Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ đánh giá đa dạng tập đoàn giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá vi k...

Tài liệu đánh giá đa dạng tập đoàn giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá vi khuẩn xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật rapd

.DOC
33
417
52

Mô tả:

MỞ ĐẦU Lúa là một trong những cây lương thực chính của hơn một nửa dân số trên thế giới (IRRI, 1994). Sản xuất lúa gạo chủ yếu tập trung ở các nước châu Á. Với điều kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam cũng là cái nôi của nền văn minh lúa nước. Đã từ lâu cây lúa trở thành cây lương thực chủ yếu, có ý nghĩa đáng kể trong nền kinh tế và xã hội nước ta. Năm 2003, sản lượng xuất khẩu gạo Việt Nam đạt 4,2 triệu tấn, tăng 11% so với năm 2000 [12]. Tuy nhiên, thực tế cho thấy có nhiều yếu tố làm giảm năng suất và chất lượng lúa gạo. Trong số đó, bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên là một trong những yếu tố hạn chế sự phát triển của lúa, bệnh có khả năng lây nhiễm mạnh và rất khó khống chế. Ở những nơi bệnh phát triển mạnh, năng suất lúa có thể giảm đến 60%. Để phòng trừ bệnh bạc lá vi khuẩn người ta thường sử dụng thuốc hoá học, song việc dùng thuốc gây độc hại cho người sử dụng và làm ô nhiễm môi trường. Hạn chế những độc hại trên thì việc gieo trồng các giống lúa kháng bệnh là có triển vọng nhất. Nhưng thực tế, giống kháng chỉ tồn tại vài năm trong sản xuất sau đó nông dân phải thay thế bằng giống mới hoặc phun thuốc diệt bệnh, vì nòi bệnh có độc tính cao hơn phát triển [10]. Để khắc phục được bệnh bạc lá vi khuẩn một cách hiệu quả, các nhà chọn giống đang sử dụng các giống kháng bệnh lai với các giống có năng suất, chất lượng cao nhằm thu được các giống vừa kháng bệnh, năng suất cao và có chất lượng tốt. Hiện nay, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã xác định được các giống lúa mang các gen kháng với các nòi khác nhau của bệnh bạc lá vi khuẩn. Đây là những nguồn gen quí trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh cũng như các trong nghiên cứu đa dạng di truyền [4], [10]. Trong những năm 90, kỹ thuật sinh học phân tử đã trở thành công cụ rất có hiệu quả trong phân tích đa dạng, bảo tồn và tiến hóa giống loài ở sinh vật. Nghiên cứu đa dạng trên đối tượng lúa là vấn đề được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm và kết quả là có rất nhiều công trình chỉ ra mức độ đa hình ở lúa khi sử dụng chỉ thị RAPD [14], [29] và RELP [18], [25]. Trong các loại chỉ thị, thì chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) đơn giản, ít tốn kém nên được sử dụng rộng rãi hơn các chỉ thị AFLP, RFLP, SSR. Sử dụng chỉ thị RAPD, các nhà khoa học có thể đánh giá và phân loại tập đoàn giống cây trồng một cách nhanh chóng và chính xác. Trên thực tế, chỉ thị RAPD cho kết quả đặc trưng đối với từng cá 1 thể và có thể ứng dụng chỉ thị này để phân tích tính đa hình ADN nhờ sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên. Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài: ‘‘Đánh giá đa dạng tập đoàn giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá vi khuẩn Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật RAPD” với mục tiêu: đánh giá đa dạng phân tử của 36 giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá vi khuẩn, nhằm phục vụ việc xác định bố mẹ trong nghiên cứu lập bản đồ và chọn tạo giống lúa kháng bệnh. 2 Ch¬ng 1. TæNG QUAN TµI LIÖU 1.1. giíi thiÖu vÒ c©y lóa C©y lóa thuéc hä hßa th¶o (Poaceae), th©n bôi, l¸ mÒm. Lóa trång thuéc chi Oryzae víi nhiÒu loµi kh¸c nhau. Trong sè 23 loµi ®· ®îc ph©n lo¹i th× chØ cã hai loµi lµ O. glaberrima vµ O. sativa ®îc trång cÊy. Loµi O. glaberrima ®îc trång chñ yÕu ë mét sè níc miÒn T©y ch©u Phi. Cßn loµi O. sativa cã ë kh¾p thÕ giíi vµ tËp trung phÇn lín ë ch©u ¸. Loµi O. sativa ®îc chia lµm 3 loµi phô: Indica, Japonica, Javanica. Lóa Indica ®îc trång ë c¸c vïng nhiÖt ®íi vµ cËn nhiÖt ®íi; Japonica ®îc trång chñ yÕu ë c¸c vïng «n ®íi vµ cËn «n ®íi; Javanica chØ ®îc trång ë mét vµi n¬i thuéc Indonesia (Khush, 1997). Loµi Oryza sativa cã sè nhiÔm s¾c thÓ lµ 2n = 24. T¸m trong sè 23 loµi lóa d¹i cã bé gen ë thÓ tø béi, cßn l¹i ®a sè c¸c lo¹i lóa d¹i vµ lóa trång hiÖn nay cã bé gen lµ thÓ lìng béi (Khush, 1997) [7], [21]. Lóa ph©n bè kh¾p thÕ giíi, tr¶i tõ vÜ ®é 55 0 B¾c thuéc Trung Quèc ®Õn 360 Nam thuéc Chi Lª. Theo FAO (1999) diÖn tÝch ®Êt canh t¸c lóa trªn toµn thÕ giíi kho¶ng 150 triÖu ha. Riªng Trung Quèc vµ Ên ®é chiÕm kho¶ng 50% diÖn tÝch trång lóa vµ 56% s¶n lîng lóa toµn cÇu. Ch©u Phi cã diÖn tÝch trång lóa gÇn b»ng diÖn tÝch trång lóa cña ViÖt Nam, nhng s¶n lîng lóa l¹i thÊp h¬n tõ 2 ®Õn 3 lÇn [2], [7]. 