Tài liệu đánh giá khả năng trung hòa độc tốc nọc độc rắn hổ mang (naja naja) bằng kháng thể lòng đỏ (igy) kháng nọc rắn

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN VĂN TÂM ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TRUNG HÒA ĐỘC TỐ NỌC ĐỘC RẮN HỔ MANG (NAJA NAJA) BẰNG KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ (IGY) KHÁNG NỌC RẮN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Văn Phan TS. Nguyễn Hữu Đức NHÀ XUÂT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2018 1. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Văn Tâm i 2. LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của quý thầy cô, các anh chị và các bạn. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới các thầy cô giáo khoa Công nghệ Sinh học, các thầy cô giáo Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã chia sẻ tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Đặc biệt tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy TS. Lê Văn Phan, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và thầy TS. Nguyễn Hữu Đức, Bộ mộn Công nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, luôn giúp đỡ hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận. Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo cùng toàn thể các anh chị, các bạn trong Công ty TNHH Một Thành Viên AVAC Việt Nam, đặc biệt là các anh chị tại phòng R&D Lab nơi tôi công tác đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, các bạn trong tập thể lớp CH24 CNSHC, những người luôn động viên, giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành tốt luận văn này. Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Văn Tâm ii 3. MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................. I LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... II MỤC LỤC ...................................................................................................................... III DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................... VI DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... VII DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................... VIII TRÍCH YẾU LUẬN VĂN ............................................................................................. IX THESIS ABSTRACT ...................................................................................................... X PHẦN 1. MỞ ĐẦU.......................................................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu đề tài .................................................................................................. 2 1.3. Phạm vi nghiên cứu .......................................................................................... 3 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn .......................................................................... 3 1.4.1. Ý nghĩa khoa học.............................................................................................. 3 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn .............................................................................................. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................... 4 2.1. Tình hình tai nạn do rắn độc cắn trên thế giới và việt nam .............................. 4 2.1.1. Tình hình tai nạn do rắn độc cắn trên Thế giới ................................................ 4 2.1.2. Tình hình tai nạn do rắn độc cắn ở Việt Nam .................................................. 5 2.2. Tổng quan về các loài rắn độc ở việt nam ........................................................ 5 2.2.1. Các loài rắn độc ở Việt Nam ............................................................................ 5 2.2.2. Độc tố nọc rắn độc ........................................................................................... 7 2.2.3. Các triệu chứng lâm sàng khi rắn độc độc cắn ............................................... 11 2.2.4. Phương pháp sơ cứu và điều trị khi rắn độc cắn ............................................ 