MỞ ĐẦU
Lúa là một trong những cây lương thực chính của hơn một nửa dân số trên
thế giới (IRRI, 1994). Sản xuất lúa gạo chủ yếu tập trung ở các nước châu Á. Với
điều kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam cũng là cái nôi của nền văn minh lúa nước.
Đã từ lâu cây lúa trở thành cây lương thực chủ yếu, có ý nghĩa đáng kể trong nền
kinh tế và xã hội nước ta. Năm 2003, sản lượng xuất khẩu gạo Việt Nam đạt
4,2 triệu tấn, tăng 11% so với năm 2000 [12].
Tuy nhiên, thực tế cho thấy có nhiều yếu tố làm giảm năng suất và chất
lượng lúa gạo. Trong số đó, bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây
nên là một trong những yếu tố hạn chế sự phát triển của lúa, bệnh có khả năng lây
nhiễm mạnh và rất khó khống chế. Ở những nơi bệnh phát triển mạnh, năng suất
lúa có thể giảm đến 60%. Để phòng trừ bệnh bạc lá vi khuẩn người ta thường sử
dụng thuốc hoá học, song việc dùng thuốc gây độc hại cho người sử dụng và làm ô
nhiễm môi trường. Hạn chế những độc hại trên thì việc gieo trồng các giống lúa
kháng bệnh là có triển vọng nhất. Nhưng thực tế, giống kháng chỉ tồn tại vài năm
trong sản xuất sau đó nông dân phải thay thế bằng giống mới hoặc phun thuốc diệt
bệnh, vì nòi bệnh có độc tính cao hơn phát triển [10].
Để khắc phục được bệnh bạc lá vi khuẩn một cách hiệu quả, các nhà chọn
giống đang sử dụng các giống kháng bệnh lai với các giống có năng suất, chất
lượng cao nhằm thu được các giống vừa kháng bệnh, năng suất cao và có chất
lượng tốt. Hiện nay, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã xác định được các giống lúa
mang các gen kháng với các nòi khác nhau của bệnh bạc lá vi khuẩn. Đây là những
nguồn gen quí trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh cũng như các trong nghiên cứu
đa dạng di truyền [4], [10].
Trong những năm 90, kỹ thuật sinh học phân tử đã trở thành công cụ rất có
hiệu quả trong phân tích đa dạng, bảo tồn và tiến hóa giống loài ở sinh vật. Nghiên
cứu đa dạng trên đối tượng lúa là vấn đề được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan
tâm và kết quả là có rất nhiều công trình chỉ ra mức độ đa hình ở lúa khi sử dụng
chỉ thị RAPD [14], [29] và RELP [18], [25]. Trong các loại chỉ thị, thì chỉ thị RAPD
(Random Amplified Polymorphic DNA) đơn giản, ít tốn kém nên được sử dụng
rộng rãi hơn các chỉ thị AFLP, RFLP, SSR. Sử dụng chỉ thị RAPD, các nhà khoa
học có thể đánh giá và phân loại tập đoàn giống cây trồng một cách nhanh chóng và
chính xác. Trên thực tế, chỉ thị RAPD cho kết quả đặc trưng đối với từng cá
1
thể và có thể ứng dụng chỉ thị này để phân tích tính đa hình ADN nhờ sử
dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên. Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi thực
hiện đề tài: ‘‘Đánh giá đa dạng tập đoàn giống lúa có tính kháng khác nhau với
bệnh bạc lá vi khuẩn Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật RAPD” với mục tiêu:
đánh giá đa dạng phân tử của 36 giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá
vi khuẩn, nhằm phục vụ việc xác định bố mẹ trong nghiên cứu lập bản đồ và chọn
tạo giống lúa kháng bệnh.
2
Ch¬ng 1. TæNG QUAN TµI LIÖU
1.1. giíi thiÖu vÒ c©y lóa
C©y lóa thuéc hä hßa th¶o (Poaceae), th©n bôi, l¸ mÒm. Lóa trång thuéc chi
Oryzae víi nhiÒu loµi kh¸c nhau. Trong sè 23 loµi ®· ®îc ph©n lo¹i th× chØ cã hai
loµi lµ O. glaberrima vµ O. sativa ®îc trång cÊy. Loµi O. glaberrima ®îc trång chñ
yÕu ë mét sè níc miÒn T©y ch©u Phi. Cßn loµi O. sativa cã ë kh¾p thÕ giíi vµ tËp
trung phÇn lín ë ch©u ¸. Loµi O. sativa ®îc chia lµm 3 loµi phô: Indica, Japonica,
Javanica. Lóa Indica ®îc trång ë c¸c vïng nhiÖt ®íi vµ cËn nhiÖt ®íi; Japonica ®îc
trång chñ yÕu ë c¸c vïng «n ®íi vµ cËn «n ®íi; Javanica chØ ®îc trång ë mét vµi n¬i
thuéc Indonesia (Khush, 1997).
Loµi Oryza sativa cã sè nhiÔm s¾c thÓ lµ 2n = 24. T¸m trong sè 23 loµi lóa
d¹i cã bé gen ë thÓ tø béi, cßn l¹i ®a sè c¸c lo¹i lóa d¹i vµ lóa trång hiÖn nay cã bé
gen lµ thÓ lìng béi (Khush, 1997) [7], [21].
Lóa ph©n bè kh¾p thÕ giíi, tr¶i tõ vÜ ®é 55 0 B¾c thuéc Trung Quèc ®Õn 360
Nam thuéc Chi Lª. Theo FAO (1999) diÖn tÝch ®Êt canh t¸c lóa trªn toµn thÕ giíi
kho¶ng 150 triÖu ha. Riªng Trung Quèc vµ Ên ®é chiÕm kho¶ng 50% diÖn tÝch trång
lóa vµ 56% s¶n lîng lóa toµn cÇu. Ch©u Phi cã diÖn tÝch trång lóa gÇn b»ng diÖn tÝch
trång lóa cña ViÖt Nam, nhng s¶n lîng lóa l¹i thÊp h¬n tõ 2 ®Õn 3 lÇn [2], [7].
1.2. BÖnh b¹c l¸ vi khuÈn ë lóa (Xanthomonas oryzae)
BÖnh b¹c l¸ (cßn gäi lµ bÖnh ch¸y b×a l¸) lµ
mét trong nh÷ng bÖnh h¹i lóa nguy hiÓm do vi khuÈn
Xanthomonas oryzae g©y nªn. lµ mét trong nh÷ng
bÖnh h¹i lóa nguy hiÓm. BÖnh xuÊt hiÖn lÇn ®Çu tiªn
ë NhËt B¶n n¨m 1884. N¨m 1960, bÖnh lan truyÒn
sang, sau nguån bÖnh ®îc t×m thÊy ë c¸c vïng kh¸c ë
ch©u Phi, Australia, Mü vµ mét sè níc Mü La Tinh.
ë ViÖt Nam, bÖnh phæ biÕn ë tÊt c¶ c¸c vïng trång
lóa trong c¶ níc, tõ vïng nói cao ®Õn ven biÓn. BÖnh
cã thÓ lµm gi¶m n¨ng suÊt tõ 6 - 60%. BÖnh ph¸ h¹i
trong c¶ vô §®«ng xu©n, hÌ HÌ thu vµ vô mMïa.,
®Æc biÖt, bÖnh g©y h¹i nÆng trong c¸c th¸ng nhiÖt ®é
cao. Ma b·o lµ ®iÒu kiÖn ®Ó bÖnh l©y lan vµ ph¸t
triÓn m¹nh. Trong nh÷ng n¨m 1970 - 1975, bÖnh
H×nh1: TriÖu chøng cña bÖnh
b¹c
l¸
lóa
vi
khuÈn
do
ph¸t triÓn vµ g©y thiÖt h¹i nÆng cho ë lóa ë kh¾p c¸c tØnh phÝa B¾c [2].
Xathomonas oryzae g©y ra
1.2.1. Vi khuÈn g©y bÖnh b¹c l¸ lóa (Xanthomonas aryzae)
Vi khuÈn Xanthomonas oryzae cã h×nh gËy ng¾n, hai ®Çu trßn, lµ vi khuÈn
Gram (-) vµ kh«ng h×nh thµnh bµo tö. C¸c tÕ bµo vi khuÈn ®îc bäc trong mµng nhÇy
vµ liªn kÕt víi nhau thµnh mét khèi t¬ng ®èi v÷ng ch¾c ngay c¶ trong níc. Trªn m«i
trêng nh©n t¹o, khuÈn l¹c cã mµu vµng nh¹t vµ cã thÓ sèng trong ph¹m vi pH 4,0 -
3
8,8. NhiÖt ®é thÝch hîp nhÊt cho vi khuÈn sinh trëng lµ 260C - 300C, nhiÖt ®é tèi
thiÓu lµ 550C - 100C vµ nhiÖt ®é tèi ®a lµ 400C [9], [11].