1.2. BÖnh b¹c l¸ vi khuÈn ë lóa (Xanthomonas oryzae) BÖnh b¹c l¸ (cßn gäi lµ bÖnh ch¸y b×a l¸) lµ mét trong nh÷ng bÖnh h¹i lóa nguy hiÓm do vi khuÈn Xanthomonas oryzae g©y nªn. lµ mét trong nh÷ng bÖnh h¹i lóa nguy hiÓm. BÖnh xuÊt hiÖn lÇn ®Çu tiªn ë NhËt B¶n n¨m 1884. N¨m 1960, bÖnh lan truyÒn sang, sau nguån bÖnh ®îc t×m thÊy ë c¸c vïng kh¸c ë ch©u Phi, Australia, Mü vµ mét sè níc Mü La Tinh. ë ViÖt Nam, bÖnh phæ biÕn ë tÊt c¶ c¸c vïng trång lóa trong c¶ níc, tõ vïng nói cao ®Õn ven biÓn. BÖnh cã thÓ lµm gi¶m n¨ng suÊt tõ 6 - 60%. BÖnh ph¸ h¹i trong c¶ vô §®«ng xu©n, hÌ HÌ thu vµ vô mMïa., ®Æc biÖt, bÖnh g©y h¹i nÆng trong c¸c th¸ng nhiÖt ®é cao. Ma b·o lµ ®iÒu kiÖn ®Ó bÖnh l©y lan vµ ph¸t triÓn m¹nh. Trong nh÷ng n¨m 1970 - 1975, bÖnh H×nh1: TriÖu chøng cña bÖnh b¹c l¸ lóa vi khuÈn do ph¸t triÓn vµ g©y thiÖt h¹i nÆng cho ë lóa ë kh¾p c¸c tØnh phÝa B¾c [2]. Xathomonas oryzae g©y ra 1.2.1. Vi khuÈn g©y bÖnh b¹c l¸ lóa (Xanthomonas aryzae) Vi khuÈn Xanthomonas oryzae cã h×nh gËy ng¾n, hai ®Çu trßn, lµ vi khuÈn Gram (-) vµ kh«ng h×nh thµnh bµo tö. C¸c tÕ bµo vi khuÈn ®îc bäc trong mµng nhÇy vµ liªn kÕt víi nhau thµnh mét khèi t¬ng ®èi v÷ng ch¾c ngay c¶ trong níc. Trªn m«i trêng nh©n t¹o, khuÈn l¹c cã mµu vµng nh¹t vµ cã thÓ sèng trong ph¹m vi pH 4,0 - 3 8,8. NhiÖt ®é thÝch hîp nhÊt cho vi khuÈn sinh trëng lµ 260C - 300C, nhiÖt ®é tèi thiÓu lµ 550C - 100C vµ nhiÖt ®é tèi ®a lµ 400C [9], [11]. Vi khuÈn x©m nhËp cã tÝnh chÊt thô ®éng vµ cã thÓ x©m nhiÔm qua thñy khæng, lç khÝ ë trªn mÐp l¸, ®Æc biÖt qua vÕt th¬ng x©y x¸t trªn l¸. Khi ®· tiÕp xóc víi bÒ mÆt cã mµng níc, vi khuÈn dÔ dµng di ®éng vµ x©m nhËp vµo bªn trong qua c¸c lç khÝ, qua vÕt th¬ng ®Ó nh©n lªn vÒ mÆt sè lîng, sau ®ã theo c¸c bã m¹ch dÉn lan réng ®i. Trong ®iÒu kiÖn ma Èm, trªn bÒ mÆt vÕt bÖnh sÏ tiÕt ra nh÷ng giät dÞch vi khuÈn vµ th«ng qua sù va ch¹m gi÷a c¸c l¸ lóa, bÖnh cã thÓ lan truyÒn tõ l¸ nµy sang l¸ kh¸c ®Ó tiÕn hµnh x©m nhiÔm lÆp l¹i nhiÒu lÇn trong thêi kú sinh trëng cña c©y lóa [6], [9]. HiÖn nay, cã rÊt nhiÒu nßi vi khuÈn g©y bÖnh b¹c l¸, ph©n bè ë nhiÒu níc trªn thÕ giíi. C¸c nhµ khoa häc cã thÓ ph©n lo¹i c¸c nßi X. oryzae theo tÝnh g©y bÖnh cña chóng. Nh×n chung, c¸c nßi vi khuÈn kh¸ kh¸c nhau vÒ tÝnh g©y bÖnh vµ trë nªn ®éc h¬n khi truyÒn lÆp ®i lÆp l¹i qua c¸c thÕ hÖ cña gièng kh¸ng bÖnh, nhng tÝnh g©y bÖnh vÉn kh«ng thay ®æi hoÆc gi¶m ®i khi x©m nhiÔm qua c¸c gièng lóa mÉn c¶m [11]. 1.2.2. TriÖu chøng cña bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn BÖnh b¹c l¸ vi khuÈn thêng ph¸t sinh díi d¹ng c¸c säc vµng kÐo dµi tõ mÐp l¸ c¸ch ®Ønh vµi cm. Trªn phiÕn l¸, vÕt bÖnh lan réng theo c¶ chiÒu dµi vµ réng, cã mÐp viÒn h×nh sãng råi trë nªn vµng sau vµi ngµy. Khi bÖnh tiÕn triÓn, vÕt bÖnh lan réng phñ kÝn c¶ mÆt l¸, chuyÓn tõ tr¾ng sang x¸m nh¹t do sù sinh trëng cña c¸c nÊm ho¹i sinh. §èi víi c¸c gièng c¶m nhiÔm, vÕt bÖnh lan réng tíi bÑ l¸ vµ cã thÓ ph¸t triÓn xuèng tËn phÇn díi cña bÑ l¸, lµm phiÕn l¸ bÞ hÐo vµ cuén l¹i trong khi l¸ vÉn cßn xanh, sau ®ã toµn bé phiÕn l¸ cã thÓ bÞ hÐo råi kh« ®i. ë c¸c ruéng lóa bÞ bÖnh nghiªm träng, h¹t còng cã thÓ bÞ nhiÔm bÖnh. Trªn vá h¹t xuÊt hiÖn c¸c ®èm mµu nh¹t, xung quanh cã mÐp viÒn d¹ng giät dÇu. Khi h¹t cßn non vµ xanh c¸c vÕt bÖnh lé râ, khi b«ng chÝn vÕt bÖnh sÏ cã mµu x¸m,, hoÆc tr¾ng hoÆc vµng nh¹t [6], [19]. 1.2.3. c¸c yÕu tè ¶nh hëng ®Õn sù ph¸t triÓn cña bÖnh Trong dù b¸o bÖnh b¹c l¸, yÕu tè khÝ hËu lµ ®èi tîng ®Ó ph©n tÝch. C¸c nhµ khoa häc ph¸t hiÖn thÊy r»ng møc ®é nhiÔm bÖnh t¬ng quan víi tæng lîng ma, møc ®é ngËp lôt, giã m¹nh vµ ®é s©u níc tíi. NhiÖt ®é t¬ng ®èi cao trong thêi kú lóa sinh trëng cã thÓ lµm t¨ng bÖnh, song mïa hÌ qu¸ nãng vµ kh« lµ ®iÒu kiÖn h¹n chÕ bÖnh. Kü thuËt trång trät còng lµ mét trong nh÷ng ®iÒu kiÖn quan träng ¶nh hëng ®Õn sù ph¸t sinh, ph¸t triÓn bÖnh, song còng rÊt phøc t¹p v× mét mÆt nã ¶nh hëng tíi sù ph¸t sinh ph¸t triÓn cña c©y lóa - lµm t¨ng hay lµm gi¶m tÝnh chèng chÞu, mÆt kh¸c nã ¶nh hëng tíi tiÓu khÝ hËu ®ång ruéng. Trong c¸c yÕu tè kü thuËt ch¨m sãc th× ph©n bãn cã ¶nh hëng râ rÖt nhÊt tíi sù ph¸t sinh, ph¸t triÓn cña bÖnh. Cô thÓ lµ bãn ®¹m qu¸ nhiÒu, bãn thóc muén, thiÕu l©n, kali vµ magie ®Òu lµm t¨ng bÖnh. ë nh÷ng n¬i ®Êt chua, óng ngËp ®Æc biÖt ë nh÷ng vïng ®Êt nhiÒu mïn, hµng lóa bÞ ch¾n n¾ng th× bÖnh b¹c l¸ cã thÓ ph¸t triÓn m¹nh h¬n [6]. 4 Trong tÊt c¶ c¸c giai ®o¹n sinh trëng, c©y ®Òu cã thÓ bÞ nhiÔm bÖnh nhng ë møc ®é kh¸c nhau tuú tõng giai ®o¹n sinh trëng. Nãi chung, tõ thêi k× m¹ ®Õn khi lóa ®Î nh¸nh lµ thêi kú bÖnh t¬ng ®èi Ýt h¬n so víi giai ®o¹n cuèi ®Î nh¸nh. Giai ®o¹n lóa lµm ®ßng - trç - chÝn s÷a lµ giai ®o¹n rÊt mÉn c¶m víi bÖnh, hiÖn tîng nµy thÓ hiÖn kh¸ râ nÐt trªn c¸c gièng lóa ng¾n ngµy, chÞu ph©n, cã n¨ng suÊt cao, cÊy trong vô Chiªm xu©n vµ vô Mïa [11]. 