13 2.3. Tống quan về huyết thanh kháng nọc rắn (htknr) .......................................... 16 2.3.1. Cơ sở miễn dịch học ....................................................................................... 16 2.3.2. Kháng thể kháng nọc rắn ................................................................................ 18 2.3.3. Kháng thể lòng đỏ (IgY) kháng nọc rắn ......................................................... 19 2.3.4. Tình hình nghiên cứu HTKNR trên Thế giới và Việt Nam ........................... 21 iii PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 24 3.1. Địa điểm nghiên cứu ...................................................................................... 24 3.2. Thời gian nghiên cứu ..................................................................................... 24 3.3. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ................................................................... 24 3.3.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 24 3.3.2. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 24 3.4. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 26 3.5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 26 3.5.1. Phương pháp xác định liều gây chết 50% trên chuột (LD50) ......................... 26 3.5.2. Phương pháp gây miễn dịch cho gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn ....... 26 3.5.3. Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà với kháng nguyên nọc rắn bằng phản ứng ELISA .............................................................................. 27 3.5.4. Phương pháp xác định đặc tính và hàm lượng kháng thể lòng đỏ (IgY) kháng nọc rắn ................................................................................................. 28 3.5.5. Phương pháp đánh giá khả năng trung hòa độc tố nọc rắn hổ mang (Naja naja) bằng kháng thể IgY kháng nọc rắn ............................................. 30 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 33 4.1. Kết quả ........................................................................................................... 33 4.1.1. Kết quả xác định liều nọc rắn gây chết 50% trên chuột (LD50) ..................... 33 4.1.2. Kết quả đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn ............................................................................................................ 34 4.1.3. Kết quả tách chiết kháng thể IgY ................................................................... 37 4.1.4. Kết quả định lượng hàm lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn ....................... 37 4.1.5. Kết quả trung hòa độc tố nọc rắn bằng kháng thể IgY kháng nọc rắn trên tế bào ....................................................................................................... 38 4.1.6. Kết quả trung hòa độc tố nọc rắn bằng kháng thể IgY kháng nọc rắn trên chuột ........................................................................................................ 42 4.2. Thảo luận ........................................................................................................ 43 4.2.1. Đáp ứng miễn dịch của gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) ..................................................................................................... 43 4.2.2. Đặc tính và hàm lượng kháng thể IgY kháng nọc rắn.................................... 45 iv 4.2.3. Khả năng trung hòa độc tố nọc rắn hổ mang (Naja naja) bằng kháng thể IgY kháng nọc rắn .......................................................................................... 46 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 48 5.1. Kết luận .......................................................................................................... 48 5.