Tài liệu đánh giá khả năng sáng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở một số giống lúa nhật bản

Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH-KTNN ……………………………… NGUYỄN THỊ HOA ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO VÀ TÁI SINH CÂY Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA NHẬT BẢN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Di truyền học Ngƣời hƣớng dẫn: TS. LÊ XUÂN ĐẮC HÀ NỘI - 2012 Nguyễn Thị Hoa 1 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Xuân Đắc, Viện Công nghệ sinh học - Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán bộ Trại Thực nghiệm sinh học Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành khóa luận. Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Nhƣ Toản đã có những đóng góp quý báu trong quá trình tôi thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo trƣờng Đại học sƣ phạm Hà Nội 2 đã truyền đạt những khiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho tôi trong suốt thời gian thực tập. Cuối cùng, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và các bạn bè - những ngƣời luôn động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Hà Nội, tháng 5 năm 2012 Sinh viên Nguyễn Thị Hoa Nguyễn Thị Hoa 2 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận này là kết quả nghiên cứu của riêng tôi, những tƣ liệu đƣợc trích dẫn trong khóa luận này là trung thực. Kết quả nghiên cứu này không hề trùng lặp với bất kì công trình nghiên cứu nào đƣợc công bố trƣớc đây. Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Ngƣời thực hiện Nguyễn Thị Hoa Nguyễn Thị Hoa 3 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ............................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu ......................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 3 4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................................... 3 5. Ý nghĩa của đề tài .............................................................................................. 3 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 4 1.1. Tổng quan về cây lúa ................................................................................... 4 1.1.1. Nguồn gốc ................................................................................................... 4 1.1.2. Phân loại cây lúa ......................................................................................... 5 1.2. Các phƣơng pháp chọn tạo giống lúa .......................................................... 6 1.2.1. Chọn tạo bằng phƣơng pháp đột biến ......................................................... 6 1.2.2. Tạo giống cây trồng bằng phƣơng pháp chuyển gen .................................. 8 1.2.3. Tạo giống bằng phƣơng pháp lai .............................................................. 11 1.2.4. Nhập nội giống thích nghi ......................................................................... 12 1.3. Nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng ................................................ 13 1.3.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật...................................... 14 1.3.2. Nuôi cấy mô sẹo (callus) ........................................................................... 16 1.3.3. Hệ thống tái sinh trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................ 17 1.3.4. Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật ..................................................... 19 1.4. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới và Việt Nam .............................. 22 1.4.1. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới.................................................... 22 Nguyễn Thị Hoa 4 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 1.4.2. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam .................................................... 24 Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 25 2.1. Nguyên liệu ............................................................................................... 25 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................... 25 2.2.1. Tạo nguyên liệu vô trùng .......................................................................... 26 2.2.2. Nuôi cấy tạo mô sẹo .................................................................................. 26 2.2.3. Nhân mô sẹo .............................................................................................. 26 2.2.4. Tái sinh cây ............................................................................................... 27 2.2.5. Tạo cây hoàn chỉnh ................................................................................... 27 2.2.6. Đƣa cây ra trồng ........................................................................................ 27 2.3. Thu thập và xử lý số liệu ........................................................................... 28 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 30 3.1. Tạo nguyên liệu vô trùng .......................................................................... 30 3.2. Tạo mô sẹo ................................................................................................ 31 3.2.1. Ảnh hƣởng của 2,4D đến khả năng tạo mô sẹo ........................................ 31 3.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ BAP tới khả năng tạo mô sẹo ............................ 32 3.3. Nhân mô sẹo ............................................................................................. 34 3.4. Tái sinh cây ............................................................................................... 35 3.4.1. Ảnh hƣởng của tổ hợp BAP và kinetin tới khả năng tái sinh cây............. 35 3.4.2. Ảnh hƣởng của tổ hợp BAP và NAA tới khả năng tái sinh cây ............... 37 3.5. Tạo cây hoàn chỉnh ................................................................................... 38 3.6. Ảnh hƣởng của giá thể tới khả năng sống của cây ................................... 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 42 Nguyễn Thị Hoa 5 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Kết luận ............................................................................................................... 42 Kiến nghị ............................................................................................................. 