Vi khuÈn x©m nhËp cã tÝnh chÊt thô ®éng vµ cã thÓ x©m nhiÔm qua thñy
khæng, lç khÝ ë trªn mÐp l¸, ®Æc biÖt qua vÕt th¬ng x©y x¸t trªn l¸. Khi ®· tiÕp xóc
víi bÒ mÆt cã mµng níc, vi khuÈn dÔ dµng di ®éng vµ x©m nhËp vµo bªn trong qua
c¸c lç khÝ, qua vÕt th¬ng ®Ó nh©n lªn vÒ mÆt sè lîng, sau ®ã theo c¸c bã m¹ch dÉn
lan réng ®i. Trong ®iÒu kiÖn ma Èm, trªn bÒ mÆt vÕt bÖnh sÏ tiÕt ra nh÷ng giät dÞch
vi khuÈn vµ th«ng qua sù va ch¹m gi÷a c¸c l¸ lóa, bÖnh cã thÓ lan truyÒn tõ l¸ nµy
sang l¸ kh¸c ®Ó tiÕn hµnh x©m nhiÔm lÆp l¹i nhiÒu lÇn trong thêi kú sinh trëng cña
c©y lóa [6], [9].
HiÖn nay, cã rÊt nhiÒu nßi vi khuÈn g©y bÖnh b¹c l¸, ph©n bè ë nhiÒu níc trªn
thÕ giíi. C¸c nhµ khoa häc cã thÓ ph©n lo¹i c¸c nßi X. oryzae theo tÝnh g©y bÖnh cña
chóng. Nh×n chung, c¸c nßi vi khuÈn kh¸ kh¸c nhau vÒ tÝnh g©y bÖnh vµ trë nªn ®éc h¬n
khi truyÒn lÆp ®i lÆp l¹i qua c¸c thÕ hÖ cña gièng kh¸ng bÖnh, nhng tÝnh g©y bÖnh vÉn
kh«ng thay ®æi hoÆc gi¶m ®i khi x©m nhiÔm qua c¸c gièng lóa mÉn c¶m [11].
1.2.2. TriÖu chøng cña bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn
BÖnh b¹c l¸ vi khuÈn thêng ph¸t sinh díi d¹ng c¸c säc vµng kÐo dµi tõ mÐp l¸
c¸ch ®Ønh vµi cm. Trªn phiÕn l¸, vÕt bÖnh lan réng theo c¶ chiÒu dµi vµ réng, cã mÐp
viÒn h×nh sãng råi trë nªn vµng sau vµi ngµy. Khi bÖnh tiÕn triÓn, vÕt bÖnh lan réng
phñ kÝn c¶ mÆt l¸, chuyÓn tõ tr¾ng sang x¸m nh¹t do sù sinh trëng cña c¸c nÊm ho¹i
sinh. §èi víi c¸c gièng c¶m nhiÔm, vÕt bÖnh lan réng tíi bÑ l¸ vµ cã thÓ ph¸t triÓn
xuèng tËn phÇn díi cña bÑ l¸, lµm phiÕn l¸ bÞ hÐo vµ cuén l¹i trong khi l¸ vÉn cßn
xanh, sau ®ã toµn bé phiÕn l¸ cã thÓ bÞ hÐo råi kh« ®i.
ë c¸c ruéng lóa bÞ bÖnh nghiªm träng, h¹t còng cã thÓ bÞ nhiÔm bÖnh. Trªn vá
h¹t xuÊt hiÖn c¸c ®èm mµu nh¹t, xung quanh cã mÐp viÒn d¹ng giät dÇu. Khi h¹t
cßn non vµ xanh c¸c vÕt bÖnh lé râ, khi b«ng chÝn vÕt bÖnh sÏ cã mµu x¸m,, hoÆc
tr¾ng hoÆc vµng nh¹t [6], [19].
1.2.3. c¸c yÕu tè ¶nh hëng ®Õn sù ph¸t triÓn cña bÖnh
Trong dù b¸o bÖnh b¹c l¸, yÕu tè khÝ hËu lµ ®èi tîng ®Ó ph©n tÝch. C¸c nhµ
khoa häc ph¸t hiÖn thÊy r»ng møc ®é nhiÔm bÖnh t¬ng quan víi tæng lîng ma, møc
®é ngËp lôt, giã m¹nh vµ ®é s©u níc tíi. NhiÖt ®é t¬ng ®èi cao trong thêi kú lóa sinh
trëng cã thÓ lµm t¨ng bÖnh, song mïa hÌ qu¸ nãng vµ kh« lµ ®iÒu kiÖn h¹n chÕ bÖnh.
Kü thuËt trång trät còng lµ mét trong nh÷ng ®iÒu kiÖn quan träng ¶nh hëng
®Õn sù ph¸t sinh, ph¸t triÓn bÖnh, song còng rÊt phøc t¹p v× mét mÆt nã ¶nh hëng tíi
sù ph¸t sinh ph¸t triÓn cña c©y lóa - lµm t¨ng hay lµm gi¶m tÝnh chèng chÞu, mÆt
kh¸c nã ¶nh hëng tíi tiÓu khÝ hËu ®ång ruéng. Trong c¸c yÕu tè kü thuËt ch¨m sãc
th× ph©n bãn cã ¶nh hëng râ rÖt nhÊt tíi sù ph¸t sinh, ph¸t triÓn cña bÖnh. Cô thÓ lµ
bãn ®¹m qu¸ nhiÒu, bãn thóc muén, thiÕu l©n, kali vµ magie ®Òu lµm t¨ng bÖnh. ë
nh÷ng n¬i ®Êt chua, óng ngËp ®Æc biÖt ë nh÷ng vïng ®Êt nhiÒu mïn, hµng lóa bÞ
ch¾n n¾ng th× bÖnh b¹c l¸ cã thÓ ph¸t triÓn m¹nh h¬n [6].
4
Trong tÊt c¶ c¸c giai ®o¹n sinh trëng, c©y ®Òu cã thÓ bÞ nhiÔm bÖnh nhng ë
møc ®é kh¸c nhau tuú tõng giai ®o¹n sinh trëng. Nãi chung, tõ thêi k× m¹ ®Õn khi
lóa ®Î nh¸nh lµ thêi kú bÖnh t¬ng ®èi Ýt h¬n so víi giai ®o¹n cuèi ®Î nh¸nh. Giai
®o¹n lóa lµm ®ßng - trç - chÝn s÷a lµ giai ®o¹n rÊt mÉn c¶m víi bÖnh, hiÖn tîng nµy
thÓ hiÖn kh¸ râ nÐt trªn c¸c gièng lóa ng¾n ngµy, chÞu ph©n, cã n¨ng suÊt cao, cÊy
trong vô Chiªm xu©n vµ vô Mïa [11].
1.2.4. T¸c h¹i cña bÖnh b¹c l¸ lóa vi khuÈn
BÖnh b¹c l¸ vi khuÈn ®· lµm gi¶m n¨ng suÊt lóa g¹o h»ng n¨m ë Ch©u ¸
xuèng 60%. VÝ dô ë NhËt nh÷ng n¨m gÇn ®©y, cã kho¶ng 300.000 - 400.000 hecta
lóa bÞ ¶nh hëng bëi bÖnh nµy vµ n¨ng suÊt gi¶m 20 - 50%. ë nh÷ng c¸nh ®ång
nhiÔm bÖnh ngiªm träng ë Indonesia, s¶n lîng lóa cßn thÊp h¬n so víi ë NhËt; cßn
ë Ên ®é, hµng triÖu hecta lóa nhiÔm bÖnh nghiªm träng lµm cho n¨ng suÊt gi¶m tõ 6
- 60%. ë ViÖt Nam, bÖnh b¹c l¸ ®îc ph¸t hiÖn tõ l©u trªn c¸c gièng lóa mïa cò, ®Æc
biÖt tõ n¨m 1965 trë l¹i ®©y bÖnh thêng xuyªn ph¸ ho¹i nghiªm träng ë c¸c vïng
trång lóa [6], [19].th× sao?
1.2.5. C¸c biÖn ph¸p phßng trõ
C¨n cø vµo ®Æc ®iÓm sinh häc cña vi khuÈn g©y bÖnh, c¸c nhµ khoa häc ®· ®a
ra nh÷ng biÖn ph¸p phßng trõ tæng hîp nh: xö lý h¹t gièng tríc khi gieo nÕu l« h¹t
bÞ nhiÔm bÖnh, bãn ph©n ®óng kü thuËt vµ ®óng giai ®o¹n, ruéng lóa cÇn ®iÒu chØnh
møc níc thÝch hîp, chó ý vÖ sinh ®ång ruéng hoÆc cã thÓ sö dông thuèc hãa häc ®Ó
h¹n chÕ sù ph¸t sinh, ph¸t triÓn cña bÖnh... [6].
Cho ®Õn nay, viÖc sö dông gièng chèng chÞu bÖnh vÉn lµ biÖn ph¸p cã hiÖu
qu¶ nhÊt v× gi¶m ®îc chi phÝ do sö dông thuèc hãa häc vµ b¶o vÖ m«i trêng tèt h¬n.
ChÝnh v× vËy, viÖc chän t¹o ra nh÷ng gièng lóa kh¸ng bÖnh b¹c l¸ lu«n lµ môc tiªu
hµng ®Çu cña c¸c nhµ t¹o gièng trªn thÕ giíi còng nh ë ViÖt Nam [24], [30].
Cïng víi sù ph¸t triÓn cña khoa häc hiÖn ®¹i c¸c nhµ nghiªn cøu t×m thÊy
kho¶ng 24 gen kh¸ng bÖnh b¹c l¸ ë nhiÒu loµi lóa hoang d¹i vµ c¸c gièng lóa ®Þa ph¬ng. Gen kh¸ng ®îc thèng nhÊt cã tªn lµ Xa + sè thø tù, vÝ dô nh Xa1, Xa2... Trong
sè ®ã, Xa21 cã phæ kh¸ng réng vµ ®îc chó ý nhiÒu trong c«ng nghÖ chuyÓn gen
hiÖn nay [20], [27].