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 48 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 49 PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 53 v 4. DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Việt HTKNR Huyết thanh kháng nọc rắn LD50 Lethal Dose 50 FCA Freund’s complete adjuvant FIA Freund’s incomplete adjuvant PBS Phosphate buffered saline µl Microlit µg Microgarm IgY Yolk Immunoglobulin IgG Immuno Globulin G CT50 Killed 50% of the cell ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FBS Fetal bovine serum BSA Bovine serum albumin SDS Sodium dodecyl sulfate vi 5. DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Triệu chứng rắn độc cắn thuộc họ rắn hổ .................................................. 12 Bảng 2.1. So sánh một số đặc tính của kháng thể (KT) sản xuất từ huyết thanh động vật (IgG) và kháng thể sản xuất từ trứng gia cầm (IgY) (Schade, Calzado et al, 2005) ................................................................... 21 Bảng 3.1. Quy trình gây miễn dịch cho gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn........ 27 Bảng 4.1. Tỷ lệ chết của chuột ở các lô chuột thí nghiệm được tiêm nọc rắn tại các nồng độ khác nhau .............................................................................. 33 Bảng 4.2. Tỷ lệ của gà xuất hiện các triệu chứng sau gây miễn dịch gà với nọc độc rắn ....................................................................................................... 34 Bảng 4.3. Giá trị OD540 và tỷ lệ chết của tế bào khi sử dụng lượng nọc rắn khác nhau được đánh giá bằng phương pháp nhuộm Neutral Red .................... 39 Bảng 4.4. Giá trị OD540 và tỷ lệ chết của tế bào Vero khi trung hòa độc tố nọc rắn bằng kháng thể IgY – đối chứng và 56 ngày trên tế bào .................... 40 Bảng 4.5. Tỷ lệ chuột chết ở các lượng kháng thể IgY khác nhau trung hòa độc tố nọc rắn ................................................................................................... 42 6. vii 7. DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Sơ đồ cơ chê gây độc thần kinh qua xi-nap ................................................ 9 Hình 2.2. Sự truyền các loại kháng thể từ huyết thanh sang trứng gà ...................... 19 Hình 2.3. Hình thái và cấu trúc kháng thể IgG và IgY ............................................. 20 Hình 4.1. Hình ảnh chuột chết trong các lô thí nghiệm ............................................ 34 Hình 4.2. Giá trị OD405 của các mẫu ở các độ pha loãng khác nhau ........................ 35 Hình 4.3. Biến động hàm lượng kháng thể của gà sau khi gây miễn dịch với kháng nguyên là nọc độc rắn..................................................................... 36 Hình 4.4. Điên di SDS – PAGE kháng thể IgY sau tách chiết ................................. 37 Hình 4.6. Hình thái tế bào Vero trong thí nghiệm khi nhuộm Neutral Red .............. 41 8. viii 9. TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Văn Tâm Tên Luận văn: Đánh giá khả năng trung hòa độc tố nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) bằng kháng thể lòng đỏ (IgY) kháng nọc rắn. Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60620301 Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của gà mái cũng như hàm lượng kháng thể thụ động từ gà mái truyền sang trứng đối với kháng nguyên là nọc độc rắn hổ mang Naja naja để làm cơ sở cho nghiên cứu sản xuất kháng thể IgY kháng nọc rắn từ lòng đỏ trứng gà. Phương pháp nghiên cứu Nọc độc rắn được gây miễn dịch cho gà mái giai đoạn hậu bị (16 – 18 tuần tuổi) với liều gây miễn dịch dựa vào cơ sở xác định liều gây chết 50% trên chuột thí nghiệm (LD50). Phương pháp ELISA được sử dụng để đánh giá hàm lượng kháng thể kháng nọc rắn có trong huyết thanh gà và kháng thể thụ động từ gà mẹ truyền sang trứng. Các phản ứng trung hòa độc tố nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) được thực hiện trên môi trường tế bào và trên chuột thí nghiệm. Kết quả chính và kết luận Độc tính của nọc độc rắn hổ mang Naja naja được xác định trên chuột cho kết quả giá trị LD50 = 1,46µg/g. Kết quả đánh giá hàm lượng kháng thể có trong huyết thanh bằng phản ứng ELISA cho thấy nồng độ kháng thể của gà kháng nọc rắn đạt cao nhất vào ngày 49 và kéo dài đến ngày 111 sau khi gây miễn dịch. Hàm lượng kháng thể thụ động từ gà mẹ truyền