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 43 Nguyễn Thị Hoa 6 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Tỷ lệ hạt nhiễm khi khử trùng 30 Bảng 3.2 Tỷ lệ mô sẹo trên môi trƣờng 2,4D (2 mg/l) 31 Bảng 3.3 Tỷ lệ tạo mô sẹo trên môi trƣờng CT2 32 Bảng 3.4 Đánh giá chất lƣợng mô sẹo trên môi trƣờng nhân mô sẹo 34 Bảng 3.5 Tỷ lệ tái sinh cây trên môi trƣờng TS1 36 Bảng 3.6 Tỷ lệ tái sinh cây trên môi trƣờng TS2 37 Bảng 3.7 Khả năng tạo cây hoàn chỉnh 39 Bảng 3.8 Tỷ lệ cây sống trên các loại giá thể 41 Nguyễn Thị Hoa 7 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 3.1 Tạo giống mô sẹo NIP1 và NH3 trên môi trƣờng 0,2mg/l BAP Hình 3.2 33 Tỷ lệ tạo mô sẹo của các giống trên các công thức môi trƣờng 33 Hình 3.3 Nhân mô sẹo giống NH2 trên môi trƣờng có 0,5mg/l BAP 35 Hình 3.4 Tái sinh cây giống NIP1 (BAP 2mg/l và kinetin 0,3mg/l) 38 Hình 3.5 Tạo cây hoàn chỉnh giống NH3 40 Hình 3.6 Cây lúa trồng trên giá thể nƣớc sau 10 ngày 41 Nguyễn Thị Hoa 8 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4 D 2,4 - Dichlorophenoxy Axetic Axit BAP 6 - Benzyl Amino Purin ĐC Đối chứng IAA Indol - 3- Axetic Axit IBA 3 - Indol Butyric Axit Kinetin 6 furfuryl-amino-purin KTST Kích thích sinh trƣởng MS Môi trƣờng cơ bản của Murashige và Skoog NAA α- Napthalen Axetic Axit TB Trung bình cs Cộng sự MT Môi trƣờng VTM vitamin Nguyễn Thị Hoa 9 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Lúa là lƣơng thực chính của các nƣớc châu Á. Nó đã đi vào văn hóa của nhiều dân tộc, do có khẩu vị và sở thích ăn loại cơm khác nhau. Trong khi dân Đông và Đông Nam Á thích loại gạo hạt dài nhƣ Basmati, Jasmine thì các nƣớc Đông Bắc Á lại thích loại gạo tròn. Gạo tròn chỉ thích hợp trồng ở vùng ôn đới. Những nƣớc ăn gạo hạt tròn thƣờng thuộc những nƣớc phát triển và sản xuất không đủ, do đó họ sẵn sàng trả tiền cao để mua loại gạo này. Điều này trong thời gian tới có thể sẽ thay đổi, Viện nghiên cứu lúa Quốc tế IRRI gần đây đã chọn tạo đƣợc 2 giống lúa có dạng hạt gạo tròn nhiệt đới Japonica ở Philippines, đó là 2 giống NSIC Rc170 và IRRI 142 để gieo trồng trên diện rộng. Các giống lúa này mang đầy kỳ vọng giúp nông dân Philippines đạt lợi nhuận cao hơn, và nhất là giúp ngƣời tiêu dùng có thể thƣởng thức đƣợc gạo Nhật với giá rẻ, đồng thời cũng mở ra triển vọng mới đối với nông dân Việt Nam. Dù đƣợc mệnh danh là cƣờng quốc xuất khẩu gạo lớn thứ hai thế giới, nhƣng giá gạo xuất khẩu Việt Nam vẫn thƣờng thấp hơn gạo cùng loại trên thị trƣờng thế giới. Một trong những nguyên nhân là chất lƣợng. Hiện tại, do nhu cầu lúa gạo của thế giới tăng cao, nên nông dân bán gạo với giá cao hơn. Tuy nhiên, giá trị xuất khẩu gạo của Việt Nam lại kém hẳn so với giá gạo của Thái Lan. Đầu tƣ cho giống lúa chất lƣợng cao đạt tiêu chuẩn xuất khẩu cũng đƣợc nhà nƣớc đầu tƣ mạnh trong những năm qua, chất lƣợng gạo Việt Nam đã cải thiện nhiều so với trƣớc. Vào thời điểm năm 1990, gạo xuất khẩu của Việt Nam đa phần là loại gạo chất lƣợng thấp (35 đến 45% tấm). Hiện nay, tỷ lệ gạo 5 đến 10% tấm đã ở mức trên 50%. Tuy nhiên tỷ lệ gạo chất lƣợng cao, gạo thơm cho những thị trƣờng xuất khẩu cao cấp vẫn còn ít. Nguyễn Thị Hoa 10 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Chƣơng trình chọn tạo giống lúa Japonica (dạng lúa Nhật Bản) để thích nghi vùng nhiệt đới của IRRI bắt đầu năm 1991 với sự hợp tác của Hàn Quốc nhằm tạo ra giống lúa Japonica năng suất chất lƣợng cao. Với điều kiện của nhiệt độ cao ở vùng nhiệt đới, hầu hết các giống lúa Japonica này đều bị lùn, bông nhỏ và trổ sớm vì chúng nhạy cảm với ngày ngắn cho năng suất rất thấp. Các giống lúa Japonica đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao chất lƣợng. Bên cạnh đó, các giống Japonica còn đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc tăng tính chống chịu lạnh, kháng bệnh cháy lá, cháy bìa lá, khô vằn, dạng hình