1.2.6. Mét sè thµnh tùu trong chän gièng lóa kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn
Trong 50 n¨m gÇn ®©y, c¸c nhµ khoa häc ®· ph¸t triÓn nhiÒu kü thuËt thanh
läc ng©n hµng gen ®èi víi tÝnh tr¹ng chèng chÞu vi khuÈn, c«n trïng g©y h¹i c©y
trång, x¸c ®Þnh nguån cung cÊp gen kh¸ng. Víi ph¬ng ph¸p chän gièng truyÒn
thèng, c¸c nhµ khoa häc ®· t¹o ra nhiÒu gièng c©y trång kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vµ ®îc
gieo trång víi diÖn tÝch hµng triÖu ha. Vµ chän gièng ngoµi ®ång ruéng, kh¶o
nghiÖm vµ t¹o c¸c gièng lóa chèng chÞu bÖnh tõ l©u ®· ® îc thùc hiÖn ë nhiÒu níc
trªn thÕ giíi. Kh«ng hiÓu ý c©u nµy?
5
ë NhËt B¶n, gÇn ®©y c¸c nhµ khoa häc ®· chän ®îc nhiÒu gièng lóa kh¸ng
bÖnh ®îc sö dông ®Ó lai t¹o ra c¸c gièng míi nh gièng Sengoku 4, Magatama,
Zensho 26, Norin 27... Tuy nhiªn, kÕt qu¶ kiÓm tra ngoµi ®ång ruéng cho thÊy cha
chän ®îc gièng cã tÝnh chèng chÞu cao víi c¸c nßi vi khuÈn g©y bÖnh b¹c l¸ míi ®îc
gi¸m ®Þnh gÇn ®©y.
N¨m 1968, Sakaguchi vµ CS ®· kh¶o nghiÖm 863 gièng lóa ®îc trång phæ
biÕn ë nhiÒu n¬i trªn thÕ giíi vµ ph¸t hiÖn gièng lóa Lead cña MiÕn §iÖn, TKM6 vµ
Nigeria 5 chèng chÞu kh¸ víi hÇu hÕt c¸c nhãm vi khuÈn g©y bÖnh b¹c l¸ thuéc c¸c
nßi kh¸c nhau [9], [11].
ë viÖt Nam, ®· cã nhiÒu nghiªn cøu ®Ó chän t¹o gièng lóa mang gen kh¸ng
bÖnh b¹c l¸. Nh ë ViÖn Lóa §ång b»ng s«ng Ccöu lLong, b»ng ph¬ng ph¸p ®¸nh gi¸
kiÓu gen nhê chØ thÞ ph©n tö ®èi víi 148 gièng lóa ®Þa ph¬ng cã nguån gèc Duyªn
h¶i Trung Bé cho thÊy c¸c gièng lóa: Cµ §ung, Ba Tóc, Th¬m Lung, VÖ PhÝch, Lóa
Tr¾ng, NÕp Hoa Vµng, Lóa Thíc, Quinkes 85 vµ Seraup kechil 30 cã gen kh¸ng
Xa13; gen kh¸ng Xa5 ®îc t×m thÊy trªn gièng Nµng Tri, Tr¾ng Lïn, Be Ren, Giµu
Dumont; gièng Lóa Sãc, Lóa Mïa 2, Tr¾ng Qu·ng, Tr¾ng Phíc, Tµu H¬ng, Nµng
SËu cã gen kh¸ng Xa4 [4].
1.3. øng dông kü thuËt RAPD - PCR trong nghiªn cøu ®a h×nh ADN
1.3.1. Ph¶n øng PCR
Kü thuËt nh©n b¶n ADN ®Æc hiÖu dùa vµo ph¶n øng chuçi trïng hîp
(Polymerase Chain Reaction) ®îc Karry Mullis hoµn thiÖn vµo gi÷a nh÷ng n¨m 80
®· gãp phÇn t¹o ra mét cuéc c¸ch m¹ng trong sinh häc ph©n tö. Kü thuËt PCR lµ
mét ph¬ng ph¸p hoµn toµn míi trong viÖc nghiªn cøu vµ ph©n tÝch c¸c gen. Sö dông
kü thuËt PCR cã thÓ t¹o ra mét sè lîng lín c¸c b¶n sao cña ®o¹n ADN cÇn tæng hîp
mµ kh«ng ph¶i t¸ch vµ nh©n dßng. Thùc chÊt PCR lµ mét ph¬ng ph¸p in vitro
vi tro cho phÐp nh©n b¶n nhanh mét ®o¹n ADN nµo ®ã mµ chØ cÇn mét khèi lîng
mÉu ban ®Çu h¹n chÕ [8], [5]. Ph¶n øng PCR lµ mét chuçi ph¶n øng gåm nhiÒu chu
kú lÆp l¹i, mçi chu kú gåm 3 giai ®o¹n:
+ Giai ®o¹n 1 (BiÕn biÕn tÝnh): ADN ®îc biÕn tÝnh ë nhiÖt ®é kho¶ng 950C trong
thêi gian kho¶ng 1 phót, khi ®ã c¸c liªn kÕt hidro bÞ ®øt vµ sîi ADN kÐp t¸ch thµnh hai
sîi ®¬n.
+ Giai ®o¹n 2 (Gg¾n måi): ë nhiÖt ®é tõ 300C ®Õn 650C trong kho¶ng 30 gi©y
®Õn 1 phót th× c¸c måi b¾t cÆp víi sîi ADN khu«n theo nguyªn t¾c bæ sung ë hai
®Çu ®o¹n ADN cÇn nh©n. NhiÖt ®é cña bíc g¾n måi tïy thuéc vµo tõng lo¹i måi cô
thÓ, ®îc tÝnh to¸n dùa trªn nhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña ®o¹n måi [3], [5].
C«ng thøc tÝnh nhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña ®o¹n måi:
Tm = 81,5 + 16,6(log10 {J+}) + 0,41(%G + C) - (600/I) - 0,63(%FA)
Trong ®ã: {J+}: nång ®é cña c¸c cation hãa trÞ I
FA: chÊt dïng ®Ó g©y biÕn tÝnh ADN
I: chiÒu dµi cña måi
6
+ Giai ®o¹n 3 (tæng hîp ADN): ë nhiÖt ®é kho¶ng 720C, trong kho¶ng thêi
gian tõ 30 gi©y ®Õn nhiÒu phót (tuú thuéc vµo chiÒu dµi ®o¹n ADN cÇn tæng hîp),
khi ®ã, enzym Taq polymerase ho¹t ®éng vµ qu¸ tr×nh tæng hîp ADN diÔn ra trªn
nh÷ng ®o¹n gi÷a cÆp måi theo chiÒu tõ 5’- 3’.
Mét chu kú gåm 3 bíc trªn ®îc lÆp ®i lÆp l¹i nhiÒu lÇn vµ qua mçi lÇn lµm
t¨ng gÊp ®«i sè mÉu lÇn tríc. Sù t¨ng lîng mÉu nµy theo cÊp sè nh©n, nªn sau n chu
k× sè mÉu thu ®îc lµ:
A = x.2n
Trong ®ã A: Tæng sè b¶n sao ADN
x: Sè lîng ph©n tö ADN lµm khu«n ban ®Çu
n: Sè chu kú
C¸c thµnh phÇn c¬ b¶n cña mét ph¶n øng PCR gåm: ADN khu«n, hai ®o¹n
måi ®Ó x¸c ®Þnh c¸c ®iÓm b¾t ®Çu tæng hîp ADN, Taq polymerase, hçn hîp bèn tiÒn
chÊt deoxynucleotit, dung dÞch ®Öm chøa mét sè cation hãa trÞ 1, ion Mg 2+ vµ dung
m«i (níc khö ion khö trïng).
- Enzym Taq polymerase:
Enzym Taq polymerase lµ enzym chÞu nhiÖt, ®îc t¸ch tõ vi khuÈn suèi níc
nãng Thermus aquaticus. Enzym Taq cã träng lîng ph©n tö lµ 94 kDa vµ kh«ng mÊt
ho¹t tÝnh ë nhiÖt ®é cao trong giai ®o¹n g©y biÕn tÝnh ADN, nhng ho¹t tÝnh cña
enzym Taq gi¶m 50% sau 150 phót ë nhiÖt ®é 92,50C; sau 40 phót ë nhiÖt ®é 950C
vµ sau 5 - 6 phót ë nhiÖt ®é 97 0C. NÕu nhiÖt ®é t¨ng lªn tíi 95 0C trong 20 gi©y ®Ó
biÕn tÝnh ADN kÐp thµnh sîi ®¬n th× ho¹t tÝnh enzym Taq cßn l¹i 65% sau 50 chu k×
ph¶n øng.