1.2.4. T¸c h¹i cña bÖnh b¹c l¸ lóa vi khuÈn BÖnh b¹c l¸ vi khuÈn ®· lµm gi¶m n¨ng suÊt lóa g¹o h»ng n¨m ë Ch©u ¸ xuèng 60%. VÝ dô ë NhËt nh÷ng n¨m gÇn ®©y, cã kho¶ng 300.000 - 400.000 hecta lóa bÞ ¶nh hëng bëi bÖnh nµy vµ n¨ng suÊt gi¶m 20 - 50%. ë nh÷ng c¸nh ®ång nhiÔm bÖnh ngiªm träng ë Indonesia, s¶n lîng lóa cßn thÊp h¬n so víi ë NhËt; cßn ë Ên ®é, hµng triÖu hecta lóa nhiÔm bÖnh nghiªm träng lµm cho n¨ng suÊt gi¶m tõ 6 - 60%. ë ViÖt Nam, bÖnh b¹c l¸ ®îc ph¸t hiÖn tõ l©u trªn c¸c gièng lóa mïa cò, ®Æc biÖt tõ n¨m 1965 trë l¹i ®©y bÖnh thêng xuyªn ph¸ ho¹i nghiªm träng ë c¸c vïng trång lóa [6], [19].th× sao? 1.2.5. C¸c biÖn ph¸p phßng trõ C¨n cø vµo ®Æc ®iÓm sinh häc cña vi khuÈn g©y bÖnh, c¸c nhµ khoa häc ®· ®a ra nh÷ng biÖn ph¸p phßng trõ tæng hîp nh: xö lý h¹t gièng tríc khi gieo nÕu l« h¹t bÞ nhiÔm bÖnh, bãn ph©n ®óng kü thuËt vµ ®óng giai ®o¹n, ruéng lóa cÇn ®iÒu chØnh møc níc thÝch hîp, chó ý vÖ sinh ®ång ruéng hoÆc cã thÓ sö dông thuèc hãa häc ®Ó h¹n chÕ sù ph¸t sinh, ph¸t triÓn cña bÖnh... [6]. Cho ®Õn nay, viÖc sö dông gièng chèng chÞu bÖnh vÉn lµ biÖn ph¸p cã hiÖu qu¶ nhÊt v× gi¶m ®îc chi phÝ do sö dông thuèc hãa häc vµ b¶o vÖ m«i trêng tèt h¬n. ChÝnh v× vËy, viÖc chän t¹o ra nh÷ng gièng lóa kh¸ng bÖnh b¹c l¸ lu«n lµ môc tiªu hµng ®Çu cña c¸c nhµ t¹o gièng trªn thÕ giíi còng nh ë ViÖt Nam [24], [30]. Cïng víi sù ph¸t triÓn cña khoa häc hiÖn ®¹i c¸c nhµ nghiªn cøu t×m thÊy kho¶ng 24 gen kh¸ng bÖnh b¹c l¸ ë nhiÒu loµi lóa hoang d¹i vµ c¸c gièng lóa ®Þa ph¬ng. Gen kh¸ng ®îc thèng nhÊt cã tªn lµ Xa + sè thø tù, vÝ dô nh Xa1, Xa2... Trong sè ®ã, Xa21 cã phæ kh¸ng réng vµ ®îc chó ý nhiÒu trong c«ng nghÖ chuyÓn gen hiÖn nay [20], [27]. 1.2.6. Mét sè thµnh tùu trong chän gièng lóa kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn Trong 50 n¨m gÇn ®©y, c¸c nhµ khoa häc ®· ph¸t triÓn nhiÒu kü thuËt thanh läc ng©n hµng gen ®èi víi tÝnh tr¹ng chèng chÞu vi khuÈn, c«n trïng g©y h¹i c©y trång, x¸c ®Þnh nguån cung cÊp gen kh¸ng. Víi ph¬ng ph¸p chän gièng truyÒn thèng, c¸c nhµ khoa häc ®· t¹o ra nhiÒu gièng c©y trång kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vµ ®îc gieo trång víi diÖn tÝch hµng triÖu ha. Vµ chän gièng ngoµi ®ång ruéng, kh¶o nghiÖm vµ t¹o c¸c gièng lóa chèng chÞu bÖnh tõ l©u ®· ® îc thùc hiÖn ë nhiÒu níc trªn thÕ giíi. Kh«ng hiÓu ý c©u nµy? 5 ë NhËt B¶n, gÇn ®©y c¸c nhµ khoa häc ®· chän ®îc nhiÒu gièng lóa kh¸ng bÖnh ®îc sö dông ®Ó lai t¹o ra c¸c gièng míi nh gièng Sengoku 4, Magatama, Zensho 26, Norin 27... Tuy nhiªn, kÕt qu¶ kiÓm tra ngoµi ®ång ruéng cho thÊy cha chän ®îc gièng cã tÝnh chèng chÞu cao víi c¸c nßi vi khuÈn g©y bÖnh b¹c l¸ míi ®îc gi¸m ®Þnh gÇn ®©y. N¨m 1968, Sakaguchi vµ CS ®· kh¶o nghiÖm 863 gièng lóa ®îc trång phæ biÕn ë nhiÒu n¬i trªn thÕ giíi vµ ph¸t hiÖn gièng lóa Lead cña MiÕn §iÖn, TKM6 vµ Nigeria 5 chèng chÞu kh¸ víi hÇu hÕt c¸c nhãm vi khuÈn g©y bÖnh b¹c l¸ thuéc c¸c nßi kh¸c nhau [9], [11]. ë viÖt Nam, ®· cã nhiÒu nghiªn cøu ®Ó chän t¹o gièng lóa mang gen kh¸ng bÖnh b¹c l¸. Nh ë ViÖn Lóa §ång b»ng s«ng Ccöu lLong, b»ng ph¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ kiÓu gen nhê chØ thÞ ph©n tö ®èi víi 148 gièng lóa ®Þa ph¬ng cã nguån gèc Duyªn h¶i Trung Bé cho thÊy c¸c gièng lóa: Cµ §ung, Ba Tóc, Th¬m Lung, VÖ PhÝch, Lóa Tr¾ng, NÕp Hoa Vµng, Lóa Thíc, Quinkes 85 vµ Seraup kechil 30 cã gen kh¸ng Xa13; gen kh¸ng Xa5 ®îc t×m thÊy trªn gièng Nµng Tri, Tr¾ng Lïn, Be Ren, Giµu Dumont; gièng Lóa Sãc, Lóa Mïa 2, Tr¾ng Qu·ng, Tr¾ng Phíc, Tµu H¬ng, Nµng SËu cã gen kh¸ng Xa4 [4]. 1.3. øng dông kü thuËt RAPD - PCR trong nghiªn cøu ®a h×nh ADN 1.3.1. Ph¶n øng PCR Kü thuËt nh©n b¶n ADN ®Æc hiÖu dùa vµo ph¶n øng chuçi trïng hîp (Polymerase Chain Reaction) ®îc Karry Mullis hoµn thiÖn vµo gi÷a nh÷ng n¨m 80 ®· gãp phÇn t¹o ra mét cuéc c¸ch m¹ng trong sinh häc ph©n tö. Kü thuËt PCR lµ mét ph¬ng ph¸p hoµn toµn míi trong viÖc nghiªn cøu vµ ph©n tÝch c¸c gen. Sö dông kü thuËt PCR cã thÓ t¹o ra mét sè lîng lín c¸c b¶n sao cña ®o¹n ADN cÇn tæng hîp mµ kh«ng ph¶i t¸ch vµ nh©n dßng. Thùc chÊt PCR lµ mét ph¬ng ph¸p in vitro vi tro cho phÐp nh©n b¶n nhanh mét ®o¹n ADN nµo ®ã mµ chØ cÇn mét khèi lîng mÉu ban ®Çu h¹n chÕ [8], [5]. Ph¶n øng PCR lµ mét chuçi ph¶n øng gåm nhiÒu chu kú lÆp l¹i, mçi chu kú gåm 3 giai ®o¹n: + Giai ®o¹n 1 (BiÕn biÕn tÝnh): ADN ®îc biÕn tÝnh ë nhiÖt ®é kho¶ng 950C trong thêi gian kho¶ng 1 phót, khi ®ã c¸c liªn kÕt hidro bÞ ®øt vµ sîi ADN kÐp t¸ch thµnh hai sîi ®¬n. + Giai ®o¹n 2 (Gg¾n måi): ë nhiÖt ®é tõ 300C ®Õn 650C trong kho¶ng 30 gi©y ®Õn 1 phót th× c¸c måi b¾t cÆp víi sîi ADN khu«n theo nguyªn t¾c bæ sung ë hai ®Çu ®o¹n ADN cÇn nh©n. NhiÖt ®é cña bíc g¾n måi tïy thuéc vµo tõng lo¹i måi cô thÓ, ®îc tÝnh to¸n dùa trªn nhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña ®o¹n måi [3], [5]. C«ng thøc tÝnh nhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña ®o¹n måi: Tm = 81,5 + 16,6(log10 {J+}) + 0,41(%G + C) - (600/I) - 0,63(%FA) Trong ®ã: {J+}: nång ®é cña c¸c cation hãa trÞ I FA: chÊt dïng ®Ó g©y biÕn tÝnh ADN I: chiÒu dµi cña måi 6 + Giai ®o¹n 3 (tæng hîp ADN): ë nhiÖt ®é kho¶ng 720C, trong kho¶ng thêi gian tõ 30 gi©y ®Õn nhiÒu phót (tuú thuéc vµo chiÒu dµi ®o¹n ADN cÇn tæng hîp), khi ®ã, enzym Taq polymerase ho¹t ®éng vµ qu¸ tr×nh tæng hîp ADN diÔn ra trªn nh÷ng ®o¹n gi÷a cÆp måi theo chiÒu tõ 5’- 3’. Mét chu kú gåm 3 bíc trªn ®îc lÆp ®i lÆp l¹i nhiÒu lÇn vµ qua mçi lÇn lµm t¨ng gÊp ®«i sè mÉu lÇn tríc. Sù t¨ng lîng mÉu nµy theo cÊp sè nh©n, nªn sau n chu k× sè mÉu thu ®îc lµ: A = x.2n Trong ®ã A: Tæng sè b¶n sao ADN x: Sè lîng ph©n tö ADN lµm khu«n ban ®Çu n: Sè chu kú C¸c thµnh phÇn c¬ b¶n cña mét ph¶n øng PCR gåm: ADN khu«n, hai ®o¹n måi ®Ó x¸c ®Þnh c¸c ®iÓm b¾t ®Çu tæng hîp ADN, Taq polymerase, hçn hîp bèn tiÒn chÊt