Tài liệu đặc điểm thành thục sinh dục và ứng dụng hormon steroid trong sinh sản nhân tạo cá rô biển pristolepis fasciata bleeker, 1851) [tt]

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ PHAN PHƢƠNG LOAN ĐẶC ĐIỂM THÀNH THỤC SINH DỤC VÀ ỨNG DỤNG HORMON STEROID TRONG SINH SẢN NHÂN TẠO CÁ RÔ BIỂN Pristolepis fasciata (Bleeker, 1851) Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản Mã số: 62620301 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN 2016 i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ PHAN PHƢƠNG LOAN ĐẶC ĐIỂM THÀNH THỤC SINH DỤC VÀ ỨNG DỤNG HORMON STEROID TRONG SINH SẢN NHÂN TẠO CÁ RÔ BIỂN Pristolepis fasciata (Bleeker, 1851) Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản Mã số: 62620301 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. Phạm Thanh Liêm TS. Bùi Minh Tâm 2016 ii Công trình được hoàn thành tại: Khoa Thủy Sản, Trƣờng Đại học Cần Thơ Người hướng dẫn khoa học: TS. Phạm Thanh Liêm TS. Bùi Minh Tâm Phản biện 1:…………………………………………………………... Phản biện 2:…………………………………………………………... Phản biện 3:…………………………………………………………... Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường Họp tại………………………………………………………………... Vào ……..giờ………, ngày………tháng……..năm………………. Có thể tìm luận án tại: 1. Trung tâm học liệu Trƣờng Đại học Cần Thơ 2. Thƣ viện Quốc gia iii Chƣơng 1. TỔNG QUAN VỀ LUẬN ÁN 1.1 Giới thiệu Cá rô biển Pristolepis fasciata (Bleeker, 1851) là loài cá bản địa đặc trưng của miền Nam, Việt Nam. Đây là loài rộng muối, phân bố cả trong nước ngọt và lợ. Cá rô biển có phẩm chất thịt ngon và không có xương giăm nên được người dân Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) ưa thích. Trong vài năm gần đây đối tượng này trở nên khan hiếm do tình trạng lạm thác nên sản lượng đánh bắt không đủ đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng. Giá bán hiện tại trên thị trường của cá rô biển khá cao, từ 120.000150.000 đồng/kg ở kích cỡ 10-12 con/kg (Phan Phương Loan, 2014). Chính vì vậy, cá rô biển sẽ là đối tượng rất có tiềm năng để phát triển nuôi trong các hệ thống nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL cũng như khắp cả nước. Để có thể đưa cá rô biển trở thành đối tượng nuôi quan trọng trong tương lai thì việc sản xuất ra con giống nhân tạo đủ về số lượng và tốt về chất lượng là yêu cầu đầu tiên. Hiện nay, các công trình nghiên cứu về cá rô biển được công bố còn rất hạn chế. Để phát triển nuôi cá rô biển trong tương lai thì cần có nhiều nghiên cứu sâu hơn về đặc điểm sinh học, đặc biệt về sinh lý sinh sản, về các biện pháp thuần dưỡng, nuôi vỗ cá bố mẹ, kích thích sinh sản nhân tạo, ương giống,… Trong nghiên cứu và thực tế sinh sản nhân tạo các loài cá ở Việt Nam nói chung và ĐBSCL nói riêng, các chất kích thích sinh sản có nguồn gốc tự nhiên như kích dục tố trong não thùy thể cá và chế phẩm HCG (Human Chorionic Gonadotropin) hoặc những chất được tổng hợp từ công nghệ sinh học như LHRHa (Luteinizing Hormone-Releasing Hormone analogue) thường được sử dụng (Nguyễn Tường Anh, 1997). Ngoài những chất kích thích sinh sản trên, một số nghiên cứu sinh sản nhân tạo trong và ngoài nước trên cá cho thấy các hormon steroid C21 như progesteron (P), 17 - hydroxyprogesteron (17P) và 17α, 20β-dihydroxy progesteron (17,20P) có hiệu quả gây chín và rụng trứng ở quy mô thí nghiệm in vitro hoặc sản xuất (Nguyễn Tường Anh, 1999a). Để có cơ sở khoa học nhằm đưa các hormon steroid vào thực tiễn sản xuất thì việc so sánh và đánh giá tác dụng gây chín và rụng trứng của chúng so với các chất kích thích sinh sản thường được sử dụng hiện nay trên một đối tượng cụ thể là cần thiết. Điều này cũng nhằm đa dạng hoá chất kích thích sinh sản trong sản xuất giống nhân tạo cá nói chung và cá rô biển nói riêng. Với các lý do trên, đề tài “Đặc điểm thành thục sinh dục và ứng dụng hormon steroid trong sinh sản nhân tạo cá rô biển Pristolepis fasciata (Bleeker, 1851)” được thực hiện. 1 1.2 Mục tiêu tổng quát của luận án Bổ sung dữ liệu khoa học về các đặc điểm sinh học của cá rô biển, về khả năng gây chín và rụng trứng của hormon steroid trên cá rô biển, cung cấp cơ sở lý luận nhằm phát triển quy trình sản xuất giống nhân tạo và nuôi thương phẩm cá rô biển; từ đó góp phần đa dạng hóa đối tượng cá nuôi cho vùng Đồng bằng sông Cửu Long nói riêng và cả nước nói chung. 