cây lúa, vàng (lão hóa) lá sớm, cải thiện hình dạng hạt gạo, độ dẻo, hóa hồ và các đặc tính khác. Những nghiên cứu chọn tạo các giống cây trồng mới để ứng dụng vào sản xuất là rất quan trọng và đƣợc nhiều quốc gia chú trọng đầu tƣ, phát triển. Một trong các kỹ thuật đƣợc quan tâm ứng dụng vào chọn tạo giống lúa là sử dụng công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã và đang đƣợc ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nhân giống và phục tráng cây trồng, chọn tạo giống chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trƣờng, chuyển gen có giá trị kinh tế vào cây trồng, kết hợp nuôi cấy mô và đột biến thực nghiệm… Xuất phát từ cơ sở lý luận và thực tiễn ở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh giá khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây ở một số giống lúa Nhật Bản”, nhằm phục vụ các nghiên cứu tiếp theo đối với các giống lúa này. 2. Mục đích nghiên cứu Xây dựng hệ thống tạo mô sẹo, tái sinh cây trong ống nghiệm đối với một số giống lúa Nhật Bản để phục vụ các nghiên cứu ứng dụng nhƣ đột biến mô sẹo hay chuyển gen để chọn tạo giống lúa chất lƣợng cao. Nguyễn Thị Hoa 11 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 3. Nội dung nghiên cứu - Xác định môi trƣờng có khả năng tạo mô sẹo tốt nhất đối với các giống nghiên cứu. - Xác định môi trƣờng tối ƣu để tái sinh chồi của mô sẹo. - Xác định môi trƣờng ra rễ của cây tái sinh tốt nhất. - Xác định loại giá thể ra cây phù hợp nhất. 4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu - Địa điểm nghiên cứu: Trại thực nghiệm sinh học, Viện Công Nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Thời gian nghiên cứu: tháng 5/2011 - 4/2012. 5. Ý nghĩa của đề tài * Ý nghĩa của khoa học: Đề tài góp phần bổ sung quy trình kỹ thuật nuôi cấy trong ống nghiệm đối với một số giống lúa Nhật Bản. * Ý nghĩa của thực tiễn sản xuất: Các kết quả nghiên cứu của đề tài này có thể phục vụ các nghiên cứu ứng dụng nhƣ đột biến mô sẹo hay chuyển gen trên các giống lúa này để chọn tạo giống lúa chất lƣợng cao. Nguyễn Thị Hoa 12 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây lúa 1.1.1. Nguồn gốc Cây lúa trồng Oryza sativa L. (2n= 24) là loại thân thảo sống hàng năm. Thời gian sinh trƣởng của các giống dài ngắn khác nhau và nằm trong khoảng 60 - 250 ngày. Về nguồn gốc cây lúa có nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và đƣa ra nhiều ý kiến khác nhau. + Theo Candalle (1886) cây lúa có nguồn gốc từ Ấn Độ. + Theo Roselevicz (1931) cây lúa có nguồn gốc từ Đông Nam Á, đặc biệt Ấn Độ và Đông Dƣơng. Tuy có nhiều ý kiến khác nhau về nguồn gốc cây lúa nhƣng cho đến nay các nhà khoa học đã thống nhất là cât lúa có nguồn gốc ở Đông Nam Á và Nam Trung Hoa. Việc xác định nguồn gốc cây lúa ở Đông Nam Á dựa vào các cơ sở sau đây: + Đây là vùng trồng lúa có diện tích tập trung và lớn trên thế giới. + Tổ tiên của các loài loài lúa trồng hiện nay là lúa dại vẫn còn tìm thấy ở nhiều nƣớc trong khu vực này. + Theo các tài liệu lịch sử, các di tích lịch sử khảo cổ học đã cho thấy cây lúa đƣợc trồng ở khu vực này từ rất sớm khoảng 4000 - 5000 năm trƣớc. Nguyễn Thị Hoa 13 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp 1.1.2. Phân loại cây lúa Theo hệ thống phân loại học thực vật thì cây lúa trồng có vị trí phân loại nhƣ sau: - Giới (Re grum): Plante - Thực vật - Ngành (Divisio): Angios permes - Thực vật có hoa - Lớp (Classic): Mono cotyledones - Một