deoxynucleotit, dung dÞch ®Öm chøa mét sè cation hãa trÞ 1, ion Mg 2+ vµ dung m«i (níc khö ion khö trïng). - Enzym Taq polymerase: Enzym Taq polymerase lµ enzym chÞu nhiÖt, ®îc t¸ch tõ vi khuÈn suèi níc nãng Thermus aquaticus. Enzym Taq cã träng lîng ph©n tö lµ 94 kDa vµ kh«ng mÊt ho¹t tÝnh ë nhiÖt ®é cao trong giai ®o¹n g©y biÕn tÝnh ADN, nhng ho¹t tÝnh cña enzym Taq gi¶m 50% sau 150 phót ë nhiÖt ®é 92,50C; sau 40 phót ë nhiÖt ®é 950C vµ sau 5 - 6 phót ë nhiÖt ®é 97 0C. NÕu nhiÖt ®é t¨ng lªn tíi 95 0C trong 20 gi©y ®Ó biÕn tÝnh ADN kÐp thµnh sîi ®¬n th× ho¹t tÝnh enzym Taq cßn l¹i 65% sau 50 chu k× ph¶n øng. Nång ®é enzym Taq tèi u cho ph¶n øng PCR lµ 0,5 - 2,5 ®¬n vÞ; nhng nÕu nång ®é enzym qu¸ cao sÏ lµm gi¶m hiÖu xuÊt xóc t¸c cña ph¶n øng. Ngoµi ra, nång ®é Mg2+ vµ dNTP còng ¶nh hëng ®Õn ho¹t tÝnh cña enzym. HiÖn nay, cã nhiÒu lo¹i polymerase chÞu nhiÖt kh¸c cã chøc n¨ng riªng biÖt vµ hoµn thiÖn h¬n nh Tth polymerase t¸ch chiÕt tõ Thermus thermophilus, cã kh¶ n¨ng ho¹t ®éng nh mét enzym phiªn m· ngîc khi cã mÆt cña ARN khu«n vµ ion Mn2+. - ADN khu«n (template): ADN khu«n lµ vËt liÖu khëi ®Çu cho ph¶n øng PCR nªn ®ßi hái ph¶i cã ®é tinh s¹ch cao. ADN khu«n cã thÓ lµ sîi ®¬n hoÆc sîi ®«i cña chuçi ADN hayARN ®îc biÕt tríc tr×nh tù ë hai ®Çu ®Ó thiÕt kÕ måi. Th«ng thêng, nång ®é cña ADN khu«n ®îc ®a vµo ph¶n øng PCR kho¶ng 10 - 500 ng. - §o¹n måi (primer): C¸c ®o¹n måi thùc chÊt lµ c¸c oligonucleotit dµi kho¶ng 4 - 10 baz¬ (®èi víi måi ngÉu nhiªn) hoÆc kho¶ng 12 - 24 baz¬ (®èi víi måi ®Æc trng). Nång ®é måi thÝch hîp ®Ó tiÕn hµnh ph¶n øng PCR lµ tõ 0,1 - 0,5 M. Lîng måi ®a vµo ph¶n øng PCR ph¶i phï hîp víi lîng ADN cÇn tæng hîp (thêng 106 ph©n tö ADN cÇn 108 7 ph©n tö primer). NÕu nång ®é måi qu¸ thÊp th× måi sÏ hÕt tríc khi sè chu k× kÕt thóc, cßn nång ®é måi qu¸ cao th× sÏ dÔ lµm t¨ng s¶n phÈm kh«ng ®Æc hiÖu. C¸c ®o¹n måi cÇn cã tÝnh ®Æc thï ®Ó lµm t¨ng tÝnh ®Æc hiÖu cña ph¶n øng. Måi ph¶i ®îc thiÕt kÕ sao cho kh«ng ®îc bæ trî lÉn nhau, sè lîng 4 lo¹i baz¬ nit¬ trong måi nªn xÊp xØ nhau, lîng G - C gi÷a hai måi ph¶i b»ng nhau, tr¸nh nh÷ng vïng tr×nh tù kh«ng b×nh thêng nh polypurin hoÆc polyprimidine hay c¸c tr×nh tù lÆp. - C¸c nucleotit (dNTPs): Lµ hçn hîp cña bèn lo¹i deoxyribonucleotit (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) lµm nguyªn liÖu cho ph¶n øng tæng hîp ADN. Tuú thuéc vµo môc ®Ých nghiªn cøu, c¸c nhµ khoa häc cßn cã thÓ sö dông mét sè nucleotit ®· ®îc thay ®æi nh g¾n thªm biotin hoÆc digoxigenin... Nång ®é ph¶n øng cña c¸c dNTP thêng dïng vµo kho¶ng 200 mM mçi lo¹i, tuy nhiªn ë nång ®é dNTP thÊp (10 - 100 mM) Taq ADN polymerase ho¹t ®éng chÝnh x¸c h¬n. H¬n n÷a, nång ®é tèi u cña chóng phô thuéc vµo rÊt nhiÒu yÕu tè nh: + Nång ®é Mg2+ + Nång ®é chÊt måi + §é dµi cña s¶n phÈm ®îc khuyÕch ®¹i + Sè chu kú cña ph¶n øng - Dung dÞch ®Öm (buffer) Thµnh phÇn cña dung dÞch ®Öm phô thuéc vµo lo¹i enzym polymerase ®îc sö dông. Trong dung dÞch ®Öm quan träng nhÊt lµ ion Mg 2+. Ion Mg2+ lµm t¨ng nhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña ADN m¹ch ®«i, t¹o ra phøc chÊt tan víi dNTPs ®Ó h×nh thµnh c¬ chÊt mµ enzym polymerase cã thÓ nhËn ra, ®iÒu nµy rÊt cÇn thiÕt cho qu¸ tr×nh liªn kÕt cña c¸c dNTP. Nång ®é Mg2+ trong hçn hîp ph¶n øng cuèi cïng biÕn ®æi tõ 0,5 - 5,0 mM (nång ®é nµy cã thÓ thay ®æi khi cÇn thiÕt). Nång ®é ion Mg 2+ qu¸ thÊp sÏ lµm gi¶m kh¶ n¨ng tæng hîp cña enzym polymerase, cßn nÕu nång ®é qu¸ cao sÏ t¹o ra nh÷ng ph©n ®o¹n kh«ng ®Æc hiÖu. Nh×n chung nång ®é MgCl2 cã ¶nh hëng nhiÒu tíi hiÖu qu¶ vµ tÝnh ®Æc thï cña ph¶n øng. Ngoµi Mg2+ cßn mét sè chÊt kh¸c trong dung dÞch ®Öm nh AMSO, DMSO, formamide ®îc thªm vµo nh c¸c chÊt phô gia nh»m t¹o ra c¸c s¶n phÈm PCR cã kÝnh thíc lín [3]. Kü thuËt PCR lµ mét c«ng cô h÷u hiÖu cho viÖc ph©n tÝch hÖ gen cña sinh vËt v× nã cã kh¶ n¨ng t¹o ra mét lîng lín tr×nh tù ANDN ®Æc hiÖu tõ bÊt cø c¬ thÓ nµo. PCR ®îc sö dông vµo nhiÒu môc ®Ých kh¸c nhau nh: x¸c ®Þnh tr×nh tù trùc tiÕp tõ ®o¹n ®îc nh©n, nh©n b¶n quÇn thÓ mARN ®Ó lµm mÉu lai, x¸c ®Þnh c¸c tr×nh tù ®Æc hiÖu tõ cADN hay th viÖn gen, x¸c ®Þnh sinh vËt chuyÓn gen, t¹o ®ét biÕn ®Þnh híng [1]. 1.3.2. Kü thuËt RAPD vµ øng dông 8 Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, nhiÒu kü thuËt míi ra ®êi dùa trªn nguyªn t¾c cña PCR cho phÐp ta x¸c ®Þnh ®îc tÝnh ®a d¹ng cña hÖ gen víi nhiÒu u ®iÓm nh kü thuËt AFLP, SSR, RFLP, RAPD..... - Kü thuËt AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) cho phÐp ta ph¸t hiÖn ®îc tÝnh ®a d¹ng vÒ chiÒu dµi c¸c ®o¹n ADN ®îc nh©n b¶n chän läc - c¾t ra bëi enzym giíi h¹n. Sö dông kü thuËt nµy cã thÓ nh©n cïng mét lóc mét c¸ch ®Æc trng víi sè lîng lín c¸c ®o¹n ADN cã kÝch thíc giíi h¹n. Kü thuËt AFLP kÕt hîp ®îc nh÷ng u ®iÓm cña RFLP vµ RAPD nªn nã cã hiÖu qu¶ trong viÖc ph¸t hiÖn ®a h×nh ADN. Ngoµi ra, kü thuËt nµy cã thÓ ph©n tÝch tÝnh ®a h×nh mét c¸ch nhanh chãng, æn ®Þnh vµ ®¸ng tin cËy [3]. - Kü thuËt RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphic ADN - ®a h×nh vÒ chiÒu dµi cña c¸c ®o¹n ADN ®îc c¾t ngÉu nhiªn bëi c¸c enzym giíi h¹n): Sö dông kü thuËt RFLP