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Về mặt khoa học, luận án cung cấp các kiến thức cơ bản về các đặc điểm sinh học sinh sản của cá rô biển, cung cấp những số liệu khoa học về ảnh hưởng của các loại thức ăn đến sự thành thục sinh dục của cá khi được thuần dưỡng và nuôi trong ao đất. Đặc biệt, các nghiên cứu trong luận án đã tìm ra được phương thức sử dụng hormon steroid trong sinh sản nhân tạo cá rô biển. Bên cạnh đó, với kết quả nghiên cứu về sự phát triển ống tiêu hoá sẽ góp phần nâng cao tỷ lệ sống của ấu trùng cá trong quá trình ương giống. Những kết luận của luận án sẽ là nguồn dữ liệu khoa học quan trọng góp phần hoàn thiện quy trình sản xuất giống nhân tạo cá rô biển, tạo ra khả năng cung cấp con giống và góp phần đưa cá rô biển thành một đối tượng nuôi mới đầy tiềm năng và hiệu quả kinh tế. 1.4 Những điểm mới của luận án Kết quả nghiên cứu của luận án đã có những đóng góp mới về lý thuyết và ứng dụng trong sản xuất. - Cung cấp các dẫn liệu mới về các đặc điểm sinh học sinh sản của cá rô biển như kích thước thành thục lần đầu, đặc điểm phát triển tuyến sinh dục, hệ số thành thục, sức sinh sản, mùa vụ sinh sản của cá. Những dẫn liệu này làm cơ sở khoa học cho việc xây dựng giải pháp bảo vệ nguồn lợi, thuần dưỡng và góp phần xây dựng quy trình sản xuất giống nhân tạo đối tượng này. - Xác định được phương pháp nuôi, loại thức ăn phù hợp và khả năng thành thục của cá rô biển trong điều kiện nuôi nhốt. Kết quả này góp phần xây dựng quy trình sản xuất giống nhân tạo đối tượng này. - Đã đánh giá được khả năng và xác định phương pháp sử dụng 3 loại steroid là 17,20P; 17P và P để kích thích cá rô biển sinh sản: có thể kích thích cá sinh sản thành công với 17,20P trong liều quyết định sau liều sơ bộ với HCG hay LRH-A3. Việc sử dụng các hormon steroid kích thích cá rô biển sinh sản là hoàn toàn mới và kết quả này góp phần đa dạng chất kích thích sinh sản trong quy trình sản xuất giống nhân tạo đối tượng này. - Nghiên cứu đã xác định được quá trình phát triển phôi, ấu trùng và cá con của cá rô biển như thời gian ấu trùng dinh dưỡng bằng noãn hoàng, thời gian hoàn thiện quá trình phát triển ống tiêu hoá cũng như thời điểm cá 2 bắt đầu ăn thức ăn bên ngoài. Những kết quả này góp phần quan trọng trong việc ương giống thành công đối tượng này. Chƣơng 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành từ năm 2011-2014. Tất cả các thí nghiệm được thực hiện tại Khoa Thuỷ Sản, Trường Đại học Cần Thơ và Khoa Nông Nghiệp – Tài Nguyên Thiên Nhiên, Trường Đại học An Giang. 3.2 Đối tƣợng nghiên cứu Cá rô biển Pristolepis fasciata (Bleeker, 1851). 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học sinh sản cá rô biển 3.3.1.1 Phương pháp thu mẫu - Mẫu cá rô biển có khối lượng từ 19-360 gam/con được thu ở các điểm trên tuyến sông Hậu thuộc địa bàn tỉnh An Giang liên tục từ tháng 5/2012 đến tháng 4/2013. Mẫu cá được bảo quản trong dung dịch formol 10% và tiêu bản mô học buồng trứng được thực hiện theo phương pháp của Drury and Wallington (1967) và Kiernan (1990). Tiêu bản được nhuộm với thuốc nhuộm Haematoxyline và Eosin (H&E) theo Hinton (1990). 3.3.1.2 Các chỉ tiêu phân tích - Xác định các giai đoạn phát triển tuyến sinh dục dựa theo thang 6 bậc của Xakun and Buskaia (1968). - Chiều dài thành thục lần đầu Lm hay L50 là kích thước mà ở đó 50% cá thể thành thục được tính toán theo công thức của King (1995). - Xác định hệ số thành thục (Gonadosomatic Index, GSI) theo công thức của Crim and Glebe (1990) - Xác định sức sinh sản theo Banegal (1967). - Xác định đường kính trứng bằng thước đo trên kính hiển vi với số lượng trứng là 30 tế bào trên 1 mẫu. 3.3.2 Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý sinh sản cá rô biển 3.3.2.1 Phương pháp thu mẫu Mẫu cá rô biển được thu trên địa bàn tỉnh An Giang có khối lượng trung bình 51,8 gam/con và chiều dài trung bình 12,9 cm trong mùa sinh sản của cá ngoài tự nhiên để có đủ các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục. Mẫu cá được giữ sống và chuyển về phòng thí nghiệm Bộ môn Dinh dưỡng và Chế biến thuỷ sản để tiếp tục phân tích. 3.3.2.2 Các chỉ tiêu phân tích 3 - Các chỉ tiêu máu: số lượng hồng cầu; tỷ lệ huyết cầu (hematocrit), thể tích trung bình hồng cầu được xác định theo phương pháp của Larsen and Snieszko (1961; trích bởi Đỗ Thị Thanh Hương và Nguyễn Văn Tư, 2010). - Protein cơ và gan cá được xác định theo phương pháp của Lowry et al. (1951), sử dụng Bovine serum albumin (BSA, Sigma) làm đường chuẩn. - Hàm lượng vitellogenin được xác định thông qua hàm lượng phosphate protein huyết tương. 