự can thiệp của thuốc-hóa chất. Tuy nhiên, việc sử dụng và quản lý thuốc, hóa chất trong nuôi trồng thủy sản còn rất nhiều hạn chế do trình độ của người nuôi và người cung cấp. Điều đó dẫn đến việc sử dụng không đúng các loại thuốc kháng sinh. Theo điều tra của Mai Văn Tài (2004) có tới 138 loại kháng sinh đã được sử dụng trong các loại hình nuôi và sản xuất giống thủy sản ở Việt Nam. Khi việc sử dụng kháng sinh quá mức, không được kiểm soát để trị bệnh cho cá, tôm thì một điều tất yếu sẽ xảy ra đó là vấn đề kháng thuốc của các chủng vi khuẩn gây bệnh đồng thời gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người. Và như vậy thì việc phòng và xử lý bệnh cho động vật thủy sản củng như con người sau này sẽ gặp rất nhiều khó khăn. Vấn đề kháng thuốc kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản từ lâu cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu và đã xác được nhiều nhóm vi khuẩn phân lập được từ các ao nuôi cá da trơn đã kháng với nhiều loại kháng sinh như Oxytetracycline, Tetracycline, Ampiciline, …(Depaola et al, 1995; Matyar et al., 2004; Mohamed Nawaz et al., 2006). Ở 1 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Việt Nam sự kháng thuốc kháng sinh của các dòng vi khuẩn phân lập từ các ao nuôi thủy sản ở ĐBSCL cũng đã được nghiên cứu và cũng tìm thấy được 169 dòng vi khuẩn kháng với 6 loại kháng sinh thường dùng để trị bệnh cho động vật thủy sản (Nguyễn Thanh Phương và ctv., 2005). Gần đây, Từ Thanh Dung và ctv (2008) nghiên cứu sự kháng thuốc của 64 chủng Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra đã tìm ra đa số kháng với streptomycin (83%), oxytetracyline (81%)… Trong thời gian gần đây thì cá tra cũng đã được nhiều người dân ở các tỉnh Trà Vinh, Bến Tre, Sóc Trăng đưa về nuôi ở những vùng nước lợ, hiện nay việc kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra nuôi ở vùng nước ngọt khá phổ biến vậy còn cá tra nuôi ở vùng nước lợ thì sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh sẽ như thế nào? Do đó, vấn đề hết sức cấp thiết hiện nay là nghiên cứu sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra nuôi ở vùng nước lợ xảy ra như thế nào để góp phần giảm thiểu thiệt hại về kinh tế, tăng năng suất và sản lượng cá tra do sự kháng thuốc của vi khuẩn gây ra. Vì vậy mà đề tài “Đánh giá sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh và Bến Tre” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu đề tài Đánh giá sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh mủ gan, xuất huyết trên cá tra nuôi ở vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh và Bến Tre đồng thời tìm những loại thuốc đặc hiệu để tạm thời điều trị 2 loại bệnh nguy hiểm này khi cần thiết nhằm làm giảm thiệt hại cho người nuôi. 1.2.1 Nội dung thực hiện: Điều tra tình hình sử dụng kháng sinh của các hộ nuôi cá tra ở vùng nước lợ hai tỉnh Trà Vinh và Bến Tre. Phân lập, định danh và lập kháng sinh đồ của 20 chủng vi khuẩn gây bệnh (E.ictaluri và Aeromonas spp). Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chủng vi khuẩn gây bệnh trên. 2 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản Nghề nuôi trồng thủy phát triển rất mạnh ở nước ta nói chung và ở Đồng Bằng Sông Cửu Long nói riêng trong thời gian gần đây làm cho môi trường nuôi ngày càng xấu đi nghiêm trọng, sự bùng phát của dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều. Sự lan truyền dịch bệnh trong thủy sản đã dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng về kinh tế - xã hội, môi trường và thương mại quốc tế khó mà tính toán được. Tại Việt Nam, mỗi năm có hàng nghìn hộ dân nuôi luân canh tôm lúa bị thua lỗ do