Nång ®é enzym Taq tèi u cho ph¶n øng PCR lµ 0,5 - 2,5 ®¬n vÞ; nhng nÕu
nång ®é enzym qu¸ cao sÏ lµm gi¶m hiÖu xuÊt xóc t¸c cña ph¶n øng. Ngoµi ra, nång
®é Mg2+ vµ dNTP còng ¶nh hëng ®Õn ho¹t tÝnh cña enzym. HiÖn nay, cã nhiÒu lo¹i
polymerase chÞu nhiÖt kh¸c cã chøc n¨ng riªng biÖt vµ hoµn thiÖn h¬n nh Tth
polymerase t¸ch chiÕt tõ Thermus thermophilus, cã kh¶ n¨ng ho¹t ®éng nh mét
enzym phiªn m· ngîc khi cã mÆt cña ARN khu«n vµ ion Mn2+.
- ADN khu«n (template):
ADN khu«n lµ vËt liÖu khëi ®Çu cho ph¶n øng PCR nªn ®ßi hái ph¶i cã ®é
tinh s¹ch cao. ADN khu«n cã thÓ lµ sîi ®¬n hoÆc sîi ®«i cña chuçi ADN hayARN ®îc biÕt tríc tr×nh tù ë hai ®Çu ®Ó thiÕt kÕ måi. Th«ng thêng, nång ®é cña ADN
khu«n ®îc ®a vµo ph¶n øng PCR kho¶ng 10 - 500 ng.
- §o¹n måi (primer):
C¸c ®o¹n måi thùc chÊt lµ c¸c oligonucleotit dµi kho¶ng 4 - 10 baz¬ (®èi víi
måi ngÉu nhiªn) hoÆc kho¶ng 12 - 24 baz¬ (®èi víi måi ®Æc trng). Nång ®é måi
thÝch hîp ®Ó tiÕn hµnh ph¶n øng PCR lµ tõ 0,1 - 0,5 M. Lîng måi ®a vµo ph¶n øng
PCR ph¶i phï hîp víi lîng ADN cÇn tæng hîp (thêng 106 ph©n tö ADN cÇn 108
7
ph©n tö primer). NÕu nång ®é måi qu¸ thÊp th× måi sÏ hÕt tríc khi sè chu k× kÕt
thóc, cßn nång ®é måi qu¸ cao th× sÏ dÔ lµm t¨ng s¶n phÈm kh«ng ®Æc hiÖu.
C¸c ®o¹n måi cÇn cã tÝnh ®Æc thï ®Ó lµm t¨ng tÝnh ®Æc hiÖu cña ph¶n øng.
Måi ph¶i ®îc thiÕt kÕ sao cho kh«ng ®îc bæ trî lÉn nhau, sè lîng 4 lo¹i baz¬ nit¬
trong måi nªn xÊp xØ nhau, lîng G - C gi÷a hai måi ph¶i b»ng nhau, tr¸nh nh÷ng
vïng tr×nh tù kh«ng b×nh thêng nh polypurin hoÆc polyprimidine hay c¸c tr×nh tù
lÆp.
- C¸c nucleotit (dNTPs):
Lµ hçn hîp cña bèn lo¹i deoxyribonucleotit (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) lµm
nguyªn liÖu cho ph¶n øng tæng hîp ADN. Tuú thuéc vµo môc ®Ých nghiªn cøu, c¸c
nhµ khoa häc cßn cã thÓ sö dông mét sè nucleotit ®· ®îc thay ®æi nh g¾n thªm
biotin hoÆc digoxigenin... Nång ®é ph¶n øng cña c¸c dNTP thêng dïng vµo kho¶ng
200 mM mçi lo¹i, tuy nhiªn ë nång ®é dNTP thÊp (10 - 100 mM) Taq ADN
polymerase ho¹t ®éng chÝnh x¸c h¬n. H¬n n÷a, nång ®é tèi u cña chóng phô thuéc
vµo rÊt nhiÒu yÕu tè nh:
+ Nång ®é Mg2+
+ Nång ®é chÊt måi
+ §é dµi cña s¶n phÈm ®îc khuyÕch ®¹i
+ Sè chu kú cña ph¶n øng
- Dung dÞch ®Öm (buffer)
Thµnh phÇn cña dung dÞch ®Öm phô thuéc vµo lo¹i enzym polymerase ®îc sö
dông. Trong dung dÞch ®Öm quan träng nhÊt lµ ion Mg 2+. Ion Mg2+ lµm t¨ng nhiÖt ®é
nãng ch¶y (Tm) cña ADN m¹ch ®«i, t¹o ra phøc chÊt tan víi dNTPs ®Ó h×nh thµnh
c¬ chÊt mµ enzym polymerase cã thÓ nhËn ra, ®iÒu nµy rÊt cÇn thiÕt cho qu¸ tr×nh
liªn kÕt cña c¸c dNTP. Nång ®é Mg2+ trong hçn hîp ph¶n øng cuèi cïng biÕn ®æi tõ
0,5 - 5,0 mM (nång ®é nµy cã thÓ thay ®æi khi cÇn thiÕt). Nång ®é ion Mg 2+ qu¸
thÊp sÏ lµm gi¶m kh¶ n¨ng tæng hîp cña enzym polymerase, cßn nÕu nång ®é qu¸
cao sÏ t¹o ra nh÷ng ph©n ®o¹n kh«ng ®Æc hiÖu.
Nh×n chung nång ®é MgCl2 cã ¶nh hëng nhiÒu tíi hiÖu qu¶ vµ tÝnh ®Æc thï
cña ph¶n øng. Ngoµi Mg2+ cßn mét sè chÊt kh¸c trong dung dÞch ®Öm nh AMSO,
DMSO, formamide ®îc thªm vµo nh c¸c chÊt phô gia nh»m t¹o ra c¸c s¶n phÈm
PCR cã kÝnh thíc lín [3].
Kü thuËt PCR lµ mét c«ng cô h÷u hiÖu cho viÖc ph©n tÝch hÖ gen cña sinh
vËt v× nã cã kh¶ n¨ng t¹o ra mét lîng lín tr×nh tù ANDN ®Æc hiÖu tõ bÊt cø c¬ thÓ
nµo. PCR ®îc sö dông vµo nhiÒu môc ®Ých kh¸c nhau nh: x¸c ®Þnh tr×nh tù trùc tiÕp
tõ ®o¹n ®îc nh©n, nh©n b¶n quÇn thÓ mARN ®Ó lµm mÉu lai, x¸c ®Þnh c¸c tr×nh tù
®Æc hiÖu tõ cADN hay th viÖn gen, x¸c ®Þnh sinh vËt chuyÓn gen, t¹o ®ét biÕn ®Þnh
híng [1].
1.3.2. Kü thuËt RAPD vµ øng dông
8
Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, nhiÒu kü thuËt míi ra ®êi dùa trªn nguyªn t¾c cña
PCR cho phÐp ta x¸c ®Þnh ®îc tÝnh ®a d¹ng cña hÖ gen víi nhiÒu u ®iÓm nh kü thuËt
AFLP, SSR, RFLP, RAPD.....
- Kü thuËt AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) cho phÐp ta
ph¸t hiÖn ®îc tÝnh ®a d¹ng vÒ chiÒu dµi c¸c ®o¹n ADN ®îc nh©n b¶n chän läc - c¾t
ra bëi enzym giíi h¹n. Sö dông kü thuËt nµy cã thÓ nh©n cïng mét lóc mét c¸ch ®Æc
trng víi sè lîng lín c¸c ®o¹n ADN cã kÝch thíc giíi h¹n. Kü thuËt AFLP kÕt hîp ®îc nh÷ng u ®iÓm cña RFLP vµ RAPD nªn nã cã hiÖu qu¶ trong viÖc ph¸t hiÖn ®a
h×nh ADN. Ngoµi ra, kü thuËt nµy cã thÓ ph©n tÝch tÝnh ®a h×nh mét c¸ch nhanh
chãng, æn ®Þnh vµ ®¸ng tin cËy [3].
- Kü thuËt RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphic ADN - ®a h×nh
vÒ chiÒu dµi cña c¸c ®o¹n ADN ®îc c¾t ngÉu nhiªn bëi c¸c enzym giíi h¹n): Sö
dông kü thuËt RFLP cã thÓ t¹o nªn c¸c ®o¹n c¾t kh¸c nhau ®îc ph©n biÖt b»ng ph¬ng ph¸p ®iÖn di. Nhîc ®iÓm cña kü thuËt nµy lµ quy tr×nh phøc t¹p, cång kÒnh, khã
tù ®éng ho¸, tèn kÐm vµ sö dông chÊt ®ång vÞ phãng x¹ g©y nguy hiÓm cho ngêi
thao t¸c [3], [8].
- Kü thuËt SSR (Simple Sequence Repeats) hay cßn gäi lµ vi vÖ tinh
(microsatellites), lµ mét ®o¹n ADN cã sù lÆp l¹i cña mét trËt tù nucleotit ®¬n gi¶n
nµo ®ã. Kü thuËt SSR cho phÐp ph¸t hiÖn ®îc tÝnh ®a h×nh vÒ ®é dµi c¸c trËt tù
nucleotit ®¬n gi¶n. Nhîc ®iÓm cña kü thuËt SSR lµ tèn kÐm vÒ tiÒn cña, c«ng søc
trong viÖc x©y dùng cÆp måi ®Æc hiÖu cho mçi locus ®a h×nh (®Ó x©y dùng c¸c cÆp
måi ®Æc hiÖu cÇn t¸ch dßng vµ ®äc tr×nh tù mét sè lîng lín c¸c ®o¹n ADN hÖ gen
chøa ®o¹n lÆp l¹i) [8], [3].