3.3.3 Nghiên cứu nuôi vỗ thành thục sinh dục cá rô biển bằng các loại thức ăn khác nhau 3.3.3.1 Hệ thống thí nghiệm Thí nghiệm nuôi vỗ thành thục sinh dục cá rô biển được bố trí trong 9 giai bằng lưới (30 m2/giai) đặt trong ao đất. Mực nước trong giai sâu 1,8 m. Nước trong ao được trao đổi một tháng 2 lần theo thuỷ triều. Trong ao, hệ thống phun mưa được thiết kế ở các vị trí đặt giai nhằm tăng cường ôxy. 3.3.3.2 Cá dùng trong thí nghiệm Cá dùng trong thí nghiệm được đánh bắt từ tự nhiên. Cá được thích ứng trong các giai để làm quen với điều kiện nuôi nhốt và thức ăn chế biến (3 tháng). Tiến hành chọn những cá có kích cỡ tương đồng và khoẻ mạnh để bố trí thí nghiệm. Hình 1. Vi bụng cá đực (trái) và cá cái (phải) Tiêu chuẩn lựa chọn cá đực và cái đưa vào nuôi vỗ như sau (Hình 1): - Cá đực: có khối lượng từ 40-80 gam/con. Cá đực có vây bụng dài tới lỗ niệu-sinh dục. - Cá cái: có khối lượng từ 60-100 gam/con. Cá cái có vây bụng ngắn hơn cá đực. 3.3.3.3 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong 9 giai với 3 nghiệm thức (NT) và lặp lại 3 lần. Mật độ nuôi vỗ là 0,5 kg cá/m2. Tỷ lệ đực:cái là 1:1. Thức ăn được dùng trong nuôi vỗ cá bố mẹ là cá tạp (cá biển) và thức ăn công nghiệp dùng cho cá có vẩy có 35% protein (Bảng 1). - NT 1: 100% cá tạp (được băm nhỏ). 4 - NT 2: 50% cá tạp + 50% thức ăn công nghiệp (theo khối lượng). - NT 3: 100% thức ăn công nghiệp. Bảng 1. Kết quả phân tích thức ăn nuôi vỗ thành thục cá rô biển (theo % khối lượng tự nhiên của thức ăn) Thức ăn Cá tạp Thức ăn CN Vật chất khô (%) 24,07 91,29 Protein (%) 16,78 35,06 Béo (%) 3,56 2,79 Tro (%) 3,50 8,74 3.3.3.4 Cho ăn và chăm sóc Cá được cho ăn ngày 2 lần vào lúc 8 giờ và 17 giờ với mức thỏa mãn theo nhu cầu. Các chỉ tiêu thủy lý – hóa (nhiệt độ, ôxy hoà tan, pH, amôn tổng số (TAN) và nitrite): định kỳ 1 tuần đo 1 lần vào lúc 6 giờ sáng và 14 giờ chiều theo các phương pháp chuẩn. 3.3.3.5 Các chỉ tiêu phân tích - Hệ số thành thục (GSI) và tỷ lệ thành thục của cá được đánh giá 1 tháng/lần từ khi bố trí thí nghiệm nuôi vỗ. Thời gian bắt đầu thí nghiệm nuôi vỗ đến khi kết thúc là 3 tháng. 3.3.4 Nghiên cứu xác định loại, liều lƣợng, phƣơng pháp tiêm hormon steroid kích thích cá rô biển chín và rụng trứng 3.3.4.1 Cá thí nghiệm Cá rô biển dùng trong thí nghiệm này được chọn từ những cá thành thục sinh dục trong thí nghiệm nuôi vỗ. Cá được chọn là những cá khoẻ mạnh, thành thục sinh dục tốt (tuyến sinh dục ở giai đoạn IV), khối lượng từ 50-100 g/con. 3.3.4.2 Các loại hormon sử dụng trong nghiên cứu * Progesterone (P) và 17-hydroxyprogesterone (17P): của Công ty Sigma (Pháp), dạng bột, màu trắng. 17α, 20β – dihydroxyprogesterone (17,20P) được điều chế từ 17P bằng phản ứng khử bởi NaBH4 theo Norymberski and Woods (1955). - Tất cả các hormon steroid trên được hòa tan trong cồn tuyệt đối. Thể tích các dung dịch 17,20P, 17P và P tiêm cho cá được khống chế ở mức 1 mL cho mỗi kg cá cái và được tiêm vào xoang thân cá. * LRH-A3 do Trung Quốc sản xuất; * Domperidon (DOM) là của Công ty dược phẩm Hậu Giang. * Human Chorionic Gonadotropin (HCG): sản phẩm của Công ty dịch vụ nuôi trồng thuỷ sản trung ương thuộc Bộ Nông Nghiệp & PTNT. - Các hormon như HCG, LRH-A3+DOM được tiêm vào cơ 3.3.4.3 Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1 (TN1): Ảnh hưởng của các loại steroid lên quá trình chín của noãn bào cá rô biển cái 5 Thí nghiệm này gồm 3 thử nghiệm nhằm đánh giá khả năng gây chín noãn bào cá rô biển cũng như liều gây chín tối ưu của 3 loại steroid là P, 17P và 17,20P. Trong thí nghiệm này không sử dụng liều sơ bộ để đảm bảo sự chín noãn bào chỉ do tác động của các steroid. Mỗi thử nghiệm được tiến hành trên 9 cá cái, chia ngẫu nhiên thành 3 nghiệm thức như được trình bày ở bảng sau. Bảng 2. Thử nghiệm đánh giá sự chín noãn bào ở cá rô biển với hormon steroid ở các liều lượng khác nhau Tên NT 1 2 3 Số cá cái/ lần lập lại 3 3 3 Liều steroid (mg/kg cá cái) 17P 7 10 15 P 10 15 20 17,20P 3 4 5 - Tác động gây chín noãn bào của các steroid sẽ được đánh giá vào lúc 8 giờ sau khi tiêm hormon. Phương pháp đánh giá sự chín noãn bào (Final oocyte maturation-FOM) theo Brzuska (1979); Mishra and Joy (2006); Tokumoto et al. (2011) và Żarski et al. (2011). Các chỉ tiêu phân tích trong TN1 + Sự thay đổi kích thước trứng sau khi tiêm các loại steroid. + Tỷ lệ chín trứng: tỷ số trứng chín trên tổng số trứng quan sát. Thí nghiệm 2 (TN2): Kích thích sinh sản cá rô biển bằng 17,20P; 17P và P trong liều tiêm quyết định sau liều sơ bộ bằng HCG - Thí nghiệm 2 được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 4 nghiệm thức (NT) và lặp lại 3 lần. NTĐC sử dụng hoàn toàn HCG. Liều quyết định cho NTĐC là 2.500 IU HCG/kg cá cái và liều quyết định cho các NT còn lại là liều steroid tối ưu có tác dụng gây chín noãn bào từ TN1 (Bảng 3). Bảng 3. Thí nghiệm kích thích sinh sản cá rô biển bằng 17,20P, 17P và P sau liều sơ bộ bằng HCG NT 1 (ĐC) 2 3 4 Số cá cái 15 15 15 15 Liều sơ bộ (tính cho 1 kg cá cái) 500 IU HCG 500 IU HCG 500 IU HCG 500 IU HCG Liều quyết định (tính cho 1 kg cá cái) 2.500 IU HCG 5 mg 17,20P 10 mg 17P 15 mg P Thí nghiệm 3 (TN3): Kích thích sinh sản cá rô biển bằng 17,20P; 17P và P trong liều tiêm quyết định sau liều sơ bộ bằng LRH-A3+DOM - TN3 được bố trí tương tự như TN2. NTĐC sử dụng hoàn toàn LRH-A3+DOM. Liều quyết định cho NTĐC là 56 μg LRH-A3+6 mg DOM /kg cá cái và liều quyết định cho các NT còn lại là liều steroid tối ưu có tác dụng gây chín noãn bào từ TN1 (Bảng 4). 6 Bảng 4. Thí nghiệm kích thích sinh sản cá rô biển bằng 17,20P, 17P và P sau liều sơ bộ bằng LRH-A3+DOM NT 1 (ĐC) 2 3 4 Số cá cái 15 15 15 15 Liều sơ bộ (tính cho 1 kg cá cái) 14 μg LRH-A3 + 2 mg DOM 14 μg LRH-A3 + 2 mg DOM 14 μg LRH-A3 + 2 mg DOM 14 μg LRH-A3 + 2 mg DOM Liều quyết định (tính cho 1 kg cá cái) 56 μg LRH-A + 6 mg DOM 5 mg 17,20P 10 mg 17P 15 mg P Trong TN2 và TN3, cá đực được tiêm 1 lần với HCG hay LRHA3+DOM với liều bằng liều sơ bộ (1/3 liều quyết định của cá đối chứng) vào cùng thời điểm tiêm liều quyết định của cá cái. Thời gian giữa 2 lần tiêm liều sơ bộ và liều quyết định trong TN2 và TN3 là 8 giờ. Áp dụng hình thức sinh sản bán nhân tạo trong TN2 và TN3: cá sau khi tiêm chất kích thích sinh sản được vào bể đẻ (mức nước trong bể sâu khoảng 40 cm) với tỷ lệ đực/cái = 1/1 để cá tự bắt cặp sinh sản. Các chỉ tiêu phân tích trong TN2 và TN3 gồm: Thời gian hiệu ứng (giờ); Tỷ lệ cá đẻ (%); Sức sinh sản tương đối thực tế (trứng/g cá cái), Tỷ lệ thụ tinh (%), tỷ lệ nở (%) và tỷ lệ sống của cá bột (%). 3.3.5 Nghiên cứu sự phát triển của cá rô biển từ giai đoạn phôi đến 30 ngày tuổi 3.3.5.1 Quá trình phát triển phôi, thời gian cá dinh dưỡng bằng noãn hoàng, kích cỡ miệng và chiều dài cá bột - Quá trình phát triển phôi được quan sát bằng kính hiển vi ở độ phóng đại của vật kính 4X, 10X và ghi nhận đầy đủ về thời gian và hình ảnh từ khi trứng thụ tinh đến khi nở thành ấu trùng. - Thời gian cá dinh dưỡng noãn hoàng được xác định thông qua mức độ giảm đường kính noãn hoàng theo từng thời điểm khác nhau. - Kích cỡ miệng của cá được xác định dựa theo phương pháp của Shirota (1970). 3.3.5.2 Nghiên cứu sự phát triển ống tiêu hóa từ giai đoạn ấu trùng đến 30 ngày tuổi - Mẫu cá được thu vào các ngày tuổi 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 20, 25 và 30 sau khi nở. Quan sát sự biến đổi hình thái ống tiêu hóa trực tiếp dưới kính hiển vi. Tiêu bản mô học ống tiêu hóa được thực hiện theo phương pháp mô tả bởi Drury and Wallington (1967) và Kiernan (1990). 3.3.5.3 Khả năng chịu đựng của cá giai đoạn ấu trùng đến 30 ngày tuổi đối với một số yếu tố môi trường Nghiên cứu được thực hiện với cá rô biển 1, 5, 10, 20 và 30 ngày tuổi sau khi nở. 7 a) Xác định nhiệt độ cao và thấp gây chết cá: theo phương pháp của Lahdes and Vainio (2003). b) Xác định ngưỡng ôxy và cường độ tiêu hao ôxygen: theo phương pháp bình kín (Wokoma and Marioghae, 1996). c) Xác định pH cao và thấp gây chết cá: theo Wokoma and Marioghae (1996). d) Xác định độ mặn gây chết cá: theo phương pháp của Bringolf et al. (2005) và Schofield et al. (2006). 4. Phƣơng pháp xử lý số liệu Các số liệu thu thập ở tất cả các thí nghiệm được tính toán giá trị trung bình (TB), độ lệch chuẩn (STD), lớn nhất, nhỏ nhất và được trình bày dưới dạng TB±STD. Phân tích thống kê (One-way ANOVA với phép thử DUNCAN) được áp dụng để tìm ra sự khác biệt giữa các trung bình các nghiệm thức ở mức ý nghĩa p<0,05 bằng các phần mềm Excel của Office 2007 và SPSS 16.0. Các số liệu % được chuyển đổi thành arsin trước khi xử lý thống kê. Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Một số đặc điểm sinh học sinh sản của cá rô biển 4.1.1 Phân biệt giới tính Khó xác định giới tính bằng các đặc điểm hình thái bên ngoài khi cá còn nhỏ. Tuy nhiên, trong mùa sinh sản có thể phân biệt giới tính cá rô biển tương đối dễ dàng. - Cá rô biển cái có tuyến sinh dục phát triển có bụng to hơn cá đực; khi ép lên bụng cá đực thấy sẹ trắng chảy ra. - Cá rô biển đực thường có kích thước nhỏ và mình dẹp hơn cá cái. - Cá rô biển cái thành thục có lỗ sinh dục lớn và tròn hơn lỗ niệu-sinh dục của con đực. - Vi bụng của con đực dài hơn con cái (Hình 2). Hình 2. Hình dạng bên ngoài của cá rô biển đực (trên) và cái (dưới) 4.1.2 Tỷ lệ đực cái, khối lƣợng, chiều dài của cá qua các tháng thu mẫu 8 Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ cá cái ở các tháng thu mẫu đều có xu hướng cao hơn cá đực. Tỷ lệ đực:cái chung qua các tháng là 1:1,58. Cá rô biển cái thường có khối lượng và chiều dài lớn hơn cá đực (Hình 3). Sự khác biệt về khối lượng giữa cá rô biển cái và đực là rõ ràng hơn so với sự khác biệt về chiều dài. Khối lượng và chiều dài của cá thu mẫu đạt cực đại vào tháng 8 và tháng 11. Hình 3. Khối lượng (trái) và chiều dài tổng cộng (phải) trung bình của cá rô biển qua các tháng thu mẫu 4.1.3 Đặc điểm hình thái tuyến sinh dục cá rô biển cái và đực 4.1.3.1 Đặc điểm tuyến sinh dục cái (buồng trứng) Dựa vào các tiêu chuẩn phân chia các giai đoạn thành thục tuyến sinh dục của Xakun and Buskaia (1968), thì buồng trứng cá rô biển có những đặc điểm phát triển như sau: - Giai đoạn I (GĐI): buồng trứng chỉ là hai dạng sợi ngắn, nhỏ, màu trắng trong. Về mặt tổ chức học, noãn sào chỉ bao gồm tế bào sinh dục là các noãn nguyên bào. Noãn nguyên bào có nhiều góc cạnh, kích thước rất nhỏ, tế bào chất ưa kiềm nên bắt màu tím của hematoxylin mạnh, nhân ưa kiềm yếu nên bắt màu nhạt và số tiểu hạch ít. Giai đoạn này chỉ xuất hiện đối với những cá rô biển thành thục lần đầu. - Giai đoạn II (GĐII): buồng trứng có kích thước lớn lên, bề mặt có nhiều mạch máu, màu hồng nhạt. Lúc này, noãn bào có kích thước khá lớn, màng của noãn bào mỏng và tổ chức liên kết nhiều. Thể tích tế bào chất tăng lên. Nhân tròn rõ, ưa kiềm và bắt màu nhạt, trong nhân lớn có nhiều tiểu hạch. - Giai đoạn III (GĐIII): thể tích buồng trứng tăng lên, chiếm 1/2 xoang bụng, bề mặt buồng trứng có màu vàng nhạt. Noãn bào chuyển sang giai đoạn sinh trưởng chất dinh dưỡng, bắt đầu quá trình tích lũy noãn hoàng. Trong tế bào chất xuất hiện nhiều không bào (không bắt màu), nhân lớn bắt màu tím nhạt. Tế bào chất vẫn còn ưa kiềm nhưng rất yếu. Khối 9 lượng noãn hoàng tăng, noãn hoàng xuất hiện nhiều bắt màu hồng của eosin rất rõ, các hạt noãn hoàng to nằm phía ngoài trong khi các hạt nhỏ nằm sát nhân. - Giai đoạn IV (GĐIV): buồng trứng chiếm phần lớn xoang bụng, căng phồng, nhìn rõ hạt trứng; hạt trứng tròn và căng, màu vàng nhạt, các hạt trứng dễ tách rời. Kích thước của noãn bào gia tăng rõ. Kết thúc thời kỳ lớn nguyên sinh - noãn hoàng, số tiểu hạch trong nhân giảm và từ từ tan biến bào dịch nhân, nhân không có hình dạng nhất định. Kích thước noãn bào lúc này đạt cực đại. - Giai đoạn V (GĐV): là giai đoạn cá đẻ trứng, các sản phẩm sinh dục chảy ra khi ấn nhẹ vào bụng cá, khối lượng tuyến sinh dục từ đầu đến cuối giai đoạn đẻ trứng giảm đi rất nhanh. Giai đoạn này thường chỉ bắt gặp ở cá đang trong quá trình sinh sản. Trong quá trình nghiên cứu đã không thu được mẫu cá có buồng trứng ở giai đoạn V. Mô tả này dựa trên mẫu cá cho sinh sản nhân tạo. - Giai đoạn VI (GĐVI): sau khi cá đẻ xong, tuyến sinh dục teo lại, mềm nhão, màng tuyến sinh dục nhăn nheo, mạch máu dày đặc, trong buồng trứng có chứa chất dịch màu đỏ. Tế bào trứng đã rụng nhưng chưa được đẻ bắt đầu thoái hoá và trở nên dị dạng. Hình 4. Hình dạng (hàng trên) và tổ chức mô học (hàng dưới) của buồng trứng cá rô biển cái ở các giai đoạn phát triển II, III, IV và VI (từ trái sang phải) 4.1.3.2 Đặc điểm tuyến sinh dục đực (buồng tinh) Buồng tinh cá rô biển là hai dãi nằm sát hai bên xương sống, một đầu mở vào lỗ sinh dục, một đầu đính vào mặt lưng xoang thân. - Giai đoạn I (GĐI): buồng tinh chỉ là hai sợi thật mảnh nằm sát hai bên xương sống. Về hình thái thì khó xác định giai đoạn I của buồng trứng và buồng tinh. 10 - Giai đoạn II (GĐII): buồng tinh là hai dãi mỏng có màu hồng nhạt, bề mặt buồng tinh bóng. - Giai đoạn III (GĐIII): buồng tinh có màu trắng hồng, mạch máu phân bố