tôm bị chết, tổng thiệt hại trên 4,5 tỉ đồng, trong các năm 1995-1997 có khoảng 4.000 trong số 5.000 lồng nuôi cá trắm cỏ bị bệnh đốm đỏ gây thiệt hại 500.000 USD (Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I., 1998, trích dẫn bởi www.fistenest.gov.vn cập nhật ngày 31/10/2008). Trong số các bệnh của thuỷ sản thì nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn gây ra với những vụ dịch bệnh có qui mô lớn. Thông thường, người ta sử dụng thuốc kháng sinh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh. Do việc sử dụng không đúng cách và quá nhiều các loại thuốc kháng sinh được sử dụng sai nên đã gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc và tích tụ dư lượng thuốc kháng sinh trong thịt thuỷ sản. Một nguyên nhân khác gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc là việc sử dụng các loại kháng sinh với hàm lượng nhỏ trong thức ăn của thuỷ sản như một chất kích thích sinh trưởng (Mai Văn Tài và ctv., 2004). Đối với tác nhân gây bệnh là vi khuẩn thì các loài vi khuẩn gây bệnh cho một số đối tượng nuôi quan trọng mà Việt Nam phải đối mặt đó là Vibrio harveyi, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas flouresent, Streptococcus sp., Edwardsiella tarda, Edwardsiella ictaluri…(Bùi Quang Tề, 2006). Riêng đối với cá tra một số tác giả đã tìm thấy một số bệnh phổ biến như: bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E. ictaluri, bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila, A. sobria và A. caviae. Trong đó, vi khuẩn E. ictaluri là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế nguy hiểm nhất trong các mô hình nuôi công nghiệp ở ĐBSCL. Ký sinh trùng thuộc nhóm nội ký sinh protozoa bao gồm vi bào tử trùng (Microsporidium), bào tử trùng (Myxobolus spp., Henneguya spp.), trùng roi (Trypanosoma sp.), trùng lông nội ký sinh (Balantidium, Ichthyonyctus sp.),. Nhóm ngoại ký sinh gồm trùng quả dưa (Ichthyophthirius multifiliis), trùng mặt trời (Trichodina spp.) và trùng loa kèn (Epistylis sp.). Một số loài ký sinh trùng thuộc nhóm ký sinh đa bào như Metazoa đã tìm thấy trên cá như Monogenea (Thaparocleidus spp.) và 1 số loài khác thuộc nhóm trematoda. Một số bệnh chưa rõ tác nhân như hội chứng thịt philê có những đốm đỏ hoặc vàng da (Dung et al., 2008). 2.2 Các bệnh thường xuất hiện trên cá tra Dịch bệnh trên cá tra nuôi xảy ra quanh năm, kể cả mùa khô và mùa mưa nhưng nặng nhất vào lúc giao mùa, thời tiết và nhiệt độ thay đổi đột ngột kế đó là mùa mưa và mùa nước đỗ (Từ Thanh Dung và ctv., 2005). Các bệnh 3 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com thường gặp trên cá tra là: bệnh nhiễm khuẩn, xuất huyết, bệnh đốm đỏ, bệnh gan thận có mủ, lở loét, bệnh ký sinh trùng…(Bùi Quang Tề, 2006). Bệnh mủ gan trên cá tra xuất hiện đầu tiên vào mùa lũ năm 1998 ở các tỉnh nuôi thâm canh cá tra phát triển như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Sau đó bệnh lây lan sang các vùng nuôi cá tra lân cận. Đặc biệt, những năm gần đây bệnh xuất hiện cả một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng. Bệnh mủ gan đã được nghiên cứu và mô tả đầu tiên ở Việt Nam vào năm 2001 do Fugerson và ctv. Qua nghiên cứu của Từ Thanh Dung và ctv (2004) cho thấy bệnh xuất hiện cuối năm 1998 và trở nên trầm trọng vào năm 1999. Ở ĐBSCL bệnh thường xuất hiện trong suốt mùa lũ. Tuy nhiên, bọc phát cao điểm vào tháng 7-8. Bệnh xuất hiện và gây thiệt hại chủ yếu ở giai đoạn cá con, cả cá nuôi ao và nuôi bè. Theo điều tra của Trần Anh Dũng (2005), tần số xuất hiện bệnh mủ gan do Edwadsiella ictaluri gây ra chiếm 61%. Nguyễn Tấn Duy Phong (2008), tần số này lên đến 93,8% số hộ nuôi cá ở Cần Thơ và An Giang, tỉ lệ cá chết khi bị bệnh này có thể lên đến 90,0%. Ngoài ra, trên cá tra còn có một số bệnh như bệnh xuất huyết đốm đỏ xảy ra ở mọi lứa tuổi, tần số 75,0% số hộ nuôi. Bệnh trắng mang, bệnh vàng da, lồi mắt, nổ mắt có tần số xuất hiện thấp hơn. 2.3 Đặc điểm của vi khuẩn Edwadsiella và Aeromonas 2.3.1 Vi khuẩn Edwadsiella Edwardsiella thuộc họ Enterobacteriaceae có đặc điểm Gram âm, hình que mãnh, yếm khí tuỳ tiện, catalase dương, Cytocrom oxidase âm oxy hoá âm và lên men trong môi trường O/F glucose. Thường gặp hai loài: E. tarda và E. ictaluri (Bùi Quang Tề, 2006) Vi khuẩn E. ictaluri được báo cáo đầu tiên vào năm 1979, là tác nhân gây bệnh viêm ruột nhiễm khuẩn huyết (ESC-Enteris Septicaemia of Catfish) trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) (Hawke, 1979). Năm 2001, ở Việt Nam E. ictaluri đã được Fugerson và ctv (2001) phân lập và ghi nhận xuất hiện đầu tiên trên cá tra bị bệnh mủ gan ở ĐBSCL vào năm 1998 (Fugerson et al., 2001; Crumlish et al., 2002; Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan, 2007). Ngoài ra, theo Từ Thanh Dung và ctv (2005) vi khuẩn này là tác nhân gây bệnh mủ gan trên cá tra ở cá tỉnh nuôi cá tra thâm canh như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, sau đó bệnh lan dần sang các vùng nuôi lân cận. Đặt biệt, trong thời gian gần đây bệnh này cũng đã xuất hiện ở một số tỉnh mới nuôi cá tra như Bến Tre, Trà Vinh Sóc Trăng…gây thiệt hại lớn cho người nuôi. 2.3.2 Vi khuẩn Aeromonas Giống Aeromonas thuộc Aeromonadaceae gồm 2 nhóm: không di động (A. salmonicada) và di động (A. hydrophyla, A. caviae, và A. sobria). Đặc tính chung của ba loài vi khuẩn thuộc nhóm di động là vi khuẩn Gram âm, dạng hình que ngắn, yếm khí tùy tiện. Vi khuẩn Aeromonas di động phân lập từ cá nước ngọt nhiễm bệnh, thường gặp nhất là loài A. hydrophyla.(Bùi Quang Tề, 2006) 4 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Trong các chủng vi khuẩn gây bệnh thuộc giống Aeromonas thì A. hydrophyla được xem là loài gây bệnh cho cá nước ngọt quan trong nhất. Vi khuẩn này gây bệnh đốm đỏ trên cá tra và basa (Từ Thanh Dung và ctv., 2005), bệnh treo râu trên cá trê và bệnh tuột nhớt trên cá bống tượng, bệnh lở loét và xuất huyết trên baba (Bùi Quang Tề, 2006) 2.4 Các nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản. Sự kháng thuốc của vi khuẩn nói chung và của vi khuẩn gây bệnh trên trên động vật thủy sản nói riêng đã được quan tâm, nghiên cứu từ rất lâu. Từ những năm 50 của thế kỉ XX các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã nghiên cứu tới sự lan truyền rộng rãi của các loài vi khuẩn có khả năng kháng cùng lúc nhiều loại thuốc kháng sinh thông dụng (Bùi Thị Tho, 2003) Việc sử dụng kháng sinh để phòng và trị bệnh trong nuôi trồng thủy có thể dẫn đến sự hình thành các mầm bệnh vi khuẩn kháng kháng sinh và gây tác hại đến động vật nuôi và con người (Nguyễn Thanh Phương và ctv., 2005). Vì vậy, vấn đề sử dụng kháng sinh từ lâu đã được nhiều quốc gia trên thế giới quan tâm kiểm soát nhưng cũng không triệt để. Từ lâu việc sử dụng kháng sinh để phòng và trị bệnh cho động vật thủy sản đã được nhiều người dân sử dụng một cách rộng rải, không đúng qui định. Trong một nghiên cứu phỏng vấn ở Thái Lan vào năm 2000 cho thấy 20% số người nuôi tôm đã sử dụng kháng sinh để phòng chống lại các bệnh về vi rút, thêm vào đó hơn 60% các trại nuôi đã sử dụng kháng sinh để phòng bệnh (Aquaculture., 2002 trích dẫn bởi vietlinh.com, truy cập ngày 6/11/2008). Còn ở Việt Nam, việc sử dụng thuốc và hóa chất trong nghề nuôi tôm biển ngày càng gia tăng nhất là việc sử dụng kháng sinh do sự chuyển đổi nhanh chống từ nuôi