- Kü thuËt RAPD (cßn ®îc gäi lµ kü thuËt ph©n lo¹i ph©n tö): ®îc sö dông ®Ó
ph©n tÝch vµ x¸c ®Þnh mèi quan hÖ th©n thuéc gi÷a c¸c gièng c©y trång hay gi÷a c¸c
c¸ thÓ, phôc vô cho c«ng t¸c lai t¹o gièng hoÆc ph©n lo¹i. ¦u ®iÓm cña kü thuËt nµy
lµ nhanh, rÎ, ®¬n gi¶n vµ gióp x¸c ®Þnh tÝnh ®a d¹ng sinh häc, nguån gèc di truyÒn
cña c¸c gièng ®éng vËt, thùc vËt, vi sinh vËt.
N¨m 1990, William vµ CS ®· ph¸t triÓn kü thuËt RAPD (Random Amplified
Polymorphic ADN) trªn c¬ së PCR. VÒ c¬ b¶n, kü thuËt nµy sö dông nh÷ng ®o¹n
måi ng¾n kho¶ng 4 - 10 nucleotit kh«ng ®Æc trng ®Ó tiÕn hµnh ph¶n øng PCR. Nhng
®èi víi mçi ®èi tîng, ta ph¶i tiÕn hµnh sµng läc ®Ó chän läc ®îc mét sè måi thÝch
hîp [1]. S¶n phÈm PCR khi dïng víi måi ngÉu nhiªn thêng ®a d¹ng, cã chiÒu dµi tõ
100 - 5000 nucleotit vµ khi ®iÖn di trªn gel agarose ®îc ph©n t¸ch thµnh c¸c ph©n
®o¹n kh¸c nhau. TÝnh ®a d¹ng thu ®îc nhê kü thuËt RAPD lµ ®¸ng tin cËy v× khi cã
sù thay ®æi mét baz¬ nit¬ nµo ®ã th× nã sÏ ng¨n c¶n sù tiÕp hîp cña måi víi ADN
khu«n. sù mÊt ®o¹n nhiÔm s¾c thÓ hoÆc sù thªm bít ®iÓm g¾n måi còng nh sù xen
vµo mét gen nµo ®ã sÏ lµm thay ®æi kÝch thíc cña ®o¹n ADN ®îc nh©n b¶n. mçi
®o¹n måi cã thÓ t¹o ra mét hoÆc mét vµi sù ®a d¹ng, cã thÓ ph¸t hiÖn ®îc vµ cho ra
phæ ®iÖn di ®Æc trng. Kü thuËt RADP ®îc sù dông trong c¸c môc ®Ých nghiªn cøu ®a
h×nh di truyÒn, lËp b¶n ®å gen liªn kÕt vµ ph©n tÝch con lai F1.
9
u ®iÓm cña kü thuËt RADP lµ kh«ng cÇn biÕt tr×nh tù ®o¹n ADN cÇn nghiªn
cøu, quy tr×nh tiÕn hµnh nhanh, chØ cÇn mét lîng nhá ADN khu«n. Bªn c¹nh ®ã, chØ
cÇn mét bé måi ta cã thÓ sö dông ®îc víi c¸c loµi kh¸c nhau trong khi c¸c mÉu dß
RFLP chØ cã thÓ dïng ®îc cho c¸c loµi cã quan hÖ gÇn gòi nhau. TÝnh ®a d¹ng thu
®îc tõ c¸c chØ thÞ RAPD ®îc ®¸nh gi¸ cao h¬n so víi kü thuËt RFLP vµ cho phÐp
ph¸t hiÖn ®îc tÝnh ®a d¹ng ngay c¶ trong c¸c ®o¹n chøa c¸c trËt tù nucleotit lÆp l¹i.
Nhîc ®iÓm cña chØ thÞ nµy lµ: chØ thÞ RAPD cã tÝnh chÊt tréi do ®ã nh÷ng gen ®iÒu
khiÓn tÝnh tr¹ng nµo ®ã cã tÝnh lÆn sÏ khã t×m thÊy sù ®a h×nh trªn gel ®iÖn di. H¬n
n÷a, RAPD cã tÝnh chÊt ngÉu nhiªn nªn viÖc lÆp l¹i ph©n tÝch ®iÖn di ®Ó t×m liªn kÕt
gen thêng kh«ng thèng nhÊt [3].
C¸c nghiªn cøu gÇn ®©y cho thÊy RAPD lµ mét kü thuËt cã hiÖu qu¶ trong
viÖc x¸c dÞnh kiÓu gen, ph©n tÝch quÇn thÓ vµ nguån gèc loµi, nghiªn cøu di truyÒn
loµi vµ lËp b¶n ®å di truyÒn. Kü thuËt RAPD ®îc sö dông ®Ó nhËn biÕt vµ ph©n lo¹i
c¸c gièng c©y kh¸c nhau, sù ®a d¹ng di truyÒn gi÷a lóa Indica vµ Japonica, x¸c ®Þnh
sù ®a h×nh cña c¸c c©y t¸i sinh cã nguån gèc m« sÑo, tÕ bµo huyÒn phï vµ tÕ bµo
trÇn...
Yang vµ Quiros ®· sö dông 28 ®o¹n måi cã ®é dµi 10 bp ®Ó nghiªn cøu sù
kh¸c biÖt cña 23 gièng cÇn t©y vµ chóng ®îc chia thµnh 3 nhãm. KÕt qu¶ nµy còng
phï hîp khi dïng 6 chØ thÞ protein ®Ó ph©n lo¹i c¸c gièng cÇn t©y trªn (Yang vµ
Quiros, 1993). T¬ng tù nh vËy, nhiÒu t¸c gi¶ ®· dïng RAPD ®Ó lËp c©y chñng lo¹i
ph¸t sinh (phylogenic tree) cña c¸c loµi c©y nh ng«, ®u ®ñ, hµnh t©y, xoµi, cá ®inh
l¨ng…[26], [31].
Dùa trªn sù xuÊt hiÖn hay biÕn mÊt cña c¸c ph©n ®o¹n ADN khi ®iÖn di s¶n
phÈm RAPD ®îc quan s¸t thÊy ë c¸c c¸ thÓ kh¸c nhau vµ ®îc ®¸nh gi¸ theo qui íc 1
= xuÊt hiÖn vµ 0 = biÕn mÊt. Mét b¶ng gåm c¸c gi¸ trÞ 0 vµ 1 ®îc thiÕt lËp tõ c¸c c¸
thÓ nghiªn cøu sÏ cho phÐp tÝnh ra hÖ sè t¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c cÆp theo Nei vµ
Li.
Trong qu¸ tr×nh thiÕt lËp mèi quan hÖ gi÷a c¸c loµi hay nhãm loµi, mét sè
t¸c gi¶ (Apostol vµ CS, 1993) ®· x©y dùng kü thuËt ph©n nhãm th«ng qua c¸c biÓu
®å RAPD (RAPDLOT). Thùc chÊt kü thuËt nµy gåm 3 bíc:
+ Bíc 1: So s¸nh tõng cÆp ®èi tîng trong nghiªn cøu b»ng c¸ch tÝnh to¸n
kho¶ng c¸ch quan hÖ gi÷a chóng
+ Bíc 2: LËp mét ma trËn gåm tÊt c¶ nh÷ng gi¸ trÞ tÝnh to¸n ®îc tríc ®ã
+ Bíc 3: Gi¶i ma trËn vµ biÔu diÔn thµnh mét biÓu ®å ®Æc trng [17]
Ngµy nay, c¸c nhµ nghiªn cøu ®· thiÕt lËp ®îc phÇn mÒm m¸y tÝnh ®Ó tù
®éng vÏ nªn biÓu ®å mèi quan hÖ hay ®é t¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c ®èi tîng
nghiªn cøu sau khi nhËp d÷ liÖu vÒ c¸c ph©n ®o¹n ®îc nh©n b¶n cña c¸c c¸ thÓ.
NTSYS pc version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) lµ tªn cña mét ch¬ng
tr×nh thuéc kiÓu trªn ®Ó lËp ra biÓu ®å h×nh c©y. BiÓu ®å h×nh c©y thu ®îc sÏ thÓ hiÖn
møc ®é gÇn nhau cña c¸c c¸ thÓ cho phÐp ®¸nh gi¸ ®îc mèi quan hÖ di truyÒn gi÷a
c¸c c¸ thÓ ®îc nghiªn cøu. Ch¬ng tr×nh nµy cho phÐp gi¶m bít thêi gian nghiªn cøu
10
vµ cã ®é chÝnh x¸c cao nªn nã lµ mét phÇn mÒm cã hiÖu qu¶ trong viÖc ph©n tÝch kü
thuËt RAPD.
Ch¬ng 2. §èi tîng vµ ph¬ng ph¸p nghiªn cøu
2.1. §èi tîng nghiªn cøu
2.1.1. §èi tîng nghiªn cøu
§èi tîng nghiªn cøu tÝnh ®a d¹ng ADN lµ 36 gièng lóa cã nguån gèc, tÝnh
kh¸ng kh¸c nhau víi kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn cã nguån gèc vµ tÝnh kh¸ng bÖnh
kh¸c nhau do do Bé m«n Di truyÒn MiÔn dÞch, ViÖn Khoa häc Kkü thuËt Nn«ng
nghiÖp ViÖt Nam cung cÊp (tr×nh bµy nh trong b¶ng 1, ®iÓm ®¸nh gi¸ tÝnh kh¸ngchØ
míi d/nhiÔm cña c¸c gièng lóa chØ víi mét nßi vi khuÈn phæ biÕn ë vïng §ång b»ng
s«ng Hång).