qua trứng giá trị cao nhất vào ngày 56 sau gây miễn dịch và kéo dài đến ngày 91. Kết quả đánh giá khả năng trung hòa nọc rắn của kháng thể IgY trong lòng đỏ trứng gà cũng được tiến hành trên chuột Swiss và trên môi trường nuôi cấy tế bào Vero, cho thấy kháng thể IgY tách chiết từ lòng đỏ trứng gà của gà được gây miễn dịch với kháng nguyên là nọc rắn có khả năng trung hòa độc tố của nọc độc rắn (2LD50) trên chuột Swiss cũng như có khả năng trung hòa 5µg nọc rắn bổ sung vào môi trường nuôi cấy của 104 tế bào Vero. Như vậy, với các kết quả trên cho thấy kháng thể IgY thu từ trứng của gà được gây miễn dịch với nọc rắn có khả năng trung hòa độc tố nọc rắn hổ mang (Naja naja). ix 10. THESIS ABSTRACT Master candidate: Nguyen Van Tam Thesis title: Evaluate the ability to neutralize cobra venom (Naja naja) with anti-venom antibody (IgY) Major: Biotechnology Code: 60620301 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives This study was conducted to evaluate the ability of the hen's immune response as well as the passive antibody content from hen to the egg for antigen Naja naja as the basis for the study. Production of IgY antibody against snake venom from egg yolk. Materials and Methods Snake venom was immunized to hens at 16 to 18 weeks of age with a dose based on 50% lethal dose in mice (LD50). ELISA was used to evaluate the anti-venom antibody content of chicken serum and the passive antibody from broilers fed to the eggs. The reactions neutralizing snake venom (Naja naja) were carried out in the cell culture medium and in mice. Main findings and conclusions The toxicity of Naja naja snake venom was determined on the mouse resulting in an LD50 value of 1.46 μg / g. Results of serum antibody assay by ELISA showed that the antibody concentration of the antipyretic cock was highest on day 49 and lasted until day 111 after immunization. Passive antibody levels from the parental broodstock were highest at 56 days post-immunosuppressed and lasted until day 91. The results of the assessment of the ability to neutralize snake venom of IgY antibody in egg yolk was performed on Swiss mice and on Vero cell culture medium, indicating that IgY antibody extracted from chicken egg yolk was immunized with antigens that were solid venom capable of neutralizing venom of venom. solid (2LD50) on Swiss mice as well as the ability to neutralize 5μg of solid venom supplemented with 104 Vero cells. Thus, with the results shown that IgY antibody from the egg of the chicken is immune to snake venom capable of neutralizing venomous snake (Naja naja). x 11. PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Rắn độc cắn là một tai nạn thường gặp ở các nước trong khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) mỗi năm trên Thế giới có khoảng 3 triệu người bị rắn độc cắn. Ở Việt Nam ước tính có khoảng 30 nghìn nạn nhân bị rắn cắn phải nhập viện mỗi năm, trong số đó, chủ yếu do rắn hổ (ở miền Bắc) và rắn lục (ở miền Nam) (Nguyễn Quốc Thắng 1995). Thống kê của Khoa Nội tiêu hóa, Bệnh viện Quân y 121 năm 2016 cho thấy, bình quân mỗi tháng có khoảng 100 người nhập viện điều trị do bị rắn lục đuôi đỏ cắn. Theo thống kê của Trung tâm Chống độc BV Bạch Mai, rắn độc cắn đứng hàng thứ 5 trong các trường hợp ngộ độc tới cấp cứu tại Trung tâm, thường gặp từ tháng 4 đến tháng 11, là mùa sinh sôi và phát triển của nhiều loài rắn độc. Trong số những người được cứu sống, có đến 13-14% phải cắt chi hoặc một phần chi. Biểu hiện triệu chứng của nạn nhân thường xuất hiện sau 2 – 4 giờ sau khi bị rắn độc cắn. Trường hợp muộn nhất đã gặp ở khoa Hồi sức cấp cứu- bệnh viện Bạch Mai là sau 24 giờ mới xuất hiện triệu chứng liệt cơ. Triệu chứng xuất hiện càng sớm thì độc tính của nọc độc rắn càng cao, các tổn thương càng nặng dẫn đến chi phí điều trị cho các nạn nhân rất tốn kém, nhiều nạn nhân phải thở máy hàng tháng hoặc phải truyền hàng chục lít máu và huyết tương để cứu tính mạng. Kỷ lục, đầu tháng 6/2013, bệnh viện Bạch Mai đã phải truyền ≈ 46 lít máu và chế phẩm để cứu một người bệnh. Hiện nay, biện pháp điều