quảng canh sang thâm canh. Theo một điều tra của Mai Văn Tài và ctv (2004) có ít nhất 373 loại thuốc và hóa chất sử dụng trong nuôi trồng thủy sản thì có 138 loại kháng sinh và Huỳnh Thị Tú và ctv (2006) cho thấy có 74 loại thuốc và hóa chất được sử dụng trong nuôi tôm, trong đó có 19 loại kháng sinh. Theo kết quả khảo sát về việc sử dụng kháng sinh ở các nước Châu Á của Mudd (2003), (Trích dẫn bởi Tangtrongpiros., 2005). cho thấy lượng kháng sinh các nước sử dụng là khá lớn: Trung Quốc 1.500 tấn, Nhật Bản 1.100 tấn, Hàn Quốc 550 tấn, Thái Lan 420 tấn, Ấn Độ 400 tấn, Philippine 350 tấn, Pakistan 200 tấn, Đài Loan 180 tấn, Malaysia 150 tấn, Bangladesh 100 tấn, Việt Nam 50 tấn và Indonesia 20 tấn. Các kết quả nghiên cứu đó đã cho thấy sự sử dụng sai rộng rãi các loại thuốc kháng sinh. Từ đó đã tạo ra nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc. Miranda et.al (2003) đã tìm ra 25 chủng vi khuẩn khác nhau đã kháng với Oxytetraxyline từ 4 nông trại nuôi cá ở Chile. Ở ĐBSCL đã phân lập được 169 dòng vi khuẩn từ các ao nuôi thủy sản và thử với 6 loại kháng sinh và kết quả cho thấy 2% kháng với Chloramphenicol, có 59% dòng vi khuẩn kháng với 4 hay 5 loại kháng sinh trong đó có Chloramphenicol. Có 34% kháng nhiều loại kháng sinh như Chloramphenicol, Ampicilline, Tetracycline, Trimethoprim + Sulfamchoxazole, Nitrofurantion (Nguyễn Thanh Phương và 5 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com ctv., 2005). Trong thời gian gần đây, Pender et al (2008) đã nghiên cứu sự kháng thuốc của Aeromonas được phân lập từ môi trường nước của các ao nuôi cá da trơn, cá chình và trại sản xuất giống ở Hà Lan, kết quả cho thấy sự kháng thuốc của Aeromonas như sau ampicilin và oxytetracyclin là 100%, sulfamethoxazole 24%, trimethoprim 3% và ciprofloxacin và chloramphenicol là 0%. Depaola et al., (1988) khảo sát sự kháng thuốc kháng sinh Tetracycline và Oxytetracycline của vi khuẩn Aeromonas gây bệnh trên cá nheo nuôi ở Mỹ (Ictalurus punctatus) đã phân lập được 146 dòng vi khuẩn của giống Aeromonas. Trong đó, có 89 dòng vi khuẩn kháng với Oxytetracycline chiếm 61% và 32 dòng vi khuẩn kháng với Tetracycline chiếm 22%. Ở Mỹ, Mohamed et.al., (2006) đã phân lập được 81 (90%) dòng vi khuẩn thuộc giống Aeromonas đã kháng với Tetracycline. Qua kết quả cho thấy sự kháng thuốc của vi khuẩn đã tăng lên về số lượng chủng vi khuẩn kháng và loại kháng sinh bị kháng. Waltman and Shotts (1986) đã kiểm tra sự kháng thuốc trên 118 chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập được ở Mỹ với 37 loại kháng sinh. Kết quả nghiên cứu cho thấy, đa số các vi khuẩn Gram âm nhạy với hầu hết các loại thuốc đã thí nghiệm. Tuy nhiên, hơn 90% số chủng vi khuẩn kháng với colistin và sulfamid. Khi được kiểm tra sự nhạy cảm tự nhiên đối với 71 loài kháng sinh của 102 dòng vi khuẩn Edwarsiella (trong đó có 41 chủng E. ictaluri) cho rằng tất cả các dòng Edwarsiella đều nhạy cảm tự nhiên với nhóm kháng sinh tetracycline, β-lactamin, quinolone, chloramphenicol, nitrofurazion… Đồng thời tất cả các chủng đều kháng tự nhiên với nhóm kháng sinh macrolid và kháng sinh oxonilic acid (Stock et. al., 2001) Đối với bệnh mủ gan trên cá tra nuôi ở Việt Nam thì vi khuẩn phân lập được từ cá bệnh là vi khuẩn E. ictaluri và nghiên cứu sự kháng thuốc của loài vi khuẩn này. Kết quả nghiên cứu cho thấy loài vi khuẩn này thể hiện tính đề kháng và đa kháng với các loại kháng sinh thường được sử dụng trong điều trị bệnh. Tuy nhiên, số lượng, tỷ lệ chủng đề kháng và loại kháng sinh bị kháng khá khác nhau theo địa phương có bệnh xảy ra (Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan., 2007) điều này cũng