B¶ng 1. Danh s¸ch tËp ®oµn gièng lóa kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn
STT
Tªn gièng
Nguån gèc
§iÓm
STT
Tªn gièng
1
OM3499-5
ViÖt Nam
4,0
19
IRRI346
2
OM3242-50
ViÖt Nam
5,0
20
3
OM3496-9
ViÖt Nam
5,0
4
NTCD1-12
ViÖt Nam
5
NTCD1-16
6
Nguån gèc
§iÓm
IRRI
7,70
MILYANG23
Hµn Quèc
7,0
21
MILYANG42
Hµn Quèc
3,0
5,0
22
SUWION290
Hµn Quèc
9,0
ViÖt Nam
5,0
23
BJ1
Ên ®é
7,70
T¸m tiªu
ViÖt Nam
5,5
24
TÎ tÐp
ViÖt Nam
7,70
7
T¸m Xu©n B¾c
ViÖt Nam
5,5
25
BL89
ViÖt Nam
3,0
8
NÕp ®en
ViÖt Nam
3,3
26
BL28
ViÖt Nam
3,0
9
ViÖt Nam
5,5
27
BL31-97
Ên ®é
1,0
10
NÕp c¸i hoa
vµng
NÕp sím
ViÖt Nam
3,3
28
BBL72-99
Ên ®é
3,0
11
HT1
Trung Quèc
7,7
29
KBL75-99
Ên ®é
3,0
12
N87
§µi Loan
7,7
30
KBL53-99
Ên ®é
5,0
13
DV85
IRRI
1,0
31
Khang d©n
Trung Quèc
57,0
11
14
IRRI1545
IRRI
3,0
32
Chiªm h¬ng
Trung Quèc
9,0
15
IRRI20
IRRI
5,0
33
Q5
Trung Quèc
7,70
16
IRRI8
IRRI
5,0
34
D¤115
ViÖt Nam
57,0
17
KUNTLAN
§µi Loan
57,0
35
KB1
ViÖt Nam
7,70
18
ZENITH
§µi Loan
57,0
36
TN1
ViÖt Nam
7,70
Ghi chó 1: Kh¸ng cao
3: Kh¸ng
5: Kh¸ng võa 7: NhiÔm võa 9: NhiÔm nÆng
2.1.2. Ho¸ chÊt vµ thiÕt bÞ sö dông:
- Ho¸ chÊt vµ thiÕt bÞ m¸y mãc: Ho¸ chÊt vµ thiÕt bÞ sö dông ®îc ghi kÌm tªn h·ng
s¶n xuÊt cho tiÖn theo dâi: Taq ADN polymerase (Perkin-Elmer); M¸y tæng hîp
oligonucleotit tù ®éng - Gene Assemble (Pharmacia, Thôy §iÓn); M¸y ®o quang
phæ: Diode Array Spectrophotometer (Hewlett Parkard, Mü); M¸y ly t©m
AvantiTM30 (Beckman, Mü)…
- C¸c måi sö dông trong ph¶n øng RAPD: C¸c måi ngÉu nhiªn sö dông cho viÖc
ph©n tÝch genom cña 36 gièng lóa kh¸ng bÖnh b¹c l¸ lóa vi khuÈn do Phßng C«ng
nghÖ TÕ bµo Thùc vËt, ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc cung cÊp. Tr×nh tù c¸c måi dµi 10
nucleotit ®îc thiÕt kÕ theo Monna vµ CS (1994).
B¶ng 2: Danh s¸ch 21 måi ngÉu nhiªn dïng trong ph©n tÝch tËp ®oµn 36 gièng lóa
kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn.
1. Måi RA31
5’AACCGACGGG 3’
12. Måi OPP19
5’GGGAAGGACA 3’
2. Måi RA32
5’GGGGGTCGTT 3’
13. Måi UBC391 5’GCGAACCTCG 3’
3. Måi RA36
5’TACCACCCCG 3’
14. Måi V8
5’GGACGGCGTT 3’
4. Måi RA40
5’GGCGGACTGT 3’
15. Måi Q14
5’GGACGCTTCA 3’
5. Måi RA45
5’TACCACCCCG 3’
16. Måi GN38
6. Måi RA46
5’CCAGACCCTG 3’
17. Måi C19
5’GTTGCCAGCC 3’
7. Måi RA50
5’ GCTGTGCAG 3’
18. Måi O10
5’TCAGAGCGCC 3’
8. Måi RA142
5’CAATCGCCGT 3’
19. MåiO13
5’GTCAGAGTCC 3’
9. Måi RA143
5’TCGGCGATAG 3’
20. Måi O18
5’CTCGCTATCC 3’
10. Måi RA159
5’GTCCACACGG 3’
21. Måi I13
5’CTGGGGCTGA 3’
11. Måi OPA13
5’CAG CAC CCAC 3’
M¸y ly t©m l¹nh (Sigma), m¸y PCR (Thermal Cycler PTC 100 h·ng MJ), m¸y ®iÖn
di (Biorad), m¸y ®o quang phæ Model 8425A (Hewlett Packard), m¸y chôp ¶nh Gel
Doc (Pharmacia)….
2.2. Ph¬ng ph¸p nghiªn cøu
12
2.2.1. Kü thuËt t¹o c©y con vµ thu l¸ (theo ph¬ng ph¸p cña phßng C«ng nghÖ tÕ bµo thùc
vËt)§inh ThÞ Phßng, (2001) [7].(LuËna
C
ChuÈn bÞ c©y m¹: H¹t lóa ®îc ng©m, ñ cho n¶y mÇm. C¸c mÇm m¹ cã ®é dµi
1,5 - 2,0 cm ®îc ®Æt vµo cèc nu«i c©y cã ®êng kÝnh 7 cm, cao 6 cm, díi ®¸y cèc cã
lãt giÊy läc. Mçi cèc ®Æt 15 - 20 mÇm. Nu«i mÇm m¹ trong dung dÞch MS pha lo·ng
10 lÇn ë ®iÒu kiÖn ¸nh s¸ng b×nh thêng, hai ngµy thay dung dÞch mét lÇn. Khi c©y
m¹ ®îc 3 - 5 l¸ thËt th× tiÕn hµnh thu l¸ ®Ó dïng ngay hoÆc b¶o qu¶n ë tñ l¹nh s©u 800C. Ta thu l¸ non v× l¸ non cã Ýt s¶n phÈm trao ®æi chÊt g©y trë ng¹i cho kh¶ n¨ng
hoµ tan cña ADN thu ®îc.
2.2.2. T¸ch chiÕt ADN tæng sè tõ l¸ lóa
Quy tr×nh t¸ch chiÕt ADN tæng sè tõ l¸ lóa theo ph¬ng ph¸p cña Egnin vµ CS
(1998).
a) Ho¸ chÊt sö dông
Tris - HCl 1M, pH = 8,0; 5M NaCl; 0,5 EDTA; PVP; 5% SDS; RNase
10mg/ml; 3M CH3COONa, pH 5,3 hoÆc pH 7,0; TE (10mM Tris, pH = 8,0 + 1 mM
EDTA, pH = 8,0); Isopropanol: Phenol: Chlorofom: Isoamin (25:24:1); cån 80%.
b) Pha ®Öm t¸ch chiÕt ADN
B¶ng 3. Nång ®é cña ho¸ chÊt t¸ch ADN tæng sè.
Nång ®é dung dÞch stock chuÈn
Nång ®é cÇn pha
Trong 50ml
1M Tris-HCl, pH = 8,0
50 mM
2,5 ml
5M NaCl
300 mM
3 ml
0,5M EDTA
20 mM
2 ml
Polyvinylpyrrolidone
2%
1g
10% Sodium Ascorbate
0,1%
0,5 ml
20% Saccosine
1,5%
3,75 ml
Sodium Metabisulfite
1%
0,5 g
H2O cÊt khö ion v« trïng
38,5 ml
c) Quy tr×nh t¸ch chiÕt ADN tæng sè tõ l¸ lóa
- Thu 0,1 - 0,2 g l¸ lóa non, nghiÒn nhanh trong nit¬ láng b»ng cèi chµy sø cho ®Õn
khi mÉu cã d¹ng bét mÞn. NghiÒn trong nit¬ láng ®¶m b¶o mÉu ®îc nghiÒn triÖt ®Ó,
ADN thu ®îc cã d¹ng søa, cã ph©n tö lîng cao, kh«ng ®øt ®o¹n.
13
- Thªm 0,8 - 1,0 ml dung dÞch ®Öm t¸ch ADN vµo mÉu l¸ ®· nghiÒn, trén ®Òu b»ng
c¸ch ®¶o ngîc nhÑ.
- Gi÷ trong ®¸ 5 phót, thªm 0,8 - 1,0 ml dung dÞch Phenol: Chlorofom: Isoamin =
25: 24: 1, ®¶o ®Òu cho ®Õn khi dung dÞch cã mµu tr¾ng s÷a, ñ trong ®¸ 5 phót.
- Ly t©m víi tèc ®é 13.000 vßng/phót ë 40C trong 15 phót.
- ChuyÓn 0,8 ml dÞch næi phÝa trªn sang èng eppendorf míi ®· cã s½n 0,8 ml dung
dÞch isopropanol l¹nh.
- §¶o ®Òu, gi÷ ë nhiÖt ®é 40C trong 10 - 30 phót.
- Ly t©m 10.000 vßng/phót ë 40C trong 5 phót.
- Lo¹i bá phÇn dÞch næi phÝa trªn, lµm kh« phÇn kÕt tña b»ng m¸y Speed - Vac.
- Hoµ tan phÇn kÕt tña trong 150 l ®Öm TE, ®Ó qua ®ªm ë 40C cho ADN tan hÕt.
- Thªm 1,5 l RNase, trén ®Òu vµ ñ ë 370C trong 30 phót .
- Ly t©m 13.000 vßng/phót, chuyÓn dÞch ë phÝa trªn sang mét èng eppendorf 1,5 ml
míi, bíc chuyÓn ph¶i nhÑ nhµng tr¸nh khuÊy cÆn.
- Thªm 20 l CH3COONa 3M, l¾c ®Òu, thªm 400 l Isopropanol ®Ó tña l¹i.
- Ly t©m 10.000 vßng/phót trong 5 phót ë 40C, lo¹i bá dÞch næi vµ thªm 0,5 ml cån 70%.
- Ly t©m 13.000 vßng/phót, bá phÇn dÞch næi vµ lµm kh« b»ng m¸y Speed - Vac.
- Hoµ tan l¹i ADN trong 100 l TE, ®Ó qua ®ªm ë 40C.
- B¶o qu¶n ADN ë - 200C.
2.2.3. Ph¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm lîng vµ ®é s¹ch cña ADN
a) §iÖn di trªn gel agarose
- Pha agarose 0,8% trong TAE 1X, ®un nãng, ®Ó nhiÖt ®é h¹ xuèng kho¶ng 60 0C,
®æ vµo khu«n gel cã cµi lîc.
- Sau 30 phót rót lîc ra, ®æ ®Öm ch¹y ®iÖn di TAE 1X ngËp b¶n gel 1- 2 mm.
- LÊy 2 l ADN mÉu + 1 l thuèc nhuém + 7 l H2O trén ®Òu, dïng pipet tra hçn
hîp mÉu vµo giÕng.
- Ch¹y ®iÖn di ë 80V trong 30 phót.
- Nhuém gel: b¶n gel ch¹y xong ®îc nhuém trong Ethidium bromide 0,5 g/ml trong
10 phót, röa s¹ch b»ng níc.
- Soi gel trªn ®Ìn UV vµ chôp ¶nh.
b) §o b»ng m¸y ®o quang phæ hÊp thô
§o trªn m¸y ®o quang phæ cã ch¬ng tr×nh xö lý trªn m¸y vi tÝnh
14
- §o mÉu ë bíc sãng = 260 nm.
- §o mÉu ë bíc sãng = 280 nm.
- ChØnh c©n b»ng m¸y: dïng níc khö ion v« trïng ®Ó lµm chuÈn.
- KiÓm tra m¸y: ®o mét mÉu ADN cã nång ®é chuÈn ®· biÕt tríc (ADN cña thùc
khuÈn thÓ ).
- §o mÉu: pha lo·ng 200 lÇn theo c«ng thøc: lÊy 995 l níc cÊt + 5 l ADN mÉu
vµo cuvet l¾c ®Òu, ®Æt vµo m¸y ®o.
- Sau mçi lÇn ®o ph¶i röa s¹ch cuvet b»ng níc cÊt.
- In kÕt qu¶ ®o ®îc.
- Tõ ®ã, ta tÝnh ®îc hµm lîng vµ ®é s¹ch cña ADN
+ Hµm lîng ADN (ng/l) = 50 x HSPL x OD260
+ §é s¹ch ADN = OD260/ OD280
Trong ®ã HSPL: hÖ sè pha lo·ng
50: h»ng sè
OD260: chØ sè ®o ®îc ë bíc sãng 260 nm.
OD280: chØ sè ®o ®îc ë bíc sãng 280 nm.
NÕu ®é s¹ch ADN = 1,8 - 2,0 th× mÉu ®îc coi lµ s¹ch.
2.2.4. Ph©n tÝch sè liÖu RAPD
a) §o¹n måi
§o¹n måi ngÉu nhiªn sö dông cho viÖc ph©n tÝch genome cña lóa
trong nghiªn cøu nµy gåm 21 måi Operon. C¸c ®o¹n måi cã kÝ hiÖu vµ tr×nh tù
lµ:
B¶ng 2: Danh s¸ch 21 måi Operon dïng trong ph©n tÝch tËp ®oµn 36 gièng lóa
kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn.
15
1. Måi RA31
2. Måi RA32
5’AACCGACGGG 3’ 12. Måi OPP19
5’GGGGGTCGTT 3’ 3’
3. Måi RA36
5’TACCACCCCG 3’
4. Måi RA40
5’GGCGGACTGT 3’
5. Måi RA45
5’TACCACCCCG 3’
6. Måi RA46
5’CCAGACCCTG 3’
7. Måi RA50
5’GGGAAGGACA
13. Måi UBC391
3’
5’GCGAACCTCG
14. Måi V8
3’
5’GGACGGCGTT
5’GGACGCTTCA
5’ GCTGTGCAG 3’
15. Måi Q14
3’
8. Måi RA142
5’CAATCGCCGT 3’
16. Måi GrN38
9. Måi RA143
5’TCGGCGATAG 3’
5’GTTGCCAGCC
10. Måi RA159
5’GTCCACACGG 3’
17. Måi C19
3’
18. Måi O10
3’
5’TCAGAGCGCC
19. MåiO13
3’
5’GTCAGAGTCC
20. Måi O18
5’CTCGCTATCC 3’
21. Måi I13
3’
5’CTGGGGCTGA
11. Måi OPA13
ba) Ph¶n øng PCR - RAPD
- Mçi èng ph¶n øng PCR cã 25 l dung dÞch chøa 1X ®Öm PCR; 2,5 mM MgCl 2;
100 l 4dNTPs; 200 nM ®o¹n måi; 0,125 ®¬n vÞ Taq polymerase vµ 10 - 100 ng
ADN khu«n.
- Trén ®Òu hçn hîp thu ®îc (thao t¸c trong ®¸ ®Ó ®¶m b¶o c¸c hãa chÊt kh«ng bÞ mÊt
ho¹t tÝnh).
- TiÕn hµnh nh©n b¶n trong m¸y PCR - Thermal Cycler PTC 100 theo chu tr×nh:
+ Bíc 1: 940C trong 1 phót
+ Bíc 2: 920C trong 1 phót
+ Bíc 3: 350C trong 1 phót
+ Bíc 4: 720C trong 1 phót
+ Bíc 5: 720C trong 10 phót
+ Bíc 6: gi÷ ë 40C
Bíc 2 - bíc 4 lÆp l¹i 45 chu k×
16
c) §iÖn di s¶n phÈm RAPD
Pha agarose 1,8% trong TAE 1X ®un nãng, ®Ó nguéi kho¶ng 60 0C th× ®æ vµo
khu«n gel cã cµi lîc, sau 30 phót th× rót lîc ra, ®æ ®Öm ch¹y ®iÖn di TAE 1X ngËp
b¶n gel 1 mm. LÊy 3 l thuèc nhuém cho vµo mçi èng s¶n phÈm, trén dÒu. Dïng
pipet trén ®Òu, cho hçn hîp vµo giÕng vµ ch¹y ®iÖn di: 100V trong 120 phót. Nhuém
gel b»ng Ethidium bromide 0,5 g/ml trong 15 phót, röa s¹ch b»ng níc, soi gel trªn
dÌn UV vµ chôp ¶nh.
cb) Ph©n tÝch sè liÖu RAPD
Tiªu chuÈn ho¸ s¶n phÈm RAPD theo quy íc:
Sè 1: xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN.
Sè 0: kh«ng xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN.
Ph©n tÝch sè liÖu theo qui íc: 1 = ph©n ®o¹n ADN xuÊt hiÖn vµ 0 = ph©n ®o¹n ADN
kh«ng xuÊt hiÖn, khi ®iÖn di s¶n phÈm RAPD víi c¸c ®o¹n måi ngÉu nhiªn.