trị rắn độc cắn hiệu quả nhất cho các nạn nhân là sử dụng huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR) đặc hiệu. Tuy nhiên, HTKNR có tính chất đơn giá, có nghĩa là HTKNR loài này không có khả năng trung hòa độc tố của nọc độc loài rắn khác. Ngoài ra, do tính đặc hiệu kháng nguyên nọc rắn theo từng vùng địa lý nên WHO đã khuyến cáo mỗi quốc gia phải tự chế tạo hệ thống HTKNR của từng loài cho chính quốc gia mình. Bộ Y tế nước ta cũng đã quan tâm chỉ đạo việc nghiên cứu và ứng dụng sản xuất hệ thống HTKNR cho các loài rắn độc sinh sống ở Việt Nam. Đặc biệt là các HTKNR cho các loài rắn độc nguy hiểm, thường gặp; trong các loài đó, loài rắn hổ mang (Naja naja) là loài rắn rất nguy hiểm với độc tính nọc độc rất cao, phân bố rộng rãi tại các vùng 1 miền núi phía Bắc. Chất độc thần kinh có trong nọc rắn ngăn chặn hoạt động của hệ thống thần kinh và hệ thống thần kinh - cơ trong vòng 15 phút đến hai giờ, gây ra tình trạng buồn ngủ, tê liệt, mất ý thức, khó thở, tim ngừng đập dẫn đến chết. Rắn hổ mang giết chết nhiều người vì nó hoạt động cả ngày lẫn đêm. Chúng thường xuất hiện ở khu vực đông dân cư... Các nghiên cứu sản xuất HTKNR hiện nay có bản chất là các IgG thu được từ huyết thanh của các con vật được gây miễn dịch với kháng nguyên nọc độc rắn như ngựa. Tuy nhiên, các loại HTKNR được sản xuất từ nguồn động vật khác khi được tiêm cho người bị rắn độc cắn có thể có các tác dụng phụ như gây di ứng, suy thận, bệnh huyết thanh ở người nhận. Bệnh huyết thanh là phản ứng khi truyền huyết thanh ngoại lai vào cơ thể (Gold, Dart et al. 2002). Để giảm thiểu các tác nhân phụ đó thì các HTKNR cần phải rất tinh khiết loại bỏ các loại protein khác có trong huyết thanh nhưng quá trình tinh khiết HTKNR có chi phí rất cao đòi hỏi công nghệ cao (Devi, Bai et al. 2002). Kháng thể lòng đỏ có trong trứng của một số loài chim, gia cầm, bò sát, lưỡng cư (Warr, Magor et al. 1995) là một nguồn sản xuất kháng thể đa giá trong hơn một thập kỷ (Polson, von Wechmar et al. 1980) và có nhiều ứng dụng trong thực tiễn (Zhang 2003). Năm 1990, Thalley và Carroll, đã mô tả một loại kháng thể được thu từ trứng của loài gia cầm gây miễn dịch với nọc độc rắn có khả năng chống lại nọc độc rắn (Thalley and Carroll 1990). Năm 2010, các nhà khoa học Ấn Độ cũng đã công nhận khả năng điều trị các vết do rắn độc cắn của trứng gà được thu từ các con gà được gây miễn dịch với nọc rắn. Quy trình tinh sạch kháng thể IgY trong trứng đơn giản hơn nhiều so với việc tinh sạch kháng thể IgG từ huyết thanh. Nghiên cứu và sản xuất HTKNR từ lòng đỏ trứng gà là hướng đi mới trong việc tạo nguồn kháng thể kháng nọc rắn. Do đó, tôi thực hiện nghiên cứu đề tài “Đánh giá khả năng trung hòa độc tố nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) bằng kháng thể lòng đỏ (IgY) kháng nọc rắn”. 1.2. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của gà mái với kháng nguyên nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) thu thập tại Việt Nam Đánh giá khả năng trung hòa độc tố nọc độc rắn hổ mang (Naja naja) ở Việt Nam bằng kháng thể lòng đỏ (IgY) thu từ trứng gà được gây miễn dịch bằng nọc rắn. Từ đó, tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo trong quá trình nghiên cứu và sản xuất kháng thể IgY kháng nọc độc rắn hổ mang (Naja naja). 2 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Nghiên cứu đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà đối với kháng nguyên là nọc độc rắn hổ mang Naja naja và khả năng trung hòa độc tố của kháng thể lòng đỏ đối với nọc rắn trên tế bào và trên chuột thí nghiệm. 1.4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 1.4.1. Ý nghĩa khoa học Đề tài được thực hiện sẽ góp phần chứng minh khả năng trung hòa độc tố của kháng thể IgY với nọc độc rắn hổ mang (Naja naja). Đồng thời, đề tài cũng xây dựng phương pháp đánh giá kháng thể IgY kháng nọc độc rắn Naja naja cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc sản xuất kháng thể kháng nọc rắn cho loài rắn hổ mang Naja naja trên gà mái. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài thực hiện sẽ là cơ sở cho việc nghiên cứu tạo kháng thể kháng nọc rắn hổ mang (Naja naja) từ trứng gà. Kháng thể kháng nọc rắn từ trứng gà được tạo ra thành công sẽ giúp cho các nạn nhân không bị ảnh hưởng bởi các tác dụng phụ trong quá trình điều trị bằng các HTKNR được sản xuất từ huyết thanh ngựa. Ngoài ra, với quy trình tinh sạch kháng thể IgY đơn giản hơn so với quy trình tinh sạch kháng thể IgG trong huyết thanh sẽ làm giảm giá thành sản xuất của kháng thể xuống. Từ đó, việc sử dụng kháng thể kháng nọc rắn cho các nạn nhân nghèo được dễ dàng hơn. 3 12. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13. 2.1. TÌNH HÌNH TAI NẠN DO RẮN ĐỘC CẮN TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 2.1.1. Tình hình tai nạn do rắn độc cắn trên Thế giới Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới mỗi năm có khoảng 3 triệu người bị rắn độc cắn và có khoảng 50-60 nghìn người chết do rắn độc cắn. Theo thống kê của hiệp hội Chống độc Mỹ, mỗi năm có khoảng 8.000 người bị rắn độc cắn, trong đó có từ 9 - 15 người chết, tỷ lệ tử vong do rắn hổ cắn là 9% và rắn lục là 0,2% (David 2005). Theo các số liệu của tổ chức Y tế thế giới, hơn 90% các trường hợp tử vong xảy ra ở hai châu lục là châu Phi và châu Á. Rắn độc cắn xảy ra chủ yếu ở các vùng nông thôn nhiệt đới ở các nước đang phát triển và do đó rất có thể là báo cáo không đầy đủ: - Năm 1924, ở Ấn Độ có 19867 ca tử vong do rắn cắn được báo cáo sau đó - Mỗi năm, ở miền tây thảo nguyên Châu Phi, có 100000 người bị rắn cắn trong đó có 500 người là do rắn độc cắn, số ca tử vong 4 – 40 người, 19% nạn nhân được cứu sống nhưng bị tàn tật kéo dài. - Ở Tây Bengal có 160/100000 tai nạn do rắn độc cắn mỗi năm và 16 người chết (Alirol, Sharma et al. 2010) - Myanmar báo cáo năm 1991 có 14000 người bị rắn độc cắn với 1000 người bị tử vong và năm 1997 có 8000 người bị rắn độc cắn với 500 người tử vong (David 2005). - Nepal ước tính ít nhất 20000 nạn nhân bị rắn độc cắn với khoảng 200 nạn nhân tử vong ở bệnh viện mỗi năm chủ yếu ở khu vực Terai (Alirol, Sharma et al. 2010). Năm 2009 rắn độc cắn đã được công nhận bởi WHO là tai nạn thường gặp ở các nước đang phát triển có khí hậu nhiệt đới (Kularatne, Budagoda et al. 2009). Khoảng 46 quốc gia có khí hậu nhiệt đới và phần lớn là tai nạn hay gặp ở người lao động nông nghiệp. Rắn độc cắn nguyên nhân đáng kể dẫn đến tử vong và tàn tật và ảnh hưởng tâm lý con người. Nam và Đông Nam Á được xác định là có tỷ lệ rắn cắn cao nhất (Gold, Dart et al. 2002). 4 2.1.2. Tình hình tai nạn do rắn độc cắn ở Việt Nam Ở Việt Nam chưa có số liệu được công bố chính xác nạn nhân bị rắn độc cắn, nhưng số nạn nhân do rắn độc cắn có thể lên tới 30 nghìn người mỗi năm, khoảng 200-300 ca tử vong mỗi năm và thường là những người lao động nông nghiệp, công nhân trồng cây công nghiệp cao su-cafe và một vài trường hợp bị chết bởi rắn biển nhưng không đến viện. Các báo cáo tổng kết tại khoa HSCC A9 BV Bạch Mai, tỷ lệ tử vong của nhóm bệnh nhân bị rắn hổ cắn là 20% (1987 1991); 11,9% (1991-1993), 5,9% (1994 - 1997) (Vũ Văn Đính và cộng sự, 1998). Khảo sát tại bệnh viện Chợ Rẫy, tỷ lệ tử vong do rắn hổ cắn là 7,6% (1990 1994) (Trần Quốc Túy và cộng sự, 1998), theo báo cáo tại hội nghị quốc tế về rắn độc cắn tại bệnh viện Chợ Rẫy thì tại Việt Nam ước tính mỗi năm có hàng chục nghìn người bị rắn độc cắn. Theo tác giả Trịnh Xuân Kiếm, chỉ tính riêng tại bệnh viện Chợ rẫy từ năm 1994 đến tháng 8/1998 có 1.476 trường hợp bị rắn độc cắn tới viện, tử vong 36 bệnh nhân (2,5%), 6 tháng đầu 2001 số bệnh nhân bị rắn cắn là 317 chiếm 41% số bệnh nhân bị ngộ độc cấp tới viện, 6 tháng đầu 2002 số bệnh nhân bị rắn cắn 274 chiếm 37% số bệnh nhân bị ngộ độc cấp tới viện. 2.2. TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI RẮN ĐỘC Ở VIỆT NAM 2.2.1. Các loài rắn độc ở Việt Nam Việt Nam là một nước nằm trong vùng nhiệt đới với địa hình và khí hậu khác nhau giữa các miền Bắc, Trung, Nam. Từ đặc điểm tự nhiên đó đã tạo nên sự đa dạng sinh học ở nước ta, trong đó có sự đa dạng về các loài rắn độc. Theo Trần Kiên và Nguyễn Quốc Thắng, 1995 (Nguyễn Quốc Thắng 1995), Việt Nam có gần 200 loài rắn, trong đó 53 loại rắn độc chủ yếu thuộc hai họ rắn lục và rắn hổ. 2.2.1.1. Họ rắn lục - Rắn lục đuôi đỏ – Viridovipera vogeli: dài nhất 60cm, nặng tối đa 300g là loài rắn độc thứ 2 ở VN. - Rắn lục đầu bạc – Azemiops feae. - Rắn lục Protobothrops jerdoni bourreti. Ở nước ta thường gặp rắn lục xanh (Trimeresurus – stejnereri), rắn choàm quạp (ở miền Nam) (Agkistrodon rhodostoma) còn gọi là Lục Mã Lai (Rhodostoma malayii). 