phù hợp với một nghiên cứu của Crumlish et. al (2002). Kết quả nghiên cứu này cho rằng vi khuẩn E. ictaluri phân lập trên cá tra nuôi thuộc tỉnh An Giang chỉ kháng với oxolinic acid trong khi vi khuẩn được phân lập từ cá nuôi thuộc tỉnh Cần Thơ lại cho kết quả kháng với oxytetracycline và sulphomamid. Đồng thời, cùng với nghiên cứu của Depaola et al (1995) còn cho thấy số lượng và tỉ lệ chủng đề kháng khác nhau theo mùa vụ nuôi. Ngoài ra, thì sự kháng kháng sinh cũng rất khác nhau giữa các loài vi khuẩn gây bệnh ví dụ như sự kháng Aminoglycoside của E. coli được phân lập vào mùa xuân thì cao hơn các loài khác (Depaola et al., 1995). Theo một điều tra của Matyar et.al (2004) sự kháng thuốc của vi khuẩn còn khác nhau tùy theo vị trí phân lập được chúng. Kết quả từ nghiên cứu cho thấy vi khuẩn phân lập từ mang của cá thì đã kháng với 7 loại kháng sinh trong khi vi khuẩn phân lập được trong nội tạng thì chỉ kháng với 5 loại kháng sinh. 6 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com 2.5 Thuốc kháng sinh dùng trong nuôi trồng thủy sản. 2.5.1 Tổng quan về kháng sinh Thuốc kháng sinh là những chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp mà hiện nay chúng ta mới biết được một số chất, phần lớn chúng do vi trùng, nấm và xạ khuẩn sinh ra. Có tác dụng diệt hay ngăn cản sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh và không gây bệnh cho vật chủ (Bùi Quang Tề và ctv., 2005). Hiện tượng kháng sinh được Alexender Fleming phát hiện từ năm 1928 thông qua phát hiện qua chất penicillin do một loại nấm có tên là penicillium notatum sản sinh ra. Đến năm 1940 người ta đã sản xuất thành công penicillin, thử nghiệm trên động vật đã cho kết quả tốt, đến năm 1946 đã sản xuất được penicillin kết tinh, từ đó đã bắt đầu thời kỳ mới của kháng sinh (Prescott, 2000; Bùi Quang Tề và ctv., 2005). Việc phát minh ra kháng sinh đã làm thay đổi mang tính cách mạng trong điều trị các bệnh lý nhiễm trùng. Lúc mới phát hiện chúng được xem như một loại thần dược để trị bệnh nhiễm khuẩn trên cơ thể người và trên động vật. Trong nuôi trồng thủy sản, việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh do vi khuẩn, nấm…đã góp phần không nhỏ trong việc tăng năng suất và sản lượng của ngành. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh như là sử dụng một con dao hai lưỡi: nếu biết rõ tính chất, tác dụng, dùng đúng bệnh, đúng liều đúng cách, nó giúp ta trị được nhiều bệnh nguy hiểm mang lại hiệu quả kinh tế cao. Ngược lại, sử dụng bừa bãi không đúng nguyên tắc sẽ gây ra những hậu quả nghiêm trọng, chẳng những không trị được bệnh mà còn dẫn đến hiện tượng lờn thuốc của vi khuẩn, nghiêm trọng hơn là có thể làm chết sinh vật và biến đổi hệ vi khuẩn của người tiêu dùng hoặc làm cho người tiêu dùng cũng bị kháng thuốc (Bùi Thị Tho, 2003). Ảnh hưởng của vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh trên động vật nuôi đến sức khỏe con người là một vấn đề hết sức gay gắt và còn nhiều tranh luận. bằng nhiều con đường khác nhau, vi khuẩn gây bệnh trên động vật nuôi có thể truyền gen kháng thuốc kháng sinh sang vi khuẩn gây bệnh ở người. Khi đó, việc điều trị bệnh cho con người trở nên khó khăn và phức tạp hơn. (Prescott, 2000). Sự trao đổi của vi khuẩn gây bệnh giữa con người và động vật với nuôi trồng thủy sản (hình 2.1). 