nhiều. - Giai đoạn IV (GĐIV): buồng tinh đạt kích thước lớn, có màu trắng phớt hồng. - Giai đoạn V (GĐV): buồng tinh đạt kích thước lớn nhất, có màu trắng sữa. Tinh trùng chứa đầy trong ống dẫn tinh. Cá đang ở trạng thái sinh sản, sẵn sàng phóng tinh khi có hoạt động sinh sản. Khi ấn nhẹ vào lỗ sinh dục cá đực có buồng tinh ở giai đoạn này, tinh dịch sẽ chảy ra. - Giai đoạn VI (GĐVI): buồng tinh teo nhỏ lại và mềm nhão; bề mặt buồng tinh có màu đỏ bầm. Hình 5. Hình dạng của buồng tinh cá rô biển đực ở các giai đoạn phát triển I, II, III, IV, V và VI (từ trái sang phải) 4.1.4 Sự biến đổi giai đoạn thành thục sinh dục (GĐTT) cá rô biển đực và cái qua các tháng thu mẫu 4.1.4.1 Sự quan hệ giữa GĐTT sinh dục và kích thước cá theo thời gian Kết quả nghiên cứu cho thấy cá rô biển cái thu được có chiều dài tổng cộng (TL) nhỏ nhất là 6,5 cm và lớn nhất là 25,4 cm và cá rô biển đực thu được có chiều dài tổng cộng (TL) nhỏ nhất là 6,3 cm và lớn nhất là 20,8 cm. Các giá trị này của cá đực là thấp hơn cá cái. Theo Baran et al. (2007), cá rô biển cái có thể đạt thành thục sinh dục với chiều dài tổng cộng từ 7-10 cm. Dựa trên kích thước cá rô biển có tuyến sinh dục giai đoạn IV thì có thể thấy có 2 nhóm cá cái: nhóm cá nhỏ có TL≤15 cm và nhóm cá lớn có TL>15 cm; tương tự, có 2 nhóm cá đực: nhóm cá nhỏ có TL≤14 cm và nhóm cá lớn có TL>14 cm. Cá kích thước nhỏ thường chiếm tỷ lệ cao hay tuyệt đối trong các nhóm cá có giai đoạn thành thục sinh dục khác nhau, đặc biệt ở giai đoạn phát dục thấp (GĐI, II và III); trong khi cá kích thước lớn thường chiếm tỷ lệ đáng kể hay cao trong các nhóm cá có giai đoạn thành thục sinh dục cao (GĐIV). Đặc biệt, có sự gia tăng chiều dài theo giai đoạn thành thục của nhóm cá kích thước nhỏ. 11 Từ kết quả phân tích trên có thể nhận định rằng có cá kích thước nhỏ là quần đàn cá tham gia sinh sản lần đầu và cá kích thước lớn là quần đàn cá đã tham gia sinh sản mùa trước. Các quần đàn này cũng có thể sống riêng biệt và có thể hòa nhập với nhau khi tham gia sinh sản. 4.1.4.2 Sự biến đổi GĐTT sinh dục cá theo thời gian Cá rô biển cái bắt đầu quá trình phát dục từ nửa cuối mùa khô. Vào tháng 1 đã xuất hiện cá cái thành thục sinh dục (có tuyến sinh dục giai đoạn IV) với tỷ lệ 23,5%. Tỷ lệ cá cái thành thục sinh dục tăng dần và đạt cực đại (100%) vào tháng 8. Từ tháng 9 đến tháng 12, cá có tuyến sinh dục giai đoạn IV không còn nữa, cá thu được chủ yếu có tuyến sinh dục ở các giai đoạn phát triển sớm (I, II và III) (Hình 6). Đặc biệt, ở tháng 11/2012, 50% số cá thu được còn lại có buồng trứng GĐII và đều thuộc nhóm kích thước lớn; đây có thể là những cá đã tham gia sinh sản, hồi phục và bắt đầu một chu kỳ sinh dục mới. Hình 6. Biến động GĐTT sinh dục cá rô biển cái (trái) và đực (phải) theo thời gian Cá đực có buồng tinh giai đoạn I (GĐI) được tìm thấy vào các tháng 9, 10 và 12. Cá có buồng tinh giai đoạn II (GĐII) được tìm thấy ở hầu hết các tháng thu mẫu với tỷ lệ cao và tăng dần từ tháng 9/2012 (55,6%) đến tháng 2/2013 (80%). Cá có buồng tinh giai đoạn III (GĐIII) được tìm thấy ở phần lớn các tháng thu mẫu (ngoại trừ các tháng 5, 8, 10 và 11/2012) với tỷ lệ thấp ở 7/2012 (5,6%) và tăng dần từ tháng 12/2012 (12,5%) đến tháng 4 năm sau (73,3%). Cá có buồng tinh giai đoạn IV (GĐIV) cũng được tìm thấy với tỷ lệ tương đối cao ở giai đoạn đầu của nghiên cứu, từ tháng 5 (40%) đến tháng 7/2012 (55,6%) và với tỷ lệ thấp ở giai đoạn cuối của nghiên cứu, 14,3% vào tháng 3 và 13,3% vào tháng 4/2013. Khác với cá cái, cá có buồng tinh giai đoạn V (GĐV, là giai đoạn cá sinh sản) đã được tìm thấy vào tháng 5, 7 và 8/2012 với tỷ lệ lần lượt là 50, 33,3 và 100%. Cá đực đã sinh sản và ở giai đoạn hồi phục (GĐVI) chỉ tìm thấy vào tháng 11/2012 với tỷ lệ 53,8% (Hình 6). 12 Từ những khảo sát về sự biến động giai đoạn thành thục sinh dục cá rô biển trong thời gian thu mẫu cho thấy có sự tương đồng trong quá trình phát dục của cá rô biển đực và cá cái. Có thể nhận định cá rô biển có thời gian sinh sản kéo dài, bắt đầu phát dục từ tháng 1 và sinh sản tập trung vào nửa đầu mùa khô ở vùng ĐBSCL (từ tháng 5 đến tháng 8). 