5 2.2.1.2. Họ rắn hổ - Rắn hổ mang chúa (Ophiophagus hannah) chiều dài có thể tới 7m, trọng lượng lớn nhất lên tới 20 kg, một nhát cắn có thể cho ra 400mg nọc độc (có khả năng giết chết 20 người hoặc một con voi). Đây là loài rắn độc số 1 trên thế giới hiện nay. - Rắn hổ mang Ấn Độ - Naja naja: Là rắn độc cỡ lớn, dài trung bình khoảng 1m trở lên, có thể dài tới 2m. Đầu rộng và hơi dẹp, không phân biệt với cổ, có một đôi móc độc mọc ở phía trước hàm trên, có thể dựng lên được. Lưng có màu vàng lục, nâu thẫm hay đen hoặc đồng màu hoặc có những dải hoa văn như những vạch ngang đơn hoặc kép sáng màu. Hoa văn ở cổ có hai dạng, nhìn rõ khi Rắn hổ mang bạnh cổ, cổ bao giờ cũng bạnh theo chiều ngang, sang hai bên. Dựa vào hình thái ngoài, nhất là dựa vào hoa văn ở mặt, cổ, phần lưng đặc biệt là khi rắn bạnh cổ, có thể chia rắn hổ mang thành hai phân loài: Phân loài rắn hổ mang trung quốc và Rắn hổ mang một mắt kính có gọng (Naja naja atra Cantor) - Rắn hổ mang – Naja atra (rắn hổ mang bành): Nhận dạng sơ bộ: mặt sau của vùng mang phình có hình hoa văn ở giữa với 2 vệt trắng (2 gọng kính) nối từ hoa văn sang hai bên và nối liền với phần máu trắng ở phía trước cổ. Phân bố ở miền Bắc. Rắn hổ mang – Naja kaouthia (rắn hổ đất): Khi rắn bạnh cổ, trên cổ ở mặt lưng có một hình tròn màu sáng (mắt kính) chính giữa có một vết nâu đen. ở cổ về mặt bụng có một cặp vết nhỏ nằm ngang. Màu sắc ở lưng đa dạng thay đổi từ màu nâu xẫm tới màu nâu xám. Đa số cá thể mặt lưng đồng màu. Một số ít cá thể có những vạch ngang hơi sáng song không rõ rệt. - Rắn hổ mang – Naja siamensis (rắn hổ Xiêm, hổ mèo): Là loài rắn hổ mang cỡ trung bình với cơ thể khá dày. Màu sắc cơ thể của loài này có thể thay đổi từ màu xám sang màu nâu đen, với các đốm trắng hoặc sọc. Các đốm trắng có thể phủ hầu hết của con rắn. Con trưởng thành trung bình dài 0,9 đến 1,2 mét (3,0 đến 3,9 ft), và có thể tối đa 1,6 mét (5 ft) mặc dù hiếm gặp. - Rắn cạp nia – Bungarus multicinctus (rắn khoang trắng đen): Đầu không phân biệt rõ với cổ, dọc cơ thể khoanh màu đen trắng xen kẽ nhau. Mắt trung bình, con người tròn. Lưng màu đen, có 3 dải (1 ở sống lưng, mỗi bên 1 dải chạy dọc theo nơi tiếp giáp hàng vảy thân thứ nhất và hai) màu đỏ hay vàng. Có 193 236 tấm bụng; tấm hậu môn đơn; tấm dưới đuôi: sát hậu môn đơn, phía sau kép 6 Phần sau cơ thể và dưới màu vàng hay da cam. Một nhát cắn có thể cho ra 20 mg nọc độc (liều độc là 0.1mg/ kg). - Rắn cạp nia – Bungarus candidus: Chạy dọc trên thân hình trụ của loài rắn cạp nia nam này là những khoanh màu đen trắng xen kẽ nhau; gồm từ 19 đến 30 khoanh màu đen không vòng qua thân bụng và 7 đến 9 khoanh trên đuôi. Các vảy màu đen riêng lẻ thường phân bố trên các khoanh màu trắng ở nơi nối tiếp với phần bụng màu trắng. Đầu rắn màu đen xám, phía trên hai bên miệng màu sáng hơn một chút. Như tất cả loài rắn thuộc giống Bungarus đều có các vảy trơn nhẵn và phình rộng nơi xương sống. Rắn cạp nong – Bungarus fasciatus (rắn khoang vàng đen): Rắn độc cỡ tương đối lớn, thường dài trên 1m. Đầu lớn và ngắn, ít phân biệt với cổ, mắt tương đối nhỏ và tròn, thân thường nặng nề, đuôi ngắn, mút đuôi tròn, giữa sống lưng có một gờ dọc rất rõ. Hàng vảy sống lưng hình sáu cạnh, lớn hơn vảy bên. Thân có khoanh đen và khoanh vàng xen kẽ, các khoanh xấp xỉ bằng nhau. 2.2.2. Độc tố nọc rắn độc 2.2.2.1. Đặc tính lý hóa Nọc rắn khi mới tiết ra là một chất lỏng trong, mầu hơi vàng, có độ dính cao và có tỷ trọng thay đổi từ 1.03 - 1.1. Chứa 50 - 70% là nước. Sau 24h để ngoài môi trường nọc rắn bị biến chất và có mùi thối. Nếu làm khô nọc rắn trong môi trường chân không, nọc sẽ ở dưới dạng tinh thể nhỏ màu vàng và giữ nguyên được độc tính đến hàng chục năm, với 90% là protein và polypeptide (Russell 2001) 2.2.2.2. Thành phần hóa học Nọc rắn là một hợp chất hóa học, có bản chất là các protein và các enzyme, có đến 26 loại enzym đã được xác định, trong đó có 10 loại có độc tính cao, tham gia vào các phản ứng hóa học đặc biệt trong cơ thể, chuyển hóa trong tế bào (Nelson 1989) và các độc tố polypeptide. 