7 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com MÔI TRƯỜNG NUÔI THUỶ SẢN (cá và giáp xác) Biển Nước uống UỐNG Nước uống Nước thải Nguồn nước , chất thải của nông trại Chế biến Thức ăn gia súc Sông, suối HỆ THỰC VẬT Rau Cây ăn quả Phế phẩm ĐỘNG VẬT TRÊN CẠN Cừu, Ngựa, Heo, Gia Cầm, Bò Vật nuôi trong nhà Bơi lội Lò mổ Thịt Chuẩn bị, nấu, nướng.. CON NGƯỜI Bệnh viện, thành phố, nông thôn Tiếp xúc trực tiếp Hình 2.1: Các con đường trao đổi sự kháng thuốc của vi khuẩn giữa động vật và con người (Prescott ., 2000) 2.5.2 Sự kháng thuốc trong nuôi trồng thuỷ sản Hiện tượng kháng thuốc kháng sinh là khả năng mà một sinh vật có thể chịu được tác động của các loại kháng sinh. Các gen kháng thuốc thường có sẵn trong các loài vi sinh vật tạo ra kháng sinh bảo vệ chúng khỏi tác động của thuốc kháng sinh này. Những gen này có thể được hình thành trong các loài vi khuẩn khác thông qua sự trao đổi gen với một vi khuẩn tạo ra kháng sinh, do vậy chúng có khả năng tạo ra cơ chế làm trung hoà hoặc phá huỷ các loại thuốc kháng sinh (Bùi Thị Tho, 2003). 2.5.3 Cơ chế của sự kháng thuốc Một số loài vi sinh vật có sẵn khả năng chịu được một số loại kháng sinh nhất định. Sự kháng thuốc kháng sinh có thể coi như là đặc tính vốn có hoặc có thể được hình thành của các vi sinh vật này. Có nhiều cách khác nhau gây ra sự kháng thuốc của vi sinh vật. Có ba cơ chế thường gặp của hiện tượng đề kháng kháng sinh ở vi khuẩn: Thay đổi vị trí đích tác động; Thay đổi sự thu nhận kháng sinh, và bất hoạt kháng sinh (Bùi Kim Tùng, 2001). Ngoài ra, hiện tượng kháng thuốc có thể xảy ra theo một trong những cơ chế sau đây. Ø Làm thay đổi mục tiêu tác động của thuốc trên vi khuẩn ví dụ làm thay đổi protein trên vi khuẩn mà thuốc kháng sinh sẽ bám vào để tác động. 8 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Ø Vô hiệu hóa thuốc bằng enzyme bêta lactamase. Ø Làm giảm độ thẩm thấu của màng tế bào vi khuẩn nên thuốc không tác động được. 2.6 Các nhóm kháng sinh thường sử dụng trong nuôi trồng thủy sản 2.6.1 Nhóm beta-lactamin. Là nhóm kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn có phổ kháng khuẩn hẹp, chủ yếu có tác dụng trên vi khuẩn Gram (+) và một ít vi khuẩn Gram (-). Do màng tế bào của vi khuẩn Gram (-) có tỉ lệ lipit cao nên nó kỵ nước, còn nhóm β-lactamin phải khuếch tán qua các ống dẫn protein nằm trên bề mặt màng (Prescott, 2000; Bùi Kim Tùng, 2001). β-lactamin không có ảnh hưởng độc đối với cơ thể, trừ một số cơ thể có cơ địa dị ứng. Đối với kháng sinh thuộc nhóm này có thể sử dụng liều cao. Liều độc gấp 7.600 lần so với liều điều trị (Bùi Thị Tho, 2003). Đại diện của nhóm này thường được dùng trong thủy sản là Amoxilline, ampicillin (Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Quốc Thịnh, 2005) Ampicillin Là thuốc kháng sinh có phổ tác dụng rộng, có tác dụng với mốt số lượng lớn vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Có thể so sánh ampicillin với các thuốc có phổ tác dụng rộng như chloramphenicol, tetracyclin…Thuốc có tính acid, khi ở dạng muối rất dể tan trong nước (Bùi Thị Tho, 2003). Khi được dùng để điều trị, thuốc phân tán điều trong cơ thể nhưng tập trung nhiều ở gan, thận, một phần nhỏ ngấm vào dịch não tủy. Thuốc được thải trừ qua thận ở dạng nguyên thủy (Võ Văn Ninh, 2001) ra môi trường ngoài nên rất dễ gây ra hiện tượng kháng với loại thuốc này của vi khuẩn. 2.6.2 Nhóm Tetracyclin Là thuốc ức chế vi khuẩn ở nồng độ thấp và diệt khuẩn ở nồng độ cao. Nó phụ thuộc vào độ mẫn cảm của vi khuẩn đối với thuốc. Đây là nhóm kháng sinh có phổ hoạt rất rộng. Tác dụng cả đối với nhóm vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) nhưng vi khuẩn Gram (+) mẫn cảm với thuốc hơn là Gram (-), virus có kích thướt lớn, ký sinh trùng (Bùi Thị Tho, 2003; Bùi Quang Tề và ctv., 2005) Nhóm này gồm các loại kháng sinh tetracyclin (oxytetracycline, clortetracyclin, dimeclocyclin, methylencyclin) doxycyclin, minocyclin… Trong đó, doxycyclin không bị ảnh hưởng bởi thức ăn trong