4.1.5 Sự biến đổi hệ số thành thục (GSI) của cá rô biển cái và đực qua các tháng thu mẫu Hệ số thành thục của cá rô biển cái bắt đầu tăng dần từ tháng 12 năm trước (2,51%), đạt giá trị cao nhất vào các tháng 6 (14,68%), giảm dần vào các tháng sau đó (12,89% vào tháng 7 và 10,19% vào tháng 8). Vào tháng 9, tháng 10 thì hệ số thành thục của cá bắt đầu giảm nhanh (5,06 và 1,40%) và đạt thấp nhất vào tháng 11 (0,36%) (Hình 7). Tương tự, hệ số thành thục của cá rô biển đực cũng thấp nhất vào tháng 11 (0,19%) và cao nhất là vào tháng 8 (4,75%) (Hình 7). Hình 7. Biến động hệ số thành thục cá rô biển theo thời gian Hình 8. Đường cong thể hiện mối tương quan giữa tỷ lệ thành thục và chiều dài cá rô biển cái Không có sự tương quan có ý nghĩa (p>0,05) giữa hệ số thành thục (GSI, %) và chiều dài tổng cộng (TL, cm) ở cả cá rô biển đực (GSI=6238TL-4,963, r2=0,5853, n=32) và cái (GSI=4.0611TL0,345, r2=0,0175, n=87). Với hệ số thành thục của cả cá đực và cái đạt cao từ tháng 5 đến tháng 8, một lần nữa cũng cố nhận định mùa sinh sản của cá rô biển ở An Giang tập trung vào nửa đầu mùa mưa hàng năm. 4.1.6 Chiều dài thành thục lần đầu của cá rô biển Dựa trên kết quả phân tích tỉ lệ thành thục theo nhóm chiều dài của quần thể cá rô biển ở mùa sinh sản từ tháng 12/2012 đến tháng 9/2013, đã xác định được chiều dài thành thục lần đầu (L50) trung bình của loài cá này là 11,68 cm (n=364 cá thể) (Hình 8). Kết quả này là phù hợp với nhận định của Baran et al. (2007) về kích thước thành thục của cá rô biển. 13 4.1.7 Sức sinh sản và sự biến đổi đƣờng kính trứng của cá rô biển Sức sinh sản tuyệt đối của cá rô biển khá lớn, đạt 41.884 trứng/cá thể (biến động 14.786-95.346 trứng/cá thể). Sức sinh sản tương đối trung bình của cá rô biển là 453.314 trứng/kg cá cái (biến động 328.571-556.372 trứng/kg cá cái). Kết quả phân tích cho thấy có sự tương quan đường thẳng giữa sức sinh sản (SSS, trứng) và khối lượng cơ thể (WB, g) và khối lượng buồng trứng (WG, g) cá rô biển cái theo các phương trình sau. SSS (trứng) = 425,52WB + 2424 SSS (trứng) = 3684,8WG - 800,03 Với các giá trị R cao (R2=0,9046 cho WB và R2=0,7268 cho WG) phản ánh các tương quan này là chặt chẽ. Sức sinh sản tuyệt đối gia tăng theo khối lượng cơ thể và khối lượng buồng trứng cá rô biển cái (Hình 9). Hình 9. Tương quan giữa sức sinh sản với khối lượng cơ thể (trái) và khối lượng buồng trứng (phải) của cá rô biển cái (n=30) 4.2. Một số đặc điểm sinh lý sinh sản của cá rô biển 4.2.1 Mối tƣơng quan giữa khối lƣợng và chiều dài Hình 10. Tương quan giữa khối lượng (W) và chiều dài (L) của cá rô biển cái (n=226) (trái) và của cá rô biển đực (n=143) 14 Các phương trình tương quan giữa khối lượng và chiều dài được tính cho cá cái là W=0,1829L2,2685 và cho cá đực là W=0,2775L2,0547. Hệ số tương quan R2=0,8748 và R2=0,7721 cho thấy sự tương quan giữa khối lượng và chiều dài của cá cái và cá đực là chặt chẽ (Hình 10). 4.2.2 Biến đổi tỷ lệ huyết cầu (Hematocrit), số lƣợng hồng cầu và thể tích trung bình hồng cầu (MCV) theo các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục cá rô biển Tỷ lệ huyết cầu (hematocrit, %) ở cá rô biển đực (dao động trong khoảng 31,83-44,93%) cao hơn cá cái (dao động trong khoảng 26,5830,61%). Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05) giữa hematocrit và các giai đoạn phát triển tuyến sinh dục trên cá rô biển. Số lượng hồng cầu ở cá rô biển cái (biến động 0,80x106-4,07x106 tế bào/mm3) và thấp hơn giá trị của cá đực (biến động 2,37x106-2,75x106 tế bào/mm3). Số lượng hồng cầu ở cá rô biển cái có buồng trứng giai đoạn I, II và III khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) nhưng cao hơn một cách có ý nghĩa so với cá rô biển cái có buồng trứng giai đoạn IV (p<0,05). Trái lại, số lượng hồng cầu ở cá rô biển đực ở các giai đoạn phát triển của buồng tinh là khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Thể tích trung bình hồng cầu của cá đực cao hơn cá cái ở các giai đoạn phát triển tuyến sinh dục. Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05) giữa thể tích trung bình hồng cầu và các giai đoạn phát triển tuyến sinh dục trên cá rô biển. 4.2.3 Biến đổi hàm lƣợng protein trong cơ, gan và hàm lƣợng phosphate protein huyết tƣơng (vitellogenin) theo các giai đoạn phát triển tuyến sinh dục của cá rô biển Hàm lượng protein trong cơ và gan cá rô biển cái có sự biến động trong quá trình phát triển tuyến sinh dục; đạt giá trị cao nhất khi buồng trứng ở giai đoạn II và đạt giá trị thấp nhất khi buồng trứng ở giai đoạn IV. Giá trị hàm lượng protein trong cơ cá ở giai đoạn IV là khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các giai đoạn