X¸c ®Þnh hÖ sè di truyÒn gièng nhau theo 3 ph¬ng ph¸p [23]:
+ Theo Nei vµ Li, 1979 (hÖ sè Dice)
Sij
2a
2a b c
+ Theo Jaccard, 1908 (hÖ sè Jaccard)
Sij
a
abc
+ Theo Sokal vµ Michener, 1958 (hÖ sè Simple Matching: SM)
Sij
ad
abcd
Trong ®ã Sij: hÖ sè gièng nhau gi÷a hai c¸ thÓ i vµ j
a: sè ph©n ®o¹n ADN xuÊt hiÖn ë c¶ c¸ thÓ i vµ j
b: sè ph©n ®o¹n ADN xuÊt hiÖn ë i vµ kh«ng xuÊt hiÖn ë j
c: sè ph©n ®o¹n ADN xuÊt hiÖn ë j vµ kh«ng xuÊt hiÖn ë i
d: sè ph©n ®o¹n ADN xuÊt hiÖn ë c¸ thÓ i vµ j
So s¸nh hÖ sè t¬ng quan kiÓu h×nh theo 3 ph¬ng ph¸p: SM, Dice, Jaccard vµ 4
ph¬ng ph¸p ph©n nhãm UPGMA (Ph©n tÝch c¸c nhãm ph©n tö kh«ng cïng trong lîng, WPGMA (Ph©n tÝch c¸c nhãm ph©n tö cã cïng träng lîng), liªn kÕt hoµn toµn,
liªn kÕt ®¬n lÎ. LËp biÓu ®å h×nh c©y dùa vµo gi¸ trÞ t¬ng quan kiÓu h×nh (r) cao nhÊt
trong ch¬ng tr×nh NTSYS 2.1 [15], [23]. Hµm lîng th«ng tin tÝnh ®a h×nh
(Polymorphism information content = PIC) cña mçi måi x¸c ®Þnh theo c«ng thøc
PIC = 1- Pi2, trong ®ã Pi lµ tÇn sè cña allen i cña kiÓu gen ®îc kiÓm tra. Ph¹m vi
gi¸ trÞ PIC tõ 0 (kh«ng ®a h×nh) tíi 1 (®a h×nh hoµn toµn) [13].
17
§Ó kh¼ng ®Þnh kÕt qu¶ ph©n nhãm theo s¬ ®å h×nh c©y, chóng t«i biÓu diÔn
kÕt qu¶ theo ph¬ng ph¸p so s¸nh ®a chiÒu (MDS = multidimensional scaling,
Kruskal & Wish, 1978) vµ biÓu ®å ph©n tÝch theo to¹ ®é chÝnh (PCA = principal co ordinate analysis, Hauser & Crovello, 1982) [16], [29].
Ch¬ng 3. KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN
3.1. KÕt qu¶ t¸ch chiÕt ADN tæng sè
§Ó thùc hiÖn ®îc ph¶n øng RAPD th× ADN ph¶i s¹ch, kh«ng ®øt gÉy, ®ã lµ
®iÒu kiÖn ®Çu tiªn cho sù thµnh c«ng cña qu¸ tr×nh nghiªn cøu.
KÕt qu¶ kiÓm tra cho thÊy chÊt lîng vµ nång ®é ADN cña c¸c mÉu thu ®îc
®Òu s¹ch. Cô thÓ lµ ®iÖn di trªn gen agarose cho thÊy ADN tËp trung ë mét b¨ng
chÝnh, kh«ng ®øt gÉy (h×nh 2) vµ khi ®o OD ë bíc sãng 260 nm - 280 nm th× phæ
hÊp phô chØ cã mét ®Ønh hÊp phô duy nhÊt lµ 260 nm (h×nh 3).
C¸c mÉu ADN thu ®îc dÒu cã ®é tinh s¹ch cao cô thÓ lµ chØ sè tû lÖ OD 260/
OD280 thÊp nhÊt lµ 1,80 cña gièng BL28; cao nhÊt lµ 1,95 cña gièng IRRI20 (b¶ng 4).
Nh vËy kÕt qu¶ t¸ch chiÕt cña chóng t«i ®¹t ®ñ tiªu chuÈn ®Ó tiÕn hµnh c¸c thÝ nghiÖm
tiÕp theo.
B¶ng 4: Hµm lîng vµ ®é tinh s¹ch cña tËp ®oµn 36 gièng cã tÝnh kh¸ng kh¸c nhau víi bÖnh
b¹c l¸ vi khuÈn.
Tªn mÉu
OM 3499-5
Hµm lîng
ADN(g/ml)
§é tinh
s¹ch
ADNTØ sè
1025,90
1,82
Tªn mÉu
IRRI 346
Hµm lîng
ADN (g/ml)
TØ sè OD
260/280§é
tinh s¹ch
810,00
1,81
18
MILYANG
23
MILYANG
OM 3242-50
673,30
1,87
519,30
1,85
OM 3496-9
1086,00
1,86
NTCD 1-12
1850,40
1,82
NTCD 1-16
1325,40
1,85
42
SUWION
290
BJ1
1035,80
1,87
462,30
1,84
891,00
1,82
T¸m tiªu
375,50
1,91
TÎ tÐp
2101,30
1,90
T¸m xu©n b¾c
850,00
1,89
BL 89
4251,30
1,85
NÕp ®en
NÕp c¸i hoa vµng
vµng
NÕp sím
454,80
1,90
BL 28
1935,60
1,80
1502,70
1,83
BL 31-97
1201,20
1,85
2279,50
1,89
BBL 72-99
1209,70
1,81
HT 1
786,30
1,81
KBL 75-99
400,10
1,91
N 87
506,40
1,82
KBL 53-99
920,50
1,89
DV85
882,60
1,81
Khang d©n
1502,40
1,86
IRRI 1545
618,30
1,83
Chiªm h¬ng
1091,80
1,90
IRRI 20
1500,20
1,95
Q5
2341,20
1,87
IRRI 8
2145,20
1,86
D¤115
989,40
1,83
KUNTLAN
1045,30
1,87
KB 1
908,40
1,80
7 1978,10
1,87
ZENITH
(25ng) 4912,10
1
2
1,92
3
4
TN
5 1
6
H×nh 2: KÕt qu¶ ®iÖn di kiÓm tra ADN tæng sè t¸ch tõ c¸c gièng lóa nghiªn cøu
19
H×nh 3: Phæ hÊp phô ADN cña c¸c gièng lóa nghiªn cøu ®o ë bíc sãng 260 nm - 280 nm
3.2. Ph©n tÝch ®a h×nh ADN b»ng kü thuËt RAPD
Trong nghiªn cøu nµy chóng t«i sö dông 21 måi ngÉu nhiªn (ký hiÖu RA31,
RA32, RA36, RA40, RA45, RA46, RA50, RA142, RA143, RA159, OPA13, OPP19,
UBC391, V8, Q14, GN38, C19, O-10, O-13, O-18, I13) cã ®é dµi 10 nucleotit (do
phßng C«ng nghÖ TÕ bµo Thùc vËt cung cÊp) ®Ó ph©n tÝch hÖ sè kh¸c nhau vÒ di truyÒn
cña 36 gièng lóa cã tÝnh kh¸ng kh¸c nhau víi bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn.
KÕt qu¶ ë b¶ng 5 cho thÊy tæng sè cã 392 allen ®îc nh©n b¶n. Sè lîng c¸c
allen ®îc nh©n b¶n víi mçi måi xª dÞch tõ 9 (RA45) ®Õn 28 (O-18), kÝch thíc nh©n
b¶n tõ 0,23 kb ®Õn 3 kb trong ph¹m vi quan s¸t.
TÝnh ®a h×nh cña c¸c måi RAPD ®îc ®¸nh gi¸ th«ng qua gi¸ trÞ PIC
(polymorphism information content) - Gi¸ trÞ PIC cµng lín th× tÝnh ®a h×nh cµng cao
vµ ngîc l¹i. Tõ b¶ng 5 thÊy gi¸ trÞ PIC di dao ®éng tõ 0,2538 25 (RA143, OPA13)
®Õn 0,5809 58 (RA36). Trong ®ã, 3/21 cÆp måi RAPD (RA36, RA45, O-18) cho
tÝnh ®a h×nh cao víi gi¸ trÞ PIC 0,5.
Tæng sè thu ®îc 392 allen ®· ®îc nh©n b¶n, trung b×nh sè allen lµ 18,67/locut. Sè
lîng c¸c ph©n ®o¹n ADN ®îc nh©n b¶n víi mçi cÆp måi xª dÞch tõ 9 (RA45) ®Õn 28 (O18) trong ph¹m vi quan s¸t (b¶ng 4). KÝch thíc cña c¸c ph©n ®o¹n ADN nh©n b¶n tõ 0,23
Kb ®Õn 3 Kb.
B¶ng 5: Hµm lîng th«ng tin tÝnh ®a h×nh (PIC) cña tËp ®oµn 36 gièng lóa nghiªncøu
STT
Tªn måi
SP§
ADN
KÝch thíc
®o¹n ADN
(kb)
PIC
STT
Tªn måi
SP§
ADN
KÝch thíc
®o¹n ADN
(kb)
PIC
1
RA31
27
0,24 - 1,90
0,31
12
OPP19
25
0,24 - 2,90
0,290
2
RA32
16
0,30 - 2,40
0,312
13
UBC391
15
3
RA36
16
0,30 - 1,70
0,581
14
V8
16
4
RA40
14
0,25 - 2,00
0,372
15
Q14
17
5
RA45
9
0,40 - 2,10
0,500
16
GrN38
22
6
RA46
14
0,35 - 1,75
0,465
17
C19
18
7
RA50
23
0,37 - 2,10
0,331
18
O10
22
8
RA142
21
0,28 - 1,90
0,37
19
O13
16
0,20 - 1,40 0,3283
3
0,40 - 2,20 0,3863
9
0,35 - 1,70 0,4224
2
0,28 - 1,60 0,3083
1
0,60 - 3,00 0,3753
8
0,25 - 1,65 0,4044
0
0,23 - 1,80 0,35
9
RA143
16
0,25 - 1,70
0,254
20
O18
28
10
RA159
19
0,24 - 2,40
0,3183
2
21
I13
17
0,40 - 3,00 0,5295
4
0,30 - 1,90 0,4364
4
20
- Xem thêm -