ruột và hấp thu qua ruột cao gấp 10 lần so với các kháng sinh khác cùng nhóm. Do đó các kháng sinh thuộc nhóm này ngoài doxycyclin thì không nên điều trị bằng cách trộn vào thức ăn. Tetracycline dùng để trị nhiễm khuẩn toàn thân và nhiễm trùng ruột. khi điều trị bệnh bằng các kháng sinh thuộc nhóm này không nên kết hợp với ampicillin, erythromycin, colistin… như thế sẽ gây ra tác dụng đối kháng làm giảm tác dụng của thuốc chẳng những không khỏi bệnh mà còn gây ra hiện tượng kháng thuốc (Bùi Kim Tùng, 2001). Clortetracyclin, doxycyclin khi được dùng để kiểm tra kháng sinh đồ kết quả vẫn còn nhạy với nhóm vi khuẩn Vibrio sp. Nên được dùng để điều trị bệnh phát sáng trên tôm sú và 9 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com dùng để thay thế các thuốc bị cấm như chloramphenicol, nitrofuran…(Bùi Quang Tề và ctv., 2005) Theo Bùi Thị Tho (2003) thì thuốc thuốc kháng sinh thuộc nhóm này đã bị nhiều loài vi khuẩn kháng lại do nó được sử dụng rộng rãi trong điều trị cũng như dùng làm thức ăn bổ sung. Thực tế đã phân lập được nhiều chủng vi khuẩn kháng với tetracycline (Depaola el al., 1995; Waltman et al., 1996; Mohamed Nawaz et al., 2006) 2.6.3 Nhóm Quinolone Là nhóm kháng sinh có tác dụng diệt khuẩn, chúng có tác dụng ức chế tổng hợp AND. Các thuốc thuộc nhóm này được phát triển qua 2 thế hệ với phổ kháng sinh và cơ chế kháng khuẩn khác nhau. Thế hệ thứ nhất có phổ kháng khuẩn hẹp, tác dụng chủ yếu trên vi khuẩn Gram (-). Thế hệ thứ hai có phổ kháng khuẩn vừa nhanh vừa mạnh, phổ kháng khuẩn được mở rộng trên vi khuẩn Gram (-) và Gram (+). Các loại kháng sinh thuộc nhóm này là enrofloxacin, norfloxacin, ofloxacin,ciprofloxacin, oxonilic acid… (Bùi Thị Tho, 2003). Trong nuôi trồng thủy sản các kháng sinh thuộc nhóm Quinolone được sử dụng khá phổ biến trong điều trị bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri như enrofloxacin, norfloxacin rất có hiệu quả (Từ Thanh Dung và ctv., 2005). Trong điều trị bệnh phát sáng trên tôm do vi khuẩn Virio sp thì các loại kháng sinh norfloxacin và oxonilic acid thường được sử dụng (Đỗ Thị Hòa và ctv., 2005). 2.6.4 Nhóm phenicol Đây là nhóm kháng sinh có tác dụng kìm khuẩn nhưng cũng có tác dụng diệt khuẩn trong một số trường hợp bệnh truyền nhiễm với những điều kiện nhất định và nồng độ cao hơn. Thuốc có tác dụng ức chế vi khuẩn với nồng độ thấp. hoạt phổ của nó rất rộng, tác dụng trên nhiều loài vi khuân Gram (+) và Gram (-), vi rút có kích thướt lớn ( Bùi Thị Tho, 2003). 2.6.5 Nhóm Sulphamid (sulfonamide) Đây là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng trên vi khuẩn Gram (-) và một số vi khuẩn Gram (+). Sulphamid với liều kiềm khuẩn sẽ ức chế sự sinh sản phát triển của vi khuẩn do thuốc cạnh tranh với acid para amonozenzoic một yếu tố sinh trưởng cần cho sự phát triển của mọi loại tế bào trong đó có cả tế bào vi khuẩn (Bùi Thị Tho, 2003). Các loại thuốc thuộc nhóm này thường được dùng trong thủy sản là trimethoprim, sulfamethizole...và dạng kết hợp để trị bệnh đỏ mỏ, viêm ruột, xuất huyết, đốm đỏ, trắng đuôi do vi khuẩn gây ra trên cá và phát sáng do vi khuẩn gây ra trên tôm (Đỗ Thị Hòa và ctv., 2004), (Bùi Quang Tề, 2002). 