cã thÓ t¹o nªn c¸c ®o¹n c¾t kh¸c nhau ®îc ph©n biÖt b»ng ph¬ng ph¸p ®iÖn di. Nhîc ®iÓm cña kü thuËt nµy lµ quy tr×nh phøc t¹p, cång kÒnh, khã tù ®éng ho¸, tèn kÐm vµ sö dông chÊt ®ång vÞ phãng x¹ g©y nguy hiÓm cho ngêi thao t¸c [3], [8]. - Kü thuËt SSR (Simple Sequence Repeats) hay cßn gäi lµ vi vÖ tinh (microsatellites), lµ mét ®o¹n ADN cã sù lÆp l¹i cña mét trËt tù nucleotit ®¬n gi¶n nµo ®ã. Kü thuËt SSR cho phÐp ph¸t hiÖn ®îc tÝnh ®a h×nh vÒ ®é dµi c¸c trËt tù nucleotit ®¬n gi¶n. Nhîc ®iÓm cña kü thuËt SSR lµ tèn kÐm vÒ tiÒn cña, c«ng søc trong viÖc x©y dùng cÆp måi ®Æc hiÖu cho mçi locus ®a h×nh (®Ó x©y dùng c¸c cÆp måi ®Æc hiÖu cÇn t¸ch dßng vµ ®äc tr×nh tù mét sè lîng lín c¸c ®o¹n ADN hÖ gen chøa ®o¹n lÆp l¹i) [8], [3]. - Kü thuËt RAPD (cßn ®îc gäi lµ kü thuËt ph©n lo¹i ph©n tö): ®îc sö dông ®Ó ph©n tÝch vµ x¸c ®Þnh mèi quan hÖ th©n thuéc gi÷a c¸c gièng c©y trång hay gi÷a c¸c c¸ thÓ, phôc vô cho c«ng t¸c lai t¹o gièng hoÆc ph©n lo¹i. ¦u ®iÓm cña kü thuËt nµy lµ nhanh, rÎ, ®¬n gi¶n vµ gióp x¸c ®Þnh tÝnh ®a d¹ng sinh häc, nguån gèc di truyÒn cña c¸c gièng ®éng vËt, thùc vËt, vi sinh vËt. N¨m 1990, William vµ CS ®· ph¸t triÓn kü thuËt RAPD (Random Amplified Polymorphic ADN) trªn c¬ së PCR. VÒ c¬ b¶n, kü thuËt nµy sö dông nh÷ng ®o¹n måi ng¾n kho¶ng 4 - 10 nucleotit kh«ng ®Æc trng ®Ó tiÕn hµnh ph¶n øng PCR. Nhng ®èi víi mçi ®èi tîng, ta ph¶i tiÕn hµnh sµng läc ®Ó chän läc ®îc mét sè måi thÝch hîp [1]. S¶n phÈm PCR khi dïng víi måi ngÉu nhiªn thêng ®a d¹ng, cã chiÒu dµi tõ 100 - 5000 nucleotit vµ khi ®iÖn di trªn gel agarose ®îc ph©n t¸ch thµnh c¸c ph©n ®o¹n kh¸c nhau. TÝnh ®a d¹ng thu ®îc nhê kü thuËt RAPD lµ ®¸ng tin cËy v× khi cã sù thay ®æi mét baz¬ nit¬ nµo ®ã th× nã sÏ ng¨n c¶n sù tiÕp hîp cña måi víi ADN khu«n. sù mÊt ®o¹n nhiÔm s¾c thÓ hoÆc sù thªm bít ®iÓm g¾n måi còng nh sù xen vµo mét gen nµo ®ã sÏ lµm thay ®æi kÝch thíc cña ®o¹n ADN ®îc nh©n b¶n. mçi ®o¹n måi cã thÓ t¹o ra mét hoÆc mét vµi sù ®a d¹ng, cã thÓ ph¸t hiÖn ®îc vµ cho ra phæ ®iÖn di ®Æc trng. Kü thuËt RADP ®îc sù dông trong c¸c môc ®Ých nghiªn cøu ®a h×nh di truyÒn, lËp b¶n ®å gen liªn kÕt vµ ph©n tÝch con lai F1. 9 u ®iÓm cña kü thuËt RADP lµ kh«ng cÇn biÕt tr×nh tù ®o¹n ADN cÇn nghiªn cøu, quy tr×nh tiÕn hµnh nhanh, chØ cÇn mét lîng nhá ADN khu«n. Bªn c¹nh ®ã, chØ cÇn mét bé måi ta cã thÓ sö dông ®îc víi c¸c loµi kh¸c nhau trong khi c¸c mÉu dß RFLP chØ cã thÓ dïng ®îc cho c¸c loµi cã quan hÖ gÇn gòi nhau. TÝnh ®a d¹ng thu ®îc tõ c¸c chØ thÞ RAPD ®îc ®¸nh gi¸ cao h¬n so víi kü thuËt RFLP vµ cho phÐp ph¸t hiÖn ®îc tÝnh ®a d¹ng ngay c¶ trong c¸c ®o¹n chøa c¸c trËt tù nucleotit lÆp l¹i. Nhîc ®iÓm cña chØ thÞ nµy lµ: chØ thÞ RAPD cã tÝnh chÊt tréi do ®ã nh÷ng gen ®iÒu khiÓn tÝnh tr¹ng nµo ®ã cã tÝnh lÆn sÏ khã t×m thÊy sù ®a h×nh trªn gel ®iÖn di. H¬n n÷a, RAPD cã tÝnh chÊt ngÉu nhiªn nªn viÖc lÆp l¹i ph©n tÝch ®iÖn di ®Ó t×m liªn kÕt gen thêng kh«ng thèng nhÊt [3]. C¸c nghiªn cøu gÇn ®©y cho thÊy RAPD lµ mét kü thuËt cã hiÖu qu¶ trong viÖc x¸c dÞnh kiÓu gen, ph©n tÝch quÇn thÓ vµ nguån gèc loµi, nghiªn cøu di truyÒn loµi vµ lËp b¶n ®å di truyÒn. Kü thuËt RAPD ®îc sö dông ®Ó nhËn biÕt vµ ph©n lo¹i c¸c gièng c©y kh¸c nhau, sù ®a d¹ng di truyÒn gi÷a lóa Indica vµ Japonica, x¸c ®Þnh sù ®a h×nh cña c¸c c©y t¸i sinh cã nguån gèc m« sÑo, tÕ bµo huyÒn phï vµ tÕ bµo trÇn... Yang vµ Quiros ®· sö dông 28 ®o¹n måi cã ®é dµi 10 bp ®Ó nghiªn cøu sù kh¸c biÖt cña 23 gièng cÇn t©y vµ chóng ®îc chia thµnh 3 nhãm. KÕt qu¶ nµy còng phï hîp khi dïng 6 chØ thÞ protein ®Ó ph©n lo¹i c¸c gièng cÇn t©y trªn (Yang vµ Quiros, 1993). T¬ng tù nh vËy, nhiÒu t¸c gi¶ ®· dïng RAPD ®Ó lËp c©y chñng lo¹i ph¸t sinh (phylogenic tree) cña c¸c loµi c©y nh ng«, ®u ®ñ, hµnh t©y, xoµi, cá ®inh l¨ng…[26], [31]. Dùa trªn sù xuÊt hiÖn hay biÕn mÊt cña c¸c ph©n ®o¹n ADN khi ®iÖn di s¶n phÈm RAPD ®îc quan s¸t thÊy ë c¸c c¸ thÓ kh¸c nhau vµ ®îc ®¸nh gi¸ theo qui íc 1 = xuÊt hiÖn vµ 0 = biÕn mÊt. Mét b¶ng gåm c¸c gi¸ trÞ 0 vµ 1 ®îc thiÕt lËp tõ c¸c c¸ thÓ nghiªn cøu sÏ cho phÐp tÝnh ra hÖ sè t¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c cÆp theo Nei vµ Li. Trong qu¸ tr×nh thiÕt lËp mèi quan hÖ gi÷a c¸c loµi hay nhãm loµi, mét sè t¸c gi¶ (Apostol vµ CS, 1993) ®· x©y dùng kü thuËt ph©n nhãm th«ng qua c¸c biÓu ®å RAPD (RAPDLOT). Thùc chÊt kü thuËt nµy gåm 3 bíc: + Bíc 1: So s¸nh tõng cÆp ®èi tîng trong nghiªn cøu b»ng c¸ch tÝnh to¸n kho¶ng c¸ch quan hÖ gi÷a chóng + Bíc 2: LËp mét ma trËn gåm tÊt c¶ nh÷ng gi¸ trÞ tÝnh to¸n ®îc tríc ®ã + Bíc 3: Gi¶i ma trËn vµ biÔu diÔn thµnh mét biÓu ®å ®Æc trng [17] Ngµy nay, c¸c nhµ nghiªn cøu ®· thiÕt lËp ®îc phÇn mÒm m¸y tÝnh ®Ó tù ®éng vÏ nªn biÓu ®å mèi quan hÖ hay ®é t¬ng ®ång di truyÒn cña c¸c ®èi tîng nghiªn cøu sau khi nhËp d÷ liÖu vÒ c¸c ph©n ®o¹n ®îc nh©n b¶n cña c¸c c¸ thÓ. NTSYS pc version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) lµ tªn cña mét ch¬ng tr×nh thuéc kiÓu trªn ®Ó lËp ra biÓu ®å h×nh c©y. BiÓu ®å h×nh c©y thu ®îc sÏ thÓ hiÖn møc ®é gÇn nhau cña c¸c c¸ thÓ cho phÐp ®¸nh gi¸ ®îc mèi quan hÖ di truyÒn gi÷a c¸c c¸ thÓ ®îc nghiªn cøu. Ch¬ng tr×nh nµy