lá mầm - Bộ (Ordines): Poales (Graminasles) - Hòa thảo có hoa - Họ (Familia): Pcacoe (Graminac) - Hòa thảo - Họ phụ (Pryzoideae): Hòa thảo ƣa nƣớc - Chi (Genus): Oryza - Lúa - Loài (Species): Oryza Sativa - Lúa trồng Việc phân loại Oryza Sativa L. có nhiều quan điểm khác nhau: - Theo Kato (1931) chia Oryza Sativa L. thành hai loại là: + Oryza Sativa Sub. Sp. Japonica Kato (loài phụ Nhật Bản). + Oryza Sativa Sub. Sp. Indica Kato (loài phụ Ấn Độ). - Loài Oryza Sativa L. đƣợc chia làm 3 loài phụ: + Loài phụ Indica đƣợc trồng ở các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới (Việt Nam, Ấn Độ, Mianma, Philippin…). Loài phụ Indica có đặc điểm hạt dài, thân cao, mềm dễ đổ, chịu sâu bệnh khá, năng suất thấp, mẫn cảm với chu kỳ ánh sáng. + Javanica phân bố ở những nơi có vĩ độ cao (bắc Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên…), có những đặc điểm nhƣ chịu rét cao, nhƣng ít chịu sâu bệnh. + Japonica là loại hình trung gian giữa Indica và Javanica nhƣng gần với Indica hơn. Javanica có đặc điểm hạt dày và rộng hơn hạt của Indica, chỉ đƣợc trồng ở một vài nơi thuộc Indonesia (Mai Thọ Trung,1990; Khush, 1997) [10] [14]. Nguyễn Thị Hoa 14 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Ngoài ra còn một số cách phân loại khác tùy theo tiêu chí đặt ra nhƣ: - Dựa vào hình thái hạt lúa: lúa hạt tròn; lúa hạt dài… - Dựa vào thành phần dinh dƣỡng: lúa nếp; lúa tẻ… - Dựa vào thời gian sinh trƣởng: lúa ngắn ngày; lúa dài ngày… - Dựa vào mùa vụ gieo trồng có: lúa chiêm xuân; lúa mùa; lúa hè thu… 1.2. Các phƣơng pháp chọn tạo giống lúa 1.2.1. Chọn tạo bằng phương pháp đột biến Từ lâu, gây đột biến thực nghiệm để làm vật liệu khởi đầu cho chọn giống đã đƣợc coi là một trong những kỹ thuật ứng dụng cao trong nông nghiệp. Phƣơng pháp này đƣợc biết đến vào năm 1925 khi Natxon và Philippôp phát hiện rằng tia Roentgen có khả năng gây ra biến dị di truyền ở nấm. Đến năm 1926 - 1928, với các nghiên cứu của Muller trên ruồi dấm, Stadler trên lúa mạch... di truyền học phóng xạ đã trở thành nền tảng cho sự ra đời ngành chọn giống đột biến phóng xạ. Năm 1946, Auerbach và Robson phát hiện vài hợp chất có thể gây đột biến, sau đó, ngày càng nhiều hóa chất đƣợc tìm thấy có khả năng làm tăng tần số đột biến. Nhƣng đến nay, phƣơng pháp sử dụng hóa chất gây đột biến bị hạn chế vì độc hại và có nguy cơ gây ung thƣ cao. Ở Việt Nam, lĩnh vực này đã đƣợc Giáo sƣ Lƣơng Đình Của khởi xƣớng từ những năm 1960. Nhƣng mãi đến năm 1980, hƣớng nghiên cứu này mới đƣợc phát triển một cách tƣơng đối có hệ thống và định hƣớng do Phan Phải và cộng sự tiến hành. Sau đó, một loạt nghiên cứu của các tác giả nhƣ: Trần Duy Quý, Nguyễn Hữu Đống, Trần Đình Long, Mai Quang Vinh, Đỗ Hữu Ất, Lâm Quang Dụ, Nguyễn Văn Bích, Nguyễn Quang Xu, Lê Văn Nhạ,.. trên nhiều đối tƣợng cây trồng khác nhau nhƣ: lúa, ngô, đậu, lạc, táo, cà chua, hoa Nguyễn Thị Hoa 15 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp cúc... đã tạo ra nhiều dòng đột biến có giá trị, đƣợc chọn lọc và phát triển trực tiếp thành các giống quốc gia hoặc các dòng có triển vọng phục vụ cho công tác lai tạo giống mới. Việc chọn lọc dòng/giống nào để xử lý đột biến phụ thuộc vào tính trạng cần cải tiến. Các bức xạ bức xạ ion hoá mật độ cao chủ yếu gây ra những biến đổi nhiễm sắc thể (sắp xếp lại, mất đoạn...), trong khi bức xạ ion hoá mật độ thƣa (tia X, tia gamma) và bức xạ không ion hóa (tia tử ngoại) gây ra nhiều đột biến