khác (Bảng 5). Giá trị hàm lượng protein trong gan ở cá ở các giai đoạn II và IV là khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) (Bảng 5). Hàm lượng protein trong cơ và gan cá rô biển đực có khuynh hướng thấp hơn cá cái và khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) giữa các giai đoạn phát triển của buồng tinh. Như vậy, protein cơ và gan cá có tham gia vào quá trình phát triển của buồng trứng ở cá rô biển cái; trong khi đó quá trình phát triển buồng 15 tinh của cá rô biển đực không chịu sự ảnh hưởng bởi nguồn protein từ cơ và gan. Bảng 5. Hàm lượng protein cơ và gan (mg protein/g mẫu tươi) và hàm lượng vitellogenin (µg ALP/mL huyết tương) ở các giai đoạn phát triển tuyến sinh dục khác nhau của cá rô biển Giai đoạn tuyến sinh dục I II III IV Protein cơ Cá cái Protein gan 32,1±1,16b 41,2±0,78c 29,6±0,82ab 23,2±0,82a 51,1±1,30ab 63,5±0,78b 53,4±1,07ab 43,1±1,76a Hàm lượng vitellogenin 74,01±23,36a 94,60±8,01a 125,43±20,29b 148,42±35,83b Protein cơ Cá đực Protein gan 32,5±0,22a 28,4±1,36a 30,8±0,82a 22,4±0,86a 53,2±1,70a 51,2±0,90a 44,1±1,02a 39,3±0,74a Hàm lượng Vtg huyết tương, được xác định gián tiếp thông qua hàm lượng ALP, của cá rô biển cái tăng dần theo sự phát triển của tuyến sinh dục. Hàm lượng Vtg huyết tương có giá trị thấp nhất ở cá có tuyến sinh dục giai đoạn I và có xu hướng tăng dần lên đến giai đoạn II, III và đạt giá trị cực đại khi cá có tuyến sinh dục ở giai đoạn IV. Hàm lượng Vtg huyết tương khi cá có tuyến sinh dục ở giai đoạn III, IV khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với cá có tuyến sinh dục giai đoạn I và II (Bảng 5). 4.3. Ảnh hƣởng của thức ăn nuôi vỗ đến sự thành thục sinh dục (TTSD) của cá rô biển 4.3.1 Các yếu tố môi trƣờng trong quá trình nuôi vỗ TTSD cá rô biển Các yếu tố thuỷ lý hoá (nhiệt độ: 26,4-31,5oC, pH: 7,12-8,87, ôxy hòa tan: 3,01-3,91 ppm, N-NH3: 0,02-0,07 ppm và N-NO2-: 0,11-0,50 ppm) trong ao nuôi vỗ không có biến động lớn và đều nằm trong giới hạn thích hợp cho sự phát triển tuyến sinh dục của cá rô biển. 4.3.2 Sự thành thục sinh dục của cá rô biển trong quá trình nuôi vỗ 4.3.2.1 Biến động giai đoạn thành thục (GĐTTSD) của cá rô biển cái theo thời gian nuôi vỗ Vào tháng 2, khi mới bắt đầu bố trí thí nghiệm thì tất cả cá rô biển cái được khảo sát đều có tuyến sinh dục ở giai đoạn II. Đến tháng 5, phần lớn cá được khảo sát trong quá trình nuôi vỗ ở cả 3 nghiệm thức đều đã thành thục sinh dục, trong đó cá có tuyến sinh dục giai đoạn IV ở 3 nghiệm thức dao động trong khoảng 60-66,67% (Bảng 6). Bảng 6. Biến động GĐTT sinh dục (%) của cá rô biển cái theo thời gian nuôi vỗ Thời gian Tháng 2 Tháng 3 Tháng 4 Tháng 5 II 100 86,7 46,7 6,7 NT1 III 13,3 26,7 26,7 IV 26,7 66,7 II 100 93,3 46,7 6,7 16 NT2 III 6,7 53,3 33,3 IV 60,0 II 100 93,3 46,7 - NT3 III 6,7 40,0 33,3 IV 13,3 66,7 Sự thành thục sinh dục của cá rô biển cũng tuân theo quy luật chung của đa số các loài các nước ngọt vùng ĐBSCL là thành thục sinh dục vào đầu mùa mưa, được bắt đầu vào cuối tháng 4 đầu tháng 5. 4.3.2.2 Biến động hệ số thành thục sinh dục của cá rô biển cái theo thời gian nuôi vỗ Hệ số thành thục sinh dục của cá rô biển cái tăng dần qua các tháng nuôi vỗ và khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê (p>0,05) giữa các nghiệm thức (Bảng 7). Bảng 7. Sự biến động hệ số thành thục của cá rô biển cái qua các tháng nuôi vỗ Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 Tháng 2 0,69±0,23a 0,89±0,37a 0,71±0,32a Hệ số thành thục (GSI, %) Tháng 3 Tháng 4 1,85±2,26a 5,05±5,31a 1,24±0,89a 3,05±2,02a 1,33±0,92a 4,05±4,42a Tháng 5 9,91±6,89a 8,69±6,95a 10,04±6,21a 4.3.2.3 Biến động đường kính noãn bào cá rô biển theo thời gian nuôi vỗ Đường kính noãn bào của cá rô biển trong quá trình nuôi vỗ có tuyến sinh dục giai đoạn III trung bình là 0,82 mm và ở giai đoạn IV là 0,93 mm. Tóm lại, qua kết quả phân tích hệ số thành thục và đường kính trứng cho thấy, hoàn toàn có thể sử dụng một trong ba loại thức ăn là 100% cá tạp, 50% cá tạp kết hợp 50% thức ăn công nghiệp 35% protein hoặc 100% thức ăn công nghiệp 35% protein để nuôi vỗ thành thục sinh dục cá rô biển. 4.3.3 Nghiên cứu sinh sản nhân tạo cá rô biển bằng hormon steroid 4.3.3.1 Ảnh hưởng của các loại steroid lên quá trình chín của noãn bào Hình 11. Đường kính noãn bào trước và sau khi tiêm các hormon P (trái trên), 17P (phải trên) và hormon 17,20P (trái dưới) 17