cho phÐp gi¶m bít thêi gian nghiªn cøu 10 vµ cã ®é chÝnh x¸c cao nªn nã lµ mét phÇn mÒm cã hiÖu qu¶ trong viÖc ph©n tÝch kü thuËt RAPD. Ch¬ng 2. §èi tîng vµ ph¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.1. §èi tîng nghiªn cøu 2.1.1. §èi tîng nghiªn cøu §èi tîng nghiªn cøu tÝnh ®a d¹ng ADN lµ 36 gièng lóa cã nguån gèc, tÝnh kh¸ng kh¸c nhau víi kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn cã nguån gèc vµ tÝnh kh¸ng bÖnh kh¸c nhau do do Bé m«n Di truyÒn MiÔn dÞch, ViÖn Khoa häc Kkü thuËt Nn«ng nghiÖp ViÖt Nam cung cÊp (tr×nh bµy nh trong b¶ng 1, ®iÓm ®¸nh gi¸ tÝnh kh¸ngchØ míi d/nhiÔm cña c¸c gièng lóa chØ víi mét nßi vi khuÈn phæ biÕn ë vïng §ång b»ng s«ng Hång). B¶ng 1. Danh s¸ch tËp ®oµn gièng lóa kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn STT Tªn gièng Nguån gèc §iÓm STT Tªn gièng 1 OM3499-5 ViÖt Nam 4,0 19 IRRI346 2 OM3242-50 ViÖt Nam 5,0 20 3 OM3496-9 ViÖt Nam 5,0 4 NTCD1-12 ViÖt Nam 5 NTCD1-16 6 Nguån gèc §iÓm IRRI 7,70 MILYANG23 Hµn Quèc 7,0 21 MILYANG42 Hµn Quèc 3,0 5,0 22 SUWION290 Hµn Quèc 9,0 ViÖt Nam 5,0 23 BJ1 Ên ®é 7,70 T¸m tiªu ViÖt Nam 5,5 24 TÎ tÐp ViÖt Nam 7,70 7 T¸m Xu©n B¾c ViÖt Nam 5,5 25 BL89 ViÖt Nam 3,0 8 NÕp ®en ViÖt Nam 3,3 26 BL28 ViÖt Nam 3,0 9 ViÖt Nam 5,5 27 BL31-97 Ên ®é 1,0 10 NÕp c¸i hoa vµng NÕp sím ViÖt Nam 3,3 28 BBL72-99 Ên ®é 3,0 11 HT1 Trung Quèc 7,7 29 KBL75-99 Ên ®é 3,0 12 N87 §µi Loan 7,7 30 KBL53-99 Ên ®é 5,0 13 DV85 IRRI 1,0 31 Khang d©n Trung Quèc 57,0 11 14 IRRI1545 IRRI 3,0 32 Chiªm h¬ng Trung Quèc 9,0 15 IRRI20 IRRI 5,0 33 Q5 Trung Quèc 7,70 16 IRRI8 IRRI 5,0 34 D¤115 ViÖt Nam 57,0 17 KUNTLAN §µi Loan 57,0 35 KB1 ViÖt Nam 7,70 18 ZENITH §µi Loan 57,0 36 TN1 ViÖt Nam 7,70 Ghi chó 1: Kh¸ng cao 3: Kh¸ng 5: Kh¸ng võa 7: NhiÔm võa 9: NhiÔm nÆng 2.1.2. Ho¸ chÊt vµ thiÕt bÞ sö dông: - Ho¸ chÊt vµ thiÕt bÞ m¸y mãc: Ho¸ chÊt vµ thiÕt bÞ sö dông ®îc ghi kÌm tªn h·ng s¶n xuÊt cho tiÖn theo dâi: Taq ADN polymerase (Perkin-Elmer); M¸y tæng hîp oligonucleotit tù ®éng - Gene Assemble (Pharmacia, Thôy §iÓn); M¸y ®o quang phæ: Diode Array Spectrophotometer (Hewlett Parkard, Mü); M¸y ly t©m AvantiTM30 (Beckman, Mü)… - C¸c måi sö dông trong ph¶n øng RAPD: C¸c måi ngÉu nhiªn sö dông cho viÖc ph©n tÝch genom cña 36 gièng lóa kh¸ng bÖnh b¹c l¸ lóa vi khuÈn do Phßng C«ng nghÖ TÕ bµo Thùc vËt, ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc cung cÊp. Tr×nh tù c¸c måi dµi 10 nucleotit ®îc thiÕt kÕ theo Monna vµ CS (1994). B¶ng 2: Danh s¸ch 21 måi ngÉu nhiªn dïng trong ph©n tÝch tËp ®oµn 36 gièng lóa kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn. 1. Måi RA31 5’AACCGACGGG 3’ 12. Måi OPP19 5’GGGAAGGACA 3’ 2. Måi RA32 5’GGGGGTCGTT 3’ 13. Måi UBC391 5’GCGAACCTCG 3’ 3. Måi RA36 5’TACCACCCCG 3’ 14. Måi V8 5’GGACGGCGTT 3’ 4. Måi RA40 5’GGCGGACTGT 3’ 15. Måi Q14 5’GGACGCTTCA 3’ 5. Måi RA45 5’TACCACCCCG 3’ 16. Måi GN38 6. Måi RA46 5’CCAGACCCTG 3’ 17. Måi C19 5’GTTGCCAGCC 3’ 7. Måi RA50 5’ GCTGTGCAG 3’ 18. Måi O10 5’TCAGAGCGCC 3’ 8. Måi RA142 5’CAATCGCCGT 3’ 19. MåiO13 5’GTCAGAGTCC 3’ 9. Måi RA143 5’TCGGCGATAG 3’ 20. Måi O18 5’CTCGCTATCC 3’ 10. Måi RA159 5’GTCCACACGG 3’ 21. Måi I13 5’CTGGGGCTGA 3’ 11. Måi OPA13 5’CAG CAC CCAC 3’ M¸y ly t©m l¹nh (Sigma), m¸y PCR (Thermal Cycler PTC 100 h·ng MJ), m¸y ®iÖn di (Biorad), m¸y ®o quang phæ Model 8425A (Hewlett Packard), m¸y chôp ¶nh Gel Doc (Pharmacia)…. 2.2. Ph¬ng ph¸p nghiªn cøu 12 2.2.1. Kü thuËt t¹o c©y con vµ thu l¸ (theo ph¬ng ph¸p cña phßng C«ng nghÖ tÕ bµo thùc vËt)§inh ThÞ Phßng, (2001) [7].(LuËna C ChuÈn bÞ c©y m¹: H¹t lóa ®îc ng©m, ñ cho n¶y mÇm. C¸c mÇm m¹ cã ®é dµi 1,5 - 2,0 cm ®îc ®Æt vµo cèc nu«i c©y cã ®êng kÝnh 7 cm, cao 6 cm, díi ®¸y cèc cã lãt giÊy läc. Mçi cèc ®Æt 15 - 20 mÇm. Nu«i mÇm m¹ trong dung dÞch MS pha lo·ng 10 lÇn ë ®iÒu kiÖn ¸nh s¸ng b×nh thêng, hai ngµy thay dung dÞch mét lÇn. Khi c©y m¹ ®îc 3 - 5 l¸ thËt th× tiÕn hµnh thu l¸ ®Ó dïng ngay hoÆc b¶o qu¶n ë tñ l¹nh s©u 800C. Ta thu l¸ non v× l¸ non cã Ýt s¶n phÈm trao ®æi chÊt g©y trë ng¹i cho kh¶ n¨ng hoµ tan cña ADN thu ®îc. 2.2.2. T¸ch chiÕt ADN tæng sè tõ l¸ lóa Quy tr×nh t¸ch chiÕt ADN tæng sè tõ l¸ lóa theo ph¬ng ph¸p cña Egnin vµ CS (1998). a) Ho¸ chÊt sö dông Tris - HCl 1M, pH = 8,0; 5M NaCl; 0,5 EDTA; PVP; 5% SDS; RNase 10mg/ml; 3M CH3COONa, pH 5,3 hoÆc pH 7,0; TE (10mM Tris, pH = 8,0 + 1 mM EDTA, pH = 8,0); Isopropanol: Phenol: Chlorofom: Isoamin (25:24:1); cån 80%. b) Pha ®Öm t¸ch chiÕt ADN B¶ng 3. Nång ®é cña ho¸ chÊt t¸ch ADN tæng sè. Nång ®é dung dÞch stock chuÈn Nång ®é cÇn pha Trong 50ml 1M Tris-HCl, pH = 8,0 50 mM 2,5 ml 5M NaCl 300 mM 3 ml 0,5M EDTA 20 mM 2 ml Polyvinylpyrrolidone 2% 1g 10% Sodium Ascorbate 0,1% 0,5 ml 20% Saccosine 1,5% 3,75 ml Sodium Metabisulfite 1% 0,5 g H2O cÊt khö ion v« trïng 38,5 ml c) Quy tr×nh t¸ch chiÕt ADN tæng sè tõ l¸ lóa - Thu 0,1 - 0,2 g l¸ lóa non, nghiÒn nhanh trong nit¬ láng b»ng cèi chµy sø cho ®Õn khi mÉu cã d¹ng bét mÞn. NghiÒn trong nit¬ láng ®¶m b¶o mÉu ®îc nghiÒn triÖt ®Ó, ADN thu ®îc cã d¹ng søa, cã ph©n tö lîng cao, kh«ng ®øt ®o¹n. 13 - Thªm 0,8 - 1,0 ml dung dÞch ®Öm t¸ch ADN vµo mÉu l¸ ®· nghiÒn, trén ®Òu b»ng c¸ch ®¶o ngîc nhÑ. - Gi÷ trong ®¸ 5 phót, thªm 0,8 - 1,0 ml dung dÞch Phenol: Chlorofom: Isoamin = 25: 24: 1, ®¶o ®Òu cho ®Õn khi dung dÞch cã mµu tr¾ng s÷a, ñ trong ®¸ 5 phót. - Ly t©m víi tèc ®é 13.000 vßng/phót ë 40C trong 15 phót. - ChuyÓn 0,8 ml dÞch næi phÝa trªn sang èng eppendorf míi ®· cã s½n 0,8 ml dung dÞch isopropanol l¹nh. - §¶o ®Òu, gi÷ ë nhiÖt ®é 40C trong 10 - 30 phót. - Ly t©m 10.000 vßng/phót ë 40C trong 5 phót. - Lo¹i bá phÇn dÞch næi phÝa trªn, lµm kh« phÇn kÕt tña b»ng m¸y Speed - Vac. - Hoµ tan phÇn kÕt tña trong 150 l ®Öm TE, ®Ó qua ®ªm ë 40C cho ADN tan hÕt. - Thªm 1,5 l RNase, trén ®Òu vµ ñ ë 370C trong 30 phót . - Ly t©m 13.000 vßng/phót, chuyÓn dÞch ë phÝa trªn sang mét èng eppendorf 1,5 ml míi, bíc chuyÓn ph¶i nhÑ nhµng tr¸nh khuÊy cÆn. - Thªm 20 l CH3COONa 3M, l¾c ®Òu, thªm 400 l Isopropanol ®Ó tña l¹i. - Ly t©m 10.000 vßng/phót trong 5 phót ë 40C, lo¹i bá dÞch næi vµ thªm 0,5 ml cån 70%. - Ly t©m 13.000 vßng/phót, bá phÇn dÞch næi vµ lµm kh« b»ng m¸y Speed - Vac. - Hoµ tan l¹i ADN trong 100 l TE, ®Ó qua ®ªm ë 40C. - B¶o qu¶n ADN ë - 200C. 2.2.3. Ph¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm lîng vµ ®é s¹ch cña ADN a) §iÖn di trªn gel agarose - Pha agarose 0,8% trong TAE 1X, ®un nãng, ®Ó nhiÖt ®é h¹ xuèng kho¶ng 60 0C, ®æ vµo khu«n gel cã cµi lîc. - Sau 30 phót rót lîc ra, ®æ ®Öm ch¹y ®iÖn di TAE 1X ngËp b¶n gel 1- 2 mm. - LÊy 2 l ADN mÉu + 1 l thuèc nhuém + 7 l H2O trén ®Òu, dïng pipet tra hçn hîp mÉu vµo giÕng. - Ch¹y ®iÖn di ë 80V trong 30 phót. - Nhuém gel: b¶n gel ch¹y xong ®îc nhuém trong Ethidium bromide 0,5 g/ml trong 10 phót, röa s¹ch b»ng níc. - Soi gel trªn ®Ìn UV vµ chôp ¶nh. b) §o b»ng m¸y ®o quang phæ hÊp thô §o trªn m¸y ®o quang phæ cã ch¬ng tr×nh xö lý trªn m¸y vi tÝnh 14 - §o mÉu ë bíc sãng  = 260 nm. - §o mÉu ë bíc sãng  = 280 nm. - ChØnh c©n b»ng m¸y: dïng níc khö ion v« trïng ®Ó lµm chuÈn. - KiÓm tra m¸y: ®o mét mÉu ADN cã nång ®é chuÈn ®· biÕt tríc (ADN cña thùc khuÈn thÓ ). - §o mÉu: pha lo·ng 200 lÇn theo c«ng thøc: lÊy 995 l níc cÊt + 5 l ADN mÉu vµo cuvet l¾c ®Òu, ®Æt vµo m¸y ®o. - Sau mçi lÇn ®o ph¶i röa s¹ch cuvet b»ng níc cÊt. - In kÕt qu¶ ®o ®îc. - Tõ ®ã, ta tÝnh ®îc hµm lîng vµ ®é s¹ch cña ADN + Hµm lîng ADN (ng/l) = 50 x HSPL x OD260 + §é s¹ch ADN = OD260/ OD280 Trong ®ã HSPL: hÖ sè pha lo·ng 50: h»ng sè OD260: chØ sè ®o ®îc ë bíc sãng 260 nm. OD280: chØ sè ®o ®îc ë bíc sãng 280 nm. NÕu ®é s¹ch ADN = 1,8 - 2,0 th× mÉu ®îc coi lµ s¹ch. 2.2.4. Ph©n tÝch sè liÖu RAPD a) §o¹n måi §o¹n måi ngÉu nhiªn sö dông cho viÖc ph©n tÝch genome cña lóa trong nghiªn cøu nµy gåm 21 måi Operon. C¸c ®o¹n måi cã kÝ hiÖu vµ tr×nh tù lµ: B¶ng 2: Danh s¸ch 21 måi Operon dïng trong ph©n tÝch tËp ®oµn 36 gièng lóa kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn. 15 1. Måi RA31 2. Måi RA32 5’AACCGACGGG 3’ 12. Måi OPP19 5’GGGGGTCGTT 3’ 3’ 3. Måi RA36 5’TACCACCCCG 3’ 4. Måi RA40 5’GGCGGACTGT 3’ 5. Måi RA45 5’TACCACCCCG 3’ 6. Måi RA46 5’CCAGACCCTG 3’ 7. Måi RA50 5’GGGAAGGACA 13. Måi UBC391 3’ 5’GCGAACCTCG 14. Måi V8 3’ 5’GGACGGCGTT 5’GGACGCTTCA 5’ GCTGTGCAG 3’ 15. Måi Q14 3’ 8. Måi RA142 5’CAATCGCCGT 3’ 16. Måi GrN38 9. Måi RA143 5’TCGGCGATAG 3’ 5’GTTGCCAGCC 10. Måi RA159 5’GTCCACACGG 3’ 17. Måi C19 3’ 18. Måi O10 3’ 5’TCAGAGCGCC 19. MåiO13 3’ 5’GTCAGAGTCC 20. Måi O18 5’CTCGCTATCC 3’ 21. Måi I13 3’ 5’CTGGGGCTGA 11. Måi OPA13 ba) Ph¶n øng PCR - RAPD - Mçi èng ph¶n øng PCR cã 25 l dung dÞch chøa 1X ®Öm PCR; 2,5 mM MgCl 2; 100 l 4dNTPs; 200 nM ®o¹n måi; 0,125 ®¬n vÞ Taq polymerase vµ 10 - 100 ng ADN khu«n. - Trén ®Òu hçn hîp thu ®îc (thao t¸c trong ®¸ ®Ó ®¶m b¶o c¸c hãa chÊt kh«ng bÞ mÊt ho¹t tÝnh). - TiÕn hµnh nh©n b¶n trong m¸y PCR - Thermal Cycler PTC 100 theo chu tr×nh: + Bíc 1: 940C trong 1 phót + Bíc 2: 920C trong 1 phót + Bíc 3: 350C trong 1 phót + Bíc 4: 720C trong 1 phót + Bíc 5: 720C trong 10 phót + Bíc 6: gi÷ ë 40C Bíc 2 - bíc 4 lÆp l¹i 45 chu k× 16 c) §iÖn di s¶n phÈm RAPD Pha agarose 1,8% trong TAE 1X ®un nãng, ®Ó nguéi kho¶ng 60 0C th× ®æ vµo khu«n gel cã cµi lîc, sau 30 phót th× rót lîc ra, ®æ ®Öm ch¹y ®iÖn di TAE 1X ngËp b¶n gel 1 mm. LÊy 3 l thuèc nhuém cho vµo mçi èng s¶n phÈm, trén dÒu. Dïng pipet trén ®Òu, cho hçn hîp vµo giÕng vµ ch¹y ®iÖn di: 100V trong 120 phót. Nhuém gel b»ng Ethidium bromide 0,5 g/ml trong 15 phót, röa s¹ch b»ng níc, soi gel trªn dÌn UV vµ chôp ¶nh. cb) Ph©n tÝch sè liÖu RAPD Tiªu chuÈn ho¸ s¶n phÈm RAPD theo quy íc: Sè 1: xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN. Sè 0: kh«ng xuÊt hiÖn ph©n ®o¹n ADN. Ph©n tÝch sè liÖu theo qui íc: 1 = ph©n ®o¹n ADN xuÊt hiÖn vµ 0 = ph©n ®o¹n ADN kh«ng xuÊt hiÖn, khi ®iÖn di s¶n phÈm RAPD víi c¸c ®o¹n måi ngÉu nhiªn. X¸c ®Þnh hÖ sè di truyÒn gièng nhau theo 3 ph¬ng ph¸p [23]: + Theo Nei vµ Li, 1979 (hÖ sè Dice) Sij  2a 2a  b  c + Theo Jaccard, 1908 (hÖ sè Jaccard) Sij  a abc + Theo Sokal vµ Michener, 1958 (hÖ sè Simple Matching: SM) Sij  ad abcd Trong ®ã Sij: hÖ sè gièng nhau gi÷a hai c¸ thÓ i vµ j a: sè ph©n ®o¹n ADN xuÊt hiÖn ë c¶ c¸ thÓ i vµ j b: sè ph©n ®o¹n ADN xuÊt hiÖn ë i vµ kh«ng xuÊt hiÖn ë j c: sè ph©n ®o¹n ADN xuÊt hiÖn ë j vµ kh«ng xuÊt hiÖn ë i d: sè ph©n ®o¹n ADN xuÊt hiÖn ë c¸ thÓ i vµ j So s¸nh hÖ sè t¬ng quan kiÓu h×nh theo 3 ph¬ng ph¸p: SM, Dice, Jaccard vµ 4 ph¬ng ph¸p ph©n nhãm UPGMA (Ph©n tÝch c¸c nhãm ph©n tö kh«ng cïng trong lîng, WPGMA (Ph©n tÝch c¸c nhãm ph©n tö cã cïng träng lîng), liªn kÕt hoµn toµn, liªn kÕt ®¬n lÎ. LËp biÓu ®å h×nh c©y dùa vµo gi¸ trÞ t¬ng quan kiÓu h×nh (r) cao nhÊt trong ch¬ng tr×nh NTSYS 2.1 [15], [23]. Hµm lîng th«ng tin tÝnh ®a h×nh (Polymorphism information content = PIC) cña mçi måi x¸c ®Þnh theo c«ng thøc PIC = 1- Pi2, trong ®ã Pi lµ tÇn sè cña allen i cña kiÓu gen ®îc kiÓm tra. Ph¹m vi gi¸ trÞ PIC tõ 0 (kh«ng ®a h×nh) tíi 1 (®a h×nh hoµn toµn) [13]. 