10 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng Cá tra có dấu hiệu bệnh nuôi ở vùng nước lợ trên địa bàn hai tỉnh Trà Vinh và Bến Tre. 3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm Bộ tiểu phẩu, khay nhựa, đèn cồn, bình xịt cồn, que cấy, giấy vệ sinh, cốc thủy tinh, bút lông dầu, cân, thước đo, pipet, micropipette, hộp đầu col, đầu col, đĩa Petri, ống nghiệm, chai nấu môi trường. Dụng cụ thu mẫu, chai nút mài 100 ml, chai nhựa 1 lít, bao nilon, dây thun, dụng cụ thu mẫu cá. Tủ ấm, tủ cấy vi khuẩn, tủ lạnh, nồi autoclave, tủ sấy. 3.2 Hóa chất và môi trường 3.2.1 Hóa chất Nước cất, muối NaCl, dung dịch nhuộm Gram, cồn tuyệt đối, Chlorine viên, paraffin 3.2.2 Môi trường Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: TSA (Tryptone soya agar), EMB (Eosin methylen blue Lactose sucrose Agar), BHI (Brain heart in broth), EIA (Edwadsiella ictaluri agar), MHA (Mueller-Hinton Agar), glycerol…(các môi trường có nguồn gốc từ Merck) Các hóa chất môi trường test sinh hóa: O/F test, H2O2, giấy test oxidase, Bộ kit API 20E (BIOMÉRIEUX) Các loại kháng sinh dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ ): Cefazoline (CEZ), Chloramphenicol (CHL), Tetracycline (TE), Flofenicol (FFC), Doxyciline (DO), Streptomycine (SM), Ampiciline (AM). (các đĩa khnág sinh mua từ Biorad) Kháng sinh tinh dùng trong xác định MIC: Chloramphenicol, Oxytetracycline, Streptomycine (nguồn gốc Oxoid). Các loại dụng cụ và hóa chất cần thiết khác. 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp điều tra Tiến hành điều tra những hộ nuôi cá tra trên vùng nước lợ ở Trà Vinh và Bến Tre về tình hình dịch bệnh trên cá và những loại thuốc/hóa chất thường được dùng để phòng và xử lý khi có bệnh xảy ra bằng các phiếu câu hỏi đã chuẩn bị trước (phiếu điều tra xem phụ lục 1). 11 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com Địa điểm thu mẫu và điều tra được chọn theo vùng có nuôi thâm canh cá tra cao ở Trà Vinh và Bến Tre. Số liệu điều tra được xử lý bằng phần mền Excel. 3.3.2 Phương pháp thu mẫu Chọn điểm thu mẫu: ao nuôi cá tra thịt thâm canh ở vùng nước lợ hai tỉnh Trà Vinh và Bến Tre. Mỗi lần thu 5 con cá tra. Nếu ao bệnh thì thu 3-4 con cá bệnh và 1-2 con cá khỏe. Đồng thời với việc thu mẫu cá phân tích thì cũng cần ghi nhận thông tin thêm về kỹ thuật nuôi, hiện trường ao nuôi, dấu hiệu bên ngoài, bên trong của cá (phiếu thu thập thông tin xem phụ lục 2). Phương pháp thu mẫu cá theo tài liệu của Furones (2001) Khi mẫu được tiến hành thu tại chỗ, tối thiểu 5-10 con cá có biểu hiện lờ đờ được lấy mẫu. Giết chết cá bằng cách ấn mạnh lưỡi dao mổ xuyên qua đỉnh hộp sọ hoặc gây chết cá với phương pháp hủy tỷ bằng kim mũi giáo. Mẫu được chuyển đến phòng thí nghiệm, tối thiểu 5-10 con cá còn sống phải được lựa chọn cẩn thận được chứa trong các thùng chứa nước thích hợp với nồng độ oxy bão hòa. Nếu như cá được chuyển đi sau khi chết, chúng được đóng gói riêng và để trong nước đá. Gan, thận và tỳ tạng của từng con cá được cấy trên môi trường TSA (Tryptone soya agar), trong điều kiện tiệt trùng. Những khuẩn lạc rời và hình dạng đặc trưng của Edwardsiella và Aeromonas được tách ròng và lưu giữ để định danh, lập kháng sinh đồ và MIC. 3.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn Phương pháp định danh vi khuẩn: xác định các đặc điểm về hình thái , sinh hóa, kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản và sử dụng bộ kit API 20E (BIOMÉRIEUS) Vi khuẩn được định danh theo phương pháp của Frerichs và Millar (1993) v Các bước thực hiện ( phụ lục 3) 3.3.4 Phương pháp lập kháng sinh đồ Phương pháp làm kháng sinh đồ của hai nhóm vi khuẩn Aeromonas spp và E.ictaluri bằng phương pháp Kirbry-Bauer, sử dụng môi trường MHA (Mueller-Hinton Agar), chọn 7 loại kháng sinh: cefazoline (CEZ), chloramphenicol (CHL), tetracycline (TE), florfenicol (FFC), doxyciline (DO), streptomycine (SM), ampicilline (AM). v Các bước lập kháng sinh đồ theo phương pháp của Kirbry-Bauer, 1966 Ø Mật số vi khuẩn được xác định dựa vào phương pháp so màu trên máy quang phổ 12 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http://www.fineprint.com