2.2.2.3. Cơ chế gây độc Nọc độc rắn có thể được phân thành 3 nhóm chính: cytotoxin (độc tố tế bào), neurotoxin (độc tố thần kinh) và hemotoxin (độc tố máu). Nhưng ranh giới của 3 nhóm khá mờ nhạt, phần lớn các loài sử dụng kết hợp cả 3. 7 Các độc tố thần kinh (Neurotoxins): Độc tố của rắn cạp nia tác động lên cả tiền xi- nap và hậu xi-nap cho nên thời gian liệt cơ trên lâm sàng có thể kéo dài, đặc biệt nếu không được dùng HTKNR sớm và đủ liều do các độc tố này gây tổn thương sợi trục của đầu mút dây thần kinh tiền xi-nap đó là phospholipase A2. Trên lâm sàng thấy liệt mềm tiến triển. HTKNR có thể không làm đảo ngược tình trạng liệt này, tự nó tồn tại trong nhiều ngày, nhiều tuần thậm chí là cả tháng. Độc tố tiền xinap là một trong những thành phần hiệu lực nhất của nọc rắn cạp nia. Có 3 dưới nhóm của độc tố này: - Phospholipase A2 (PLA2- toxin) gắn vào màng tiền xinap thần kinh, ngăn cản các dẫn truyền thần kinh - cơ. Cơ chế gây độc của Phospholipase A2làm tổn thương các đầu mút dây thần kinh nơi acetylcholin (Ach) vừa được giải phóng, rồi can thiệp vào quá trình giải phóng Ach. - Dendrotoxins: là những chuỗi polypeptide đơn có 57 - 60 amino acid, liên kết chéo bằng 3 cầu disulphide, tuy không có hoạt tính men, nhưng ức chế kênh Na+ tại màng thần kinh làm ngưng hiện tượng khử cực màng. - Fasciculins: về cấu trúc đồng nhất như các độc tố hậu xinap, nhưng có hoạt tính ức chế cholinesterase gây co cứng cơ (do làm tăng hoạt động của acetylcholine). Độc tố hậu xi-nap:độc tố loại này còn được gọi là độc tố giống curare (curare - mimetic - toxins). Hơn 100 độc tố loại này đã được phân lập từ nọc rắn cạp nia. Bản chất chúng đều là polypeptide. Dựa theo chiều dài chuỗi polypeptide, người ta phân thành 2 nhóm chính: - Chuỗi ngắn: gồm 60 - 62 gốc amino acid, liên kết chéo bằng 4 cầu nối disulphua. - Chuỗi dài: gồm có 70 - 74 gốc amino acid, liên kết chéo bằng 5 cầu nối disulphua. Mọi độc tố thần kinh hậu xi-nap đều đồng nhất về cấu trúc và ổn định về số lượng gốc amino acide với tên chung là curare - mimetic - toxins. Chúng tác dụng theo cơ chế: Ngăn cản mối tương tác giữa Ach đã được giải phóng ở màng tiền xi-nap và thụ thể α của cholinergic ở khớp thần kinh - cơ. Vì chúng gắn vào α với ái lực cao nên hậu quả là cơ không thể co được và nếu là hệ cơ hô hấp 8 thì liệt cơ hô hấp sẽ xảy ra theo kiểu myasthenia gravis (cơn nhược cơ) và nạn nhân có thể tử vong nếu không được điều trị hồi sức hô hấp. Do vậy, tác dụng của nọc rắn có thể hồi phục nếu dùng đủ HTKNR đủ liều và cũng có thể ít nhất là một phần cải thiện khi dùng các thuốc kháng cholinesterase như neotigmin mặc dù cần phải nhắc lại liều. Sự hồi phục có thể mất nhiều ngày, nhiều tuần thậm chí có thể là nhiều tháng vì cần sự tạo mới của các receptor. Các độc tố thần kinh tác động lên điểm nối thần kinh cơ hậu xi-nap cũng tác dụng chủ yếu lên các cơ vân, gây liệt mềm tiến triển nhưng tác dụng ngoài tế bào bằng cách gắn thuận nghịch vào các thụ thể Ach. Do vậy, các tác dụng của nọc rắn cạp nia có thể hồi phục khi dùng sớm và đủ liều HTKNR. Hình 2.1. Sơ đồ cơ chê gây độc thần kinh qua xi-nap Nguồn: Internet Yếu tố gây hạ Natri máu: Vấn đề hạ natri máu lần đầu tiên phát hiện vào năm 1997 bởi các tác giả Paulo Lee, Marcelo Bento, Thomas bằng cách nhân bản dòng Natriuretic peptides đã chứng minh trong nọc nhiều loại rắn có các natriuretic peptides là các peptid gây tăng đào thải natri và nước qua thận (Ho, Soares et al. 1997). Natriuretic peptide (NP) có tác động trên nhiều cơ quan: Tác động trên tim mạch và huyết áp: NP làm giãn mạch, giảm sức cản thành mạch và hạ huyết áp. Nhưng với liều cao gây co mạch mặc dù vẫn gây 9