điểm hơn. Các tác nhân hoá học đa dạng hơn nhiều về chủng loại so với tác nhân lý học. Các tác nhân nhƣ ethyl methane sulphonate (EMS) và các hợp chất siêu đột biến nitrozo urê (nitrozoethyl urê) gây ra tần số đột biến cao ở nhiều loại cây trồng. a. Xử lý bằng chiếu xạ Để xử lý bằng chiếu xạ, hạt, cây con, các bộ phận sinh dƣỡng (hoa, bao phấn, hạt phấn...) đƣợc đặt dƣới nguồn chiếu. Trong quá trình xử lý phải đảo trộn nhiều lần hạt hoặc cây con, các bộ phận sinh dƣỡng và tuân thủ điều kiện bảo hộ lao động. Thời gian chiếu phụ thuộc vào công suất của nguồn và liều lƣợng cần xử lý. Công suất nhỏ thì thời gian xử lý dài và ngƣợc lại. Độ ẩm của hạt có ý nghĩa quyết định đối với tác động đột biến của tia bức xạ vì nó ảnh hƣởng trực tiếp tới trạng thái sinh lý của hạt. Phơi khô cũng nhƣ tăng thủy phần của hạt đều làm tăng tác động của tia bức xạ. Ngoài ra, nhiệt độ và ôxy của hạt và của không khí cũng ảnh hƣởng tới kết quả xử lý. Với tia bức xạ, có thể xử lý nhanh (từ vài phút đến vài giờ) hoặc xử lý lâu dài trong trƣờng gamma (từ nhiều tuần trở lên với cƣờng độ thấp), nhƣng Nguyễn Thị Hoa 16 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp cũng có thể xử lý gián đoạn bằng cách ngắt quãng một khoảng thời gian nhất định. b. Xử lý bằng hoá chất Xử lý các chất hoá học thƣờng diễn ra trong dung dịch. Vì tác nhân đột biến hoá học rất độc và có thể gây ung thƣ nên phải thực hiện các biện pháp bảo hộ nghiêm ngặt. Hạt (cây con, các bộ phân sinh dƣỡng) đƣợc ngâm hoặc nhúng vào dung dịch trong một thời gian nhất định. Thông thƣờng để đạt hiệu quả cao và có thể lặp lại kết quả, xử lý tác nhân hoá học đƣợc tiến hành theo nhiều bƣớc: Làm trƣơng hạt trong nƣớc, xử lý, rửa sạch, phơi khô hạt... Khi xử lý tác nhân hoá học, tác động của tác nhân đột biến cũng bị ảnh hƣởng bởi trạng thái sinh lý của các bộ phận xử lý. 1.2.2. Tạo giống cây trồng bằng phương pháp chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen đã và đang trở thành nhân tố quan trọng trong chƣơng trình chọn tạo giống cây trồng. Có thể chia nguyên lý chuyển gen làm hai cách: chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp. a, Chuyển gen trực tiếp - Chuyển gen bằng xung điện: Sử dụng xung điện với thời gian ngắn trong một điện trƣờng cực mạnh. Khi đặt tế bào trần (protoplast) trong điện trƣờng, sự dẫn điện và tính thấm của màng nguyên sinh bị thay đổi, kéo theo sự mất ổn định tại chỗ và tạm thời của màng dẫn tới sự hình thành lỗ hổng trên màng tế bào. Một loạt các lỗ Nguyễn Thị Hoa 17 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp hổng trên màng tế bào đƣợc hình thành tùy thuộc vào điện trƣờng, làm cho ADN bên ngoài môi trƣờng đƣợc truyền qua lỗ hổng vào tế bào. Một số tế bào thực vật có thể tiếp thu ADN nhờ xung điện mà không cần xử lí trƣớc nhƣ tế bào ngô, lúa và phôi non lúa mì. Zang và cs (1988) đã đƣa ra cây lúa chuyển gen từ tế bào trần sử dụng phƣơng pháp xung điện. Sau một năm Shimamoto và cs (1989) đƣa ra cây lúa chuyển gen hữu thụ đầu tiên ở giống lúa Japonica sử dụng phƣơng pháp xung điện. - Chuyển gen bằng vi tiêm (Microinjection): Ngƣời ta sử dụng kim vi tiêm và kính hiển vi để tiêm một lƣợng nhỏ ADN vào những tế bào nhất định, có thể là một tế bào nguyên vẹn. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là ADN đƣa vào tế bào một cách chính xác, thậm chí vào tận nhân và có thể quan sát đƣợc. Phƣơng pháp này cần có thiết bị có độ chính xác cao, thao tác khéo léo, kỹ thuật và kỹ năng của ngƣời thực hiện phải chính xác. - Chuyển gen bằng vi tiêm qua ống phấn (Pollen tube): Khi hạt phấn rơi trên núm nhụy (quá trình thụ phấn) hạt phấn sẽ nảy mầm hình thành ống phấn. Lúc này tiêm gen mong muốn đi theo ống phấn mang giao tử đực vào thụ tinh với giao tử cái sẽ hình thành hợp tử có mang gen chuyển vào. Phƣơng pháp này khá thành công, đặc biệt trên cây lúa và cây bông. - Chuyển gen bằng súng bắn gen (Microprojectile bombaroment biolistics): Kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen đƣợc phát hiện bởi Christou và cs (1991) và kỹ thuật này đƣợc cải tiển bởi Cao và cs (1992); Zi và cs (1993). Ngay lập tức, kỹ thuật đƣợc áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm chuyển gen lúa Japonica. Gần đây kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen cũng đã Nguyễn Thị Hoa 18 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp đƣợc áp dụng thành công với các giống lúa indica và nhiều giống Japonica (Christai và cs, 1988; Datta và cs, 1999). Cheng và cs (1998) đã có những cải tiến rất có ý nghĩa trong việc chuyển nhiều gen vào lúa Japonica sử dụng súng bắn gen. Đây là kỹ thuật tƣơng đối hiện đại và có hiệu quả khi sử dụng thiết bị (súng bắn gen) tạo đƣợc áp lực sẽ đẩy viên đạn đƣợc làm bằng kim loại trơ (vàng, tungsten, wolfram) đã bọc plasmid mang gen đã thiết kế, có kích thƣớc vào khoảng 1μm, với vận tốc 130 m/s, xuyên qua các lớp tế bào biểu bì, đi vào tế bào bên trong và gen sẽ đƣợc biểu hiện ở đó khi hợp nhất với bộ gen của tế bào chủ. Hiệu quả chuyển gen vào lúa bằng phƣơng pháp dùng súng bắn gen không những không phụ thuộc vào kiểu gen mà tần suất lại cao. Ở một vài trƣờng hợp, tần suất chuyển gen bằng phƣơng pháp này ngang với cây hai lá mầm. b, Chuyển gen gián tiếp - Chuyển gen gián tiếp nhờ virus: Đối với việc chuyển gen vào thực vật thì virus thực vật cũng đƣợc coi nhƣ một vectơ. Virus làm vectơ chuyển gen phải có các tiêu chuẩn sau: + Bộ gen có cấu trúc ADN + Có độ thiệt hại thấp hoặc không hại + Phổ kí chủ rộng + Có khả năng di chuyển qua các lỗ tế bào Nguyễn Thị Hoa 19 K34E Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp Có hai loại vius đảm nhận đƣợc vai trò chuyển gen là: Cauliflow mosaic virus (caMV) và Genini virus. - Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: Chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đƣợc xem là phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm (nhất là đối với cây hai lá mầm) dựa vào khả năng chuyển gen tự nhiên của loài vi khuẩn đất Agrobacterium. 1.2.3. Tạo giống bằng phương pháp lai Lai giống là phƣơng pháp cơ bản và đem lại hiệu quả cao, chủ động nên đƣợc sử dụng rộng rãi để tạo ra giống mới. Sử dụng phƣơng pháp lai nhằm kết hợp kiểu gen giữa bố và mẹ làm xuất hiện những tổ hợp gen mới từ đó quyết định những tính trạng và những đặc điểm tốt của các giống cây trồng. Có các kiểu lai sau: - Lai cùng loài (lai gần): là phép lai giữa các cá thể khác nhau thuộc cùng 1 loài (Bộ Nông Nghiệp & phát triển Nông Thôn, 2005) [4] . - Lai khác loài (lai xa): là hình thức lai giữa các dạng bố, mẹ thuộc hai loài khác nhau hoặc thuộc các chi, họ khác nhau nhằm tạo ra các biến dị mới có giá trị. Tuy nhiên, phƣơng pháp này gặp một số khó khăn nhất định nên ít đƣợc sử dụng. - Phƣơng pháp tạo ƣu thế lai: + Lai khác dòng đơn: tạo ra 2 dòng đơn tự thụ phấn qua 5 - 7 thế hệ, sau đó cho giao phấn với nhau. Nguyễn Thị Hoa 20 K34E Sinh - KTNN