17 §Ó kh¼ng ®Þnh kÕt qu¶ ph©n nhãm theo s¬ ®å h×nh c©y, chóng t«i biÓu diÔn kÕt qu¶ theo ph¬ng ph¸p so s¸nh ®a chiÒu (MDS = multidimensional scaling, Kruskal & Wish, 1978) vµ biÓu ®å ph©n tÝch theo to¹ ®é chÝnh (PCA = principal co ordinate analysis, Hauser & Crovello, 1982) [16], [29]. Ch¬ng 3. KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN 3.1. KÕt qu¶ t¸ch chiÕt ADN tæng sè §Ó thùc hiÖn ®îc ph¶n øng RAPD th× ADN ph¶i s¹ch, kh«ng ®øt gÉy, ®ã lµ ®iÒu kiÖn ®Çu tiªn cho sù thµnh c«ng cña qu¸ tr×nh nghiªn cøu. KÕt qu¶ kiÓm tra cho thÊy chÊt lîng vµ nång ®é ADN cña c¸c mÉu thu ®îc ®Òu s¹ch. Cô thÓ lµ ®iÖn di trªn gen agarose cho thÊy ADN tËp trung ë mét b¨ng chÝnh, kh«ng ®øt gÉy (h×nh 2) vµ khi ®o OD ë bíc sãng 260 nm - 280 nm th× phæ hÊp phô chØ cã mét ®Ønh hÊp phô duy nhÊt lµ 260 nm (h×nh 3). C¸c mÉu ADN thu ®îc dÒu cã ®é tinh s¹ch cao cô thÓ lµ chØ sè tû lÖ OD 260/ OD280 thÊp nhÊt lµ 1,80 cña gièng BL28; cao nhÊt lµ 1,95 cña gièng IRRI20 (b¶ng 4). Nh vËy kÕt qu¶ t¸ch chiÕt cña chóng t«i ®¹t ®ñ tiªu chuÈn ®Ó tiÕn hµnh c¸c thÝ nghiÖm tiÕp theo. B¶ng 4: Hµm lîng vµ ®é tinh s¹ch cña tËp ®oµn 36 gièng cã tÝnh kh¸ng kh¸c nhau víi bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn. Tªn mÉu OM 3499-5 Hµm lîng ADN(g/ml) §é tinh s¹ch ADNTØ sè 1025,90 1,82 Tªn mÉu IRRI 346 Hµm lîng ADN (g/ml) TØ sè OD 260/280§é tinh s¹ch 810,00 1,81 18 MILYANG 23 MILYANG OM 3242-50 673,30 1,87 519,30 1,85 OM 3496-9 1086,00 1,86 NTCD 1-12 1850,40 1,82 NTCD 1-16 1325,40 1,85 42 SUWION 290 BJ1 1035,80 1,87 462,30 1,84 891,00 1,82 T¸m tiªu 375,50 1,91 TÎ tÐp 2101,30 1,90 T¸m xu©n b¾c 850,00 1,89 BL 89 4251,30 1,85 NÕp ®en NÕp c¸i hoa vµng vµng NÕp sím 454,80 1,90 BL 28 1935,60 1,80 1502,70 1,83 BL 31-97 1201,20 1,85 2279,50 1,89 BBL 72-99 1209,70 1,81 HT 1 786,30 1,81 KBL 75-99 400,10 1,91 N 87 506,40 1,82 KBL 53-99 920,50 1,89 DV85 882,60 1,81 Khang d©n 1502,40 1,86 IRRI 1545 618,30 1,83 Chiªm h¬ng 1091,80 1,90 IRRI 20 1500,20 1,95 Q5 2341,20 1,87 IRRI 8 2145,20 1,86 D¤115 989,40 1,83 KUNTLAN 1045,30 1,87 KB 1 908,40 1,80 7 1978,10 1,87 ZENITH (25ng) 4912,10 1 2 1,92 3 4 TN 5 1 6 H×nh 2: KÕt qu¶ ®iÖn di kiÓm tra ADN tæng sè t¸ch tõ c¸c gièng lóa nghiªn cøu 19 H×nh 3: Phæ hÊp phô ADN cña c¸c gièng lóa nghiªn cøu ®o ë bíc sãng 260 nm - 280 nm 3.2. Ph©n tÝch ®a h×nh ADN b»ng kü thuËt RAPD Trong nghiªn cøu nµy chóng t«i sö dông 21 måi ngÉu nhiªn (ký hiÖu RA31, RA32, RA36, RA40, RA45, RA46, RA50, RA142, RA143, RA159, OPA13, OPP19, UBC391, V8, Q14, GN38, C19, O-10, O-13, O-18, I13) cã ®é dµi 10 nucleotit (do phßng C«ng nghÖ TÕ bµo Thùc vËt cung cÊp) ®Ó ph©n tÝch hÖ sè kh¸c nhau vÒ di truyÒn cña 36 gièng lóa cã tÝnh kh¸ng kh¸c nhau víi bÖnh b¹c l¸ vi khuÈn. KÕt qu¶ ë b¶ng 5 cho thÊy tæng sè cã 392 allen ®îc nh©n b¶n. Sè lîng c¸c allen ®îc nh©n b¶n víi mçi måi xª dÞch tõ 9 (RA45) ®Õn 28 (O-18), kÝch thíc nh©n b¶n tõ 0,23 kb ®Õn 3 kb trong ph¹m vi quan s¸t. TÝnh ®a h×nh cña c¸c måi RAPD ®îc ®¸nh gi¸ th«ng qua gi¸ trÞ PIC (polymorphism information content) - Gi¸ trÞ PIC cµng lín th× tÝnh ®a h×nh cµng cao vµ ngîc l¹i. Tõ b¶ng 5 thÊy gi¸ trÞ PIC di dao ®éng tõ 0,2538 25 (RA143, OPA13) ®Õn 0,5809 58 (RA36). Trong ®ã, 3/21 cÆp måi RAPD (RA36, RA45, O-18) cho tÝnh ®a h×nh cao víi gi¸ trÞ PIC  0,5. Tæng sè thu ®îc 392 allen ®· ®îc nh©n b¶n, trung b×nh sè allen lµ 18,67/locut. Sè lîng c¸c ph©n ®o¹n ADN ®îc nh©n b¶n víi mçi cÆp måi xª dÞch tõ 9 (RA45) ®Õn 28 (O18) trong ph¹m vi quan s¸t (b¶ng 4). KÝch thíc cña c¸c ph©n ®o¹n ADN nh©n b¶n tõ 0,23 Kb ®Õn 3 Kb. B¶ng 5: Hµm lîng th«ng tin tÝnh ®a h×nh (PIC) cña tËp ®oµn 36 gièng lóa nghiªncøu STT Tªn måi SP§ ADN KÝch thíc ®o¹n ADN (kb) PIC STT Tªn måi SP§ ADN KÝch thíc ®o¹n ADN (kb) PIC 1 RA31 27 0,24 - 1,90 0,31 12 OPP19 25 0,24 - 2,90 0,290 2 RA32 16 0,30 - 2,40 0,312 13 UBC391 15 3 RA36 16 0,30 - 1,70 0,581 14 V8 16 4 RA40 14 0,25 - 2,00 0,372 15 Q14 17 5 RA45 9 0,40 - 2,10 0,500 16 GrN38 22 6 RA46 14 0,35 - 1,75 0,465 17 C19 18 7 RA50 23 0,37 - 2,10 0,331 18 O10 22 8 RA142 21 0,28 - 1,90 0,37 19 O13 16 0,20 - 1,40 0,3283 3 0,40 - 2,20 0,3863 9 0,35 - 1,70 0,4224 2 0,28 - 1,60 0,3083 1 0,60 - 3,00 0,3753 8 0,25 - 1,65 0,4044 0 0,23 - 1,80 0,35 9 RA143 16 0,25 - 1,70 0,254 20 O18 28 10 RA159 19 0,24 - 2,40 0,3183 2 21 I13 17 0,40 - 3,00 0,5295 4 0,30 - 1,90 0,4364 4 20
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan